유전체 분석 기술 동향 이승배

Ⅰ. PCR 기술 분석

Ⅱ. DNA Chip 기술 분석

Ⅲ. NGS 기술 분석

Ⅳ. PCR vs. DNA Chip vs. NGS

Ⅴ. Clinical & R&D 적용 비교

목 차

Ⅰ. PCR(Polymerase Chain Reaction) : 중합효소 연쇄반응 1. 기술 개요

Primer

Cycling

중합효소 Polymerase

Cycling

N-Cycling

증폭 량 변화를 통해 특정 유전자 존재 유/무 및 발현 량 정도 등으로 진단 함. 주요 적용 분야:

① 알려진 병균/질환 감염,발병여부.

② 알려진 유전자

변이유무 파악.

③ 알려진 암유전자 발현(증식)량 분석.

④ 과학수사,친자 확인 등에도 사용.

검 체 핵산 추출 핵산 정제/역 전사 핵산 연쇄 증폭 결과 분석

검 체(혈액,소변 ,객담 ,모발 등)로부터 인체/병원체의 핵산을 원심 분리기와 핵산추출기로 추출하는 과정.

원심분리기

핵산추출기

• 고순도 핵산 정제. -노폐물 제거 • RNA 경우,1역전사 통해 cDNA생성

PCR 증폭 장비

구성 내용 시 약 PCR 장비

종 류

핵산(DNA,RNA) 추출/정제 위한 시약. Primer(시발 체) 설계/제작이 포함된 시약. 형광 Probe 설계/제작(qPCR용)이 포함된 시약. Reverse Transcription(역 전사), 중합 효소가 포함된 시약.

RT-PCR : 정성분석, 발현 유무만 파악) RT-qPCR(Real-time): 정량 분석,정확한 발현 량을 수치 파악

핵심 기술 요소

장비보다는 시약분야가 높은 부가가치가 예상됨 -장비 중요한 기능은 가열과 형광 이미지 분석하는 부분으로 Vendor간의 성능차이는 크지 않음. -시약의 경우, 매 진단 시마다 많이소비되며 성능에 따라 진단의 정확성에 큰 영향을 끼침. 정확히 설계된 Primer가 포함된 시약일 경우, 민감도가 높아, sample의 상태가 좋지 않아도 역전사 결과가 양호함. 정확히 설계된 Probe가 포함된 시약일 경우, Target유전자 구간만 선별적 형광물질이 발광하여 정교한 분석/진단이 가능함.

임상 진단용으로는 RT-qPCR(형광 Probe)방식이 주류를 이룰 것으로 전망.

빠른 진단(체취~진단:수일 내)과 저렴한 비용으로 알려진 유전자의 진단 분야에서 지속적인 수요가 예상됨.

형광Probe

1 Cycle

DNA변성

95℃가열

55℃ 냉각

각각 한 가닥 DNA로 해리

Extension

(dNTP)

72℃

Primer /Probe

,1역 전사(Reverse Transcription) : 전사 체(mRNA)는 단일 가닥(single strand)구조로 불안정하여, 역 전사 효소를 통해 인공적으로 DNA로 바꿔주는 작업(생성물: cDNA)

Ⅱ. DNA Chip (Microarray) 1. 기술 개요

분석 과정

Chip 개발 과정

유전자 DB

유전자DB內

Target 검색 후,

Probe Pair 설계

Probe 고착된 wafer와

케이스(cartridge) 조립.

Probe 붙은 Wafer

Wafer

Mask 설계

빈(void) DNA Chip

Probe Pair(탐침 유전자 쌍)를 Mask통해 Wafer에 고착.

> Perfect / Mismatch Probe 쌍으로 되어 있음.

> One color Label

Photolithography 과정

Affymetrix(Genechip) Closed된 개발 과정 Client 개

발

가능 부문

검체->핵산추출->

Labeling(Biotin시약)과정

Hybridization 과정

Probe와 샘플DNA간의

상보적 결합.

Scanning image Data Analysis

샘플 DNA와 Probe의 결합 정도에 따라

①질환 유전자② 돌연변이③ 약물대사

영향유전자 유/무나 정도를 분석 함.

Scanning 과정

Scanner를 통해 샘플DNA와 상보적결합된

Probe의 형광물질을 Scanning.

