AMPLIFIKASI GEN PENYANDI DNA POLIMERASE I TERMOSTABIL DARI Brevibacillus sp ASAL KAWAH SIKIDANG DIENG

AMPLIFICATION GENE ENCODING THERMOSTABLE DNA POLYMARASE I OF

Brevibacillus sp ISOLATED FROM SIKIDANG DIENG CREATER

D. Andang Arif Wibawa, Ratno Agung Samsumaharto Fakultas Ilmu Kesehatan, Universitas Setia Budi, Surakarta

ABSTRAK

DNA polimerase termostabil memiliki peran penting dalam penelitian biologi molecular, yaitu untuk mengamplifikasi DNA dalam proses polymerase chain reaction (PCR). DNA polimerase termostabil diekspresikan oleh mikroorganisme termofilik. Bakteri termofilik Brevibacillus sp. berhasil diisolasi dari sumber air panas kawah Sikidang Dieng, Jawa Tengah. Penelitian awal menunjukkan bahwa crude protein dari isolat Brevibacillus sp. diketahui dapat digunakan dalam PCR. Seperti halnya enzim termostabil alamiah, DNA polimerase pada isolat disintesis dalam jumlah yang sedikit dan membutuhkan teknik purifikasi yang rumit. Tujuan penelitian ini adalah melakukan isolasi gen DNA polymerase dari Brevibacillus sp. Penelitian diawali dengan melakukan amplifikasi bagian gen DNA polimerase pada genom isolat menggunakan primer spesifik. Fragmen yang teramplifikasi kemudian diisolasi, dimurnikan. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa gen DNA Pol I termostabil berhasil diamplifikasi dari DNA genom Brevibacillus sp menghasilkan fragmen berukuran ± 2,7 kb. Kata kunci : DNA Pol I termostabil, PCR, Brevibacillus sp., termofilik,

ABSTRACT Thermostable DNA polymerase has an important role in molecular biology research to amplify small amount of DNA through polymerase chain reaction (PCR). Thermostable enzymes are expressed by thermophillic microorganisms. Thermophillic bacteria Brevibacillus sp. has been isolated from Sikidang Crater, Dieng Plateu, Central Java. Previous study showed that crude protein of the isolate could be used in PCR. Unfortunately, like most native thermostable enzymes, the thermostable DNA polymerase of the isolate is synthesized in a very low level and therefore is cumbersome to purify. The purpose of this research is to clone thermostable DNA polymerase gene of the isolate. The DNA polymerase gene of the isolate was amplified by PCR method using spesific primers. The amplified fragment was then isolated, purified. The result showed that the DNA Pol I gene was successfully be amplified from the isolate DNA genom, resulting in ± 2,7 kb sequence in length. Keywords : Thermostable DNA Pol I, PCR, Brevibacillus sp , thermophilic

PENDAHULUAN

Mikroorganisme tahan panas, termofil dan hipertermofil berpotensi sebagai penghasil enzim termostabil yang berguna dalam berbagai bidang industri, kesehatan dan penelitian. Salah satu enzim termostabil yang berpotensi komersial dalam era pasar global adalah DNA

polimerase termostabil. DNA polimerase termostabil merupakan enzim yang sangat luas penggunaannya dalam biologi molekuler di bidang kesehatan, peternakan, pertanian, industri, dan penelitian. Enzim ini digunakan dalam Polymerase Chain Reaction (PCR) yaitu metode in vitro untuk mensintesis urutan DNA yang spesifik secara enzimatis menggunakan

dua primer oligonukleotida yang melakukan hibridisasi pada rangkaian dan arah berlawanan dari daerah DNA target (Erlich, 1992). Metode PCR dapat digunakan untuk diagnosis awal penyakit sel sabit penyebab anemia pada manusia. Metode ini telah dikembangkan juga untuk melakukan analisis berbagai penyakit genetik, mendeteksi agen penyebab penyakit infeksi, mengidentifikasi orang berdasar polimorfisme genetik pada loci, digunakan untuk memecahkan kasus kriminal dan menentukan hubungan orang tua dan anak. Bidang peternakan menggunakan PCR untuk menganalisis garis keturunan sehingga dalam perkawinan (sexing) didapatkan hasil keturunan yang diinginkan. Bidang pertanian menggunakan PCR untuk mendeteksi penyakit tanaman dan sifat genetik yang diinginkan yang masih dalam rangka pengawasan. Sejumlah mutasi gen tunggal selama perkembangan organisme dapat dianalisis dengan PCR tanpa melakukan kloning. Jumlah DNA yang sedikit yang diperoleh dari beberapa tempat dapat juga digunakan untuk analisis filogenetik, migrasi dan interbreeding pada manusia maupun organisme yang lain berdasar hasil PCR (Daniel, 1991).

