UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO - UFRJ

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS - ICB

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MORFOLÓGICAS

ANDERSON DELANO SANTOS ARAÚJO

DEGENERAÇÃO GORDUROSA EM MÚSCULO ESQUELÉTICO DO MANGUITO ROTATOR DE OVELHAS: UM ESTUDO

EXPERIMENTAL

SALVADOR

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2008

ANDERSON DELANO SANTOS ARAÚJO

DEGENERAÇÃO GORDUROSA EM MÚSCULO ESQUELÉTICO

DO MANGUITO ROTATOR DE OVELHAS: UM ESTUDO EXPERIMENTAL.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Morfológicas do Instituto de Ciências Biomédicas da UFRJ realizado em parceria com o Instituto de Ciências da Saúde da UFBA, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências Morfológicas.

Orientador: Prof. Dr. Radovan Borojevic

Co-orientador: Prof. Dr. Gildásio Cerqueira Daltro

SALVADOR 2008

Araújo, Anderson Delano Santos

DEGENERAÇÃO GORDUROSA EM MÚSCULO ESQUELÉTICO DO MANGUITO ROTATOR DE OVELHAS: UM ESTUDO EXPERIMENTAL/ Anderson Delano Santos Araújo

42 f.; 30 cm; il.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Ciências Biomédicas e Universidade Federal da Bahia. Instituto de Ciências da Saúde, 2008. Orientador: Prof. Radovan Borojevic. Co-orientador: Prof. Gildásio Daltro

1. Degeneração gordurosa 2. Músculo esquelético 3. Modelo experimental 4. Manguito rotador.

TERMO DE APROVAÇÃO

ANDERSON DELANO SANTOS ARAÚJO

DEGENERAÇÃO GORDUROSA EM MÚSCULO ESQUELÉTICO DO MANGUITO ROTATOR DE OVELHAS: UM ESTUDO EXPERIMENTAL.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Morfológicas do Instituto de Ciências Biomédicas da UFRJ realizado em parceria com o Instituto de Ciências da Saúde da UFBA, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências Morfológicas.

Prof. Dr. Maria Isabel Doria Rossi Professor da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ) _______________________________________________ Prof. Dr. Luciana Maria Pedreira Ramalho Professora da Universidade Federal da Bahia (UFBA) ________________________________________________ Prof. Dr. Vitor Antonio Fortuna Professor da Universidade Federal da Bahia(UFBA) __________________________________________________ Prof. Dr. Márcia Cury El-Cheikh Revisor e Suplente, Universidade Federal do Rio de Janeiro __________________________________________________ Radovan Borojevic Orientador, Professor Titular da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ) ___________________________________________________ Gildásio de Cerqueira Daltro Co-Orientador, Professor Adjunto da Universidade Federal da Bahia ___________________________________________________ Anderson Delano Santos Araújo Mestrando ___________________________________________________ Salvador ____ de _____________ de 2008

RESUMO

O presente estudo teve como objetivo avaliar a degeneração muscular do manguito rotador em ovelhas, visando estabelecer um modelo experimental em animais de médio porte para o desenvolvimento de pesquisa da manipulação de células-tronco autólogas, como uma opção de tratamento. Foram utilizadas ovelhas adultas da raça Santa Inês, fêmeas, de 2 a 4 anos, com 25 a 35 kg, clinicamente saudáveis. Os Ovinos foram anestesiados e foi realizada a tenotomia do tendão do músculo infra-espinal. Para que o tendão lesionado não se recuperasse, um dreno “Penrose” que foi suturado à porção final do tendão. Foram coletadas biópsias musculares com 21, 35 e 65 dias pós-lesão. As amostras foram processadas pelo método de rotina histopatológica. Os procedimentos deste trabalho foram avaliados e aprovados pela Comissão de Bioética. Nas amostras de 21 dias pós-lesão apresentaram alguns pontos poucos adipócitos entre os fascículos (perimísio) e poucos adipócitos entres as fibras musculares (endomísio). Com 35 dias pós-lesão foi observada maior infiltração de adipócitos no perimísio e no endomísio, do que com 21dias. Nas amostras de 65 dias pós-lesão foi observada uma acentuada infiltração de tecido adiposo e havia diminuição do tamanho das fibras musculares e desarranjo estrutural; e formação de tecido de granulação próximo a região onde foi colocado o dreno, apresentando infiltrado de células mononucleares, proliferação de tecido conjuntivo e neovascularização. Este modelo experimental mostrou-se adequado para o estudo da infiltração gordurosa do tecido muscular do manguito rotator. Palavras chave: Degeneração gordurosa, músculo esquelético, modelo experimental, manguito rotador.

ABSTRACT

This study aimed to evaluate the muscle degeneration of the rotator cuff in sheep, to establish an experimental model of animal midsize search for the development of the manipulation of autologous stem-cells, as an option to treatment. Take used the adult sheep Santa Inez race, female, from 2 to 4 years, with 25 to 35 kg, clinically healthy. The sheep were anesthetized and was held to tenotomy infraespinal. For the injured tendon is not recover, a drain "Penrose" that was sutured to the final portion of the collected tendão. Take used muscle biopsies with 21, 35 and 65 days post-injury. The samples were processed by means of routine histopathology. The procedures of this work were reviewed and approved by the Commission on Bioethics. In samples of 21 days post-injury showed some few points between the issues adipocytes (perimysion) and few adipocytes between the muscle fibers (internal perimysium). With 35 days post-injury was observed in greater infiltration of adipocytes perimysion and internal perimysion, than with 21days. In samples of 65 days post-injury was observed a marked infiltration of fat and there was reduction in the size of muscle fibers and structural breakdown and formation of granulation tissue near the region where the drain was placed, giving infiltrate of mononuclear cells, proliferation connective tissue and neovascularization. This experimental model proved to be suitable for the study of fat infiltration of the muscle tissue of rotator cuff. Key words: fatty degeneration, skeletal muscle, experimental model, rotator cuff.

DEDICATÓRIA

À todos as pessoas que contribuíram para a minha formação, científica ou pessoal e que sempre acreditaram na palavra de um homem.

AGRADECIMENTO

Á Deus, que sempre guiou a minha vida e sempre mostrou-me isso ao longo da

minha caminhada.

Aos Meus Pais e Minhas Irmãs pelo amor, pela dedicação incansável, pelos

exemplos e por serem o meu combustível.

À Denise, simples assim!

Aos Meus Avós pelos exemplos e pelo amor e à Minha Mamãe Norma pelo

amor incondicional.

Aos Meus familiares (Tios e Primos) pelo apoio de sempre.

Aos Meus Pais, Irmãos e Avós paulistas que me acolheram e sempre me

ofertam um amor verdadeiro. Incondicional.

Ao Meu Professor Radovan Borojevic por ter me acolhido, ajudado, acreditado

em mim e por sempre me ensinar a ser Professor.

Ao Meu Professor Gildásio Daltro pela acolhida e pelos ensinamentos na

Ortopedia do Hospital Universitário Professor Edgard Santos.

À Minha Professora Maria Eugênia pelo carinho, atenção e incentivo.

Ao amigo Paulo Itamar Ferraz Lessa pela amizade e pelo incentivo.

À toda equipe do Laboratório de Histologia da UFRJ e à equipe de Medicina

Veterinária da UFF e em especial à Minha Professora Ana Maria Ferreira.

À equipe da Ortopedia e Traumatologia do HUPES pelos ensinamentos e pela

amizade.

À Minha Amiga Gorete (Laboratório da UFRJ) pelo carinho e atenção de

sempre.

Ao Meu Amigo Bruno Adelmo pela amizade, pelas risadas e pelo apoio na

informática.

À Daniela Heine pelo amor e amizade constantes.

Aos Meus alunos pela confiança e carinho devotados.

Aos Meus Amigos Marcelo Rios e Jaqueline pela amizade e confiança.

Ao Meus Amigos Fábio Luciano e Janice pela amizade e pelo incentivo.

Ao Meu C.R. do Flamengo pelo sorriso que sempre coloca no meu rosto e por

sempre me ensinar, seja nas vitórias, seja nas derrotas.