Probe

Sample DNA

Perfect match와 Mismatch

검체 핵산 추출/정제

(DNA or RNA)

Labeling

(Biotin 시약)

Illumina(Bead Chip)

Agilent Nimblegen(Roche)

2. 기본 정보

핵심 기술 요소

Exclusive DB축척 -> 정교한 Probe개발 가능 -> 진단 범위와 정확성 ↑

▶Exclusive DB: 외부에 공개되지 않은 질환-치료제 관련 변이 유전자 DB

▶정교한 Probe : 보다 rare한 변이를 많이 탐침 할 수 있는 비 공개된 Probe

Exclusive한 DB와 Probe 개발 역량 정 의

Microarray라고도 불리며, Wafer(슬라이드글라스)나

Bead(구형태 물질) 위에 탐침 유전자(Probe)를

고밀도로 집적시킨 Chip.

Labeling된 분석 대상 핵산(DNA/RNA)과 Probe를

Hybridization(혼성화)시키고 반응을 분석하는 기법.

Oligo nucleotide Chip

- 20~80개의 짧은 Oligo nucleotide Probe 사용.

- 정확한 서열(Probe)을 알기에 고민감도 분석가능.

- PCR 및 Cloning 필요 없음. 최근 대표적인 주류.

cDNA chip.

- 상대적으로 긴 cDNA(mRNA 역 전사 산물)를 Probe로 사용. (300개~500개 이상 염기) PCR / Cloning 필요. - 발현 차이 분석은 용이하나 작은 염기 변이에 대한 분석(SNP)등에는 적합하지 않음.

종류

기본 정보

분석 역량

정확한 Normalization 능력. Normalization이란 분석 결과 편차를 보정해서 표

준화하는 작업으로 분석결과의 신뢰도에 영향이 있음.

숙련된 Sample preparation 역량. (정교한 핵산추출/Quality Control)

숙련된 Scanner/분석 Tool사용 역량과 경험.

주요 분류 특징 응용 분야

Expression Profiling Chip

유전자 발현 패턴에 근거한 진단 (m RNA)

주로 Cancer의 ①Precise classification. ② Outcome Prediction, ③ Drug Responsibility

Genotyping Chip

Genotyping에 근거한 진단 (DNA)

① Pharmacogenomics ② Genetic Diseases, ③ Pathogen detection/Typing

DNA Chip 주요 분류/응용 분야

제조사 Technology

Affymetrix Synthesized probes(Probe합성) One channel(biotin)

Agilent Inkjet on glas slide One/two channel(형광물질)

Illumina Bead type(작은 구에 Probe 고착) One channel(형광물질)

Nimblegen (roche)

Synthesized Probes One channel(형광물질)

Ⅱ. DNA Chip (Microarray)

Sample Preparation과정

① 핵산 추출/정제 ② DNA Library 제작 (DNA에 1Primer 부착) ③ 증폭

NGS 과정

① Lib와 4가지 형광 색 2dNTP간 결합 ② 카메라 촬영> 이미지 파일 ③ 이미지 분석> 염기문자 변형

Bioinformatics 과정

① 염기문자파일 upload ② 기본 데이터 분석 Pipe-line : 매핑/정렬/Filtering변이 ③ 고도화 분석 (변이DB,통계/확

률 Algorithm 적용) ④ 분석 결과 보고서

1Primer: Template DNA마다 Sequencing 시작 부분을 표시해 주기 위한 작은 염기 가닥으로 정확한 설계가 중요함. 2dNTP(deoxy-Nucleoside-Tri Phosphate): DNA가 합성될때 최소 단위 뉴클레오티드로 dATP, dCTP, dGTP, dTTP 4가지 있음. 3Flowcell: Library가 고정된 NGS용 Pannel. 시퀀싱 외부에서 샘플 준비 후 시퀀싱 장비로 이 판(flowcell)을 삽입 시킴.

Ⅲ. NGS(Next Generation Sequencing) 1. 기술 개요

산출물 문자파일 CTAACC TGGGCT TCATCC GCTAAT CCGCT CCTACC

증폭기

Library 제작 시약

핵산추출, 정제기

산출물 3Flow-cell위에 증폭된 DNA Library

고도화 분석(통계)

외부 통계 DB 변이DB

질병DB

….

진단 / 확률

알고리즘

매핑

정렬

분 류

기본데이터 분석Pipe-line

분석 결과 보고서

2. 기본 정보

핵심 기술 요소

Probe/Primer 설계 능력에 따라 정확도 달라짐. (G.C Contents rate, Coverage depth의 정확한 계산)

☞ 역량에 따라 Sequencing/Data analysis 재 시도, 추가 시약 사용 원인이 됨.

Sample Preparation

역량

Ⅲ. NGS(Next Generation Sequencing)

정 의

‘massively parallel’ sequencing 불림.

in-vitro 방식 대량 증폭방식을 사용.

높은 정확성 (PCR, DNA Chip 대비)

High throughput과 짧은 run time

Multiplexing Capability Sequencing 기술.

