analiza etarskog ulja korena biljne vrste artemisia ... · (rubottom) oksidacija, kiselo...
TRANSCRIPT
Univerzitet u Nišu
Prirodno-matematički fakultet
Departman za hemiju
Analiza etarskog ulja korena biljne vrste Artemisia
absinthium L.
Master rad
Mentor: Kandidat:
Prof. dr Niko S. Radulović Sunčica A. Veljković
Niš, 2018. god.
Eksperimentalni deo ovog master rada rađen je u Laboratoriji za organsku
analizu i sintezu (Departman za hemiju, Prirodno-matematički fakultet,
Univerzitet u Nišu), kao i u laboratorijama Departmana za hemiju, Univerziteta
u Britanskoj Kolumbiji.
Zahvaljujem se svom mentoru dr Niku Raduloviću na odvojenom vremenu,
sugestijama i ukazanoj pomoći prilikom izrade ovog master rada. Veliku
zahvalnost dugujem i dr Polini Blagojević na odvojenom vremenu, sugestijama
i velikoj pomoći pri izradi ovog master rada. Takođe se zahvaljujem članicama
komisije dr Mariji Genčič i dr Danijeli Kostić na korisnim sugestijama, kao i
svim istraživačima iz Laboratorije za organsku analizu i sintezu na sugestijama
prilikom izrade ovog rada.
Zahvaljujem se i svojim prijateljima koji su bili uz mene i bodrili me.
Na kraju, najveću zahvalnost dugujem svojim roditeljima, na podršci prilikom
studiranja i svemu što su učinili za mene, bratu Radomiru koji je uvek bio uz
mene i učinio da postanem ono što jesam, i svom partneru Vladanu, koji je imao
razumevanja i podržavao me u mojim odlukama. Hvala vam!
Skraćenice
Nomenklatura
CH3 ili Me Metil-grupa
CH2 Metilenska grupa
OCOR Estarska funkcionalna grupa
R Alkil-grupa
Reagensi i rastvarači
CDCl3 Deuterohloroform
CH2Cl2 Dihlormetan
DCC N,N’-Dicikloheksilkarbodiimid
DCU N,N’-Dicikloheksilurea
DMAP 4-(Dimetilamino)piridin
Et2O Dietil-etar
EtOAc Etil-acetat
EtOH Etanol
DIBAH Diizobutilaluminijum-hidrid
PPTS Piridinijum p-toluensulfonat
py Piridin
TMSCl Trimetilsilil-hlorid
mCPBA meta-hlorperbenzoeva kiselina
HF Fluorovodonična kiselina
THF Tetrahidrofuran
Instrumenti i metode razdvajanja
1D Jednodimenzionalni
2D Dvodimenzionalni
1H NMR Protonic Nuclear Magnetic Resonance (protonska
nuklearna magnetna rezonanca)
13C NMR C-13 Nuclear Magnetic Resonance (nuklearna
magnetna rezonanca ugljenika 13C)
δ Hemijsko pomeranje u NMR spektrima
bs Broad singlet (široki singlet)
COSY Correlation Spectroscopy
d Dublet
dd Dublet dubleta
ddd Dublet dubleta dubleta
ddt Dublet dubleta tripleta
FID Free Induction Decay (raspad slobodne indukcije)
GC/MS Gas Chromatography/Mass Spectrometry (gasna
hromatografija sa masenom detekcijom) gDQCOSY Gradient-enhanced Double Quantum Filtered
Correlation Spectroscopy gHMQC Gradient-enhanced Heteronuclear Multiple-bond
Correlation Spectroscopy HMBC Heteronuclear Multiple-bond Correlation Spectroscopy
HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence
J Konstanta kuplovanja
m Multiplet
NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy
pdq Pseudo doublet of quartets (pseudo dublet kvarteta)
ptt Pseudo triplet tripleta
q Quartet (kvartet)
qq Quartet of quartets (kvartet kvarteta)
RI Retention Index (retencioni indeks)
Rt Retention Time (retenciono vreme)
s Singlet
t Triplet
td Triplet dubleta
tdd Triplet dubleta dubleta
TIC Total Ion Current (ukupna jonska struja)
TLC (HTC) Thin Layer Chromatography (tankoslojna
hromatografija)
TMS Tetrametilsilan
UV UltraViolet (Ultraljubičasto)
Ostalo
°C Celzijusov stepen
aq. Aqueous solution (vodeni rastvor)
eq. equivalent (ekvivalent)
g Gram
h Čas
Hz Herc
mg Miligram
MHz Megaherc
min Minut
mL Mililitar
mmol Milimol
ppm Parts per milion (milioniti deo)
R, S stereodeskriptori
r.t. (s.t.) sobna temperatura
v/v zapremina po zapremini
Sadržaj
1 UVOD ................................................................................................................................ 8
2 OPŠTI DEO ..................................................................................................................... 12
2.1 Analiza etarskih ulja .................................................................................................. 13
2.2 Sinteza sastojaka etarskih ulja ................................................................................... 19
2.3 Biljna vrsta Artemisia absinthium L. ........................................................................ 23
2.3.1 Etarsko ulje korena vrste A. absinthium ............................................................ 24
3 EKSPERIMENTALNI DEO ........................................................................................... 27
3.1 Hemikalije ................................................................................................................. 28
3.2 Biljni materijal........................................................................................................... 28
3.3 Izolovanje etarskog ulja ............................................................................................ 28
3.4 Metode analize .......................................................................................................... 29
3.4.1 Gasna hromatografija-masena spektrometrija (GC/MS) ................................... 29
3.4.2 Nuklearno-magnetna rezonantna (NMR) spektroskopija .................................. 29
3.4.3 Hromatografija na koloni ................................................................................... 30
3.4.4 Hromatografija na tankom sloju (HTS) ............................................................. 30
3.5 Sinteza diestra lavanduladiola ................................................................................... 31
3.5.1 Sinteza silil-enol-etra karvona (i1)..................................................................... 31
3.5.2 Oksidacija silil-enol-etra karvona: dobivanje smeše dijastereomernih 3-
trimetilsililoksikarvona (i2a i i2b) ......................................................................................... 31
3.5.3 (5S,6S)- i (5S,6R)-6-Hidroksi-5-izopropenil-2-metil-2-cikloheksenon (i3a i i3b)
............................................................................................................................ 32
3.5.4 (1S,2R,6S)- i (1S,2S,6S)-6-Izopropenil-3-metil-3-cikloheksen-1,2-diol (i4a i i4b)
............................................................................................................................ 32
3.5.5 (2E,5S)-2-Metil-5-(prop-1-en-2-il)heks-2-endial (i5)........................................ 33
3.5.6 (2E,5S)-2-Metil-5-(prop-1-en-2-il)heks-2-en-1,6-diol (i6) ................................ 33
3.5.7 Sinteza (2E,5S)-2-Metil-5-(prop-1-en-2-il)heks-2-en-1,6-diil-diizovalerata ..... 34
4 REZULTATI I DISKUSIJA ............................................................................................ 35
4.1 Rezultati GC/MS analize uzorka etarskog ulja dobivenog iz korena vrste A.
absinthium ............................................................................................................................ 36
4.2 Nepoznata jedinjenja u uzorku etarskog ulja dobivenog iz korena biljne vrste A.
absinthium ............................................................................................................................ 39
4.3 Sinteza hidroksilavandulola i potvrda identiteta novih jedinjenja ............................ 46
5 ZAKLJUČAK .................................................................................................................. 50
6 LITERATURA ................................................................................................................ 53
7 PRILOG ........................................................................................................................... 56
8
1 UVOD
9
Etarska ulja (isparljiva ulja, eterična ulja) su složene smeše isparljivih jedinjenja koja se
dobijaju destilacijom, destilacijom sa vodenom parom, hidrodestilacijom ili hladnim ceđenjem
odogvarajućeg biljnog materijala (Baser i Demirci, 2007). Mnoga etarska ulja ili pojedini
njihovi sastojci imaju biološka i/ili organoleptička svojstva koja ih čine dragocenim sirovinama
u prehrambenoj, farmaceutskoj i poljoprivrednoj industriji kao i industriji parfema. Pored toga,
pojedini isparljivi biljni metaboliti često se koriste kao lako dostupni i jeftini polazni materijal
u organskoj sintezi. Na primer, hiralno čist monoterpen karvon, koji je lako dobiti izolovanjem
iz njime bogatih biljnih vrsta (na primer Anethum graveolens L., Carum carvi L., Mentha
spicata L.), a ne bi ga bilo jednostavno napraviti u laboratoriji, često se koristi kao polazno
jedinjenje za sintezu drugih, znatno složenijih prirodnih proizvoda (Xuan i sar., 2012; Huang i
sar., 2012; Kim i sar., 2012; Lee, 2004). Dodatno, i etarska ulja, i pojedinačni isparljivi biljni
metaboliti koji ulaze u njihov sastav, često se koriste kao hemotaksonomski markeri
(Blagojević i sar., 2015).
Imajući sve gore pomenuto na umu, ne čudi što su etarska ulja predmet ispitivanja velikog
broja naučnika. Gasna hromatografija sa masenom detekcijom (GC/MS) zauzima centralno
mesto u analizi etarskih ulja. Ipak, zbog složenosti sastava (tipično, isparljiva ulja se sastoje od
više desetina manje ili više srodnih jedinjenja), i dalje su česti slučajevi kada pojedini
detektovani sastojci ostaju neidentifikovani (Blagojević i sar., 2017), pa se, uprkos decenijama
prethodnih istraživanja, čak i u etarskim uljima intenzivno ispitivanih vrsta i dalje mogu naći
nova jedinjenja.
Sastojci se, nakon GC/MS analize, identifikuju na osnovu rezultata pretrage baza podataka
(mnoge od njih su usko specijalizovane (Adams, 2007; Hoschmut i sar., 2003)) koje sadrže
masene spektre velikog broja isparljivih organskih jedinjenja, kao i poređenjem
eksperimentalno određenih retencionih indeksa detektovanih sastojaka sa literaturno
dostupnim indeksima. Kad god je to moguće, vrši se i ko-hromatografija odgovarajućih
standarda sa uzorkom ulja, čime se dobijaju mnogo pouzdaniji rezultati. Ipak, ovaj pristup se
može direktno primeniti samo onda kada se radi o poznatim jedinjenjima. U slučaju novih
jedinjenja, pretrage baza koje sadrže masene spektre i/ili retencione indekse mogu tek dati ideju
o kakvom se jedinjenju radi, a nakon toga se može sintetisati standard za ko-hromatografiju.
Ipak, u situacijama kada jedinjenje ne može biti identifikovano na osnovu pretraga baza
podataka, standardni pristup je izolovanje i spektralna karakterizacija detektovanog,
potencijalno novog jedinjenja. Međutim, najčešće su detektovana, a neidentifikovana
jedinjenja zastupljena u uzorcima ulja tek u neznatnim količinama, pa njihovo izolovanje i
utvrđivanje strukture mogu biti zahtevni.
10
Kao primer uspešnog izolovanja i spektralne karakterizacije može poslužiti metil-3-(5-
(prop-1-in-1-il)tiofen-2-il)propanoat, retki prirodni proizvod koji je pre oko pola veka prvi i do
skora jedini put detektovan u nekom uzorku prirodnog porekla. Nedavno je oko 10 mg ovog
jedinjenja izolovano iz etarskog ulja dobijenog iz bezmalo 1 kg korena biljne vrste Artemisia
absinthium L. (beli pelin) (Blagojević, 2017, i reference koje se tamo pominju).
Na severnoj hemisferi široko rasprostranjena biljna vrsta A. absinthium (porodica
Asteraceae, odnosno glavočike), koristi se u tradicionalnoj medicini zbog svog
antibakterijskog, antimikotičnog, antipiretičkog, antihelmintičkog, antimalaričnog i
dijaforetičkog dejstva, a takođe se upotrebljava u industriji parfema i u prehrambenoj industriji,
gde se dodaje vermutu i absintu. Za razliku od uzorka ulja izolovanih iz nadzemnih delova
belog pelina, ulje korena je do sada ispitivano samo u nekoliko radova (Kennedy i sar., 1993;
Llorens-Molina i Vacas, 2015; Llorens-Molina i sar., 2016; Blagojević, 2017; Blagojević i sar.,
2006). Ovo ga svakako čini dobrim potencijalnim izvorom do sada neotkrivenih prirodnih
jedinjenja.
