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espectrofotometría UV

Análisis cualitativo por Espectrofotometría UV de fármacos de abuso en plasma.

Cepeda, A.; Paseiro, P. y Simal, J.

Palabras clave: Sep Pak C18, espectroscopía UV, barbitúricos, ácido salicílico, cafeína, teofilina.

Se propone un método rápido y sencillo para la determinación cualitativa en plasma de barbitúricos (amobarbital, aprobarbital, barbital, butabarbital, butalbital, dial, fenobarbital, pentobarbital y seco­barbital), ácido salicílico, cafeína y teofilina, basado en un proceso de purificación de la muestra me­diante la utilización de las minocolumnas Sep PakR C18 y el examen del residuo al UV.

A quick and simple method is proposed for the qualitative determination of sorne Barbiturates in plas- · ma (Aprobarbitone, Amylobarbitone, Barbitone, Dial, Pentobarbitone, Phenobarbitone, Qinalbarbito­ne, Secbutotabarbitone and Talbutal), Salicylic acid, Cafeine and Theophylline. This method is based on the purification process of the example by the use of the cartridge Sep Pak™ C18 and the exa­mination of the purified at the spectroscopy UV.

Introducción

El incesante incremento del uso de medicamen­tos ha hecho que a parte de los beneficios obteni­dos por su utilización se produzcan envenenamien­tos e intoxicaciones, siendo los barbitúricos los fár­macos más frecuentemente implicados en sobredo­sis agudas tal y como lo demuestran Frati y colabs. (1983) en un estudio en España durante los años

Departamento de Química Analitica, Nutrición y Bromatología. Universidad de Santiago de Compostela.

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1974-1980. Otros fármacos, como los salicilatos, han sido causantes de intoxicaciones accidentales prin­cipalmente en niños menores de 5 años (Levine, 1982).

La necesidad de procedimientos analíticos rá­pidos para la identificación de fármacos a niveles tóxicos ha hecho que se apliquen numerosas técni­cas analíticas en el campo de la Toxicología Foren­se, entre ellas, la espectrofotometría UV, descrita am­pliamente en la bibliografía. Clarke (1969); Corner (Fiorey, 1972); Jain y Cravey (1974) la aplican para determinar barbitúricos en materiales biológicos me­diante el desplazamiento del máximo de absorción a diferentes valores de pH. Gupta y Lundberg (1973) determinan teofilina en sangre en presencia y ausen-

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espectrofotometría UV

cía de. barbitúricos. Routh (Sunshine, 1983) analiza cafeína en suero midiendo la absorbancia a 273 nm.

Así mismo, los procesos de purificación del plas­ma son muy variados, White y Graves (1974) extraen con cloroformo y reextraen con hidróxido sódico para separar fármacos áci9os y neutros. Otros autores uti­lizan columnas de purificación basadas en principios cromatográficos como son las resinas XAD-2 (Eia­hi, 1980); columnas Extrelut (Breiter y colabs, 1976) y las más recientes como son las minicolumnas de fase «reversa» Sep Pak C18 (AIIan y colabs, 1980).

Para la realización de este trabajo hemos com­binado la purificación de la muestra con minicolum­nas Sep Pak C18 y la determinación cualitativa en plasma de varios fármacos de abuso mediante es­pectrofotometría UV.

Parte experimental

Material y aparatos

- Minicolumnas de fase «reversa•• Sep Pak C18. (Watters, art. 51910)

- Jeringa de vidrio de capacidad 5 mi con aguja hi­podérmica de 8.5 cm de longitud y 0,5 mm de diá­metro interno.

-Centrífuga que alcance 4000 rpm. - Baño María. -Tubos de centrífugas de fondo conico graduados

de 10 mi. - Bomba de vacío. -Balanza analítica que aprecie hasta 0,1 mg. -Indicador de pH universal Merck art. 9535. - Espectrofotómetro UV Hitachi modelo 100-60 y re-

gistrador Hitachi de doble canal modelo 561 . -Cubetas apareadas de cuarzo de 1 cm. de

espesor. - Material de uso común en el laboratorio.

Reactivos

Los reactivos utilizados son de calidad analítica y todos los fármacos empleados cumplen las nor­mas USP XIX/BP proporcionados por Analar (ácido salicílico); Serva (teofilina); Merck (cafeína); Sandoz (butalbital); Barcia (barbital, aprobarbital, butabarbi­tal, secobarbital, pentobarbital, dial, amobarbital, fenobarbital). - Soluciones patrón concentradas de cada fárma­

co en hidróxido sódico 0,1N.- Se preparan de manera que cada mi contenga el nivel tóxico del fármaco correspondiente para 2,5 mi de plasma

técnicas de LABORATORIO • n• 141

0,7

190 220 250 280 310 340

nm

Figura 1. Espectro de absorción al UV de un "blanco de plasma».

39

¡

l r 1

espectrofotometría UV

0,7 0,,1

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190 220 250 280 310 340 190 220 250 280 310 34 0

nm nm

Figura 2. Espectro de absorción al UV del grupo de Jos barbitúricos obtenido de muestras de plasma sobrecar­gadas con 125 p.g comparado con su espectro patrón para cada componente.