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA 11

2 REVISÃO DE LITERATURA 14 2.1 DESENVOLVIMENTO DO MÚSCULO ESQUELÉTICO 14 2.2 ESTRUTURA DO MÚSCULO ESQUELÉTICO 16 2.3 CARACTERÍSTICAS DO MÚSCULO ESQUELÉTICO ADULTO 18 2.4 CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DA REGENERAÇÃO DO TECIDO ESQUELÉTICO.

19

2.5 O MANGUITO ROTADOR E A INFILTRAÇÃO ADIPOSA 22

3 OBJETIVOS

25

3.1 OBJETIVO GERAL 25 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 25

4 MATERIAIS E MÉTODOS 26 4.1 ANIMAIS 26 4.2 PROCEDIMENTO CIRÚRGICO 26 4.2.1 PROCEDIMENTO PRÉ-ANESTÉSICO 26 4.2.2 INDUÇÃO ANESTÉSICA 26 4.3 CIRURGIA 26 4.4 COLETA E PROCESSAMENTO DO MATERIAL 27 4.5 ANÁLISE HISTOLÓGICA DA BIÓPSIA MUSCULAR 27 4.6 PROTOCOLO PARA A DETECÇÃO DOS CARBOIDRATOS REATIVOS COMA A LECTINA DA GRIFFONIA SIMPLICIFORA

28

4.7 HISTOMORFOMETRIA 29 4.8. ANÁLISE ESTATÍSTICA 29

5 RESULTADOS 30 4.1 ASPECTOS CLÍNICOS E MACROCÓPICOS 30 4.2 AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA 30

5 DISCUSSÃO 32

6 CONCLUSÕES 36

ANEXOS 37

REFERÊNCIAS 39

LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS ATP - Adenosia tri fostato BS-I - Lectina Griffonia simplicifora CK - Creatina quinase CCR2 - Receptor proteína DM - Dermomiotomo E - Ectoderma LP - Placa lateral MCP-1 - Monocyte chemotactic protein 1 MCK - Creatina quinase muscular MHC - Miosina de cadeia pesada MRF - Fator regulatorio miogenico MyoD - Proteína de regulação da diferenciação muscular Myf5 - Fator miogenico 5 MT - Miotomo NC - Notocorda NT - Tubo neural NCAM - Moléculas de adesão neuronal PAS - Ácido periódico reativo de Schiff SC - Esclerotomo

1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA

A degeneração e ruptura do tendão são causas freqüentes de incapacidade

funcional dolorosa no homem. A forma usual de tratamento consiste na

reparação cirúrgica e re-inserção dos tendões rompidos. Tanto a reparação

espontânea quanto o tratamento conservador com a cicatrização do tendão em

posição retraída freqüentemente levam a uma função não satisfatória devido à

retração músculo-tendinosa, atrofia e infiltração adiposa nos músculos

esqueléticos. O tecido adiposo pode, eventualmente, substituir a maioria das

fibras musculares no fascículo muscular (Goutallier et al, 1994). Após algumas

semanas, as alterações retrácteis se tornam irreversíveis (Matsumoto et al,

2002), representando a principal causa da perda de função permanente,

apesar do sucesso do ponto de vista técnico, no reparo do tendão (Goutallier et

al, 1995). A lesão muscular associada é hoje, considerada como um processo

degenerativo não específico (Tomanek & Cooper, 1972; Baker & Hall-Craggs,

1980; Bjorkenheim, 1989; Josza et al, 1990).

Experimentalmente já foi verificado que a liberação do tendão leva a

profundas alterações estruturais e funcionais no músculo esquelético

(Bjorkenheim, 1989). Os músculos se tornam atróficos, sendo que as fibras de

contração lenta (fibras do tipo I) são mais afetadas que as fibras de contração

rápida (tipo II). O tecido conjuntivo intramuscular aumenta enquanto que o

número de capilares diminui (Josza et al, 1990). O músculo esquelético encurta

e perde parcialmente sua capacidade de criar tensão (Crawford, 1977). Após

um tempo relativamente curto as alterações se tornam irreversíveis (Jozsa et

al, 1990).

Na prática médica são observadas alterações musculares semelhantes

após a lesão por ruptura dos tendões dos músculos do manguito rotador. A

atrofia muscular é freqüentemente pronunciada e parece depender do tamanho

da ruptura e do tempo pós-lesão (Nakagaki et al, 1996; Gerber et al, 2000).

Imagens obtidas por tomografia computadorizada e ressonância magnética

demonstram a progressiva infiltração ou substituição dos músculos do

manguito rotador pelo tecido adiposo, processo denominado de degeneração

adiposa muscular (Goutallier et al, 1989; Goutallier et al, 1994; Nakagaki et al,

1996; Fuchs et al, 1999). Estas alterações musculares têm uma grande

relevância clínica uma vez que a degeneração adiposa pode predizer a

possibilidade de reparação das rupturas do tendão do manguito rotador

(Thomazeau et al, 1997; Goutallier et al, 1999) e influenciar de forma

substancial o prognóstico da reparação do manguito rotador (Goutallier et al,

1999; Pfirrmann et al, 1999; Gerber et al, 2000) ou da artroplastia total do

ombro (Edwards et al, 2002). A recuperação parcial da lesão pode ocorrer

quando há presença de atrofia muscular (Thomazeau et al, 1997; Gerber et al,

2000). Por outro lado, quando há presença de degeneração adiposa, a lesão

no ombro humano parece ser irreversível (Goutallier et al, 1999; Gerber et al.

2000). Além disso, a degeneração gordurosa muscular pode aumentar após a

reparação mesmo quando se obtém a reparação do tendão para o osso

(Gerber et al, 2000).

A degeneração gordurosa no músculo esquelético é observada em uma

variedade de doenças neuromusculares incluindo a distrofia muscular de

Duchene (Goutallier et al, 1994), miopatia mitocondrial (Goutallier et al, 1995),

miopatia nemalínica (Matsumoto et al, 2002), e esclerose lateral amiotrófica

(Baker e Hall-Craggs, 1980), em lesões tóxicas musculares (Bjorkenheim,

1989), lesão isquêmica (Tomanek e Cooper, 1972) e após denervação (Josza

et al, 1990; Crawford, 1977).

A degeneração gordurosa tem como conseqüência importante a perda da

função muscular e de amplitude de movimento, ocasionando uma mudança

funcional e estrutural nos músculos esqueléticos(Goutallier et al, 1995).

Baseado nestas informações e sabendo-se que a atrofia muscular e o infiltrado

de células de gordura são importantes fatores prognósticos é necessário o

entendimento dos mecanismos celulares e moleculares que disparam e

mantém a degeneração adiposa no músculo esquelético durante a reparação

da lesão tendinosa.

Na última década, as terapias celulares abriram novas perspectivas em

tratamento de doenças degenerativas. O aporte de células progenitoras

mostrou-se capaz de restaurar a estrutura e função dos tecidos atrofiados ou

degenerados, inclusive de músculo esquelético (Decary,1997). No caso da

atrofia e degeneração gordurosa a questão de terapia celular permanece

aberta. O aporte de novas células pode promover a regeneração do músculo,

mas pode também trazer novos progenitores de células adiposas. A

diferenciação adiposa é a via de diferenciação espontânea defaut de células-

tronco mesenquimais, quer fazem parte de maioria dos protocolos de terapias

celulares de tecidos de origem mesodérmica. O aporte desse tipo de

progenitores pode, portanto, tornar-se deletério na terapia de degeneração

associada com hipertrofia de tecido adiposo ectópico.

Com objetivo de esclarecer a possibilidade de uma nova proposta de

terapias para a degeneração gordurosa do músculo, estamos propondo um

estudo da lesão muscular provocada pela ruptura do tendão do músculo infra-

espinhal em ovelhas para futuramente propor protocolos de terapia celular

visando a reversão deste processo de degeneração.

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Desenvolvimento do músculo esquelético

Todos os músculos esqueléticos, exceto os músculos da cabeça são

derivados de células precursoras mesodérmicas que se originam nos somitos.