Upravo iz tog razloga, za cilj ovog master rada postavljeno je ispitivanje sastava etarskog
ulja korena belog pelina, usmereno ka potrazi za novim ili retkim, malo zastupljenim,
isparljivim biljnim metabolitima.
Da bi postavljeni cilj bio ostvaren, urađeno je sledeće:
a) Izolovanje etarskog ulja korena biljne vrste A. absinthium.
b) Klasična analiza etarskog ulja (GC/MS analiza uz pretragu odgovarajućih dostupnih
baza podataka masenih spektara i retencionih indeksa).
c) Preparativno hromatografsko razdvajanje sastojaka izolovanog ulja.
d) Sinteza standarda za ko-hromatografiju i potvrda strukture.
Ispitivanja su sprovedena korišćenjem sledećih metoda/postupaka:
e) Izolovanje etarskog ulja: hidrodestilacijom koršćenjem Klevendžerovog (Clevenger)
aparata.
f) Analiza etarskog ulja: gasna hromatografija sa masenom detekcijom (GC/MS);
rezultati GC/MS analize procesuirani su pomoću softverskog paketa AMDIS
(Automated mass spectral deconvolution and identification system).
g) Preparativno razdvajanje sastojaka izolovanog ulja: kolonskom hromatografijom na
silika-gelu (tok hromatografije je praćen hromatografijom na tankom sloju, HTS).
11
h) Sinteza standarda za ko-hromatografiju: sinteza silil-enoletara, Rubotomova
(Rubottom) oksidacija, kiselo katalizovana hidroliza silil-etara, redukcija litijum-
aluminijumhidridom, oksidacija vicinalnih diola pomoću olovo-tetraacetata,
Šteglihova (Steglich) esterifikacija.
i) Utvrđivanje strukture izolovanih i sintetisanih jedinjenja: 1D- i 2D- nuklearna
magnetna rezonantna spektroskopija (NMR).
12
2 OPŠTI DEO
13
2.1 Analiza etarskih ulja
Etarska ulja su složene smeše isparljivih, biljnih jedinjenja ili jedinjenja koja nastaju iz
nativnih biljnih metabolita prilikom izolovanja, često okarakterisana jakim mirisom. Slabo su
rastvorna u vodi, ali su rastvorna u mastima i organskim rastvaračima. Na sobnoj temperaturi
su obično u tečnom stanju. Sastojci etarskih ulja najčešće potiču iz terpenskog (monoterpeni i
seskviterpeni) ili fenilpropanoidnog biosintetskog puta, i pripadaju različitim klasama
organskih jedinjenja. Na slici 2.1. su dati primeri nekih široko rasprostranjenih monoterpena
koji sadrže različite funkcionalne grupe: alkoholnu (lavandulol (1), mentol (2)), fenolnu
(timol (3), karvakrol (4)), etarsku (1,8-sineol (5)), aldehidnu (neral (6), geranial (7)),
ketonsku (karvon (8), pulegon (9)), estarsku (linalil-acetat (10)) i/ili dvostruku vezu (-pinen
(11), mircen (12)).
Slika 2.1. Strukturne formule nekih monoterpenoida, sastojaka etarskih ulja: lavandulol (1),
mentol (2), timol (3), karvakrol (4), 1,8-sineol (5), neral (6), geranial (7), karvon (8), pulegon
(9), linalil-acetat (10), -pinen (11) i mircen (12)
14
Etarska ulja su lokalizovana u biljnim ćelijama ili duktima, žlezdama, glandularnim
dlakama, i mogu se ekstrahovati iz cvetova, semenja, lišća, pupoljka, korena, ploda, stabla ili
kore biljke. Produkcija etarskih ulja je genetski definisana, ali do određenih granica je genetska
kontrola pod uticajem egzogenih i endogenih faktora, samim tim varijabilnost biljnih genoma
omogućava pojavu različitih hemijskih rasa, tj. hemotipova. Različiti faktori utiču na sastav
etarskog ulja neke vrste, a najvažniji od njih su genotip, fenofaza ontogenetskog razvoja,
ekološki faktori, način obrade biljne sirovine i način izolovanja ulja.
Ulje se iz biljke može izolovati na više načina: ekstrakcijom rastvaračem i superkritičnim
fluidima, ekspresijom pod pritiskom, fermentacijom, anfleraž tehnikom, destilacijom vodenom
parom ili hidrodestilacijom (Bakkali i sar., 2008).
Najčešće se analiza etarskih ulja vrši korišćenjem gasne hromatografije sa FID detekcijom
(GC/FID), odnosno gasne-hromatografije sa masenom detekcijom (GC/MS) (slika 2.2). Gasni
hromatograf razdvaja komponente smeše u vremenu. Vreme zadržavanja sastojaka na koloni,
odnosno vreme koje protekne od trenutka injektovanja smeše na kolonu do pojave maksimuma
pika je retenciono vreme (Rt). Kako vreme zadržavanja zavisi od strukture jedinjenja, može se
koristiti kao jedan od kriterijuma za međusobno razlikovanje sastojaka smeše koja se analizira.
Međutim, retenciono vreme zavisi i od parametara GC programa koji se koristi (temperatura,
protok nosećeg gasa, dimenzije kolone), kao i konstrukcije konkretnog aparata. Da bi u praksi
mogli da budu poređeni rezultati različitih analiza, umesto retencionog vremena, koriste se
retecioni indeksi (RI). Retencioni indeksi se određuju tako što se paralelno sa uzorkom
analizira i serija n-alkana. Alkanima se dodeljuju vrednosti retencionih indeksa na taj način što
se broj atoma ugljenika u alkanu pomnoži sa 100. Retencioni indeksi jedinjenja iz razmatranog
uzorka se računaju po formuli koja se bira na osnovu temperaturnog programa analize. Na
primer, ukoliko se u toku programa temperatura linearno povećava, treba indekse računati po
dole datoj formuli (Van den Dool i Kratz, 1963):
𝑅𝐼 = 100𝑛 +100(𝑡𝑥 − 𝑡𝑛)
(𝑡𝑛+1 − 𝑡𝑛)
U formuli, RI je retencioni indeks, n predstavlja broj C-atoma u alkanu koji eluira pre
razmatranog jedinjenja, tx, tn i tn+1 su retenciona vremena na kojima eluiraju razmatrano
jedinjenje, alkan koji mu prethodi i alkan koji ga sledi.
RI vrednosti za neko jedinjenje, određene na istom tipu (polarnosti) kolone, čak i onda kada
analiza nije vršena u potpunosti na isti način (vreme trajanja programa, brzina protoka nosećeg
gasa i sl) su jednake, odnosno mogu tek neznatno da se razlikuju (najčešće do nekih 10 RI
jedinica).
15
Slika 2.2. Šema tipičnog GC/MS aparata; osnovne komponente: cilindar sa nosećim
gasom (nije prikazan), sistem za injektovanje uzorka, hromatografska kolona, jonizator,
maseni analizator, elektronski multiplikator i sistem za prikupljanje i analizu podataka, tj.
računar (slika je preuzeta iz Il-Young Kim i sar., 2016).
Nepodudaranje RI vrednosti nekog sastojka smeše sa odgovarajućom literaturnom
vrednošću za konkretno jedinjenje znači da se ne radi o istom jedinjenju. Ipak, mnoga
jedinjenja imaju približno ili potpuno iste retencione indekse (koeluiraju), pa se samo
korišćenjem RI kao kriterijuma ne može utvrditi kvalitativni sastav smeše (na primer, sabinen
i 1-okten-3-ol, slika 2.3., česti sastojci etarskih ulja koji imaju potpuno različitu strukturu, na
DB-5MS koloni imaju isti retencioni indeks 988) (Radulović i Blagojević, 2013). Drugim
rečima, podudaranje RI vrednosti je neophodan, ali ne i dovoljan uslov za identifikaciju.
Dodatni kriterijum za identifikaciju se može dobiti kada se gasna hromatografija kombinuje
sa masenom spektrometrijom (masena detekcija), koja omogućava da se za sastojke smeše
dobiju i maseni spektri. Šema tipičnog GC/MS aparata je prikazana na slici 2.2. Jedinjenja se
mogu identifikovati poređenjem eksperimentalno zabeleženog masenog skena sa masenim
spektrima iz odgovarajućih baza podataka. Podudarnost i retencionog indeksa, i masene
fragmentacije u najvećem broju slučajeva znači da se radi o istim jedinjenjima.
16
Slika 2.3. Strukture nekih jedinjenja koja se mogu naći u etarskim uljima: (1) sabinen, (2) 1-
okten-3-ol, (3) α-tujen, (4) triciklen, (5) α-tujon, (6) β-tujon, (7) cis-epoksiocimen, (8) trans-
sabinil-acetat, (9) linalil-estri, (10) bornil-estri, (11) geranil-estri, (12) neril-estri (-OC(O)R-
najčešće ostaci nižih karboksilnih kiselina)
17
Slika 2.4: Iznad: maseni sken etarskog ulja vrste Artemisia ludovichiana na Rt=4,53 min
(MS1) i maseni spektar sabinena (MS2) (s leva na desno); ispod: razlika MS1 i MS2 i maseni
spektar 1-okten-3-ola (MS3) (s leva na desno). (Slika je preuzeta iz Blagojević, 2010).
Ipak, ovde treba voditi računa o tome da ako je hromatografsko razdvajanje efikasno,
odgovor detektora se zaista odnosi na jedno jedinjenje, u protivnom, dobija se usrednjeni
spektar za sva jedinjenja koja su u datom trenutku ko-eluirala. Na primer, kod gore pomenutih
sabinena i 1-okten-3-ola, koji ko-eluiraju, odgovor masenog detektora je "smeša" masenih
spektara pojedinačnih jedinjenja, koja oslikava i udeo pomenutih supstanci prisutnih u datom
trenutku u detektoru (slika 2.4) (Blagojević, 2010).
Upotreba masene detekcije pri GC analizi etarskih ulja dovela je do velikog napretka i
omogućila identifikaciju velikog broja sastojaka, pogotovu onih čija je relativna zastupljenost
na nivou traga (relativni udeo manji od 0,05%). Pregled novije literature koja se odnosi na
etarska ulja i odgovarajuće ekstrakte ukazuje na veliki skok u prosečnom broju sastojaka
etarskih ulja koji se može detektovati i identifikovati. Nekada se u etarskim uljima moglo
identifikovati svega nekoliko desetina jedinjenja dok je danas sve veći broj primera kada se u
jednom etarskom ulju ili ekstraktu uspešno može da utvrdi identitet i nekoliko stotina sastojaka.
Ovome je, pored upotrebe same masene spektrometrije, u mnogome doprineo i razvoj
specijalizovanih softverskih paketa, kakvi su AMDIS i MassFinder (Hochmut i sar., 2003), i
dostupnost odgovarajućih baza masenih spektara, od kojih su neke usko specijalizovane
(MassFinder (Hochmut i sar., 2003) i Adamsova (2007) baza).
18
Slika 2.5. Maseni spektri α-tujena i triciklena iz Massfinder baze (Hochmut i sar., 2003)
Međutim, iako je znatno olakšana, analiza etarskih ulja se i dalje ne može smatrati
jednostavnom (Radulović i Blagojević, 2013; Blagojević, 2010). Ne samo što mnoga jedinjenja
imaju iste ili približno iste retencione indekse, veliki broj sastojaka etarskih ulja ima gotovo
identične masene spektre. Takav je, na primer, slučaj sa velikim brojem monoterpena. Kao
primer se mogu iskoristiti maseni spektri α-tujena i triciklena, prikazani na slici 2.5. Retencioni
indeksi ovih jedinjenja, na DB5-MS kapilarnoj koloni, su vrlo bliski i iznose 924 i 921 (Adams,
2007).