40 técnicas de LABORATORIO • n° 141

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1

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espectrofotometría UV

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0,6 0,6 1 1 1

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1 1 1

0,1 1 0,1 \ 1 1 1 1

1 1 1 1 1

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190 220 250 2 80 310 340 190 220 250 280 310 340 nm nm

Figura 3. Espectro de absorción al UV de una muestra de plasma sobrecargada con 37,5 p.g de cafeína comparado con su espectro patrón.

técnicas de LABORATORIO • n° 141 41

espectrofotometría UV

0,7 0,7 1 1 1 1 1 1 1

1 1

0,6 ----- pH= 1 0,6 1 ----- pH= 1 1

-pH=10 1

-p~!= 10 1 1 1 1 A273 o,s 0,5 1 1

Az73 1

' 1

0,4 0,4 1 patrón muestra 1 1 1 1 1

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' 1 1 1 1 l 1 1 \ 1

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' 1 1 l 1

0,1 1 1 o, 1

190 220 250 280 310 340 190 220 250 280 310 340

nm nm

Figura 4. Espectro de absorción al UV de una muestra de plasma sobrecargada con 50 pg de teofilina comparado con su espectro patrón.

(Stead y Moffat, 1983). barbitúricos .................................. 125 ¡.¡g/ml cafeína . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 37,5 ¡.¡g/ mi salicílico, ácido .... ...... ..... ............. 500 ¡.¡g/ mi teofilina ... .. ..................... ...... ..... ... 50 ¡.¡g/ mi

- Soluciones patrón de trabajo de cada fármaco.­Se preparan por dilución 1 a 10 de las anteriores

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y ajustadas a pH 10. -Metano! -Etanol -Hidróxido sódico 0,1N y 0,01N. - Plasma humano fresco congelado de donante

único proporcionado por el Hospital General de: Galicia. El plasma se descongela en baño de

técnicas de LABORATORIO • n° 141

1 l 1 f 1 i

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-pH= 10

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1 1 patrón 1 1 1 1 1 1 1 1 l \ : 1 '.J 1 0,3

1

0,2

o' 1

190 220 250 280 310 340

nm

0.7

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

o, 1

____ pH= 1

-pH= 10

muestra

190 220 250 280 310 340

nm

Figura 5. Espectro de absorción al UV de una muestra de plasma sobrecargada con 500 pg de ácido salicílico com­parado con su espectro patrón.

agua a 30 °C. - Preparación de las muestras de plasma tipo.­

Para cada fármaco se añade 1 mi de solución pa­trón concentrada a 2,5 mi de plasma y se diluye hasta 5 mi con agua destilada.

Procedimiento

Con la muestra de plasma. -Acondicionamiento de las minicolumnas de fa­

se «reserva» Sep Pak C18: Se pasa a través de la minicolumna 5 mi de me­

tano! seguidos de 5 mi de agua destilada y 5 mi de

técnicas de LABORATORIO - n• 141

agua acidulada a pH 3 con ácido clorhídrico. -Purificación con las minicolumnas Sep Pak

C18. La solución de plasma se acidifica con 4-5 go­

tas de ácido clorhídrico 1N hasta pH aproximada­mente de 3, se centrifuga a 4000 rpm durante 5 m in, se recoge el sobrenadante con la jeringa, se lava el tubo con 5 mi de agua acidulada a pH 3. La mues­tra y las aguas de lavado se pasan a través de la minicolumna Sep Pak C18 a razón de 2 ml/min. ·Al objeto de eliminar el agua contenida en el volumen muerto de la minicolumna se realiza una pequeña succión a vacío. Posteriormente se eluye con 2 mi

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espectrofotometría UV

de etanol y la solución alcohólica se evapora a se­quedad en un Baño María. El residuo obtenido se disuelve en 0,1 mi de hidróxido sódico 0,01N y se di­luye a 10 mi ajustando el valor de pH a 10.

-Obtención de los espectros. Con la solución anterior se consiguen los espec­

tros a pH 10 y a pH 1 (acidificando con ácido clorhí­drico 1N) entre 340 y 190 nm.

Con los patrones. Se obtienen directamente los espectros a pH 10

y pH 1 con las soluciones patrón de trabajo. Por último se comparan los espectros obtenidos

para la muestra con los patrones respectivos.

Resultados

Las Figuras -1 a 5- representan los espectros de absorción al UV obtenidos a pH=10 (línea conti­nua) y pH=1 (línea punteada).

En la Figura -1- se recogen los correspondien­tes a un ··blanco de plasma ... En las Figuras restan­tes se recogen los espectros obtenidos de las solu­ciones patrón diluidas de cada uno de los fármacos estudiados así como los espectros de absorción a que han dado lugar las muestras de plasma tipo.

Discusión

El ccblanco de plasma" da lugar a una interferen­cia plasmática con un máximo de absorción a 273 nm que no depende del pH del medio.

En los barbitúricos, se observa que en los pa­trones desaparecen el máximo de absorción al cam­biar la solución de pH 10 a pH 1, este mismo efecto se produce en las muestras de plasma tipo.

La cafeína y teofilina presentan máximos de ab­sorción en la zona en la que absorbe la interferen­cia plasmática. Se puede detectar la presencia de estas sustancias (a sus niveles tóxicos) por el incre­mento cuantitativo que se produce en los valores de absorbancia con relación al ccblanco de plasma ... Además en el caso de la teofilina se produce un des­plazamiento del máximo de absorción de 274 nm (pH 10) a 270 nm (pH 1).

El ácido salicílico da un máximo de absorción a 300 nm a pH 10 y pH 1, lo que hace posible su detección, sin embargo no se ha observado el má­ximo de absorción a 235 nm a pH ácido como apa­rece en el patrón, debido a la presencia de fondo interferente plasmático.

A la vista de los resultados obtenidos, concluí-

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mas que la utilización de las minicolumnas Sep Pak C18 dan lugar a una purificación satisfactoria de las muestras de plasma, lo que permite detectar de una manera rápida y sencilla los componentes estu­diados.

Agradecimientos ·

Nuestro reconocimiento al Hospital General de Galicia por habernos facilitado de forma gratuita el plasma para realizar las muestras; así mismo, agra­decemos a la firma comercial Sandoz por suminis­trarnos también de forma gratuita el fármaco butal­bital.

Bibliografía

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