anÁlises toxicolÓgicas paula christiane soubhia laboratório de toxicologia centro de controle de...
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ANÁLISES TOXICOLÓGICASANÁLISES TOXICOLÓGICAS
Paula Christiane SoubhiaLaboratório de ToxicologiaCentro de Controle de Intoxicações
INTRODUÇÃO AO PLANEJAMENTO DE ANÁLISESINTRODUÇÃO AO PLANEJAMENTO DE ANÁLISES
NOÇÕES PARA A PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS NOÇÕES PARA A PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS
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Laboratório de Análises Toxicológicas – LATLaboratório de Análises Toxicológicas – LATAuxílio ao diagnóstico de intoxicaçõesAuxílio ao diagnóstico de intoxicações
Análises quali/quanti
Administração de antídotos
Diagnóstico diferencial
Prognóstico – nomogramas
Biomonitorização
Pesquisas: toxinologia, toxicocinética, analíticas
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InformaçõesInformações
História
Indivíduo: anamnese
Síndrome tóxica
Agente tóxico suspeito
Quantidade
Circunstância
Horário da intoxicação
PESQUISA DO AGENTE
PESQUISA DO AGENTE
TÓXICOTÓXICO
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1) Direcionamento – o que pesquisar e onde? 2) Tipos de matrizes biológicas3) Preparação da amostra
- Liberação dos analitos da matriz- Remoção de interferentes endógenos- Técnicas de extração- Aumento da seletividade e sensibilidade
4) TécnicasCCDCromatografia em fase gasosaCromatografia líquida
Planejamento da análise Planejamento da análise AMOSTRAAMOSTRA
MÉTODOMÉTODO
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Tipos de Amostras Tipos de Amostras UrgênciaUrgência Controle Controle
terapêuticoterapêuticoForenseForense OcupacionOcupacion
alalDopingDoping Amostras Amostras
alternativasalternativasSangueSangue SangueSangue VíscerasVísceras SangueSangue SangueSangue SuorSuor
UrinaUrina SalivaSaliva Produtos Produtos diversosdiversos
UrinaUrina UrinaUrina MecônioMecônio
Lav. GástricoLav. Gástrico Humor Humor vítreovítreo
SalivaSaliva UnhaUnha
ProdutoProduto CabeloCabelo
MedicamentMedicamentosos
Ar Ar exaladoexalado
SalivaSaliva
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SangueSangue
Sangue total, soro e/ou plasmaSangue total, soro e/ou plasma Matriz complexaMatriz complexa AnticoagulanteAnticoagulante HemóliseHemólise Volume: menor disponibilidadeVolume: menor disponibilidade Correlação com o efeito Correlação com o efeito Período de detecção:Período de detecção: Etanolemia: assepsia com degermante sem álcool.Etanolemia: assepsia com degermante sem álcool.