Rezultati analize etarskih ulja se dodatno mogu učiniti pouzdanijim ukoliko se dostupni
standardi jedinjenja (preliminarno) identifikovanih na osnovu RI i MS kriterijuma ko-
injektiraju sa uzorkom razmatranog etarskog ulja. Na ovaj način se mogu razrešiti
dvosmislenosti vezane za jedinjenja gotovo istih masenih spektara, sa veoma bliskim
vrednostima retencionih indeksa. Ipak, u ekstremnom slučaju jedinjenja jednake MS
fragmentacije koja potpuno ko-eluiraju pod uslovima GC/MS analize, jedino rešenje je
preparativno razdvojiti data jedinjenja (npr. HPLC metodom), i izvršiti njegovu spektralnu
karakterizaciju. Dodatna poteškoća vezana za ko-injekciju je i dostupnost samog standarda.
Uzevši u obzir tipičnu složenost etarskih ulja, potvrda strukture svakog sastojka ko-injekcijom,
zahtevala bi izvođenje velikog broja eksperimenata, a da se na raspolaganju ima više desetina
specifičnih, često retkih i komercijalno nedostupnih jedinjenja.
-Thujene #102 ("unknow n"). [95/09/25]
41
53 65
77
93
105 121136
40 60 80 100 120 140
20
40
60
80
100
Tricyclene #96 ("unknow n"). [1/08/30]
39
5367
77
93
105
121
136
40 60 80 100 120 140
20
40
60
80
100
19
Pristup "izolovanje-strukturna karakterizacija" je odličan način kojim se mogu prevazići
ispred pomenuti problem klasičnog pristupa analizi etarskih ulja (ko-injekcija, ista MS
fragmentacija i nova jedinjenja za koja ne postoje literaturni MS i RI podaci). Nuklearna-
magnetna rezonantna spektroskopija (NMR), pogotovu kada se kombinuju rezultati 1D- i 2D-
eksperimenata, daje mogućnost da se nedvosmisleno utvrdi identitet nekog organskog
jedinjenja. U slučaju sastojaka etarskih ulja, na ovaj se način mogu otkloniti problemi povezani
sa strukturno srodnim jedinjenjima koja imaju istu MS fragmentaciju (ovo je slučaj velikog
broja regioizomera). Nedostatak ovog pristupa je u vremenu koje je neophodno za razdvajanje,
dostupnosti uzoraka (za GC/MS analizu je potrebno svega nekoliko mikrolitara rastvora ulja
koncentracije čak i manje od 1 mg/mL, a za NMR analizu je najbolje imati bar nekoliko
miligrama čistog jedinjenja), pa čak i nemogućnost da se dobije čisto jedinjenje (veliki broj
sastojaka ima slične osobine, pa razdvajanje može biti jako zahtevno).
Neka vrsta međurešenja između klasičnog i "izolovanje-strukturna karakterizacija"
pristupa, onda kada se radi o jedinjenjima za koja ne postoje literaturni RI i/ili MS podaci,
preliminarna je identifikacija sastojaka na osnovu rezultata GC/MS analize, a zatim sinteza
standarda koji bi omogućio potvrdu strukture ko-injekcijom. Ovakav pristup je, na primer,
iskorišćen u slučaju novih estara nađenih u biljnim vrstama Achillea falcata L. i Anthemis
segetalis L. (Radulović i sar., 2015a; Radulović i sar., 2013) ili serije sumpornih jedinjenja iz
ulja vrste Allium ursinum L. (Radulović i sar., 2015b). Onda kada na osnovu MS fragmentacije
nepoznatog jedinjenja nije moguće dobiti ideju o njegovoj strukturi, može se izvršiti parcijalno
frakcionisanje ulja. NMR analizom frakcije obogaćene nepoznatim jedinjenjem može se steći
bar delimični uvid u njegovu strukturu, koja se dalje može potvrditi ko-injekcijom u
međuvremenu sintetisanog standarda.
2.2 Sinteza sastojaka etarskih ulja
U literaturi se može naći veliki broj primera za sintezu različitih sastojaka etarskih ulja
(Heathcock i sar., 1982; Fleming i Paterson, 1979). Kako su ova jedinjenja veoma raznovrsna
po svojoj strukturi (ugljenični skelet, prisustvo specifičnih funkcionalnih grupa i sl.), sinteza
različitih isparljivih biljnih jedinjenja često zahteva korišćenje potpuno različitih strategija.
Veoma često specifičan međusobni odnos supstituenata može da učini sintezu i na prvi pogled
jednostavnih jedinjenja problematičnom. Na primer, 5-hidroksikarvon je nađen u malim
količinama u etarskom ulju vrste M. spicata (Miyashita i sar., 1985). Da bi na stereoselektivni
20
način uveli hidroksilnu-grupu u položaj 5 karvona, Miyashita i saradnici (1985) su izvršili
sintezu koja je predstavljena na slici 2.6., i koja je podrazumevala ukupno 9 koraka.
(I) PhSeNa, AcOH, EtOH; (II) DIBAH, PhMe; (III) DHP, PPTS, CH2Cl2; (IV) H2O2, py, CH2Cl2; (V) Δ, CCl4; (VI) PPTS, EtOH; (VII) t-
BuO2H, VO(acac)2, PhH; (VIII) CrO3∙2py, CH2Cl2 ili CrO3, vodeni rastvor H2SO4, (CH3)2CO; (IX) Al2O3
Slika 2.6. Sinteza (+)-5-hidroksikarvona iz (R)-(-)-karvona (Miyashita i sar., 1985);
Nasuprot tome, uvođenje hidroksilne-grupe u položaj 3 karvona mnogo je jednostavnije.
Za ovaj slučaj, može se iskoristiti Rubotomova (Rubottom) oksidacija (Lee, 2004; Kim, 2011;
Rubottom i sar., 1978). Ovaj tip oksidacije je odličan način za uvođenje hidroksilne grupe u α-
položaj ketona. Keton je najpre potrebno prevesti u silil-enol-etar, koji se zatim oksiduje
pomoću mCPBA. Oksidacija je praćena spontanim premeštanjem silil-grupe. Desililovanjem
proizvoda premeštanja dobija se željeni α-hidroksiketoni. Mehanizam Rubotomove oksidacije
je prikazan na slici 2.7
21
Slika 2.7. Mehanizam Rubotomove oksidacije. (1) peroksi kiselina R1, R2 = H, alkil, aril; (2)
siloksi oksiran; (3) oksokarbenijum jon; (4) α-siloksikarbonilni derivati; (5) α-
hidroksikarbonil derivat
Ponekad se kombinacijom samo nekoliko reakcija, pažljivim odabirom redosleda koraka i
startnog materijala, može dobiti veliki broj regioizomera. Kao primer se može iskoristiti sinteza
regioizomernih alilmetoksifenil-estara (slika 2.8), neophodnih da bi mogla nedvosmisleno da
se potvrdi struktura novih jedinjenja nađenih u etarskom ulju biljne vrste A. segetalis
(Radulović i sar., 2013). Kako se sa slike 2.8. može videti, autori su praktično koristili samo 4
različite reakcije, a sintetisali su biblioteku od ukupno 54 različita jedinjenja. Pritom, dve od
pomenute četiri reakcije su suštinski iste (alkilovanje fenola u baznim uslovima; reakcije i) i
ii)). Za "pozicioniranje" alil-grupe u željeni položaj, korišćeno je Klajzenovo premeštanje.
(i) MeI, K2CO3, DMF, 24 h, r.t.; (ii) alil-bromid, K2CO3, DMF, 24 h, r.t.; (iii) 220 °C, 4 h, N2; (iv) RCOOH,
DCC/DMAP, CH2Cl2, 24 h, r.t.
Slika 2.8. Sinteza regioizomernih alilmetoksifenil-estara
22
Slika 2.9. Mehanizam Šteglihove esterifikacije na primeru sinteze estara endo-fenhola
Od mnogo različitih metoda za dobijanje estara, u gore pomenutoj sintezi biblioteke
jedinjenja je iskorišćena Šteglih-ova (Steglich) esterifikacija. Šteglih i Neses (Neises) su još
1978. godine razvili metodu koja omogućava građenje estara direktno iz alkohola i kiselina, u
gotovo kvantitativnom prinosu i pod blagim uslovima (Neises i Steglich, 1978). Ova metoda,
poznata kao Šteglihova esterifikacija, adaptacija je starijeg postupka za dobijanje amida
pomoću N,N’-dicikloheksilkarbodiimida (DCC, reagens za kuplovanje) i 1-
hidroksibenzotriazola. Kao katalizator se koristi (4-dimetilamino)piridin, postupak se najčešće
vodi na sobnoj temperaturi, u dihlormetanu kao rastvaraču. Pošto se reakcija odvija pod blagim
uslovima, može se koristiti i za esterifikaciju osetljivih supstrata, koji mogu lako podleći
sporednim reakcijama. Mehanizam Šteglihove reakcije dat je na slici 2.9.
Kako se može videti iz svega nekoliko primera datih gore, sinteza sastojaka etarskih ulja
može biti vremenski i strateški (planiranje i izvođenje sinteze) zahtevan posao. Ipak, u nekim
slučajevima sinteza standarda je jedino rešenje za potvrdu strukture novog jedinjenja koje je
nemoguće prečistiti iz složenog matriksa. Čak i onda kada je na drugi način moguće utvrditi
strukturu sastojka ulja, sintetski pristup daje mogućnost da se dobiju i serije analoga i derivata,
što je od velikog značaja kod utvrđivanja mehanizma delovanja biološki aktivnih jedinjenja.
23
2.3 Biljna vrsta Artemisia absinthium L.
Rod Artemisia je jedan od najvećih i najrasprostranjenijih među blizu 100 rodova tribusa
Anthemideae (Blagojević, 2006) Pripada porodici glavočika, tj. porodici Asteraceae. Ovaj rod
sadrži približno 400 različitih vrsta, koje se mogu pretežno naći u Aziji, Evropi i Severnoj
Americi, međutim, ima ih i u drugim oblastima umerenog pojasa. Taksonomsku sistematizaciju
roda predložio je Karl fon Line još 1753. godine (tabela 2.1)
Tabela 2.1. Taksonomska sistematizacija roda Artemisia (tabela preuzeta iz Blagojević,
2006)
Carstvo Plantae
Podcarstvo Tracheobionta
Nadrazdeo Spermathophyta
Razdeo Magnoliophyta
Klasa Magnoliopsida
Podklasa Asteridae
Red Asterales
Familija Asteraceae
Tribus Anthemideae
Subtribus Atremisiinae
Rod Artemisia L.
Biljke iz roda Artemisia su višegodišnje, vrlo retko jednogodišnje, zeljaste i žbunaste biljke,
sa jakim vretenastim i drvenastim korenjem. Ono po čemu su specifične je gorak ukus koji
potiče od organskih jedinjenja terpenoida koji se nalaze u listu biljke. Stabla su uglavnom
prava, manje debljine, srebrnaste do beličaste boje. Listovi su perasti, naizmenično
raspoređeni, složeni i podeljeni u više režnjeva, a sa jednog čvora izbija uglavnom po jedan
list. Cvetovi su uglavnom manji, obično žute, ređe crvenkaste boje i formirani su u vidu
metlica. Plodovi su sitne i glatke semenke.
24
Slika 2.5. Izgled nadzemnog dela i korena vrste A. absinthium
Artemisia absinthium L., beli pelin, uspravna je, sivo-zelena, do sivo-bela biljka, sa mnogo
listova. Listovi su sa obe strane gusto, belo dlakavi (slika 2.5). Odozgo su sivo-zeleni, odozdo
sivo-beli. Cvetovi su žuti, ili zeleno-žuti, grupisani u cvasti. Ovo je vrlo rasprostranjena biljka.
Najčešće se nalazi u Evropi, Aziji i Severnoj Africi. Uglavnom raste na stenovitim i sunčanim
područjima, na rečnim obalama, duž ograda i puteva, a uzgaja se i u vrtovima.
2.3.1 Etarsko ulje korena vrste A. absinthium
Etarsko ulje dobiveno iz nadzemnih delova belog pelina je prethodno ispitivano mnogo
puta (Blagojević i sar., 2006; Radulović i Blagojević, 2013, Blagojević i sar., 2017).