Durante o desenvolvimento embrionário a especificação das células

precursoras mesodérmicas para a linhagem miogênica é regulada por sinais

positivos e negativos originários dos tecidos circunjacentes (FIGURA 1A)

A especificação para a linhagem miogênica requer um aumento da

expressão de MyoD e Myf5, ativadores transcripcionais da família do fator

regulatório miogênico (MRF). Células miogênicas proliferativas positivas para

MyoD e/ou Myf5 são denominadas mioblastos. A partir do momento em que

elas saem do ciclo celular se tornam miócitos terminalmente diferenciadas que

expressam as MRFs tardias, a miogenina e a MRF4 e subseqüentemente os

genes músculo-específicos tais como a miosina de cadeia pesada (MHC) e a

creatina quinase muscular (MCK) (FIGURA 1B).

FIGURA 1A. Sinalização e eventos celulares na formação do músculo

esquelético embrionário. Células mesodérmicas dos somitos localizadas na

porção dorsal do somito (dermomiotomo – DM) recebem sinais dos tecidos

circunjacentes que induzem Wnts, sonic hedgehog (Shh) e Noggin ou inibem

(BMP 4) a expressão de MRFs primárias (Myf 5 e MyoD) e o comprometimento

para a linhagem miogênica. Mioblastos comprometidos migram lateralmente e

formam o miótomo (MT), o qual, eventualmente forma a musculatura

esquelética. Pax 3 promove a miogênese no miótomo lateral. . E, ectoderma;

LP, placa lateral; SC, esclerotomo; NC, notocorda; NT, tubo neural. (Retirado

de Chargé & Rudnicki, 2004).

FIGURA 1B. A expressão de Pax 3 nas células precursoras contribui para a

expansão das células miogênicas. Após a indução de Myf5 e/ou MyoD, as

células mesodérmicas do somito são comprometidas para a linhagem

miogênica (mioblastos). Posteriormente a upregulation de MRFs secundárias

(miogenica e MRF4) induz a diferenciação terminal de mioblastos para

miócitos. Finalmente a fusão de miócitos dá origem a miofibras multinucleadas

(retirado de Chargé & Rudnicki, 2004).

Por fim, os miócitos mononucleados se fundem formando um sincício

multinucleado o qual eventualmente se torna uma fibra muscular madura

contráctil (FIGURA 1B). Durante o desenvolvimento muscular uma

subpopulação de mioblastos não se diferencia permanecendo associada à

superfície das miofibras em desenvolvimento como células musculares

satélites, quiescentes (FIGURA 1B). Após a maturidade sexual o músculo

esquelético se torna um tecido estável caracterizado pela presença de fibras

musculares pós-mitóticas multinucleadas (Revisto por Chargé & Rudnicki,

2004)

2.2 Estrutura do Músculo esquelético

O tecido muscular é constituído por células alongadas, que contem

grande quantidade de filamentos citoplasmáticos de proteínas contráteis

geradoras de forças necessárias para a contração desse tecido utilizando a

energia contida nas moléculas de ATP. A célula muscular tem origem no

mesoderma e sua diferenciação ocorre pela síntese de proteínas filamentosas

concomitante com o alongamento das células. De acordo com as

características morfológicas e funcionais, distinguem-se três tipos de tecido

muscular; o músculo estriado esquelético, o músculo estriado cardíaco e o

músculo liso (Junqueira. 2004).

O músculo esquelético tem sido objeto de estudo em pesquisas nos

variados campos do conhecimento. O tecido muscular é capaz de exercer um

trabalho dinâmico, que permite a movimentação articular e um trabalho estático

que permite a estabilização articular (McComas, 1996). Afecções de diversas

origens podem acometer a musculatura e vem despertando um crescente

interesse por sua organização estrutural e funcional.

O músculo estriado esquelético é formado por feixes de células

cilíndricas muito longas e multinucleadas que apresentam estriações

transversais. Essas células ou fibras têm contração rápida e vigorosa e estão

sujeitas ao controle voluntário. Alguns componentes das células musculares

receberam nomes especiais como: sarcolema (membrana celular),

sarcoplasma (citossol) e o retículo sarcoplásmatico (retículo endoplasmático

liso) (Junqueira, 2004).

No músculo-esquelético os numerosos núcleos se localizam na periferia

das fibras, nas proximidades do sarcolema, fato este que ajuda a distinguir este

do músculo cardíaco, já que ambos possuem estriações transversais, porém no

músculo cardíaco os núcleos são centrais. As fibras musculares estão

organizadas em grupos de feixes envolvidos por uma camada de tecido

conjuntivo chamada epimísio que recobre o músculo inteiro. Do epimísio

partem finos septos de tecido conjuntivo que se dirigem para o interior do

músculo separando os feixes, com estes septos constituindo o perimísio

envolvendo os feixes de fibras. Cada fibra muscular, individualmente, é

envolvida pelo endomísio que é formado pela lâmina basal da fibra muscular,

associada às fibras reticulares. O endomísio apresenta escassa população

celular constituída por algumas células do conjuntivo, principalmente

fibroblastos (Junqueira, 2004). A unidade estrutural contrátil do músculo

esquelético é a fibra muscular esquelética ou miônio, célula cilíndrica - com 1 a

30 cm de comprimento e diâmetro de 10 a 100 µm - em que os vários núcleos

se dispõem em posição subsarcolêmica e com numerosas miofibrilas no

citoplasma (McComas, 1996).

Um segundo tipo celular da linhagem miogênica é a célula satélite,

mononucleada, sem miofibrilas, que se apóia na membrana basal do miônio.

Essas células persistem na fase G0 do ciclo celular, mas, em resposta a

determinados estímulos, podem entrar no ciclo mitótico, proliferar e se fundir ao

miônio. Desse modo, contribuem para o crescimento, reparo e hipertrofia pós-

natal do músculo-esquelético. Quando em mitose, as células satélites

expressam, temporariamente, moléculas específicas como os fatores de

transcrição da família MyoD, as isoformas da cadeia pesada da miosina e a

desmina (proteína de filamento intermediário), tanto in vitro quanto in vivo.

O MyoD é um membro da família de proteínas cuja expressão ectópica

pode induzir células não-miogênicas a se submeterem à diferenciação

miogênica. A família MyoD compreende MyoD, miogenina e Myf-5. Todas

possuem um domínio protéico conservado, o motivo bHLH e podem ativar a

expressão de genes musculares específicos. Cada membro da família pode

regular um estágio diferente do desenvolvimento muscular. Myf-5 e MyoD

parecem agir no estágio inicial da diferenciação dos mioblastos e a miogenina

no estágio mais tardio do mesmo (Koishi et al, 1994; Fuchtbauer et al, 1992).

As células satélites também expressam as moléculas de adesão NCAM

e M-caderina, no estado quiescente. A M-caderina está presente em células

satélites de músculos normais, desnervados ou em regeneração (Kuschel et

al., 1999). Os miônios apresentam no citoplasma miofibrilas cilíndricas de 1 a 2

µm de diâmetro que, freqüentemente, são tão longas quanto à própria célula

muscular. Estas miofibrilas consistem de pequenas unidades contráteis

repetidas, em série – sarcômeros - cada um com comprimento de 2,2 µm, que

conferem à miofibrila esquelética sua aparência estriada (Alberts et al., 2004).

Cada sarcômero é formado por filamentos finos e espessos. Os primeiros são

compostos de actina e proteínas associadas, sendo ligados por uma de suas

extremidades à linha Z, em cada extremidade do sarcômero. As extremidades

livres dos filamentos finos se estendem em direção ao centro do sarcômero,

onde se sobrepõem aos filamentos espessos. Estes, por sua vez, são

formados a partir de isoformas de miosina II específicas de músculo (Alberts et

al., 2004). As proteínas do disco Z estão em troca dinâmica com um pool

citoplasmático – incluindo até mesmo as proteínas previamente caracterizadas

como componentes estruturais estáticos do disco Z, como a -actinina e a

miotilina (LANGE et al., 2006).