종류

기본 정보

분석 Pipeline

최적화 역량

기본 분석 Pipe-line의 최적화된 조합 중요 : 각 과정간 다양한 Tool 中, 최적화된 조합으로 pipeline하는 것이 성능,분석 결과 신뢰도에 영향.

고도화 분석 pipeline모듈 수준이 분석 결과 영향 大 : 외부 변이,약물 DB와 연관 분석을 위한 pipeline설

계 및 구축 역량이 진단 결과의 신뢰도와 직결됨.

주요 분류 응용 분야

Clinical Application

NIPT. 동반진단: 암환자 유전자 변이와 항암치료제 반응 분석

R&D

De novo sequencing. Novel mutations 유전자 발굴/분석. 동/식물 유전자 분석 연구. (품종 등)

주요 분류/응용 분야

Whole Genome Sequencing:

전체 게놈 서열 분석으로 새로운 생물에 대한 서열 발굴,

Genetic map, GWAS, DNA Marker 발굴로 주로 사용.

Whole Transcriptome Sequencing:

전체 전사 체 서열분석으로 질병유전자 발현 분석,

치료제 반응 분석에 사용.

Whole Exome Sequencing

암,유전질환 변이 유전자 분석 및 진단용에 사용.

ChIP Sequencing

전사인자 이상으로 인한 유전자 발현이상 분석에 사용.

Small RNA Sequencing

간섭유전자(siRNA/miRNA) 발굴/항암 치료제 개발 사용

Bisulfite sequencing

유전자의 Methylation 분석에 따른 암 진단에 쓰임.

Target Sequencing은 별도기법 아니고 Probe에 의해

특정 region만 capturing해서 sequencing 하는 기법.

실험 전체 계획의 완성도 중요

– 전 공정 계획(workflow) 수립.

– 적합한 sample 수량. – 적합한 시약 선택. – 적합한 Sequencer 선택.

실험계획 및 환경 구성

Ⅲ. NGS(Next Generation Sequencing) 3. NGS 요소와 COST 상관 관계

▣ Coverage:

유전자의 특정 영역에 대한 overlapping된 염기 서열(read).

Sample Preparation 과정 중, Library 제작 과정에서부터

각의 Library가 전/후로 overlapping 되도록 설계/제작함.

▣ Coverage depth:

Overlapping정도(높이)를 나타내는 것을 depth.

구간 평균 depth가 높을 수록 sequencing의 정확도 ↑

▣ Coverage depth와 Sequencing 정확도와 연관 관계:

Overlapping정도(depth)가 높을 수록 중첩 구간의 서열 분석이 반복됨으로 써, missing되거나 인식되는 오류 률 감소.

사례마다 상이하나 정확성을 위해 통상 30X( 30 Depth ) 이상으로 진행하며, Clinical application의 경우 1000X 경우 있음.

G C T C A G G C T C G C T C A G G C T C

표준 전체 염기 서열(Reference Read )

G C T C

A G G C T

C T C A G

G C T C A

G C T C

A G G C T

C T C A G

C G C T

A G

Genome 특정 구간의 Mapping된 Coverage 염기서열들(reads)

Depth

▣ Coverage depth와 Sequencing Cost와 연관 관계:

Depth를 높게 설계하려면 Library preparation 과정의 adaptor나 primer에 대한 설계 시부터 고려해서 적용 함.

중첩된 동일한 구간이 많을 수록, Library 수량 증가, 시약 증가, Sequencing running 증가로 이어져 결국 비용 증가 함.

▣ BGI Health 사례:

NGS 기반 NIPT 서비스를 제공하는 BGI Health에서는 서비스 비용이 RMB 약 2,600(USD 428) 이다. 이는 미국 업체 가격

(USD 700~1,500 이상)대비 상당히 낮은 비용으로써 Coverage depth를 매우 낮게 함으로 써 조절했음.

Test 정확도의 보정을 Bioinformatics 고도화 분석에서 보완하였으나, 정확도의 risk는 존재 함.

G C

Ⅳ. PCR vs. DNA Chip vs. NGS RT-qPCR DNA Chip NGS

민감도 Sensitivity

보통 높음 가장 높음

샘플 처리 비용 Sample Prep Cost

적음. (관련시약 개발이 open되어 있

고, 다수 회사 제품 有)

높음 (labeling 시약, Probe kit에 대한 소수 기업 제품 사용(고가, closed 환경))

가장 높음 (소수 Global 기업용 시약(kit)용만 사용해야 함(고가, closed 환경))

장비 운용 비용 Scanning Cost

낮음 높음 가장 높음

데이터분석 비용 Data analysis

Cost

낮음

높음

가장 높음

처리소요시간 Turn around Time

1~2일 3~4일 10일 내외

주요 적용 분야

알려진 병균/질환 감염 발병

여부.