Poređenjem rezultata prethodnih ispitivanja može se zaključiti da sastav isparljivog profila A.
absinthium varira u zavisnosti od dela biljke iz kog je ono izolovano, geografskog porekla,
fenofaze i klimatskih faktora (Tabela 2.2.; Blagojević i sar., 2006). Jedna od zajedničkih
osobina prethodno ispitivanih uzoraka etarskog ulja je složenost njegovog sastava. Česti
(glavni) sastojci ranije ispitivanih uzoraka bili su α- i β-tujon, i cis-epoksiocimen, trans-sabinil-
acetat i/ili hrizantenil-acetat (slika 2.3).
25
Tabela 2.2. Glavni sastojci iz nekih od prethodnih ispitivanja etarskog ulja nadzemnog
dela vrste A. absinthium (Blagojević i sar., 2006 i reference tamo citirane)
% u etarskim uljima
Populacija
Sastojak
1 2 3 4 5 6 7 8
sabinen 5,5a 0,1 b 0,3 trc 0,8-9,8 7,4 -
β-mircen 0,1 1,2 tr 6,8-20 33,2 0,2
α-tujen 0,4 tr 2,8-16 20,8 0,2
linalool 5,9 1,6 10,5 7,4 1,7 2,1-5,1 1,5 0,2
β-tujen 26,0 1,3 5,5-12,8 13,7 0,5
cis-6,7-epoksiocimen 24,1 30,0 31,1 25 0-6,7
trans-6,7-epoksiocimen 1,9 2,3 4,0 0-0,7
kamfor 17,0 0-0,2 1,4
terpinen-4-ol 1,0 12,0 tr 0,2-0,5 0,4 1,8
cis-hrizantenil-acetat 1,2 15,5 43,4 22,0 0,1
biciklo[2.2.1]hept-2-en-7-ol 8,5
α-felandren 0,2 50,5 tr 0,2-0,7 0,3
tujil-acetat 0,4-21,3
sabinil-acetat 4,3 tr 6,6
β-kariofilen 4,12 0,6 1,4 1,5-4,5 0,6
hamazulen 1,0 0,2-0,8 17,8
kariofilen-oksid 0,3 2,8 0,52 10,0 4,3
nuciferil-butanoat 8,2
nuciferil-propanoat 5,1
neril-propanoat 3,9 0,52-1,3d
Ključ: 1, Hrvatska; 2, Francuska; 3, Egipat; 4, Španija; 5, Italija; 6, Sibir; 7, Republika Baškortostan, i 8, Turska.
a Četiri dominantna sastojka svakog ulja su data podebljanim brojkama. b sastojak nije identifikovan, c Sastojak
pronađen u tragovima, d Ostali estri nerola su prisutni u većoj količini.
Za razliku od etarskog ulja nadzemnog dela biljke, koren belog pelina je vrlo mali broj puta
ispitan. Kennedy i saradnici (1993) su pokazali da je ulje korena belog pelina (populacija iz
Škotske) sadržalo -fenhen (53%), -mircen (6%), endo-bornil-acetat (2%) i -pinen (1%)
(autori nisu pomenuli nijedan drugi sastojak). Sva ova jedinjenja su pronađena u uzorku
etarskog ulja korena belog pelina iz Srbije (-fenhen (23%) -mircen (2%), endo-bornil-acetat
(4%) i -pinen (2%)) (Blagojević i sar., 2006). Specifičnost uzorka iz Srbije bilo je prisustvo
značajne količine estara acikličnih monoterpena regularnog skeleta, koji su činili više od 50%
ovog uzorka: linalil- (53,4%), bornil- (4,2%), geranil- (4,1%) i neril-estri (2,8%) (Blagojević i
sar., 2006). Llorens-Molina i saradnici su ispitivali uzorke etarskih ulja dobivenih iz korena
26
populacija A. absinthium iz Španije i Mađarske (Llorens-Molina i Vacas, 2015; Llorens-
Molina i sar., 2016). Oni su pronašli da su -fenhen (12,4–23,7%) i -mircen (20,2–31,9%)
bili najzastupljeniji. Takođe, karakteristika gotovo svih uzoraka ulja korena bio je visok sadržaj
estara: 56,5-80,2% u uzorcima iz Mađarske, odnosno 59,9-90,3% u uzorcima iz Španije. Ipak,
u uzorcima iz Mađarske, dominantni su bili estri acikličnih monoterpena (9,8-62,4%: npr. -
mircen (0,8-18,0%), α-fenhen (1-42,8%). Estri cikličnih monoterpena su činili od 4,7 do 38,8
% (npr. bornil-acetat (1,7-26,6%), β-terpinil-acetat 0,1-2,9%)). Istovremeno, estri cikličnih
monoterpena (pre svega bornil-acetat (14,0-55,5%) i β-terpinil-acetat (0,1-2,9%)), činili su
41,3-60,3 % španskih uzoraka; estri acikličnih monoterpena činili su 10,7-40,7 % ovih etarskih
ulja.
27
3 EKSPERIMENTALNI DEO
28
3.1 Hemikalije
Sve hemikalije koje su korišćene u ovom radu bile su p.a. čistoće, sem ako nije drugačije
naglašeno. (R)-(-)-Karvon, organske kiseline (izovalerijanska i glacijalna sirćetna), p-
anisaldehid, olovo-tetraacetat, natrijum-hidrogenkarbonat, magnezijum-sulfat, natrijum-
hlorid, litijum-diizopropilamid (2 M rastvor u suvom tetrahidrofuranu), litijum-
aluminijumhidrid, trimetilsilil-hlorid (TMSCl), N,N’-dicikloheksilkarbodiimid (DCC), 4-
(dimetilamino)piridin (DMAP), meta-hlorperbenzoeva kiselina (mCPBA, najmanje 70%), HF
(48% vodeni rastvor), kao i rastvarači: suvi tetrahidrofuran (THF), dietil-etar (Et2O),
dihlormetan (CH2Cl2), pentan, heksan, etil-acetat (EtOAc), metanol, acetonitril,
deuterohloroform (CDCl3) nabavljeni su od kompanije Sigma-Aldrich. Sve hemikalije
upotrebljavane su bez prethodnog prečišćavanja.
3.2 Biljni materijal
Koren vrste A. absinthium je sakupljen u fazi cvetanja, u avgustu 2017. godine u Nišu, iz
samonikle populacije koja raste uz reku Nišavu. Herbarski primerak je pohranjen u herbarijumu
Laboratorije za organsku analizu i sintezu Prirodno-matematičkog fakulteta, Univerziteta u
Nišu (vaučer broj SV001_2017). Nakon slušenja do konstantne mase na sobnoj temperaturi,
koren je usitnjen i podvrgnut hidrodestilaciji.
3.3 Izolovanje etarskog ulja
Etarsko ulje je dobijeno od usitnjenog suvog korena biljne vrste A. absinthium
hidrodestilacijom u Klevendžerovom aparatu u toku 2,5 h (hidrodestilacija je ponovljena 3 puta
sa po približno 440 g materijala). Nakon hidrodestilacije, ulje je iz vodenog sloja ekstrahovano
dietil-etrom, a etarski ekstrakt sušen nad anhidrovanim MgSO4. Posle odvajanja sredstva za
sušenje filtracijom, etar je uklonjen destilacijom na rotacionom-vakuum uparivaču, na sobnoj
temperaturi. Ukupno je dobijeno 3,2 g ulja (ukupni prinos, izražen u odnosu na masu polaznog
materijala, bio je 0,183%). Neposredno nakon izolovanja, 1 mg ulja je rastvoren u dietil-etru
(1:100, masa/zapremina) i podvrgnut GC/MS analizi (temperaturni programi 1 i 2).
29
3.4 Metode analize
3.4.1 Gasna hromatografija-masena spektrometrija (GC/MS)
Sve GC/MS analize su vršene na aparatu Hewlett-Packard 6890N II, na kapilarnoj koloni
30 m x 0,25 mm, sa stacionarnom fazom DB-5MS (5% fenil-metilsiloksan, Agilent
Technologies, SAD), debljine filma 0,25 μm. Gasni hromatograf je bio direktno kuplovan sa
masenim detektorom MSD 5975B iste kompanije. Temperatura injektora i interfejsa su
održavane na 250 C i 300 C, dok je temperaturno programiranje bilo linearno. Program 1:
temperatura je postepeno povećavana od 70 do 290 C brzinom 5 oC/min; u toku poslednjih 10
min temperatura je održavana na 290 C. Program 2: temperatura je držana na 70 C u toku
jednog minuta, a zatim postepeno povećavana od 70 do 300 C brzinom 20 oC/min; u toku
poslednja 3 min temperatura je održavana na 300 C. Helijum je korišćen kao noseći gas, a
brzina protoka je bila 1 mL/min. Uzorci, pripremljeni kako je prethodno opisano, injektovani
su u pulsed split modu (u toku početnih 0,5 min brzina protoka je bila 1,5 mL/min, a nakon
toga, do završetka analize, 1,0 mL/min; split ratio je bio 40:1). Jonizacija je vršena u EI modu,
elektronima energije 70 eV, a maseni spektri su beleženi za m/z vrednosti u opsegu od 35 do
500 (vreme skeniranja 0,32 s).
Obrada TIC hromatograma (TIC = Total Ion Current) i masenih spektara vršena je u
programu AMDIS (Automated Mass Spectral Deconvolution and Identification System, ver.
2.68) zajedno sa NIST MS Search programskim paketom (ver. 2.0d, Nacionalni institut za
standarde i tehnologiju (NIST), SAD).
3.4.2 Nuklearno-magnetna rezonantna (NMR) spektroskopija
Odgovarajuća masa uzorka je rastvorena u 1 mL CDCl3, a 0,7 mL tog rastvora je prebačeno
u 5 mm Wilmad 528-TR-7 NMR kivetu. 1H i 13C NMR spektri snimljeni su na Bruker Avance
III 400 MHz spektrometru (1H na 400 MHz, a 13C na 101 MHz) na Prirodno-matematičkom
fakultetu u Nišu, opremljenim sa 1H/13C radnom glavom (probe head) ili na Bruker Avance
300 spektrometru (1H na 300 MHz, a 13C na 75 MHz) na Departmanu za hemiju Univerziteta
u Britanskoj Kolumbiji, opremljenom 1H/13C/31P/19F Bruker QNP 5 mm radnom glavom i
BACS-120 autosemplerom. 1H NMR spektri su snimljeni sa 16 ponavljanja, relaksacionim
vremenom od 1 s, vremenom prikupljanja signala od 4 s, 0,125 Hz digitalnom FID rezolucijom,
30
51 280 FID veličinom, sa spektralnom širinom od 6410 Hz i rezolucijom tačaka od 0,0003
ppm. 13C NMR spektri su snimljeni uz Waltz16 1H širokopojasno dekuplovanje, 12000
ponavljanja, relaksacionim vremenom od 0,5 s, vremenom akumulacije signala od 1 s,
digitalnom FID rezolucijom od 0,5 Hz, 65536 FID veličinom, spektralnom širinom od 31850
Hz i rezolucijom tačaka od 0,005 ppm. Za snimanje 2D spektara korišćene su standardne pulsne
sekvence iz softvera instrumenta. 1H – 1H gDQCOSY i NOESY spektri su snimljeni sa
spektralnim širinama od 5 kHz i u F2 i u F1 oblasti. Snimanje je vršeno sa 1024 × 512 tačaka
sa 32 ponavljanja i vremenom relaksacije od 2,0 s. Vreme mešanja prilikom snimanja NOESY
spektara je bilo 1 s. Obrada podataka vršena je na matrici sa 1024 podataka. Inverzno-
detektovani 2D spektri heteronuklearne korelacije su mereni u 512 kompleksnih tačaka u F2 i
256 uzastopnih tačaka u F1, pri čemu je prikupljeno 128 (gHMQC) ili 256 (1H – 13C gHMBC)
ponavljanja po tački sa relaksacionim vremenom od 1,0 s. Spektralna širina za F2 dimenziju je
bila 5 kHz, a za F1 27 kHz. gHMQC eksperimenti su bili optimizovani za C-H kuplovanje od
125 Hz. 1H - 13C gHMBC eksperimenti su bili optimizovani za kuplovanje od 10 Hz. Furijeova
transformacija je bila izvršena na matrici od 512 podataka. Za sve 2D spektre korišćene su
kvadratne sinusne funkcije pomerene za π/2 duž F1 i F2 ose.