2.3 Características do Músculo Esquelético Adulto

As fibras musculares são circundadas individualmente por tecido

conjuntivo e agrupadas em feixes que formam o músculo esquelético. São

altamente vascularizados para prover os nutrientes essenciais para a função

muscular. A fibra muscular madura está em contato com um neurônio motor

único e expressa moléculas características para a contração muscular,

principalmente as isoformas de miosina de cadeia pesada e enzimas

metabólicas. A especificação para as propriedades contráteis do músculo

esquelético é dada tanto pelo neurônio motor quanto a origem do mioblasto

muito embora os mecanismos precisos ainda não estejam clarificados

(Wigmore & Evans, 2002). Os músculos esqueléticos adultos são compostos

por uma mistura de miofibras com diferentes propriedades fisiológicas, desde

um tipo de contração lenta, resistente à fadiga a um tipo de contração rápida,

não resistente à fadiga. A proporção de cada tipo de fibra dentro do músculo

determina sua capacidade contrátil global. Apesar destas diferenças

fisiológicas, o mecanismo básico da contração muscular é semelhante em

todas as miofibras e é o resultado do mecanismo de escorregamento dos

filamentos espessos ricos em miosina sobre os filamentos finos ricos em

actina, após ativação neuronal (Huxley, 2000). A rede de tecido conjuntivo no

músculo esquelético transforma as contrações das miofibras em uma unidade

funcional onde a contração das miofibras é transformada em movimento via as

junções miotendíneas nas extremidades onde as miofibras se ligam ao

esqueleto através dos tendões. Portanto, as propriedades funcionais do

músculo esquelético dependem da manutenção de uma rede complexa de

miofibras, neurônios motores, vasos sanguíneos e matriz extracelular.

2.4 Características morfológicas da regeneração do tecido esquelético.

O músculo esquelético de adulto é um tecido estável com baixo turnover

(Decary et al, 1997; Schmalbruch & Lewis, 2000). Lesões pouco extensas

suscitam somente um baixo turnover muscular. Estima-se que no músculo

esquelético adulto de rato não mais que 1 – 2% das células sejam substituídas

cada semana (Schmalbruch & Lewis, 2000). Entretanto, o músculo esquelético

de mamíferos tem uma capacidade rápida e extensa de resposta frente a uma

lesão grave.

Quando ocorre uma lesão muscular causada por trauma direto (como

uma atividade física extensa e mais especificamente um treino de resistência)

ou por defeitos inatos genéticos, a regeneração muscular é caracterizada por

duas fases: uma fase degenerativa e uma fase regenerativa. O evento inicial da

degeneração muscular é a necrose das células musculares. Este evento é

geralmente iniciado pela ruptura do sarcolema da miofibra resultando em

permeabilidade da miofibra. A ruptura da integridade da miofibra é indicada

pelo aumento dos níveis séricos das proteínas musculares tais como a creatina

quinase - CK que usualmente está restrita ao citosol da miofibra. Em humanos

e em modelos animais, o aumento sérico de CK também é observado em

doenças musculares degenerativas como nas distrofias musculares. A ruptura

da integridade da membrana sarcolemal resulta em aumento do influxo de

cálcio resultando em perda da homeostasia de cálcio e aumento da proteólise

dependente do aumento do influxo deste íon (Belcastro et al, 1997; Alderton &

Steinhardt, 2000). Implica-se as calpaínas, que são proteases ativadas pelo

cálcio, capazes de clivar as proteínas miofibrilares e do citoesqueleto, no

processo inicial de degeneração miofibrilar (Belcastro et al, 1997).

A fase inicial da lesão muscular está geralmente acompanhada pelo

recrutamento de células inflamatórias e miogênicas. Fatores liberados pelo

músculo lesado ativam as células inflamatórias residentes no músculo que

liberam sinais quimiotáticos para a circulação. Granulócitos neutrófilos são as

células que inicialmente invadem o músculo lesado, sendo vistas nas primeiras

6 horas após a lesão. Após 48 horas, os macrófagos se tornam as células

predominantes no infiltrado inflamatório (Tidball, 1995). Além de seu papel na

degradação da área lesada e fagocitose dos debris celulares tem sido

verificado seu importante papel na regulação dos eventos essenciais na

regeneração do músculo esquelético (Lescaudron et al, 1999; Merly et al,

1999). Diferentes subpopulações macrofágicas estão presentes tanto no

músculo lesado quanto no músculo em regeneração de ratos (McLENNAN,

1996). Tanto a proteína MCP-1 e seu receptor CCR2 estão expressas no

músculo esquelético lesado (Summan et al, 2006; Warren et al, 2004). Além

disso, a imunoexpressão de CCR2 foi vista em macrófagos e em células

precursoras musculares miogenina-positivas (Warren et al, 2005). O papel do

eixo MCP-1 – CCR2 na regeneração muscular foi evidenciado utilizando

animais nocautes para CCR2. Os animais nocautes apresentaram defeito na

regeneração muscular com aumento da adipogênese e fibrose intramuscular

(Warren et al, 2004).

A degeneração muscular é seguida de ativação do processo

regenerativo. A reparação e a manutenção do sincício são feitas por um pool

de células miogênicas precursoras, indiferenciadas, denominadas células

satélites que se localizam abaixo da lamina basal que circunda a miofibra.

Durante o desenvolvimento pós-natal, as células satélites se dividem para

formar novos núcleos para as fibras musculares em crescimento (Moss and

Leblond, 1971), antes de se tornarem quiescentes enquanto as miofibras se

tornam maduras (Schultz et al, 1978). Entretanto as células satélites retém sua

capacidade de proliferar e se diferenciar em resposta a necessidades para o

turnover do núcleo e hipertrofia da miofibra (Snow, 1977,1978; Bischoff, 1986;

Schmalbruch & Lewis, 2000).

A ativação e proliferação das células satélites é provavelmente a

responsável pela enorme capacidade e eficiência de regeneração do músculo

esquelético lesado, com geração de grande número de novos miotubos nos

primeiros 3 dias após uma lesão aguda grave (Whalen et al, 1990). A taxa e

grau deste reparo é enorme considerando-se a escassez de células satélites

associadas com cada miofibra implicando em uma rápida ativação e expansão

dos precursores para a restauração da fibra muscular (Zammit et al, 2002).

A ativação das células satélites ou, seja, sua passagem do estado

quiescente para as etapas subseqüentes ao longo da linhagem miogênica

miogênese é controlada por vários fatores de transcrição, principalmente os

fatores regulatórios miogênicos (MRFs), o Myf5,MyoD, miogenina, and MRF4

(revisto por Zammit & Beauchamp, 2001). Os fatores Myf5 and MyoD

determinam a linhagem miogênica (Rudnicki et al, 1993; Tajbakhsh et al, 1996)

enquanto que a miogenina é essencial para a diferenciação muscular (Hasty et

al., 1993). No músculo adulto, o locus do Myf5 está ativo nas células satélites

quiescentes com Myo D aparecendo durante a ativação e a miogenina assim

que se inicia a diferenciação muscular (Fuchtbauer & Westphal, 1992;

Grounds et al, 1992; Yablonka-Reuveni & Rivera, 1994; Cooper et al, 1999;

Beauchamp et al, 2000).

Histologicamente, as fibras neoformadas são reconhecidas em cortes

longitudinais e em fibras isoladas como fibras contendo núcleos centrais

presentes por vezes ao longo de toda a extensão da fibra regenerada, o que

sugere que a fusão celular não ocorre de forma difusa durante a regeneração

mas, de forma focal no sítio da lesão (Blaveri et al, 1999). As fibras

neoformadas são geralmente basofílicas o que reflete a alta taxa de síntese

protéica e expressam formas embrionárias de miosina de cadeia pesada (Hall-

Craggs & Seyan, 1975; Whalen et al, 1990). Quando a fusão miocitária se

completa, as novas miofibras formadas aumentam em tamanho e o núcleo se

move para a periferia da fibra muscular.