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UrinaUrinaTriagens qualitativas Triagens qualitativas
Disponível em grandes volumesDisponível em grandes volumesColeta não invasivaColeta não invasiva> Chance de encontrar a substância> Chance de encontrar a substânciaPresença de produtos de biotransformação Presença de produtos de biotransformação DulteraçãoDulteraçãoTriagemTriagemSó indicativo de uso Só indicativo de uso
Quantificação Quantificação correção com creatininacorreção com creatinina
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Conteúdo gástricoConteúdo gástrico
Análises qualitativas Análises qualitativas Coletar a 1ª porçãoColetar a 1ª porção Grande volume disponívelGrande volume disponível Agente tóxico em grandes Agente tóxico em grandes
concentrações e não concentrações e não biotransformadobiotransformado
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Amostra Amostra
ESTABILIDADEESTABILIDADE
MatrizMatriz
Tipo de agente tóxico: medicamentos, metais, praguicidasTipo de agente tóxico: medicamentos, metais, praguicidas
ARMAZENAMENTOARMAZENAMENTO
PeríodoPeríodoTubos especiais: mTubos especiais: metais (HNOetais (HNO33 10%, água deionizada) - 10%, água deionizada) - complexaçãocomplexaçãoPraguicidas (acetona) - resíduosPraguicidas (acetona) - resíduos
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ANÁLISES TOXICOLÓGICASANÁLISES TOXICOLÓGICAS
APLICAÇÃOAPLICAÇÃO ÁREASDiagnóstico clínico
Forense
Doping
Controle terapêutico
Biomonitorização
O QUE SE ESPERA ENCONTRARO QUE SE ESPERA ENCONTRAR
PROD INALTERADO/BIOTRANSFORMADOPROD INALTERADO/BIOTRANSFORMADO
QUALIQUALI
TRIAGEMTRIAGEM
QUANTIQUANTI
sensibilidadesensibilidade
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TÉCNICAS DE PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS EM TÉCNICAS DE PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS EM ANÁLISES TOXICOLÓGICASANÁLISES TOXICOLÓGICAS
A preparação de amostras pode ser A preparação de amostras pode ser considerada como uma série de operações considerada como uma série de operações unitárias necessárias para que determinada unitárias necessárias para que determinada substância (analito) possa ser detectada substância (analito) possa ser detectada pela técnica analítica de escolha.pela técnica analítica de escolha.
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ANÁLISES TOXICOLÓGICAS ANÁLISES TOXICOLÓGICAS Técnicas analíticasTécnicas analíticas
CromatográficasCromatográficasEspectrométricasEspectrométricasImunoensaiosImunoensaiosEspectrotométricasEspectrotométricasColorimétricasColorimétricas
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EQUIPAMENTOS DE CROMATOGRAFIAEQUIPAMENTOS DE CROMATOGRAFIA
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Técnicas analíticas FinalidadeCCD/HPTLC Triagem medicamentos, drogas abuso,
praguicidasCG Medicamentos, drogas, praguicidas,
solventesHPLC Medicamentos, drogas, praguicidas,
solventes
Espectrometria de Absorção Atômica (EAA)
Metais (Pb, Cd, As, Hg)
ICP TraçosEspectrometria de massas Peso molecular e características
estruturais da amostraEspectrofotometria Substância inalterada, produtos de
biotransformação e indicadores biológicos
Colorimetria MedicamentosImunoensaios Triagem e confirmaçãoEletroforese capilar Praguidas – glifosato, paraquat, drogas
de abuso
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Típicas operações em preparação de Típicas operações em preparação de amostras:amostras:
A) Liberação dos analitos da amostraA) Liberação dos analitos da amostra
B) Remoção de interferentes endógenosB) Remoção de interferentes endógenos
C) Técnicas de extraçãoC) Técnicas de extração
D) Aumento da seletividade e sensibilidadeD) Aumento da seletividade e sensibilidade
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A) Liberação dos analitos da amostraA) Liberação dos analitos da amostra
Analito na matrizAnalito na matriz
- conjugado- conjugado
- livre- livre
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BIOTRANSFORMAÇÃOMaconha - 9THC
CH3
OCH3
CH3
OH
C5H11
Delta-9-Tetraidrocanabinol (THC)
C
OCH3
CH3
OH
C5H11
OOH
Ácido 11-nor-delta-9-THC-COOH
C
OCH3
CH3
OH
C5H11
OO ácido glicurônico
Ácido 11-nor- delta -9 -THC-COOH conjugado
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SUBSTÂNCIAS CONJUGADAS SUBSTÂNCIAS CONJUGADAS
HidróliseHidrólise
- Alcalina- Alcalina
- Ácida- Ácida
- Enzimática- Enzimática
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HIDRÓLISE ALCALINA HIDRÓLISE ALCALINA
Ácido 11-nor- delta -9 -THC-COOH conjugado
3CH
nicoC
OCH3
OH
C5H11
OO ácido glicurô
Ácido 11-nor-delta-9-THC-COOH
C
OCH3
CH3
OH
C5H11
OOH
60°C
NaOH
-Vantagens:-processo mais rápido-custo baixo
- Desvantagens:-degradação de analitos
não estáveisp.ex. benzodiazepínicos
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HIDRÓLISE ENZIMÁTICA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA Esteróides Anabólicosconjugados Esteróides Anabólicos
livres55°C/1 hora
Beta glucuronidase
-Vantagens:Vantagens:-não degrada os analitos
- Desvantagens:- Desvantagens:-custo mais alto-maior tempo de reação-controle mais rigoroso das condições-enzimas podem ser inibidas por substâncias presentes nas
amostras
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B) B) Remoção de interferentes endógenosRemoção de interferentes endógenos
Uma matriz biológica consiste de muitos Uma matriz biológica consiste de muitos
componentes, como proteínas, lipídios, componentes, como proteínas, lipídios, carboidratos que podem interferir na análise.carboidratos que podem interferir na análise.