Vrednosti hemijskih pomeranja su date u δ (ppm) jedinicama, a konstante kuplovanja u Hz.
Unutrašnji standard je bio tetrametilsilan (TMS) i/ili rezidualni hloroform, odnosno
deuterohloroform, CDCl3 (1H NMR: δH = 7,26 ppm), odnosno: 13C NMR: δC = 77,16 ppm).
Dobijeni podaci su obrađeni u programu MestReNova (ver. 6.0.2-5475, Mestrelab Research,
Santiago de Compostela, Španija).
3.4.3 Hromatografija na koloni
Za preparativno razdvajanje etarskog ulja (izokratska hromatografija; eluent:
heksan/EtOAc=19:1, v/v) i prečišćavanje sintetisanih jedinjenja (uslovi za svako pojedinačno
jedinjenje su navedeni kasnije), korišćena je kolonska hromatografija na silika-gelu 60 (40-63
m, Merck, Darmštat, Nemačka). Tok hromatografije je praćen HTS i GC/MS analizama.
3.4.4 Hromatografija na tankom sloju (HTS)
HTS je vršena na aluminijumskim pločama sa prethodno nanešenim slojem silika-gela 60
UV254 (Merck, Darmštat, Nemačka). Kao eluent su za svaki konkretan slučaj korišćene
odgovarajuće smeše rastvarača (u slučaju etarskog ulja, heksan/EtOAc=19:1, v/v). Mrlje su
31
vizuelizovane pomoću UV lampe (254 i 365 nm) i izazivane rastvorom dobivenim
rastvaranjem 3,75 mL glacijalne sirćetne kiseline, 9 mL koncentrovane sumporne kiseline i 9
mL p-anisaldehida u 340 mL metanola, nakon čega su zagrevane fenom.
3.5 Sinteza diestra lavanduladiola
3.5.1 Sinteza silil-enol-etra karvona (i1)
U 100 mL 2 M rastvora LDA u THF-u (200 mmol) je dodato 50 mL anhidrovanog THF-a.
Ovaj rastvor je ohlađen na 0 °C nakon čega je u kapima, uz mešanje, dodato 20 mL (R)-(-)-
Karvona (127 mmol) rastvorenog u suvom THF-u. Smeša je mešana na 0 °C u toku 1 sata,
nakon čega je u nju dodato 32 mL TMSCl (256 mmol). Nakon mešanja (pod atmosferom azota)
preko noći na sobnoj temperaturi, reakciona smeša je razblažena sa 150 mL etil-acetata, isprana
hladnom vodom i sušena nad bezvodnim magnezijum-sulfatom. Nakon uklanjanja sušila,
rastvarač je uklonjen na rotacionom vakuum uparivaču. Dobijeni sirovi proizvod je analiziran
pomoću NMR, GC/MS i HTS metoda (heksan/EtOAc = 9:1, v/v) koje su pokazale prisustvo
željenog proizvoda i male količine neizreagovalog karvona i drugih primesa.
1H NMR (300 MHz, CDCl3), δ (ppm): 5,59-5,53 m, 1H), 4,82-4,74 (m, 2H), 4,74-4,69 (m,
1H), 3,01 (ddd, J = 12,3, 8,5, 3,8 Hz, 1H), 2,26-2,01 (m, 2H), 1,73 (bs, 3H), 1,70 (q, J = 1,5
Hz, 3H), 0,21 (s, 9H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ (ppm): 148,6, 144,7, 132,0, 110,6, 110,1,
105,9, 42,0, 28,8, 20,7, 15,8, 0,3; MS (EI, 70 eV): m/z 222(98), 207(99), 181(66), 165(100),
91(26), 73(94). RI(DB5-MS) = 1223.
3.5.2 Oksidacija silil-enol-etra karvona: dobivanje smeše dijastereomernih 3-
trimetilsililoksikarvona (i2a i i2b)
Sirovi silil-enol-etar karvona je rastvoren u 600 mL metilen-hlorida, ohlađen na 0 °C, a
onda je dodato 20 g (238 mmol) natrijum-hidrogenkarbonata, i 32 g (najmanje 130 mmol)
čvrste mCPBA. Reakciona smeša je pod atmosferom azota mešana na sobnoj temperaturi u
toku 3 sata. Nakon toga je izdvojeni talog uklonjen filtracijom kroz celit, a filtrat uparen pod
vakuumom. Tako dobijeni zelenkasti ostatak je tretiran pentanom. Novoizdvojeni talog je
uklonjen ceđenjem. Uklanjanjem rastvarača pod vakuumom dobijeno je žuto ulje (20 g).
32
GC/MS analiza (prilog, slika P5) je pokazala prisustvo 3-trimetilsiloksikarvona, kao i
delimično desililovanih proizvoda. Sirovi proizvod je korišćen dalje bez prečišćavanja.
MS (EI, 70 eV): m/z 223(100), 181(12), 156(78), 141(35), 77(37). RI(DB5-MS) = 1345.
3.5.3 (5S,6S)- i (5S,6R)-6-Hidroksi-5-izopropenil-2-metil-2-cikloheksenon (i3a i i3b)
Sirova smeša proizvoda (20 g) i2a i i2b rastvorena je u 200 mL metanola. Uz mešanje, u
nju je dodato 6 mL 48% vodenog rastvora HF (173,4 mmol). Reakciona smeša je mešana na
sobnoj temperaturi u toku 1 sata. Nakon toga, u smešu je dodato 250 mL vode, pa je onda
pažljivo neutralisana dodavanjem čvrstog natrijum-hidrogenkarbonata. Smeša je ekstrahovana
6 puta sa po 100 mL EtOAc. Sjedinjeni organski slojevi su sušeni nad bezvodnim magnezijum-
sulfatom, pa su sušilo i rastvarač uklonjeni. Zaostalo tamno-žuto ulje je prećišćeno
hromatografijom. Kao eluent je korišćena smeša heksan/EtOAc = 8:2 (v/v). Na ovaj način su
dobiveni čisti i3a i i3b. Identifikacija je vršena na osnovu GC/MS i 1H NMR metoda (dobijeni
rezultati su bili u saglasnosti sa literaturnim podacima (Lee, 2004)).
(5S,6S)-6-Hidroksi-5-izopropenil-2-metil-2-cikloheksenon, i3a (8,9 g, ukupni prinos u
odnosu na karvon 42%): 1H NMR (300 MHz, CDCl3), δ (ppm): 6,65 (m, 1H), 4,82 (s, 1H),
4,68 (s, 1H), 4,39 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 3,63 (s, 1H), 3,15 (s, 1H), 2,74-2,47 (m, 3H), 1,80 (s,
3H), 1,66 (s, 3H); MS (EI, 70 eV): m/z 166(2), 148(41), 137(20), 82(100), 54(25); RI(DB5-
MS)=1233.
(5S,6R)-6-Hidroksi-5-izopropenil-2-metil-2-cikloheksenon, i3b (4,2 g, ukupni prinos u
odnosu na karvon 19%): 1H NMR (300 MHz, CDCl3), δ (ppm): 6,77 (m, 1H), 4,95-4,96 (m,
2H), 4,17 (d, J = 12,7 Hz, 1H), 3,80 (s, 1H), 2,74-2,67 (m, 1H), 2,49-2,42 (m, 2H), 1,86 (s,
6H); MS (EI, 70 eV): m/z 166(5), 148(21), 137(31), 82(100), 54(26); RI(DB5-MS)= 1244.
3.5.4 (1S,2R,6S)- i (1S,2S,6S)-6-Izopropenil-3-metil-3-cikloheksen-1,2-diol (i4a i i4b)
U ohlađeni rastvor (0 °C) 5 g (30 mmol) i3a u 60 mL suvog THF-a dodato je, uz intenzivno
mešanje, 2,2 g LiAlH4 (57,8 mmol). Smeša je nakon toga mešana u toku 5,5 sati na sobnoj
temperaturi. Nakon isteka ovog vremena, ponovo je ohlađena do 0 °C, razblažena sa 30 mL
33
EtOAc i isprana 1 M vodenim rastvorom HCl. Nakon sušenja nad bezvodnim magnezijum-
sulfatom, sušilo je uklonjeno ceđenjem, a rastvarač na rotacionom vakuum uparivaču. Sirovi
proizvod je prečišćen kolonskom hromatografijom (izokratski, etil-acetat/metilen-hlorid = 1:3,
v/v)
(1S,2R,6S)-6-Izopropenil-3-metil-3-cikloheksen-1,2-diol (2,48 g; prinos 49,2%). 1H NMR
(300 MHz, CDCl3), δ (ppm): 5,59 – 5,53 (m, 1H), 4,98 – 4,95 (s, 1H), 4,91 (s, 1H) 4,04 (bs,
1H), 3,65 (dd, J = 11,4, 3,9 Hz, 1H), 2,45 – 2,20 (m, 2H), 2,19 – 1,98 (m, 3H), 1,85 (br s, 3H),
1,76 (bs, 3H); MS (EI, 70 eV): m/z 168(1), 150(18), 132(12), 117(13), 107(11), 91(22),
84(100), 67(8), 55(13), 41(13); RI(DB5-MS)=1250.
(1S,2S,6S)-6-Izopropenil-3-metil-3-cikloheksen-1,2-diol (1,65 g; prinos 32,8%): 1H NMR
(300 MHz, CDCl3), δ (ppm): 5,44–5,36 (m, 1H), 4,93 (br s, 1H), 4,89 (s, 1H), 4,04 (d, J = 7.2,
1H), 3,62 (dd, J = 11,6, 7,5 Hz, 1H), 2,53 – 2,28 (m, 3H), 2,21–1,96 (m, 2H), 1,77–1,72 (m,
6H). MS (EI, 70 eV): m/z: 168(1), 150(17), 132(12), 117(12), 107(11), 91(22), 84(100), 67(8),
55(13), 41(13); RI(DB5-MS)=1247.
3.5.5 (2E,5S)-2-Metil-5-(prop-1-en-2-il)heks-2-endial (i5)
U rastvor jedinjenja i4a (2 g, 11,8 mmol) u MeCN (50 mL) je uz mešanje, na sobnoj
temperaturi, dodato je 5,5 g Pb(OAc)4 (11,8 mmol). Nakon mešanja u toku sat vremena,
reakciona smeša je razblažena dietil-etrom, isprana 1 M HCl, sušena preko MgSO4. Nakon
uklanjanja sušila filtriranjem, a rastvarača pod vakuumom, dobijeno je 1,8 g sirovog proizvoda.
1H NMR (300 MHz, CDCl3), δ (ppm): 9,59 (d, J = 1.1 Hz, 1H), 9,37 (s, 1H), 6,39 (tq, J = 7,2,
1,2 Hz, 1H), 5,15 (brs, 1H), 4,95 (brs, 1H) 3,19 (t, J = 6,9 Hz, 1H), 2,83 (dddq, J = 15,4, 7,9,
6.9, 1,0 Hz, 1H), 2,60 (dddq, J = 15,4, 7,9, 7,8, 1,0 Hz, 1H), 1,77 (brs, 3H), 1,75 (brs, 3H). MS
(EI, 70 eV): m/z: 166(1), 151(15), 137(91), 123(33), 120(34), 109(79), 95(47), 83(100), 67(80),
55(95), 41(54); RI(DB5-MS)=1232.