2.5 O Manguito Rotador e a Infiltração Adiposa

O manguito rotador consiste de quatro músculos: o subescapular, o

supraespinal, o infraespinal e o redondo menor. Todos eles se originam na

escápula e inserem-se nas tuberosidades da cabeça umeral que possui três

funções essenciais: estabilidade, mobilidade e nutrição da articulação gleno-

umeral. Os músculos do manguito rotador terminam em tendões largos e

achatados, contínuos com a cápsula articular para formar o manguito

músculotendíneo. O músculo subescapular origina-se da porção anterior da

escápula e insere-se na pequena tuberosidade. O supraespinal origina-se na

fossa supra-espinhal, passa sob o acrômio e insere-se no topo da grande

tuberosidade. Já o infraespinal origina-se na fossa infra-espinhal e insere-se na

grande tuberosidade, atrás do músculo supraespinal e o redondo menor

origina-se da porção látero-inferior da escápula e insere-se na porção posterior

da grande tuberosidade (Sobotta, 2000)

A anatomia vascular do manguito rotador constitui um dos fatores

etiológicos do desenvolvimento das lesões do manguito, com o supraespinal

recebendo sua irrigação sanguínea da massa muscular. A chamada “área

crítica de Codman”, localizada próxima à inserção do supraespinal, é o local

onde a patologia degenerativa do manguito se inicia. Esta área é

hipovascularizada, pois se encontra continuamente comprimida entre o acrômio

e a grande tuberosidade. Sabe-se ainda que há mais abundância de vasos

sanguíneos na porção superior do que na porção inferior. A patogênese das

lesões do manguito rotador é muito controversa tendo no trauma, atrito

(degeneração), hipovascularização e impacto subacromial são os fatores mais

frequentemente citados (Sizinio, 2003).

Charles Neer (1972) descreveu as três fases evolutivas da síndrome

compressiva do manguito rotador. Na fase I ocorrem edema e hemorragias

reversíveis e tem relação direta com o uso excessivo do membro superior. A

fase II é marcada por fibrose e tendinite do manguito rotador e ocorrem de

maneira crônica e intermitente. Já na fase III ocorre a ruptura completa do

manguito com alterações ósseas, cistos subcondrais e formação de osteófitos.

A ruptura dos tendões dos músculos do ombro pode ser responsável pela

degeneração muscular e esta é caracterizada pela infiltração de células

gordurosas no tecido muscular, fato este já confirmado por estudos histológicos

(Goutallier et al, 1994). A infiltração gordurosa e a atrofia são consideradas

como sendo conseqüentes do desuso e da degeneração ou denervação do

músculo, sendo que essa última depende da espessura do tendão e do tempo

ocorrido após a lesão, ainda que a degeneração não tenha relação com o

envelhecimento, somente ocorrendo com o músculo lesionado (Ryan et al.

2002). Ocorre um aumento da densidade do tecido conjuntivo intramuscular e

uma diminuição do número de capilares e os músculos encurtados e

parcialmente lesados perdem a capacidade de desenvolver tensão. Após um

período relativamente curto, estas mudanças tornam-se irreversíveis,

ocasionando uma mudança funcional e estrutural nos músculos esqueléticos

(Gerber et al, 2004).

A degeneração do músculo supra-espinal é global, porém geralmente

leve já a do infra-espinal é global e se mais de meio tendão estiver

despedaçado, pode ser muito severa (Goutallier et al, 1994). O subescapular

também pode ser acometido de forma severa, mas envolve somente a parte do

músculo que está com o tendão rompido e o infra-espinal pode estar com

degeneração se existir uma ruptura larga e ântero-superior envolvendo o

supra-espinal e o subescapular (Goutallier et al, 1994; Gerber et al, 2004;

Meyer et al, 2005). A degeneração gordurosa é um importante fator de

prognóstico para as cirurgias do manguito rotador. Esta é progressiva com o

tempo e é acompanhada por uma debilidade da função muscular, embora

diminua após o reparo, sendo um fator que prediz a reparabilidade do tendão e

influencia substancialmente no resultado clínico da intervenção cirúrgica

(Goutallier et al, 1994; Gerber et al, 2004; Meyer et al, 2005).

3. OBJETIVOS

3.1 Geral

Desenvolver e caracterizar um modelo de lesão muscular em ovelhas pela

ruptura do tendão do músculo infra-espinal que se assemelhe à lesão do

manguito rotator.

3.2 Específicos

3.2.1. Descrever as alterações degenerativas e reparadoras no músculo infra-

espinhal após 21, 35 e 60 dias da ruptura do tendão provocada

experimentalmente.

3.2.2. Quantificar, através de estudo morfométrico, a densidade volumétrica da

infiltração / degeneração gordurosa no músculo infra-espinhal após 35 e 60

dias da ruptura do tendão provocada experimentalmente.

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Animais

Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com as

recomendações éticas e legais especificadas para a experimentação animal do

Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (1991).

Vários estudos experimentais tem demonstrado que os ombros das ovelhas

são modelos adequados para o estudo de desordens do manguito rotador em

humanos. Com base nessas informações foram selecionadas oito ovelhas

fêmeas, jovens, com idade entre 18 e 24 meses e com pesos entre 20 e 30 kg.

4.2 Procedimento cirúrgico

4.2.1 Procedimento pré-anestésico

Foram administrados, por via intravenosa, 0,1 mg/kg de Maleato de

Acepromazina 0,2% (Acepromazina, Syntec) e 0,2 mg/kg de Midazolam

(Induson, Cellofarm Farmacêutica). Além disso, foi administrado 0,4 mg/kg de

morfina, injetada via intramuscular.

4.2.2 Indução anestésica

Para a indução anestésica foram injetados por via intravenosa, 5 mg/kg

de Cloridrato de Cetamina 10% (Cetamin, Syntec) e 0,1 mg/kg de Midazolam

(Induson, Cellofarm Farmacêutica). Para manutenção da narcose anestésica

foi administrado por via inalatória Isoflurano (Isoforine, Cristália).

4.3 Cirurgia

Todos os procedimentos foram realizados em campo cirúrgico estéril, no

Hospital Veterinário da Universidade Federal Fluminense, segundo a técnica

descrita por Gerber e colaboradores (2004). Foi realizada uma incisão

cirúrgica curva, de 15 cm, na região posterolateral da articulação do ombro

direito. A incisão foi aprofundada e a origem acromial do músculo deltóide foi

identificada. O músculo foi elevado na sua porção cranial para a exposição da

inserção tendinosa do músculo infra-espinhal e sua inserção na porção

proximal do úmero. O tendão infra-espinhoso foi liberado de sua inserção da

unidade músculotendínea, na porção proximal do úmero, de forma a mimetizar

uma lesão crônica do manguito rotador. O ombro contralateral serviu como

controle. Relatos prévios mostraram que os tendões do infraespinal das

ovelhas se reparam espontaneamente após uma tenotomia. Para impedir esse

reparo espontâneo, a extremidade do tendão foi coberta com um tubo de

silicone de 5 cm (tubo de dreno de silicone com diâmetro de 12 milímetros,

instrumento médico da Fortuna, Taipei, Formosa) que foi fechada com sutura

na extremidade distal, técnica descrita por Gerber e colaboradores (2004).

4.4 Coleta e processamento do material

Foi realizada a dissecação e biopsias dos músculos infraespinhais, nos

tempos pós-cirúrgicos de 21, 35 e 60 dias, com cerca de 0,5 cm por 0,5 cm,

sendo fixadas imediatamente após a retirada cirúrgica em formaldeído 10%

tamponado. O material foi posteriormente submetido à técnica de rotina para

inclusão em parafina. Resumidamente, os fragmentos foram submetidos à

desidratação em soluções crescentes de álcool etílico, clarificados em xileno e

embebidos em parafina. Cortes de 3 µm de espessura foram obtidos em

micrótomo rotatório e corados com hematoxilina-eosina (técnica histológica

para estudo topográfico), tricrômico de Masson, PAS (ácido periódico-reativo

de Schiff) e Picro-Sirius para colágeno.

