ANALISIS MICROBIOLOGICO DE ALIMENTOS

POR QUE SE ANALIZAN LOS M.O. PRESENTES EN LOS ALIMENTOS ??

• Conocemos que existen varias clases de microorganismos (alterantes, propios del alimentos y contaminantes)

• Entonces la cantidad y clase de microorganismos presentes en un alimento es indudablemente un parámetro de CALIDAD del mismo.

• Por este motivo se han establecido niveles de contaminación microbiana para mediante SU análisis saber si el alimento es apto o no para su consumo.

Que m.o. se analizan en un alimento ?

• Recuento total (cantidad de organismos viables que tiene un alimento) como un dato general del nivel de contaminación microbiana

• Pero también se requiere conocer el tipo de flora que tiene determinado alimento para conocer las posibles alteraciones del mismo: – Mohos en cereales – Bacterias psicrótrofas en un alimento refrigerado– Levaduras en un jugo de frutas – Bacterias anaerobias en un alimento empacado al vacio

Que m.o. se analizan en un alimento?

Si los alimentos son causantes de ETAS es muy importante analizar la presencia de m.o. PATOGENOS

Pero su investigación generalmente es laboriosa y requiere mucho tiempo (escasa cantidad) , por lo que generalmente se usan m.o. asociados llamados INDICADORES que para serlo deben cumplir las siguientes características :

- debe estar presente siempre que pueda estarlo el patógeno - sus cantidades deben ser elevadas para facilitar su detección - su supervivencia debe ser similar a la del patógeno

INDICADORES

• Escherichia coli generalmente se usa como INDICADOR ya que su presencia indica algún antecedente de origen fecal.

• Es útil como indicador especialmente en el agua pero en otros que proporcionan medios mas ricos (Ej : correlación con Salmonella en carne)

• Mas se utilizan como indicadores de calidad higiénica : – COLIFORMES FECALES

METODOS DE DETECCION

• Existen varios métodos de detección, pero su elección depende de varios factores :– Clase de alimento- Rapidez con que se requiere el resultado- Tipo de m.o. investigado - Equipos y reactivos con los que se cuenta- Aplicabilidad del método

METODOS DE DETECCION

1. EXAMEN DIRECTO : Se basa en ver las bacterias en el microscopio, tomando una muestra directa (para verlas se requiere por lo menos 10^ 6 bacterias/ml) las levaduras y mohos se ven mas fácilmente con aumento de 45 X . Una alternativa especialmente utilizada en leches es concentrar la muestra mediante filtración a través de un filtro de policarbonato, teñirse con naranja de acridina y utilizar un microscopio de epifluorescencia.

2. MEDIOS DE CULTIVO • Pueden ser líquidos o sólidos. Los sólidos están constituidos por

AGAR que es un polisacárido obtenido de algas rojas, cuya propiedad principal es que forma geles a concentración baja (1,5-2%), para fundirlo requiere T elevadas (baño maría en ebullición) pero para solidificar puede hacerlo aprox. a 40 C haciendo posible mezclarlo con muestras que contienen m.o. y también es estable frente a la hidrólisis microbiana.

• Existen : – Medios de cultivo generales (agar nutritivo, agar para recuento en

placa para bacterias y agar dextrosa patata para hongos)– Medios selectivos : Contienen inhibidores que permiten el crecimiento

de un solo tipo de m.o. (ej : medio con cristal violeta inhibe el crecimiento de bacterias G+ , y permite crecimiento de G-).

MEDIOS DE CULTIVO : identificación

Para reconocer los m.o. presentes en un alimento se sigue los siguientes pasos :1. Siembra : Depositar en el medio de cultivo una muestra (generalmente dilución

1-10) del alimento mediante inoculación o estriado2. Observación : luego del crecimiento microbiano (varia según el medio, humedad

y temperatura) , se obtienen colonias, las mismas que pueden observarse al microscopio mediante técnicas : examen en fresco , coloración y tinción

E.Coli : G- S.aureus : G+

3. Pruebas bioquímicas : Permiten identificar la especie y subespecie de microorganismo mediante las reacciones que producen en ciertos sustratos debido a sus características bioquímicas propias.