3.5.6 (2E,5S)-2-Metil-5-(prop-1-en-2-il)heks-2-en-1,6-diol (i6)
U ohlađeni rastvor rastvor (0 °C) 1,8 g (oko 10 mmol) sirovog proizvoda i5 u 40 mL suvog
34
THF-a dodato je, uz intenzivno mešanje, 0,85 g LiAlH4 (21,9 mmol). Smeša je nakon toga
mešana u toku 5,5 sati na sobnoj temperaturi. Nakon isteka ovog vremena, ponovo je ohlađena
do 0 °C, razblažena sa 30 mL EtOAc i isprana 1 M vodenim rastvorom HCl. Nakon sušenja
nad bezvodnim magnezijum-sulfatom, sušilo je uklonjeno ceđenjem, a rastvarač na rotacionom
vakuum uparivaču. Sirovi proizvod je prečišćen kolonskom hromatografijom (etil-
acetat/metilen-hlorid = 1:3, v/v), čime je dobijeno 1,11 g jedinjenja i6. Prinos 2 koraka,
polazeći od jedinjenja i4a, bio je 55%.
1H NMR (300 MHz, CDCl3), δ (ppm): 5,39 (m, 1H), 4,92 (br s, 1H), 4,82 (brs, 1H), 3,98 (s,
2H), 3,64 - 3,42 (m, 2H), 2,31 (tt, J = 7,4, 6,5 Hz, 1H), 2,21 - 2,06 (m, 2H), 1,94 (br s, 1H),
1,75 (br s, 1H), 1,70 (brs, 3H), 1,66 (brs, 3H); MS (EI, 70 eV): m/z 152(14), 137(46), 121(75),
107(49), 93(65), 79(47), 68(99), 67(97), 55(55), 43(100); RI(DB5-MS)=1341.
3.5.7 Sinteza (2E,5S)-2-Metil-5-(prop-1-en-2-il)heks-2-en-1,6-diil-diizovalerata
Diol i6 (1 eq., 100 mg, 0,6 mmol), izovalerijanska kiselina (2,1 eq, 126 mg, 1,24 mmol),
N,N’-dicikloheksilkarbodiimid (DCC, 2,5 eq, 300 mg, 1,5 mmol), 4-(dimetilamino)piridin
(DMAP, 0,7 eq, 50 mg, 0,4 mmol) i 20 mL anhidrovanog CH2Cl2 mešani su preko noći na
sobnoj temperaturi zaštićeni od uticaja spoljašnje atmosfere kalcijum-hloridnom cevčicom.
Nakon hlađenja reakcione smeše na ledenom kupatilu, izdvojeni talog N,N’-dicikloheksiluree
je odvojen filtracijom. Zatim je dodato 10 mL pentana i smeša ponovo filtrirana. Rastvarač je
uklonjen destilacijom na rotacionom-vakuum uparivaču. Sirovi proizvod reakcije je prečišćen
kolonskom hromatografijom (izokratska hromatografija; eluent: heksan/EtOAc=19:1, v/v).
Dobiveno je 164 mg proizvoda (prinos 81%). 1H NMR spektar je dat na slici 4.14. Rezultati
GC/MS analize su dati u prilogu.
1H NMR (300 MHz, CDCl3), δ (ppm): 5,39 (t, J = 7,3 Hz, 1H), 4,85 (t, J = 2,0, 1H), 4,74 (brs,
1H), 4,56 (s, 2H), 4,10 – 3,98 (m, 2H), 2,42 (tt, J = 7,0, 6,6 Hz, 1H), 2,28 – 1,98 (m, 7H), 1,7
– 1,60 (brs, 7H), 0,94 (d, J = 6,5 Hz, 6H), 0,93 (d, J = 6,5 Hz, 6H); MS (EI, 70 eV): m/z 135(25),
134(60), 119(69), 107(13), 106(14), 105(14), 93(23), 85(100), 57(84), 41(22); RI(DB5-
MS)=2102.
35
4 REZULTATI I DISKUSIJA
36
4.1 Rezultati GC/MS analize uzorka etarskog ulja dobivenog iz korena
vrste A. absinthium
Rezultati GC/MS analize uzorka etarskog ulja dobivenog iz korena biljne vrste A.
absinthium, sumirani su u tabeli 4.1. Odgovarajući ukupni jonski hromatogram (TIC
hromatogram) dat je na slici 4.1. Od 68 jedinjenja navedenih u tabeli 4.1, koji su činili ukupno
98% analiziranog ulja (procenti se odnose na udeo površine ispod pika koji odgovara
konkretnom sastojku u ukupnoj površini ispod ukupne jonske struje) pretragom Wiley, NIST,
MassFinder i Adamsove baze podataka, kao i relevantne literature, a na osnovu podudarnosti
masenih spektara i retencionih indeksa, uspešno je identifikovano 59 jedinjenja koja su činila
92% ukupnog jonskog hromatograma. Čak 89,4% uzorka su činili monoterpeni (na primer,
monoterpeni iregularnog skeleta, MI: 25,5%; monoterpeni acikličnog skeleta, MA: 17,9%;
monoterpeni p-mentanskog skeleta, MP: 14,6%). Interesantno je da su monoterpeni tujanskog
tipa, često dominantni sastojci ulja nadzemnog dela iste vrste, činili tek 0,9% uzorka.
Slika 4.1. Ukupni jonski hromatogram uzorka etarskog ulja dobivenog iz korena biljne vrste
A. absinthium (temperaturni program 1, videti eksperimentalni deo)
37
Tabela 4.1. Hemijski sastav uzorka etarskog ulja dobivenog iz korena biljne vrste A.
absinthium
RI (DB-5MS) Jedinjenje % Klasa
926 α-Tujen 0,1 MT
936 α-Pinen 1,1 MP
952 α-Fenhen 17,4 MP
974 Sabinen 0,5 MT
982 β-Pinen 1,5 MP
988 β-Mircen 9,0 MA
1010 α-Felandren 6,8 MM
1019 α-Terpinen 0,1 MM
1026 p-Cimen 2,6 MM
1031 Limonen 1,0 MM
1034 β-Felandren 0,5 MM
1044 (E)-β-Ocimen 0,1 MA
1059 γ-Terpinen 0,1 MM
1086 Terpinolen 0,1 MM
1113 (E)-4,8-Dimetilnona-1,3,7-trien 0,1 O
1121 β-Tujon 0,1 MT
1126 cis-p-Ment-2-en-1-ol 1,4 MM
1144 trans-p-Ment-2-en-1-ol 0,9 MM
1151 Kamfor 0,1 MB
1163 Lavandulol 1,0 MI
1165 2-Metoksi-3-(1-metilpropil)pirazin 0,1 O
1175 endo-Borneol 0,5 MB
1179 Terpinen-4-ol 0,2 MT
1195 Metil-salicilat 0,7 O
1200 cis-Piperitol 0,3 MM
1211 trans-Piperitol 0,4 MM
1216 Fragranol 0,2 MI
1225 Nerol 0,2 MA
1229 Timol-metiletar 0,1 MM
1236 Heksil-2-metilbutanoat 0,1 O
1249 cis-Mirtanol 0,2 MP
1252 trans-Mirtanol 0,1 MP
1253 Metil-citronelat 0,1 MA
1254 Piperiton 0,1 MM
1282 Lavandulil-acetat 4,1 MI, E
1286 endo-Bornil-acetat 9,0 MB, E
1296 trans-Pinokarvil-acetat 0,2 MP, E
1320 Metil-geranat 0,1 MA
1335 cis-Piperitil-acetat 0,2 MM, E
1342 Fragranil-acetat 1,2 MI, E
1348 Citronelil-acetat 0,2 MA, E
38
1357 Neril-acetat 0,8 MA, E
1363 Nepoznato jedinjenje 1a 0,1 N
1370 Nepoznat jedinjenje 2a 0,5 N
1373 Nepoznato jedinjenje 3a 2,1 N
1377 Nepoznato jedinjenje 4a 2,4 N
1381 cis-Mirtanil-acetat 0,1 MP, E
1385 trans-Mirtanil-acetat 0,2 MP, E
1391 β-Elemen 0,1 S
1415 Lavandulil-izobutanoat 7,6 MI, E
1447 Neril-propanoat 0,1 MA, E
1467 Nepoznato jedinjenje 5a 0,1 N
1478 Citronelil-izobutanoat 0,9 MA, E
1483 Neril-izobutanoat 2,6 MA, E
1491 Nepoznato jedinjenje 6a 0,3 N
1501 Lavandulil-izovalerat 5,3 MI, E
1503 Lavandulil-2-metilbutanoat 3,8 MI, E
1506 Geranil-izobutanoat 0,9 MA, E
1510 Nepoznato jedinjenje 7a 0,4 N
1517 Isobornil-izovaletar 0,1 MB, E
1566 Citronelil-2-metilbutanoat 0,8 MA, E
1569 Fragranil-2-metilbutanoat 1,1 MI, E
1571 Lavandulil-valerat 0,8 MI, E
1575 Fragranil-izovalerat 0,4 MI, E
1577 Neril-izovalerat 2,1 MA, E
1692 Metil-3-(5-(prop-1-in-1-il)tiofen-2-il)propanoat 0,7 O
2011 Nepoznato jedinjenje 8a 0,4 N
2102 Nepoznato jedinjenje 9a 0,7 N
Ukupno 98,0
MA, aciklični monoterpeni 17,9
MB, monoterpeni bornanskog skeleta 9,6
MI, monoterpeni iregularnog skeleta 25,5
MM, monoterpeni p-mentanskog skeleta 14,6
MP, monoterpeni pinanskog skeleta 3,4
MT, monterpeni tujanskog skeleta 0,9
E, estri monoterpenskih alkohola 42,3
S, seskviterpeni 0,1
O, ostali 1,7
N, neidentifikovana jedinejnja 6,0%
a Maseni spektri (EI, 70 eV) neidentifikovanih jedinjenja, dati u formi m/z (int%)- nepoznato jedinjenje 1: 136(46), 121(56), 107(33), 93(100), 79(23),
69(22), 68(23), 67(43), 43(56), 41(25); nepoznato jedinjenje 2: 136(43), 121(87), 108(22), 107(40), 95(21), 94(21), 93(100), 79(29), 67(51), 43(65);
nepoznato jedinjenje 3: 136(54), 121(74), 107(34), 95(29), 93(100), 81(44), 80(30), 79(41), 67(32), 43(75); nepoznato jedinjenje 4: 136(46), 121(69),
95(32), 94(30), 93(100), 81(34), 80(32), 79(36), 67(30), 43(63); nepoznato jedinjenje 5: 136(46), 121(69), 109(24), 108(76), 93(87), 79(25), 69(51),
57(33), 43(29), 41(40); Nepoznato jedinjenje 6: 136(96), 121(100), 107(41), 93(79), 81(37), 79(44), 71(29), 69(41), 43(48), 41(38); Nepoznato
jedinjenje 7: 136(48), 121(80), 107(38), 93(100), 81(46), 80(33), 79(38), 67(32), 43(43), 41(34); Nepoznato jedinjenje 8: 135(32), 134(82), 119(100), 105(22), 93(35), 85(97), 71(54), 57(64), 43(66), 41(30); Nepoznato jedinjenje 9: 135(25), 134(60), 119(69), 107(13), 106(14), 105(14), 93(23),
85(100), 57(84), 41(22).
39
Glavni sastojci su bili -fenhen (17,4%), mircen (9,0%), -felandren (6,8%), endo-bornil-
acetat (9,0%), i lavandulil-izobutanoat (7,6%). Uopšteno govoreći, ovde dobijeni rezultati su u
saglasnosti sa prethodnim koji se tiču ulja korena iste vrste (Kennedy i sar., 1993; Llorens-
Molina i Vacas, 2015; Llorens-Molina i sar., 2016; Blagojević i sar., 2006) po pitanju
klase/identiteta najzastupljenijih sastojaka. Na primer, u ovom, kao i u svim do sada
analiziranim uzorcima glavni sastojak je bio -fenhen. Takođe, i ovde je nađen visoki sadržaj
estara monoterpenskih alkohola (42,3%). Ipak, distribucija sastojaka po klasama, i njihova
pojedinačna zastupljenost (ovo se lako uočava poređenjem podataka sumiranih u tabeli sa
prethodno objavljenim rezultatima), a pored toga i prisustvo estara iregularnog monoterpena
fragranola, ukazuju da bi pomenuti uzorak ipak mogao odgovarati novom hemotipu A.
absinthium.