4.5 Análise histológica da biópsia muscular:

A organização geral de tecidos foi avaliada assim como as alterações

distróficas (degeneração / regeneração) existentes no tecido. Foi utilizada uma

escala histológica de 4 pontos, modificada de Hack e colaboradores (1999),

considerando-se o percentual da secção histológica apresentando os seguintes

parâmetros: fibrose, infiltração adiposa e degeneração e inflamação.

0 – nenhuma alteração;

1 – 5 -10% da superfície apresentando lesão;

2 - >10–25% da superfície apresentando lesão;

3 - > 25% - 50% da superfície apresentando lesão;

4 - > 50% da superfície apresentando lesão.

4.6 Protocolo para a detecção dos carboidratos reativos coma a lectina da

Griffonia simplicifora

A lectina Griffonia simplicifora (BS-I) se liga especificamente a resíduos

galactosil, cora o endotélio vascular de várias espécies animais inclusive o de

rato (Alroy et al, 1987). Portanto, utilizamos a lectina Griffonia simplicifora

biotinilada (B-1105, Vector Laboratories, USA) para a detecção do endotélio,

sendo utilizada para a quantificação dos capilares.

Em resumo, os cortes histológicos foram desparafinados e hidratados,

seguindo-se então a inibição da peroxidase endógena em solução de H2O2 a

3% em metanol por 15 minutos, lavagem em tampão fosfato salina (PBS) pH

7,4 após o bloqueio das ligações inespecíficas com solução de PBS-BSA 5%.

Os cortes histológicos foram então incubados com a lectina biotinilada na

diluição de 1: 100, em solução tampão contendo sais de metais (Kiernan,

1990), por 16 horas, na geladeira, em câmara úmida. Posteriormente, as

lâminas foram submetidas a lavagens com solução de PBS e incubadas com a

estreptavidina conjugada à peroxidase (Sigma, USA) na diluição de 1:50, em

PBS. Para a visualização da peroxidase foi utilizado o substrato cromógeno

DAB (Liquid DAB, DAKOCYTOMATON), seguindo-se lavagens com PBS e

água destilada, e contracoloração pela hematoxilina.

4.7 Histomorfometria

O estudo morfométrico foi realizado através de um sistema de captura

de imagens, constituído de câmara fotográfica digital EVOLUTION (Media

Cybernetics, USA) acoplada a microscópio de luz E 500 NIKON (Japan) e a um

computador contendo o programa de análise de imagens MAGEPRO–PLUS

5.0 (Media Cybernetics, USA). Imagens digitalizadas de alta qualidade (2048 x

1536 pixels buffer) obtidas das lâminas coradas pela HE e Griffonia simplicifora

utilizando a lente objetiva de 20x foram utilizadas para a quantificação da

densidade capilar (número de secções transversais de capilares / µm2).

4.8. Análise estatística

Todos os dados foram submetidos a análise estatística com auxílio do

programa Microsoft Excel® e SigmaStat®.

Os resultados da análise histomorfométrica dos grupos foram expressos

sob a forma de média ± desvio padrão. Na comparação de mais que duas

médias em uma única variável categórica independente (fator), aplicou-se o

teste de Análise de Variância (ANOVA) e o pós-teste Student-Newman-Keuls.

Um p<0,05 foi considerado como significativo.

5. RESULTADOS

5.1 Aspectos clínicos e macroscópicos

Os animais apresentaram–se após o procedimento cirúrgico

aparentemente bem, levantando-se imediatamente e andando. Nas

observações realizadas 21, 35 e 60 dias pós-lesão os animais apenas

apresentaram no galope uma claudicação leve, com redução da fase de apoio

na marcha, embora as patas dianteiras dos ovinos sejam de utilização para

propulsão.

No procedimento da biópsia aos 60 dias, foi feita uma incisão também

no local onde foi realizada a incisão do tendão. Foi observado que

macroscopicamente o tendão parecia ter se regenerado, apresentando aspecto

semelhante ao tendão original, apesar da presença de um tubo protetor que foi

envolvido pelo tecido conjuntivo.

5.2 Análise Histopatológica

O músculo infra-espinhal dos animais com 21 dias de lesão exibiu uma

organização relativamente pouco distorcida, com feixes musculares paralelos.

Algumas fibras estavam degeneradas (Escore=2, Anexo A), células em

regeneração caracterizadas pela presença de núcleos centrais enfileirados

(Escore=1, Anexo A) e processo inflamatório do tipo mononuclear com raros

granulócitos polimorfonucleares (Escore 3, Anexo A). Notava-se presença de

muito raras e pequenas células adiposas em meio às fibras musculares

fasciculares (Escore=1, Anexo A) e em maior numero no espaço interfascicular

(Escore=1, Anexo A). Todos os adipócitos, incluindo os menores no início da

diferenciação, eram tipicamente uniloculares. Nos espaços interfasciculares os

focos nascentes eram associados aos vasos sanguíneos de pequeno e médio

calibre, com rico tecido adventicial. Os pequenos adipócitos eram

freqüentemente próximos ao lado abluminal dos vasos. Com diferenciação

plena e aumento do volume do lóculo gorduroso, formavam-se cachos

preenchendo os espaços interfasciculares adjacentes. O infiltrado inflamatório

não era mais pronunciado nos focos interfasciculares de adipogênese, sendo

freqüentemente mais intenso nas interfaces interfasciculares ao longo dos

perimísios.

Após 35 dias de lesão notou-se a presença ainda de algumas células

degeneradas (Escore=2, Anexo A), raras células em regeneração (Escore=0,

menos de 5% da superfície examinada, Anexo A) e inflamação constituída por

células mononucleares presentes tanto em regiões inter- quanto

intrafasciculares (Escore=2, Anexo A). Infiltração gordurosa também foi vista

nas duas regiões, sendo mais abundantes em região interfascicular (Escore=2,

Anexo A). Ela se tornou dissecante, separando totalmente os feixes

musculares pela infiltração contínua ao longo dos perimísios.

Progressivamente, grupos de adipócitos invadiam também os feixes

musculares, separando os grupos cada vez menores. Deposição de fibras

colágenas foi vista em torno de células adiposas em áreas interfasciculares

(Escore=1, Anexo A) e entre fibras musculares (Escore=1, Anexo A; Figuras 1,

Anexo B).

Após 60 dias verificamos raras células degeneradas (Escore=1),

diminuição da inflamação em relação ao ponto 21 e 35 (Escore=1) e aumento

da infiltração gordurosa, tanto entre as fibras musculares, dentro do fascículo

muscular (Escore=2), quanto nas regiões interfasciculares (Escore=2). Fibras

colágenas também se mostraram mais abundantes dentro dos fascículos

musculares, em menor quantidade em regiões interfasciculares (Anexo B,

figuras 1-8).

6. DISCUSSÃO

Este estudo foi feito com objetivo de caracterizar descritivamente, do

ponto de vista histológico, as mudanças estruturais que ocorrem no músculo

esquelético após a desinserção da unidade músculo-tendínea do manguito

rotador de ovelhas. Nesta situação cria-se a inatividade do manguito rotador. O

protocolo cirúrgico utilizado para a desinserção do manguito rotador das

ovelhas foi o de Gerber e colaboradores (2004). A vantagem deste protocolo,

onde o tendão liberado é colocado e fixado dentro de um tubo de silicone, é a

criação de um modelo de lesão onde há o aparecimento de alterações no

músculo esquelético, devido a inatividade muscular, como a degeneração

adiposa e a atrofia muscular (Eccles, 1948; Björkenheim, 1989; Josza et al

1990), sem evidências de reparação muscular espontânea (Gerber et al, 2004).

Foi verificado que, a ruptura tendínea induzida, do músculo supraespinal de

coelhos seguida da inserção de uma membrana de polivinilidina (Durapore 7

SVLP, Millipore), para prevenir a reinserção espontânea, de forma semelhante

ao do tubo de silicone, ocasionou uma atrofia muscular, infiltração adiposa e

retardo da regeneração muscular (Matsumoto et al, 2002). Em humanos, o

retardo do tratamento cirúrgico também agrava as lesões no músculo, tanto a

infiltração adiposa quanto a atrofia muscular, sendo que após o reparo cirúrgico

com a re-inserção do tendão não levou a melhora do quadro nem reversão das

lesões (Nakagaki et al, 1996; Matsumoto et al, 2002; Gladstone et al, 2007),

aspecto também visto em coelhos (Rubino et al, 2007).