Hingga sekarang ini semua DNA polimerase termostabil komersial yang digunakan untuk PCR diproduksi oleh negara-negara maju. Oleh karena itu penelitian ini diarahkan untuk menemukan dan memproduksi DNA polimerase baru melalui teknologi kloning. Disamping memberikan hasil kajian secara ilmiah, penelitian ini juga akan menghasilkan suatu produk yang dapat dimanfaatkan dalam biologi molekuler di bidang kesehatan, peternakan, pertanian, industri, dan penelitian serta memberi keuntungan secara komersial.

DNA polimerase termostabil Taq dari bakteri termofilik Thermus aquaticus

merupakan yang pertama yang diisolasi, dikarakterisasi dan digunakan untuk PCR. Enzim serupa telah berhasil diisolasi dari genus Thermus yang lain yaitu T. flavus, T. thermophilus HB-8, T. caldophilus GK24, T. filiformis (Choi dkk.,1999). Sejumlah DNA polimerase dari arkaea juga telah dapat ditemukan dan dikarakterisasi misalnya dari Methanococcus jannaschii (Jokela dkk., 2004), Aeropyrum pernix (Cann dkk., 1999), Pyrococcus horikoshii (Shen dkk., 2001), P. abysii (Gueguen dkk., 2001), dan P. furiosus (Uemori dkk., 1997).

Semua DNA polimerase termostabil komersial dihasilkan oleh negara-negara maju. Fakta menunjukkan bahwa kebutuhan dan harga DNA polimerase termostabil untuk PCR sangat tinggi sehingga masih terbuka peluang secara komersial. Hal ini mendorong upaya untuk mencari alternatif memanfaatkan potensi keanekaragaman hayati Indonesia sebagai sumber DNA polimerase termostabil. Hasil penelitian sebelumnya menunjukkan crude protein dari Brevibacillus sp. yang berasal dari kawah Sikidang Dieng dapat digunakan untuk PCR

(Wibawa, 2008). Penelitian tersebut mengalami kesulitan dalam isolasi DNA polimerase yang dilakukan terhadap protein isolat Brevibacillus sp mengalami kesulitan karena sebagian besar merupakan protein tahan panas. Tujuan utama penelitian ini melakukan isolasi gen penyandi DNA polimerase I isolat Brevibacillus sp yang selanjutnya pada

penelitian lanjutan akan dilakukan kloning pada vektor ekspresi.

METODE PENELITIAN

Bahan:

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah : Medium. Bahan penyusun media Luria Bertani yang dimodifikasi mengandung bacto tryptone, ekstrak khamir, NaCl, MgSO4.7H2O, CaCl2, H3BO3, Na2MoO4.2H2O. Bahan untuk PCR, Kloning dan Sekuensing Gen Penyandi DNA polimerase. Tris Base, SDS (Sodium Dodecyl Sulfate), bahan-bahan : bromophenol blue, xylene, xyanol, EDTA (asam etilen

diamina tetraasetat), kloroform, isopropanol, etanol, agarose phenol, Na-asetat, NaCl, CTAB (Hexadecyltrimethyl ammonium bromide), dan ficol type 400, etidium bromide, bead Ready to Go PCR, primer sebagai berikut : primer eksternal FPEXT (primer forward) = 5’-YCG AGG AGG GAT GAG ATT G-3’ dan RPEXT (primer reverse) = 5’-TTATTT SGC RTC RTA CCAYG-3’, dan primer internal dan Reversed 5’-ATTTCGCGTCATACCATG TC’-3, Natrium asetat, MgCl2, KCl, pipes, KOH, NaOH, CaCl2, dimethyl formamide, MgSO4, glukosa, aquadest, marker DNA 100 bp, Alat: Beberapa alat yang digunakan adalah sentrifus, vorteks, waterbath shaking, hot plate, UV transilluminator, mini gel migration through, spektrofotometer, thermocycler .