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B) B) Remoção de interferentes endógenos Remoção de interferentes endógenos - - PROTEÍNAS -PROTEÍNAS -
Matriz: sangue total/plasmaMatriz: sangue total/plasma
Determinação: fármacos (ligado/livre)Determinação: fármacos (ligado/livre)
Método: precipitação/desnaturaçãoMétodo: precipitação/desnaturação
Finalidades: precipitação em contato com a fase móvel e Finalidades: precipitação em contato com a fase móvel e obstruir a coluna cromatográficaobstruir a coluna cromatográfica
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AgentesAgentes precipitantes- alteração da precipitantes- alteração da solubilidade na solução aquosasolubilidade na solução aquosa
Ácidos: formação de sais insolúveis com a forma catiônica ormação de sais insolúveis com a forma catiônica das proteínasdas proteínas Ácido tricloroacético e ácido perclórico
Solventes orgânicos: Solventes orgânicos: solventes que são miscíveis em água como acetona, metanol, etanol e acetonitrila podem abaixar a solubilidade de proteínas.
Sais: retirada da água de solvatação e diminuição da Sais: retirada da água de solvatação e diminuição da solubilidade das proteínas – efeito salting-out : solubilidade das proteínas – efeito salting-out : ssulfato de amônio
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C) Técnicas de extraçãoC) Técnicas de extração
1) Extração líquido-líquido (LLE)
2) Extração em fase sólida (SPE)
3) Extração por head space (HS)
4) Micro extração em fase sólida (SPME)
5) Derivação
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C) Técnicas de extração C) Técnicas de extração
Transferir os analitos (matriz original) de forma adequada para análise em instrumentação cromatográfica
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ExtraçãoExtração
Propriedades físico-químicas (analitos, interferentes e Propriedades físico-químicas (analitos, interferentes e matriz)matriz)
PolaridadePolaridade
SolubilidadeSolubilidade
Estabilidade química e térmicaEstabilidade química e térmica
Clean-up – interferentes endógenos ou exógenosClean-up – interferentes endógenos ou exógenos
Concentração – sensibilidadeConcentração – sensibilidade
Tempo: 80% da análiseTempo: 80% da análise
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1) Extração líquido-líquido (LLE)1) Extração líquido-líquido (LLE)Extração direta do material biológico com um solvente imiscível com a água.Extração direta do material biológico com um solvente imiscível com a água.