4.2 Nepoznata jedinjenja u uzorku etarskog ulja dobivenog iz korena
biljne vrste A. absinthium
Pojedini sastojci analiziranog ulja (nepoznata jedinjenja 1 do 9, tabela 4.1) nisu mogli biti
identifikovani na osnovu pretrage dostupnih baza podataka. Posebno interesantnim su se
učinila jedinjenja sa retencionim indeksima 2011 i 2102 (nepoznata jedinjenja 8 i 9, ukupno
zastupljena sa 1,1% u uzorku). Ova jedinjenja su imala relativno jednostavnu, međusobno
uporedivu fragmentaciju (intenzivni joni na m/z 119 i 134), koja je (zbog prisustva jona na m/z
43 i 71, odnosno m/z 57 i 85) ukazivala na to da se možda radi o estrima (izo)buterne i/ili
(izo)valerijanske kiseline. Indeksi ovih jedinjenja "padali" su u oblast diterpena, što je
ukazivalo na to da bi mogli imati oko 20 ugljenikovih atoma.
Da bi potencijalno bio utvrđen identitet ovih jedinjenja, etarsko ulje je frakcionisano sa
ciljem da se pomenuti sastojci izoluju u čistom stanju. To je izvršeno korišćenjem kolonske
hromatografije na silika-gelu, izokratskom metodom, uz smešu heksana i etil-acetata u odnosu
19:1 (v/v) kao mobilne faze. Iz 1,0 g etarskog ulja, dobiveno je 15 mg frakcije čiji je TIC
hromatogram, sa uvećanjem i masenim spektrima pojedinih sastojaka, prikazan na slici 4.2.
Ova frakcija, koja je za glavne sastojke imala pomenuta nepoznata nova jedinjenja, sadržala je
još nekoliko sastojaka, prisutnih u tragovima. Na slici 4.2 je pored zavisnosti ukupne jonske
struje od vremena (TIC hromatogram), data još i vremenska zavisnost m/z 119 i 134 parcijalnih
jonskih stuja. Ovo je ukazalo na to da je u ulju prisutna serija jedinjenja koja su imala sličnu
fragmentaciju. Razlika u fragmentaciji se ogledala samo u jonima koji bi mogli da potiču iz
40
kiselinskog dela estra (npr. m/z 43 i 71, odnosno m/z 57 i 85). Među ovim novodetektovanim
analozima, najzastupljenije jedinjenje (odgovarajući MS spektar na slici 4.2 je obeležen sa 1;
RI 1920) bi tako moglo biti (izo)butanoat, neidentifikovano jedinjenje 9 (odgovarajući MS
spektar na slici 4.2 je obeležen sa 3; RI 2011) bi mogao biti (izo)pentaonat. Na osnovu MS
fragmentacije, činilo se da je neidentifikovano jedinjenje 8 (odgovarajući MS spektar na slici
4.2 je obeležen sa 2; RI 2102), mogao biti mešoviti (izo)butanoat/(izo)pentanoat. I razlike u
retencionim indeksima (inkrement od oko 90 RI jedinica) išle su u prilog pretpostavci da se
radi o homolozima koji su se razlikovali za po jednu CH2 jedinicu.
Kako se na osnovu ovih preliminarnih rezultata moglo očekivati da dominantne sastojke
frakcije, zbog njihove veoma slične strukture (estri dve homologe alifatične kiseline), neće biti
lako razdvojiti, a kako je na raspolaganju bilo tek 15 mg ove smeše, frakcija nije dalje
prečišćavana, već je direktno analizirana primenom 1D i 2D NMR metoda. Odgovarajući NMR
spektri su prikazani na slikama 4.3-4.8.
41
Slika 4.2. Ukupni (TIC, označeno crnom bojom) i parcijalni jonski hromatogrami (m/z 119
(zeleno) i 134 (plavo), redom) hromatografske frakcije etarskog ulja A. absinthium
(temperaturni program 1, videti eksperimentalni deo); maseni spektri (odozgo naniže) –
jedinjenje u tragovima koje nije detektovano u ukupnom ulju (1; RI 1920), neidentifikovano
jedinjenje 8 (2; RI 2011), neidentifikovano jedinjenje 9 (3; 2102)
Rezultati 13C NMR analize su potvrdili da nepoznata jedinjenja sadrže estarsku
funkcionalnu grupu (4 signala u oblasti od 178 do 173 ppm, od kojih su tri bila uporedivog
intenziteta, a jedan približno trostruko intenzivniji), odnosno, glavni sastojci frakcije sadržali
su četiri različite estarske grupe. Ovo je ukazalo na to da jedinjenja, kako se na osnovu MS za
nepoznato jedinjenje 8 činilo (prisustvo jona sa m/z 43/71 (ostatak (izo)buterne kiseline) i m/z
57/85 (ostatak (izo)valerijanske kiseline)), sadrže po dve estarske grupe, ali i da je frakcija
možda složenija nego što se to na prvi pogled, na osnovu rezultata GC/MS analize, činilo
(frakcija sačinjena ne od dva, nego više dominantnih jedinjenja uporedive zastupljenosti).
Slično se moglo zaključiti i na osnovu protonskog spektra, koji je još ukazao da su
najzastupljeniji sastojci frakcije estri izovalerijanske, izobuterne i 2-metilbutanske kiseline,
kao i na to da u uzorku "ima" najviše ekvivalentnih ostataka izovalerijanske kiseline (signali u
oblasti 1,05-0,82 ppm i 1,17-1,10 ppm). Iz DEPT-135 (slika 4.5) spektra se moglo zaključiti
42
da najzastupljeniji sastojci frakcije sadrže ukupno 4 CH2 grupe direktno vezane za kiseonik.
Na osnovu HSQC spektra je bilo očigledno da je jedna od ovih grupa (4,44 ppm/69,7 ppm)
vezana još i za C-atom koji nije protonovan. Ovo nije važilo za ostale tri (signali odgovarajućih
protona su bili preklopljeni). Još je bilo interesantno da je integral za protone na 4,44 ppm bio
približno jednak onom za protone u oblasti 4,11-3,98 (dodatne tri CH2 grupe).
Slika 4.3. 13C NMR spektar hromatografske frakcije etarskog ulja A. absinthium
43
Slika 4.4. 1H NMR spektar hromatografske frakcije etarskog ulja A. absinthium
Slika 4.5. Deo DEPT-135 spektra hromatografske frakcije etarskog ulja A. absinthium
44
Slika 4.6. HSQC spektar hromatografske frakcije etarskog ulja A. absinthium
Slika 4.7. HMBC spektar hromatografske frakcije etarskog ulja A. absinthium
45
Slika 4.8. NOESY spektar hromatografske frakcije etarskog ulja A. absinthium
Ovo je dalje ukazalo da se najverovatnije radi o smeši uporedivih količina tri diestra istog
diola i da je kod sva tri jedna od estarskih pozicija ekvivalentna (estar izovalerijanske kiseline).
Na osnovu pomeranja iz protonskog spektra, pretpostavljeno je da je druga pozicija
esterifikovana izovalerijanskom, izobuternom i 2-metilbutanskom kiselinom.
Protoni na 5,41 (multiplet), 4,84 i 4,74 ppm (široki singleti) ukazali su da diol sadrži 2
dvogube veze, od kojih je jedna terminalna (ovo je zaključeno na osnovu rezultata HSQC
analize). Dalje informacije o strukturi su dobivene kombinacijom rezultata HSQC, HMBC i
NOESY analiza (slike 4.6 – 4.8), koji su ukazali da bi diol mogao biti (E)-2-metil-5-(prop-1-
en-2-il)heks-2-en-1,6-diol (odnosno hidroksilovani lavandulol). Konfiguracija neterminalne
dvogube veze pretpostavljena je na osnovu jasne NOESY interakcije između protona CH2
grupe na 4,44 ppm i olefinskog protona na 5,51 ppm. Takođe, uočene HMBC interakcije
sugerisale su da je novouvedena OH grupa esterifikovana izovalerijanskom kiselinom, a i da
je OH grupa koja se nalazi u istom položaju kao ona kod lavandulola esterifikovana
izovalerijanskom, 2-metilbutanskom i izobutanskom kiselinom (slika 4.9 a - c). Pošto je
analizirano ulje sadržalo i lavandulol i njegove estre, ova preliminarna identifikacija se činila
smislenom. Takođe, na osnovu masenog spektra i razlike u retencionom indeksu,
najverovatnije je detektovan i diizobutil estar lavandulola (slika 4.9 d). Ipak, kako bi
46
identifikacija bila nedvosmisleno potvrđena, bilo je neohodno sintetisati bar jedan od
identifikovanih estara.
Slika 4.9. Potencijalne strukture novih jedinjenja
4.3 Sinteza hidroksilavandulola i potvrda identiteta novih jedinjenja
Kim sa saradnicima (2011) je već ranije, proučavajući primenljivost novorazvijene metode
za selektivnu deoksigenaciju alilnih-alkohola, sintetisao nekoliko različitih diestara (E)-2-
metil-5-(prop-1-en-2-il)heks-2-en-1,6-diola. Sinteza je bazirana na (R)-karvonu (8, slika 2.1)
kao lako dostupnom polaznom materijalu (Kim i sar., 2011). Vodeći se istom strategijom, i
nepoznato jedinjenje 9 (tabela 4.1), koje bi moglo biti diestar (E)-2-metil-5-(prop-1-en-2-
il)heks-2-en-1,6-diola i izovalerijanske kiseline, moglo bi biti sintetisano od (R)-karvona
(retrosintetska šema je data na slici 4.10).
Prvi korak sinteze koja odgovara pomenutoj retrosintetskoj analizi je uvođenje OH-grupe
u -položaj u odnosu na karbonilnu-grupu. Kim i saradnici, kao i Lee (2004), uspeli su da to
uspešno izvedu pomoću Rubotomove oksidacije (mehanizam ove reakcije dat je u poglavlju
2.2). Iz tog razloga, bilo je neophodno najpre (R)-karvon prevesti u trimetilsilil-enol-etar.
Reakcija je vođena u suvom THF-u, korišćenjem LDA kao sterno zaštićene, nenukleofilne baze
(slika 4.11). Za razliku od Kima i saradnika (2011), kao i Lee-a (2004), LDA nije generisan in
situ, već je korišćen komercijalni 2M rastvor baze. Postupak je u svemu ostalom (temperatura
i način obrade reakcione smeše) bio identičan onom koji je opisao Kim (2011).
47
Slika 4.10. Retrosintetska šema dobijanja diizovalerata hidroksilavandulola
Sirovi silil-enol-etar (jedinjenje i1) nije prečišćavan (u prilogu je dat odgovarajući maseni
spektar, kao i 1H, 13C i HSQC spektri), već je direktno korišćen u reakciji oksidacije. Korišćeni
su tipični uslovi za Rubotomovu oksidaciju (Lee, 2004). Dobijeni sirovi proizvod (TIC
hromatogram i MS za i2 su dati u prilogu), koji se mahom sastojao od silil-enol-etra i2 (smeša
dva dijastereomera), kao i izvesne količine desililovanih alkohola i3a i i3b, direktno je, bez
prečišćavanja, podvrgnut desililovanju pomoću vodenog rastvora HF (Lee, 2004). Proizvodi
reakcije su razdvajani izokratskom kolonskom hromatografijom, što je omogućilo dobijanje
čistih hidroksiketona i3a i i3b. Identitet ovih jedinjenja je utvrđen na osnovu poređenja 1H
NMR spektralnih podataka sa odgovarajućim literaturnim vrednostima (Kim i sar., 2011; Lee,
2004). Dijastereomer i3a je dobijen u približno dvostruko većem prinosu od i3b, a ukupni
prinos za oba jedinjenja, izražen u odnosu na karvon, iznosio je 61%.