• BBL : Reacciones bioquímicas http://virus.usal.es/Web/demo_mr/Enterotube/EnterotubeII.htm#A

METODOS DE DETECCION

2. Técnicas de Cultivo. Las bacterias tienen un tamaño muy reducido,

por lo que para conocerlas es necesario trabajar con poblaciones (millones de m.o.), lo que se obtiene haciéndolas crecer en medios especiales, a condiciones externas e internas especificas (CULTIVO BACTERIANO)

Ejemplo : análisis de aguas http://www.laanunciataikerketa.com/microorg_metodo.pdf

Métodos de recuento : • Recuento en placa : Diluir la muestra en agua de peptona

y sembrar por duplicado en el medio de cultivo seleccionado . Para contar el numero de bacterias, la placa debe tener entre 30 y 300 colonias y se calcula su valor total en la muestra inicial

- NMP (numero mas probable ) : implica sembrar tres diluciones (1g, 0,1 g y 0,01 g) en tres tubos con el medio liquido , según den positivo se estima el numero mas probable de bacterias mediante una tabla.

3. OTROS METODOS

• Prueba de reducción de colorantes : Son pruebas sencillas y rápidas que mediante el cambio de color de un colorante permiten conocer si existe alta actividad microbiana, especialmente se usa en la industria láctea .

Los colorantes mas utilizados son azul de metileno (azul a incoloro), Resarzurina (azul a rosa y luego a incoloro )

3. OTROS METODOS PRUEBA DEL AZUL DE METILENO

• Contaminación: Con la prueba de la reductasa se estima la cantidad de microorga nismos, inocuos o patógenos, que hay en un mililitro de leche. El reacti vo es solución alcohólica de azul de metileno. Después de añadido, se calienta suavemente el líquido midiendo con un cronómetro el tiempo necesario para su decoloración. Cuanto menor es el tiempo, mayor es la contaminación.

• Muestra ensayada Tiempo de decoloración Microorganismos en

un mililitro de leche• Leche pasteurizada más de 5 horas menos de 200 000• Leche recién ordenada 2 horas 4 millones• Leche muy contaminada 20 minutos más de 20 millones

3. OTROS METODOS

• Determinación de ATP : BIOLUMINISCENCIA El ATP se encuentra en las células vivas, por tanto en los

alimentos se encontrara en cantidad directa en relación a los m.o. vivos presentes (contienen enzima luciferasa que transforman la Luciferina en luz en presencia de ATP)

La cantidad de luz medida se relaciona con la cantidad de m.o. presentes. http://virus.usal.es/Web/demo_mr/lumi_UniLi

te/lumi_UniLite.html

3. OTROS METODOS

• Métodos inmunológicos : Permiten identificar antígenos específicos de la superficie de los m.o. o toxinas como la botulínica o estafilocócica, asi como las mico toxinas

• Metodología del DNA / RNA que mediante el análisis de la secuencia de bases en el genoma identifica a la especie de m.o.

BIBLIOGRAFIA

- Adams M.R. Moss M.O. Microbiologia de Alimentos, Editorial AcribiaS.A. Zaragoza (Espana) 1997 • BIOLUMINISCENCIA

http://virus.usal.es/Web/demo_mr/lumi_UniLite/lumi_UniLite.html• BBL : Rxnes bioquimicas

http://virus.usal.es/Web/demo_mr/Enterotube/EnterotubeII.htm#A- www.itescam.edu.mx/principal/sylabus/fpdb/recursos/r29473.DOC

• - MÉTODOS DE ESTUDIO Y CONTROL DE LOS MICROORGANISMOSDra. M. E. Arias Fernández, Dpto. Microbiología y Parasitología