Fenômeno: partiçãoFenômeno: partição
Coeficiente de partição/distribuição: Coeficiente de partição/distribuição: K= CK= C22/C/C11
pH fase aquosapH fase aquosa
proporção vol. das fasesproporção vol. das fases
↑↑ da fase extratorada fase extratora
2 ou mais extrações2 ou mais extrações
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ELLELL
urina
Solvente orgânicourina
Drogas/ metabólitos
Agitação
Centrifugação Separação da fase orgânica
Extrato
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Solvente extratorSolvente extrator Solubilidade da substância (ordem de polaridade – série Solubilidade da substância (ordem de polaridade – série
eluotrópica)eluotrópica) Baixa viscosidade – interação com a matrizBaixa viscosidade – interação com a matriz Baixo ponto de ebuliçãoBaixo ponto de ebulição Corrosão em equipamentosCorrosão em equipamentos ToxicidadeToxicidade Menos polares: matrizes biológicasMenos polares: matrizes biológicas CustoCusto Aditivos e estabilizadores de solventesAditivos e estabilizadores de solventes
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ESCOLHA DOS SOLVENTES ESCOLHA DOS SOLVENTES Drogas ácidas e neutras
acetato de etila, diclorometano, éter-isopropanol 7:3, n-hexano-éter 1:1, entre outros.
Drogas básicas e neutras álcool isoamílico 1 ou 2% em n-hexano, éter etílico,
diclorometano, n-hexano-acetato de etila 7:3, etcPraguicidas
n-hexano, éter de petróleoMetais
metil-isobutilcetona (Pb-pirrolidina ditiocarbamato de amônia)
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INFLUÊNCIA DO pH NA SOLUBILIDADEINFLUÊNCIA DO pH NA SOLUBILIDADE
Substâncias de caráter básico – extração básicaEx. anfetaminas
Matriz
Anfetamina
CH2 CHCH3
NH
H
OH --Forma ionizada
neutro
CH2 CHCH3
NH
H
Ajuste do pHAjuste do pHNaOH 2%NaOH 2%
Impurezas ácidasConvertidos em ânions
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INFLUÊNCIA DO pH NA SOLUBILIDADEINFLUÊNCIA DO pH NA SOLUBILIDADE
Substâncias de caráter ácido – Extração ácidaEx. ácido 11-nor-delta -9-THC-COOH
ácido 11-nor-delta -9-THC-COOH
C
OCH3
CH3
OH
C5H11
OOH
NeutroC
OCH3
CH3
OH
C5H11
OOH
H+
Ajuste do pHAjuste do pHHCl 5%HCl 5%
Impurezas Impurezas básicas cátionsbásicas cátions
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AJUSTE DE pHAJUSTE DE pH
Drogas ácidas e neutras Soluções ácidas (HCl diluido, NH4Cl saturado, tampão
acetato, tampão fosfato) Tampões sólidos (fosfato)
Drogas básicas e neutras Soluções alcalinas (NaOH diluído, NH4OH diluido,
Na2CO3, Na3BO3, tampão fosfato, tampão borato) Tampões sólidos (carbonato/bicarbonato)
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ELLELL
= molécula de água
+ NaCl
Na+ Cl-
CH2 CHCH3
NHH
+
Efeito Salting-outEfeito Salting-out
Melhora do coeficiente de Melhora do coeficiente de partição/distribuição entre um solv. partição/distribuição entre um solv. orgânico e a aquosaorgânico e a aquosa
Diminui a formação de emulsõesDiminui a formação de emulsões Aumenta a recuperação do analitoAumenta a recuperação do analito
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Vantagens - ELLVantagens - ELL
Fácil execuçãoFácil execuçãoNão requer instrumentação Não requer instrumentação
especialespecialBoa seletividadeBoa seletividadeGrande variedade de sistemas Grande variedade de sistemas
de extraçãode extração
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Desvantagens - ELLDesvantagens - ELL
Amostras com alta afinidade com a fase aquosaAmostras com alta afinidade com a fase aquosa Impurezas do solventeImpurezas do solventeFormação de emulsõesFormação de emulsõesToxicidade do solvente extratorToxicidade do solvente extratorGrandes volumes de amostra e solvente – resíduosGrandes volumes de amostra e solvente – resíduosProcedimento trabalhoso e demoradoProcedimento trabalhoso e demoradoDifícil automaçãoDifícil automação
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2) EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA2) EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDAExtração em Fase Sólida (SPE) A técnica de SPE é a mais utilizadas no preparo de amostras, tanto quando se quer pré-concentrar compostos de interesse, quanto em casos em que se pretende simplesmente separá-los de constituintes que possam interferir na análise.