É bem conhecido que a desinserção do tendão leva a retração músculo-

tendínea provocando mudanças estruturais e arquiteturais profundas no

músculo esquelético (Hans et al, 2003; Meyer et al, 2004). O músculo sofre

atrofia sendo que as fibras lentas do tipo I são mais afetadas que as rápidas do

tipo II (Josza et al, 1990) e perda do volume muscular (Matsumoto et al, 2002;

Gerber et al, 2004; Meyer et al, 2004). Ocorre um encurtamento da fibra

muscular provavelmente devido a diminuição dos sarcômeros (Baker & Hall-

Craggs, 1978) e infiltração adiposa substancial nos espaços criados pela

modificação arquitetural muscular, porém sem evidências de um processo

degenerativo da unidade músculo-tendínea (Meyer et al, 2004). O tecido

adiposo e também o tecido fibroso invadem o músculo. Alguns autores

consideram que este processo visa preencher o espaço criado pela atrofia

muscular (Uhthoff et al, 2003). Há tanto uma infiltração adiposa intrafascicular

quanto extrafascicular (Matsumoto et al, 2002; Gerber et al, 2004), muito

embora o mecanismo que inicia o processo da infiltração adiposa ainda não

seja esclarecido. A implantação de estruturas tubulares, independente do tipo

de material, dentro do tecido muscular, provoca o aparecimento de lipoblastos

no tecido de granulação formado (Xaymardan et al, 2002).

No presente estudo, não pudemos realizar um estudo morfométrico

comparativo no sentido de inferirmos uma diminuição da área das fibras

musculares (atrofia) e/ou aumento da área de tecido adiposo. Por esta razão foi

realizado um estudo semi-quantitativo com a utilização de escores para

determinados parâmetros morfológicos. Diversos estudos em patologia

muscular tem utilizado este tipo de análise semi-quantitativa (Hack et al, 1999;

Fanin et al, 2007). Verificamos que tanto após 35 dias quanto 60 dias da

realização da desinserção tendínea há mínima evidencia de um processo

regenerativo dentro do músculo, o que corrobora o modelo proposto por Gerber

e colaboradores (2004). Além disso, pudemos evidenciar tanto o acúmulo de

tecido adiposo intrafascicular e interfascicular assim como aumento do tecido

conjuntivo extrafascicular e intrafascicular semelhante ao já descrito em

coelhos e em ovelhas (Björkenheim et al, 1989; Gerber et al, 2004; Meyer et al,

2004; Rubino et al, 2007; Coleman et al, 2008). Além disso, pudemos verificar

que o processo angiogênico já se encontra em fase de remodelamento, tendo

sido possível demonstrar a diminuição do número de capilares no tempo 60

dias. O uso da lectina GS permitiu evidenciar a célula endotelial, permitindo

desta forma, aferir o número de capilares existentes no músculo.

Gerber e colaboradores (2004) detectaram em exames de ressonância

magnética (RNM) que nem todas as partes do supra-espinal sofrem o mesmo

grau de atrofia. Nas atrofias conseqüentes a lesões nervosas, o infiltrado de

tecido gorduroso ocorre nas áreas desnervadas e nas atrofias por lesões

completas do tendão, o acúmulo de tecido adiposo é mais homogênea. A parte

mais superficial do músculo que se origina da fáscia reage diferentemente à

lesão e à retração do tendão do que a parte profunda que se origina da

escapula. A parte mais próxima à fáscia contribui mais para a atrofia muscular

do que a parte próxima à inserção muscular que por sua vez sofre mais com o

infiltrado de tecido gorduroso.

A origem dos adipócitos presentes no músculo em regeneração ainda

não é conhecida. Há evidências de que elas possam ser derivadas de células

precursoras mesenquimais presentes no tecido muscular. No tecido adiposo

subcutâneo, células estromais vasculares do tecido muscular podem ser a

fonte dos pré-adipócitos, que geram novos adipócitos. O processo semelhante

pode ocorrer na degeneração gordurosa intramuscular (Hausman &

Eichardson, 1998; Hausman & Poulos, 2005).

Sabe-se atualmente que os pericitos perivasculares têm características

pluripotenciais e estão presentes em todos os tecido adultos inclusive no tecido

muscular (Diaz-Flores et al, 1991; 1992; Brighton et al, 1992; Doherty et al,

1998; Shi & Gronthos, 2003; Brachvogel et al, 2005; Meirelles et al, 2007). Seu

potencial adipogênico, em cultura, já foi demonstrado (Farrington-Rock et al,

2004). Outra possibilidade para a origem dos adipócitos na lesão é a partir da

célula satélite muscular. Ela é uma célula multipotencial, capaz de exibir

diferenciação miogênica, osteogênica e adipogênica (Asakura et al, 2001) e

que, as condições de hiperóxia, também pode ser induzida em linhagem

adipogênica (Csete et al, 2001). Finalmente, o infiltrado inflamatório

mononuclear pode conter os progenitores pluripotentes de origem medular, que

são mobilizados da medula óssea para os tecidos em processo de inflamação

e regeneração, assim como monócitos que podem conter uma subpopulação

com características de progenitores pluripotentes (Zhao et al. 2003).

As vias de indução ectópica da diferenciação adipocítica no músculo em

degeneração não são conhecidas. A sinalização via MCP1 e seu receptor

CCR2 está expressa no músculo esquelético lesado (Summan et al, 2006;

Warren et al, 2004). A mesma via é responsável da mobilização de macrófagos

em tecido adiposo na síndrome metabólica e diabete (Kanda et al, 2006). A

mobilização de macrófagos e o intenso infiltrado mononuclear no interior de

feixes musculares representam aparentemente uma resposta à mesma

sinalização, que simultaneamente atrai e ativa a linhagem mono-macrofágica.

Em conseqüência da ativação, os macrófagos secretam grande quantidade de

TNFα cujo alvo, entre outros, é a via de sinalização do PPARγ Este gene é o

gene-master de diferenciação de pré-adipócitos em adipócitos, e a sua

ativação pode ser suficiente para converter os progenitores mesenquimais

perivasculares em adipócitos. Semelhante ao tecido adiposo em diabete, os

adipócitos ectópicos podem por sua vez ativar a mesma sinalização, gerando

um circulo auto-sustentado de hipertrofia adiposa. Este quadro se reflete na

dificuldade de reversão da atrofia muscular gordurosa, mesmo depois do

restabelecimento da ligação teno-muscular e solução da sua causa inicial.

As hipóteses citadas devem ser verificadas em estudos futuros, assim

como a viabilidade da proposta de uma terapia celular, que poderia, por vias

parácrinas, reverter o quadro de hipertrofia de adipócitos. Alternativamente, o

aporte de novos progenitores mesenquimais poderá aumentar a diferenciação

de novos adipócitos, e este perigo deve ser adequadamente avaliado.

7. CONCLUSÕES

O modelo de lesão muscular em ovelhas pela ruptura do tendão do

músculo infra-espinal que se assemelhe à lesão do manguito rotator se

mostrou representativo das lesões degenerativas e atrofia gordurosa de

músculo em humanos.

A infiltração progressiva de adipócitos envolveu seqüencialmente

perimísio e endomísio, com evidências morfológicas de atrofia das fibras

musculares em estágios avançado.

O início de diferenciação adipocítica envolveu as regiões perivasculares,

sugerindo a origem de novos adipócitos a partir de pericitos perivasculares.

Os achados sugerem cautela em propostas de terapia celular que

contemple a introdução de células mesenquimais nas regiões em degeneração

gordurosa, pois elas podem exacerbar a proliferação e diferenciação de

progenitores adipocíticos in situ.