알려진 유전자 변이 파악.

알려진 암유전자 발현 량 분석.

과학수사,친자확인 등 사용

주로 Cancer의

Precise classification.

Outcome Prediction.

Drug Responsibility.

Pharmacogenomics.

Genetic Diseases.

Pathogen detection/Typing.

NIPT, 동반진단:

De novo 유전자 서열 분석.

Novel mutations 유전자 발굴 / 분석

동/식물 유전자 분석.

Ⅳ. PCR vs. DNA Chip vs. NGS

구분 세부 기종 WGS WTS WES Chip-seq

Methylation Genotyping

/GWAS DTC

Companion Diagnosis

NIPT Mendelian Disorder

Pharmacogenomics

Pathogen detection/

Typing

PCR

Rt pcr

Rt-qpcr

DNA chip

Affymetrix

Illumina

Agilent

Nimblegen

NGS

Hiseq

Myseq

454

ion-torrent

지원 불가 일부 지원가능 지원 가능

WGS : Whole Genome Sequencing

WTS: Whole Transcriptome Sequencing, RNA-Seq

WES: Whole Exome Sequencing

Ⅴ. Clinical & R&D 적용 비교

NGS 기술이 유전체 분석 연구분야에서 활용이 가장 높음.

NGS의 장점은 광범위한 유전체 분석과 Novel 변이발굴이

가능하며, 높은 민감도 분석이 가능함.

DNA Chip은 비교적 높은 민감도와 Multiplexing한 처리가

가능하다는 장점이 있으나, Novel 변이 발굴과 민감도 수준이

NGS에 미치지 못하여 연구분야 활용도가 NGS에 비해 뒤처짐.

PCR은 짧은 처리시간이란 장점은 있으나, Novel 변이발굴이나

민감도가 낮아 유전체 분석 연구 분야 활용도가 낮음.

기 알려진 유전체 대상으로 유/무나 발현 정도를 통해 진단을

하는 Clinical 분야에서는 PCR이 빠른처리 시간, 저비용 ,유전자

존재 유/무, 발현 정도가 쉽게 분석 가능해 가장 높은 활용도 임.

DNA Chip은 빠른 처리시간, 다중 유전자 분석 가능, 저 비용과

PCR 대비 높은 민감도이나 활용도 부문에서 PCR에 뒤처짐.

NGS는 아직까지 시약/장비 구동의 고 비용, 산출된 대량 Data

analysis 비용과 처리시간으로 인해 NIPT나 동반 진단 분야

외에는 활용도가 높지 않음.

NGS Cost가 많이 down될 경우, 활용도의 급격한 증가가 전망됨.

활용도

High

Now

Clinical

Low

Time

NGS

DNA Chip

PCR

Now

R&D 활용도

High

Low

NGS

DNA Chip

PCR

Time

기술 분류 방법

aCGH*: array Comparative Genomic Hybridization, ChIP/LA*: Chromatin Immuno Precipitation / Location Analysis

Appendix DNA CHIP 기술 분류

Hybridization 방식에 따라

One Channel

Two Channel

Affymetrix-GeneChip Illumina-BeadChip Nimblegene- Agilient-SurePrint(2008년 ~)

Array에 1개 Sample만 Probe와 반응시키는 방식

Probe 종류에 따라

cDNA형

OligoNuecleotide

Target 종류에 따라

RNA

DNA

Affymetrix-GeneChip Illumina-BeadChip Agilent-SurePrint Nimblegene-

최초 Stanford 발명 제품. Agilent (2005년 전/후)

제작 기법에 따라

Photolisography

Bead linked Lib

Agilent - SurePrint illumina Affymetrix Nimblegene

Illumina-Beadchip Agilent-SurePrint Nimblegene-

Array에 2개 Sample(Reference와 Target)을 Probe에 경쟁적으로 반응시키는 방식

Array에 고착시킨 Probe를 PCR에서 mRNA를 역 전사 시킨 cDNA로 제작. 길이:

Array에 고착시킨 Probe를 인공적으로 합성한 올리고 DNA. 길이: (20~60mers)

Agilent - SurePrint

①Gene expression, ②Splicing, ③Variants, ④miRNA application

①aCGH* , ②SNP, ③ChIP/LA* application.

Mask에 따른 차별적인 빛 투과 기법으로 Probe를 고착하는 방식

Bead(구형)에 Probe를 고착하는 방식

Agilent - SurePrint illumina – Beadchip Affymetrix- Genechip Nimblegene

Ink Jet Printing 잉크젯 프린트 방식으로 Probe 고착

Affymetrix-GeneChip Nimblegen-

Illumina-BeadChip

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