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Fluído biológico é misturado com um adsorvente e Fluído biológico é misturado com um adsorvente e posteriormente eluido com solvente apropriado.posteriormente eluido com solvente apropriado.
Mecanismo de retenção das substânciasMecanismo de retenção das substâncias AdsorçãoAdsorção PartiçãoPartição
Mecanismos de dessorçãoMecanismos de dessorção Solvente orgânicoSolvente orgânico Dessorção térmicaDessorção térmica
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EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDAEXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA
ETAPASETAPAS1.1.Condicionamento:Condicionamento: Umidificação e ativação dos Umidificação e ativação dos2.2.Adição da amostraAdição da amostra: Retenção quantitativa do : Retenção quantitativa do
composto de interesse e remoção de parte da matrizcomposto de interesse e remoção de parte da matriz3.3.LavagemLavagem: Remoção da maioria dos componentes : Remoção da maioria dos componentes
da matriz, o que aumenta a seletividadeda matriz, o que aumenta a seletividade4.4.EluiçãoEluição: Eluição quantitativa do composto de : Eluição quantitativa do composto de
interesse na colunainteresse na coluna
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Metanol +tampão fosfato
1
Amostra + água + PI + tampão
fosfato
BEPIInterf.COC
2
Água + HCl 0,1M + metanol
3
Diclorometano/ isopropanol / NH3
(80:20:2)
4
EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDAEXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA
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EFS aparatoEFS aparato
PREENCHIMENTOPREENCHIMENTOFase sólida - Fase sólida -
empacotada em coluna (cartuchos)empacotada em coluna (cartuchos)
NaturezaNaturezaPolímeros porososPolímeros porosos
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Tipos de colunas (SPE)Tipos de colunas (SPE)
APOLARES/fase reversa: octadecil, octil, fenilAPOLARES/fase reversa: octadecil, octil, fenil
INTERAÇÕES NÃO-POLARES (Van der Waals)INTERAÇÕES NÃO-POLARES (Van der Waals)
SiC8
Octil
SiPH
Fenil
SiCHCiclohexil
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Tipos de colunas (SPE)Tipos de colunas (SPE)
Si C N
H O
CNCianopropil
Si NH
H
H
O
NH2
Aminopropil
Si O
OH
O
HH
NH
2OHDiol
POLARES/fase normal: cianopropil, diolPOLARES/fase normal: cianopropil, diol
INTERAÇÕES tipo hidrofílica: dipolo-dipolo, pontes HINTERAÇÕES tipo hidrofílica: dipolo-dipolo, pontes H
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Tipos de colunas (SPE)
- TROCA IÔNICA- INTERAÇÕES IÔNICAS (Eletrostáticas)
SiC
O
O- +NH3 RCBA
Ácido carboxílico
Si
SO3- +NH3
SCXÁcido
benzenosulfônico
Si N+(CH3)3-SO3 R
SAXTrimetil
aminopropil
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FATORES QUE AFETAM A EXTRAÇÃO EM FATORES QUE AFETAM A EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDAFASE SÓLIDA
pHpHTipo de amostraTipo de amostraVolume de amostraVolume de amostraTratamento do adsorventeTratamento do adsorvente
CondicionamentoCondicionamentoLavagemLavagemDessorção (eluição)Dessorção (eluição)
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EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDAEXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDAVANTAGENS / VANTAGENS / DESVANTAGENSDESVANTAGENS
Redução do volume da amostra e do solvente extratorRedução do volume da amostra e do solvente extrator Maior rapidez na análiseMaior rapidez na análise Aumento de eficiência da extração (recuperação)Aumento de eficiência da extração (recuperação) Não formação de emulsõesNão formação de emulsões Volume de evaporação diminuídoVolume de evaporação diminuído Maior facilidade de automaçãoMaior facilidade de automação Maior seletividadeMaior seletividade Boa reprodutibilidadeBoa reprodutibilidade Várias possibilidades de adsorventes e solventesVárias possibilidades de adsorventes e solventes Alto custo, importaçãoAlto custo, importação Viscosidade da amostra afeta o fluxoViscosidade da amostra afeta o fluxo