FIGURA 1A. Animal após 21 dias de lesão. Microfotografia exibindo feixes musculares separados por células adiposas (seta) e infiltrado inflamatório ( ponta de seta ). Coloração: HE. Aumento original: 100X

FIGURA 1B. Animal após 21 dias de lesão. Microfotografia exibindo espaço interfascicular com infiltração adiposa (seta). Em meio ao fascículo muscular, fibras musculares em degeneração circundadas por infiltrado inflamatório (ponta de seta). Coloração: HE. Aumento original: 200X.

FIGURA 1C. Animal após 21 dias de lesão. Microfotografia exibindo detalhe do infiltrado inflamatório em meio as fibras musculares esqueléticas (seta). Coloração: HE. Aumento original: 400X

FIGURA 1D. Animal após 21 dias de lesão. Microfotografia exibindo fascículos musculares corados intensamente pelo PAS. Nota-se entre fibras musculares presença de células adiposas (seta). Aumento original: 100X

FIGURA 2A. Animal após 35 dias de lesão. Microfotografia exibindo fascículos musculares separados por tecido adiposo ( ∗ ). Coloração: HE. Aumento original: 100X

FIGURA 2B. Animal após 35 dias de lesão. Microfotografia exibindo fascículos musculares separados por tecido adiposo e raros adipócitos presentes em meio ao fascículo muscular. Coloração: HE. Aumento original: 200X.

FIGURA 2C. Animal após 35 dias de lesão. Microfotografia exibindo fascículos musculares em corte transversal, tendo em área, em torno de célula em degeneração, infiltrado inflamatório mononuclear (seta). Coloração: HE. Aumento original: 400X.

FIGURA 2D. Animal após 35 dias de lesão. Microfotografia exibindo fascículos musculares em corte longitudinal. Nota-se em uma fibra muscular núcleos enfileirados, centrais, indicativo de célula em regeneração (seta). Coloração: HE. Aumento original: 400X

FIGURA 3A. Animal após 35 dias de lesão. Microfotografia exibindo fascículos musculares separados por tecido adiposo ( ∗∗∗∗ ) e fibras musculares heterogêneas em relação ao conteúdo de glicogênio ( seta ). PAS. Aumento original: 100X

FIGURA 3B. Animal após 35 dias de lesão. Microfotografia exibindo fascículos musculares separados por tecido adiposo e fibras musculares com ausência quase total de glicogênio (seta). PAS. Aumento original: 100X.

FIGURA 3C. Animal após 35 dias de lesão. Microfotografia exibindo fascículos musculares em corte longitudinal exibindo traves fibrosas entre os fascículos musculares (seta). Picro-Sirius. Aumento original: 100X.

FIGURA 3D. Animal após 35 dias de lesão. Microfotografia exibindo fascículos musculares em corte longitudinal. Traves fibrosas interfasciculares e mínima deposição de colágeno intrafascicular demonstradas pelo Picro-Sirius. Aumento original: 200X

FIGURA 4A. Animal após 60 dias de lesão. Microfotografia exibindo fascículos musculares separados por tecido adiposo ( ∗ ). Coloração: HE. Aumento original: 100X

FIGURA 4B. Animal após 60 dias de lesão. Microfotografia exibindo fascículos musculares separados por tecido adiposo e adipócitos presentes em meio ao fascículo muscular. Coloração: HE. Aumento original: 200X.

FIGURA 4C. Animal após 60 dias de lesão. Microfotografia exibindo fascículos musculares em corte transversal, tendo em área, em torno de célula em degeneração, infiltrado inflamatório mononuclear (seta). Coloração: HE. Aumento original: 400X.

FIGURA 4D. Animal após 60 dias de lesão. Microfotografia exibindo fascículos musculares em corte longitudinal com alguns adipócitos intrafasciculares ( ∗ ). Nota-se em uma fibra muscular núcleos enfileirados, centrais, indicativo de célula em regeneração (seta). Coloração: HE. Aumento original: 400X

FIGURA 5A. Animal após 60 dias de lesão. Microfotografia exibindo fascículos musculares separados por tecido adiposo ( ∗∗∗∗ ) e fibras musculares com ausência quase completa do conteúdo de glicogênio (seta). Coloração: PAS. Aumento original: 100X

FIGURA 5B. Animal após 60 dias de lesão. Microfotografia exibindo fascículos musculares separados por tecido adiposo e fibras musculares com ausência total de glicogênio (seta). Coloração: PAS. Aumento original: 200X.

FIGURA 5C. Animal após 60 dias de lesão. Microfotografia exibindo fascículos musculares em corte longitudinal exibindo intensa degeneração adiposa e traves fibrosas entre os fascículos musculares (seta). Coloração: Picro-Sirius. Aumento original: 100X.

FIGURA 5D. Animal após 35 dias de lesão. Microfotografia exibindo fascículos musculares em corte longitudinal. Traves fibrosas interfasciculares e mínima deposição de colágeno intrafascicular demonstradas pelo Picro-Sirius. Aumento original: 200X

FIGURA 6A. Animal após 35 dias de lesão. Microfotografia exibindo vasos capilares corados pela Griffonia simplicifora isolectina I (GS-I) biotinilada e revelada pela estreptavidina-peroxidase, utilizando a diaminobenzidina como substrato cromógeno. Contracoloração: hematoxilina. Aumento original: 100X.

FIGURA 6B. Animal após 60 dias de lesão. Microfotografia exibindo a reatividade da lectina (GS-I) em vasos. Reação histoquímica para lectina. Contracoloração: hematoxilina Aumento original: 100X.

10

20

30

*

***

*

***

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FIGURA 6C. Representação gráfica da densidade capilar no músculo esquelético de ovelhas após a desinserção do tendão do músculo infraespinhal. Houve diferença significativa da densidade vascular no músculo infraespinhal animais. Dados representados pela média e desvio padrão da densidade capilar após 35 e 60 dias da lesão. ∗∗∗ ; ∗ : grupos diferentes entre si, com significância estatística (p<0,05).

FIGURA 7A. Animal após 21 dias de lesão. Microfotografia exibindo fascículo muscular tendo no espaço interfascicular algumas células adiposas, algumas delas em íntimo contacto com a parede da vênula (seta). Coloração: HE. Aumento original: 400X.

FIGURA 7B. Animal após 21 dias de lesão. Microfotografia exibindo o mesmo aspecto anterior. Coloração: HE. Aumento original: 400X.

FIGURA 7C. Animal após 21 dias de lesão. Microfotografia exibindo infiltração adiposa em espaço interfascicular. Notar a parede venular em contato com adipócitos (seta). Coloração: HE. Aumento original: 400X.

FIGURA 7D. Animal após 60 dias de lesão. Microfotografia exibindo espaço inerfascicular com infiltração adiposa e células inflamatórias (seta). Coloração: HE. Aumento original: 200X

FIGURA 8A. Animal após 35 dias de lesão. Microfotografia de corte histológica de músculo infra-espinhal lesado corado pela técnica imunohistoquímica para a detecção da isoforma alfa de músculo liso revelada pela técnica da avidina-biotina-peroxidase. A cor marrom da diaminobenzidina identifica a actina alfa de músculo liso existente em pericitos, em torno de capilares (seta). Notar a íntima relação da parede capilar com o adipócito. Aumento original: 400X.

FIGURA 8B e 8C. Animal após 35 dias de lesão. Microfotografia de músculo infra-espinhal lesado corado pela técnica imunohistoquímica para a detecção da isoforma alfa de músculo liso revelada pela técnica da avidina-biotina-peroxidase. A cor marrom da diaminobenzidina identifica a actina alfa de músculo liso existente em pericitos, em torno de capilares (seta). Células adiposas presentes em íntima relação com a parede de capilares e/ou vasos de pequeno calibre. Aumento original: 400X.

FIGURA 8D. Animal após 35 dias de lesão. Microfotografia de tecido muscular lesado corado para a detecção da isoforma alfa de músculo liso e revelada pela técnica da avidina-biotina-peroxidase. Reatividade para pericitos e camada muscular de vasos evidente no espaço interfascicular (seta). Células adiposas presentes em íntima relação com a parede de capilares e/ou vasos de pequeno calibre. Aumento original: 200X.

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