Slika 4.11. Uvođenje OH-grupe u -položaj karvona i redukcija rezultujućeg ketona do diola
Sledeća reakcija, redukcija hidroksiketona do diola (slika 4.11), vršena je korišćenjem
čistog izomera i3a praćenjem ranije opisanog postupka (Kim i sar., 2002), a dobijena je smeša
48
dijastereomera i4a i i4b, u približnom odnosu 1,5:1. Ukupan prinos, nakon prećišćavanja
kolonskom hromatografijom koja je omogućila razdvajanje izomera, bio je 82%. 1H NMR
spektralni podaci za ova jedinjenja su bili u saglasnosti sa onima koje su objavili Kim i
saradnici (2011). Za sledeću reakciju je korišćen samo izomer i4a, koji je oksidovan pomoću
olovo-tetraacetata do diala i5 (videti prilog i eksperimentalni deo). Sirovi dial je odmah nakon
obrade reakcione smeše, bez prečišćavanja, redukovan do alkohola i6 (Kim i sar., 2011).
Slika 4.12. Raskidanje C-C veze diola pomoću olovo-tetraacetata i redukcija rezultujućeg
dialdehida do dialkohola
Konačno, ciljno jedinjenje, koje bi, na osnovu rezultata GC/MS i NMR analize uzorka
dobijenog frakcionisanjem etarskog ulja vrste A. absinthium, trebalo da odgovara nepoznatom
jedinjenju 9, sintetisano je iz (E)-2-metil-5-(prop-1-en-2-il)heks-2-en-1,6-diola pomoću
Šteglihove esterifikacije.
Slika 4.13. Esterifikacija (E)-2-metil-5-(prop-1-en-2-il)heksen-2-en-1,6-diola
1H NMR sintetisanog diestra ((2E,5S)-2-metil-5-(prop-1-en-2-il)heks-2-en-1,6-diil
diizovalerat) dat je na slici 4.14. Struktura nepoznatog jedinjenja 9 (ne računajući tačnu
stereohemiju hiralnog centra) je konačno potvrđena ko-injekcijom frakcije ulja sa sintetisanim
standardom (jedinjenje c sa slike 4.9). Ovo je novo jedinjenje, koje do sada nikada nije
pronađeno u živom svetu, niti prethodno sintetisano.
Na osnovu analogije, može se pretpostaviti da nepoznato jedinjenje 8 odgovara jedinjenju
"a" sa slike 4.9. Na osnovu rezultata GC/MS analize frakcije ulja se čini da je ova frakcija
sadržala 2 dominantna jedinjenja. NMR analiza, sa druge strane, ukazala je na to da ulje sadrži
49
uporedive količine 3 jedinjenja (jedinjenja a-c, slika 4.9). Ovo, na prvi pogled, neslaganje
GC/MS i NMR rezultata bi se moglo objasniti činjenicom da su jedinjenja b i c potpuno ko-
eluirala u toku gasne-hromatografije. Ova jedinjenja, koja se razlikuju tek po položaju jedne
metil-grupe u jednom od kiselinskih ostataka diestara, trebalo bi da imaju slične MS spektre i
uporedive hromatografske osobine. Za proveru ove pretpostavke, kao i za potvrdu tačne
strukture ostalih homologa detektovanih u tragovima u frakciji ulja A. absinthium (maseni
spektar jednog od njih je dat na slici 4.2 (jedinjenje 1), i za utvrđivanje tačne stereohemije, biće
potrebna dodatna ispitivanja.
Slika 4.14. 1H NMR spektar sintetisanog standarda (2E,5S)-2-metil-5-(prop-1-en-2-il)heks-2-
en-1,6-diil-diizovalerata
50
5 ZAKLJUČAK
51
Analizom etarskog ulja korena A. absinthium detektovano je 68 jedinjenja, od čega je 59
jedinjenja uspešno identifikovano poređenjem masenih spektara i retencionih indeksa sa
literaturnim podacima. Nakon frakcionisanja etarskog ulja i NMR analize frakcije koja je bila
bogata jedinjenjima koja eluiraju na RI 2011 i 2102 (tabela 4.1), dodatno su identifikovani
diestri hidroksilavandulola i izovalerijanske, 2-metilbutanske i/ili izobutanske kiseline.
Njihova identifikacija je dodatno potvrđena i sintezom jednog od tih estara, diizovalerata.
Sinteza je izvršena u 7 koraka polazeći od karvona: 1) prevođenje karvona u trimetil-silil-enol-
etar, 2) uvođenje -OH grupe u α-položaj u odnosu na karbonilnu grupu pomoću Rubotomove
oksidacije, 3) desililovanje dobijenog proizvoda pomoću vodenog rastvora fluorovodonične
kiseline, 4) redukcija dobijenog proizvoda pomoću LiAlH4, 5) oksidacija do diala pomoću
olovo-tetraacetata, 6) redukcija proizvoda do hidroksilavandulola i 7) esterifikacija dobijenog
diola pomoću Šteglihove reakcije. Nakon ko-injekcije frakcije ulja sa dobijenim standardom,
potvrđeno je prisustvo ovog diizovalerata u etarskom ulju. Ovaj estar, kao i drugi estri
hidroksilavandulola, detektovani u ulju, predstavljaju nove prirodne proizvode.
Put koji je neophodno preći od trenutka kada se detektuje potencijalno novo jedinjenje, do
trenutka kada se pouzdano zna njegova struktura može biti veoma težak i dug. Klasični pristup
analizi etarskih ulja podrazumeva poređenje masenih skenova iz ukupnog jonskog
hromatograma sa onima sakupljenim u okviru odgovarajućih baza podataka, kao i poređenje
eksperimentalno određenog retencionog indeksa datog jedinjenja sa literaturno dostupnim
retencionim indeksom. Da su maseni spektri ovde razmatranih novih jedinjenja bili dostupni u
nekoj od takvih baza, za njihovu identifikaciju bi bilo potrebno svega nekoliko sekundi,
odnosno nekoliko desetina hiljada puta manje vremena. Naravno, mnogo pouzdaniji rezultat
se dobija kada se umesto oslanjanja na prosto poređenje retencionih indeksa i masenih spektara
identitet jedinjenja potvrdi ko-hromatografijom sa odgovarajućim standardom ili izolovanjem
jedinjenja iz složenog matriksa, i njegovom daljom spektralnom analizom. Ipak, čak i ako se
na kraju ispostavi da je podudaranje npr. MS-a bila koincidencija, i dalje se mnogo toga može
zaključiti o strukturi nepoznatog jedinjenja na osnovu poznavanja strukture (pogrešnog)
kandidata iz baze (npr. jedinjenja sa gotovo identičnim MS-om, a neodgovarajućim RI-om).
Ako ništa drugo, to može biti odlična polazna tačka pri planiranju dalje strategije utvrđivanja
strukture.
Sve ovo, dakle, ide u prilog tome da baze podataka masenih spektara treba stalno
obogaćivati. Pristup "kombinatorne biblioteke", ima veliki potencijal u tom smislu. Sintezom
jedinjenja koja bi mogla nastati iz već poznatih prirodnih proizvoda nekim od poznatih
biosintetskih puteva gore pomenute baze se mogu obogatiti velikim brojem jedinjenja (derivata
52
i analoga prirodnih proizvoda). Na taj način bi se otkrivanje nekih minornih metabolita moglo
mnogostruko olakšati.
U tom smislu, rezultati iskazani u ovom master radu mogli bi biti odlična polazna tačka za
formiranje nove kombinatorne biblioteke mešovitih diestara. Uključivanje
spektralnih/retencionih podataka za jedinjenja iz takve biblioteke u relevantne baze masenih
spektara i retencionih indeksa možda bi pokazali da ovde razmatrana jedinjenja nisu tako
ograničene zasupljenosti u biljnom svetu kako se to na prvi pogled čini.
53
6 LITERATURA
54
Adams RP., 2007, Identification of Essential Oil Components by Gas Chromatography/Mass
Spectrometry, 4th edition, Allured Publishing Corporation, Carol Stream, IL
Bakkali F., Averbeck S., Averbeck D., Idaomar M., 2008, Food Chem. Toxicol., 46, 446-475
Baser KHC, Demirci F., In Berger RG (Ed.)., 2007, Flavours and Fragrances: Chemistry,
Bioprocessing and Sustainability, Springer, 43-86
Blagojević P, Radulović N, Stojanović G., 2006, J. Agric. Food Chem., 54, 4780-4789
Blagojević P., 2006, Magistarski rad: Hemijski sastav i mikrobiološka aktivnost etarskih ulja
biljnih vrsta Artemisia absinthium L. i Artemisia vulgaris L., Prirodno-matematički fakultet,
Niš, Srbija
Blagojević P.D., Pešić M.S., Radulović N.S., 2017, Nat. Prod. Com., 12 (4), 603-606
Blagojević, P., 2010, Doktorska disertacija: Novi pristup poređenju složenih smeša isparljivih
jedinjenja prirodnog porekla: veza procentualnog sastava i prinosa etarskog ulja, odnosno
sastava i usrednjenog masenog skena ukupnog jonskog hromatogram, Prirodno-matematički
fakultet, Niš, Srbija
Carnat A.P., Madesclaire M., Chavignon O., Lamaison J.L., 1992, J. Essent. Oil Res., 4, 487-
490
Fleming I., Paterson I., 1979, Synthesis, 1979 (9), 736-738
Heathcock C.H., Tice C.M., Germroth T.C., 1982, J. Am. Chem. Soc., 104 (22), 6081-6091
Hochmut D.H, Koning W.A, Joulain D., 2003, Massfinder 2.3: Software and Data Bank,
Hamburg, Germany, Available at http://www.massfinder.com.
Huang J., Yang J.R., Zhang J., Yang J., 2012, J. Am. Chem. Soc.,134 (21), 8806-8809
Kennedy A., Deans S., Svoboda K., Gray A., Waterman P., 1993, Phytochemistry, 32, 1449-
1451
Kim I.Y., Suh S.H., Lee K.I., Wolfe, R., 2016, Experimental and Molecular Medicine. 48.
10.1038/emm.2015.97
Kim J.H., Su L., Jung H., Koo S., 2011, Org. Lett., 13 (10), 2682-2685
Lee C.A., 2004, PhD Thesis: Synthesis and Studies Toward Multidrug Resistance-Modulating
Natural Products, University of Pittsburgh
Llorens Molina J.A., Vacas S., Castell Zeising V., Németh Zámboriné E., 2016, J. Essent. Oil
Res., 29 (1), 11-21
Llorens-Molina J.A., Vacas S., 2015, J. Essent. Oil Res., 27(5), 395-405
Miyashita M., Suzuki T., Yoshikoshi A., 1985, J. Org. Chem., 50 (18), 3377-3380
Neises B., Steglich W., 1978, Angew. Chem. Int. Ed., 17, 522-524
Radulović N., Blagojević P., 2013, J. Chrom. A, 1301, 190-199
55
Radulović N.S., Miltojević A.B., Stojković M.B., Blagojević P.D., 2015b, Food Res. Inter.,
78, 1-10
Radulović N.S., Mladenović M.Z., Blagojević P.D., Stojanović-Radić Z.Z., Ilic-Tomic T.,
Senerovic L., Nikodinovic-Runic J., 2013, Food Chem. Tox., 62, 554-565.
Radulović N.S., Mladenović M.Z., Randjelovic P.J., Stojanović N.M., Dekić M.S., Blagojević
P.D., 2015a, Food Chem. Tox., 80, 114-129
Rubottom G.M., Gruber J.M., Boeckman R.K., Jr, Ramaiah M., Medwid J.B., 1978,
Tetrahedron Lett. 19(47); 4603-4606
Van Den Dool H., Kratz, P.D., 1963, J. Chrom., 11, 463-471
56
7 PRILOG
57
Slika P1. Rezultati GC/MS analize sirovog proizvoda i1 (temperaturni program 2, videti
eksperimentalni deo)
58
Slika P2. 1H NMR (300 MHz) spektar jedinjenja i1
Slika P3. 1H NMR (300 MHz) spektar jedinjenja i1
59
Slika P4. HSQC (300 MHz) spektar jedinjenja i1
60
Slika P5. Rezultati GC/MS analize sirovog proizvoda i2 (temperaturni program 2, videti
eksperimentalni deo)
61
Slika P6. Rezultati GC/MS analize sintetisanog standarda (((2E,5S)-2-metil-5-(prop-1-en-2-
il)heks-2-en-1,6-diil-diizovalerat) (temperaturni program 2, videti eksperimentalni deo)