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3) EXTRAÇÃO POR 3) EXTRAÇÃO POR HEAD SPACEHEAD SPACE
DETERMINAÇÃO DE VOLÁTEIS
Amostra (urina, sangue ou saliva) + sulfato de sódio + PI
ESTUFA 70°C 30 min GC
seringa
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4) MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA 4) MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME(SPME)-Baseado na partição do analito entre a fibra de extração e a matriz (amostra)
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61 2 3 4 5
SPMESPME
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MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME) Fibras comercialmente disponíveis Fibras comercialmente disponíveis
Fase estacionária (espessura do filme)
Abreviação Aplicação geral
Polidimetilsiloxano (100 m) PDMS Compostos não-polares, voláteis
Polidimetilsiloxano (30um) PDMS Não-polares, voláteis e semi-voláteis
Polidimetilsiloxano (7um) PDMS Não-polares, semi e não voláteis
Polidimetilsiloxano divinilbenzeno (65um)
PDMS-DVB Polar
Poliacrilato (85um) PA Polar, uso geral, voláteis
Carboxeno-polidimetilsiloxano (75um, 85um)
CAR-PDMS Voláteis
Carbowax- divinilbenzeno (65um, 75um)
CW-DVB Polar, voláteis
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MICRO EXTRAÇÃO EM FASE MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)SÓLIDA (SPME)
Fatores que afetam a eficácia de extração por SPME:Fatores que afetam a eficácia de extração por SPME: Dimensões da fibra (comprimento, espessura);Dimensões da fibra (comprimento, espessura); Temperatura de extração;Temperatura de extração; Efeito da matriz (presença de sal, pH);Efeito da matriz (presença de sal, pH); Velocidade de agitação;Velocidade de agitação; Tempo de extração.Tempo de extração.
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MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)
Vantagens da SPME sobre a SPE e extração Vantagens da SPME sobre a SPE e extração líquido-líquido:líquido-líquido:
SimplicidadeSimplicidade PráticoPrático RápidoRápido Extração sem utilização de solventesExtração sem utilização de solventes Pode ser automatizado.Pode ser automatizado.
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5) Derivação5) DerivaçãoObjetivos:Objetivos:
- CG- CG
- Aumento da volatilidade e diminuição da - Aumento da volatilidade e diminuição da polaridadepolaridade
- Redução da degradação térmica- Redução da degradação térmica
- Aumento da resposta do detector – adição de - Aumento da resposta do detector – adição de grupamentos funcionaisgrupamentos funcionais
- Melhora da separação e a sensibilidade- Melhora da separação e a sensibilidade
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DERIVAÇÃODERIVAÇÃO
N
C
CH3
OO H
O CO
N
C
CH3
OO CH2CF2CF3
O CO
PFP/PFPA
70°C 20 min
PFP: PentafluoropropanolPFPA: Anidrido pentafluoropropiônico
Ex. Benzoilecgonina: Aumento da sensibilidade para detectores detector
de captura eletrônica
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REFERÊNCIASREFERÊNCIAS1) MCDOWALL, R.D. Sample preparation for
biomedical analysis. J. Chromatogr. B, 492, p.3-58, 1989.
2) WONG, S.H., SUNSHINE, I. Handbook of Analytical therapeutic drug monitoring and toxicology. CRC Press, 1997.
3) THEODORIDIS, G., KOSTER, E.H.M., JONG, G.J. Solid phase microextraction for the analysis of biological samples. J. Chromatogr. B, 745, 49-82, 2000.