Prosedur kerja:

Analisis gen `penyandi DNA polimerase termostabil

Isolasi DNA. DNA genom diisolasi menggunakan metode preparasi mini (Ausubel dkk., 1992) yang sudah dimodifikasi. Metode ini menggunakan 1,5 ml biakan sel yang disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 5 menit. Pelet yang diperoleh kemudian diresuspensikan ke dalam 500 µl TE (0.1 M Tris-HCl, 0.1 M EDTA; pH 8) yang ditambah 40 µl lisosim (50 mg/ml) dan diinkubasi pada 37oC selama 60 menit. Ke dalam suspensi kemudian ditambahkan lagi 200 µl SDS 10 %, 100 µl NaCl 5 M, dan 80 µl CTAB, dihomogenkan dan inkubasi dilanjutkan pada suhu 68oC selama 30 menit. Kloroform kemudian ditambahkan dengan perbandingan volume yang sama 1:1, dicampur dengan hati-hati dan disentrifugasi pada 13.000 rpm selama 5 menit. Lapisan atas yang terbentuk dipindahkan ke dalam tabung mikro baru, ditambah isopropanol 0.6 x volume lapisan atas yang dipindahkan dan disentrifugasi kembali pada 13.000 rpm selama 5 menit. Pelet yang terbentuk dicuci dengan mengalirkan etanol 70 % dan dikeringanginkan, kemudian diresuspensi dalam 20 µl TE. Untuk visualisasi DNA, dilakukan elektroforesis menggunakan gel agarosa 1 %, pada tegangan 100 Volt selama 25 menit. Visualisasi pita DNA yang terbentuk dilakukan dengan perendaman gel agarosa dalam larutan etidium bromida dan kemudian diiluminasi menggunakan UV transilluminator. Pemurnian DNA. Hasil isolasi DNA dimurnikan dengan menambahkan TE hingga volume

mencapai 100 µl. Kemudian ditambah 100 µl campuran fenol: kloroform:isoamilalkohol (25:24:1) dan dihomogenkan. Campuran disentrifugasi pada 13.000 rpm selama 5 menit. Lapisan atas yang terbentuk dipindahkan ke dalam tabung mikro baru, kemudian ditambah Na-asetat 3 M dan etanol absolut, masing-masing 0.1x dan 2x volume lapisan atas yang dipindahkan. Campuran disentrifugasi kembali pada 13.000 rpm selama 5 menit, pelet yang terbentuk dicuci dengan etanol 70 %, dikering-anginkan dan kemudian diresuspensi ke dalam 20 µl TE. Untuk visualisasi DNA, dilakukan elektroforesis menggunakan elektroforesis gel agarosa 1 %, pada tegangan 100 Volt selama 25 menit. Pita DNA dilihat menggunakan UV transilluminator setelah perendaman dalam larutan etidium bromida. Amplifikasi Gen Penyandi DNA Polimerase. Pada tahap amplifikasi gen penyandi DNA

polymerase termostabil digunakan PCR dengan komposisi 1 (satu) bead Ready to Go, 2 μl primer forward (20 pmol), 2 μl primer reverse (20 pmol), 2,5 μl template DNA (<1 μg) untuk volume larutan PCR 25 μl.. Daur PCR berlangsung pada kondisi denaturasi awal 94oC, selama 5 menit dan proses selanjutnya sebanyak 25 daur yang terdiri dari denaturasi (94oC selama 45 detik), penempelan primer (50oC selama 45 detik) dan polimerisasi (72oC selama 2 menit 45 detik). Setelah akhir daur, polimerisasi dilanjutkan pada suhu 72oC selama 7 menit kemudian proses dihentikan pada suhu 4oC. DNA hasil PCR dielektroforesis pada gel agarosa 2% dan pita yang terbentuk dilihat menggunakan UV transluminator setelah perendaman dalam larutan etidium bromida.

Pemurnian produk PCR

Pemurnian produk PCR dilakukan dengan menggunakan QIAQuick Gel Extraction Kit

(Qiagen).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Lumpur kawah Sikidang Dieng, Jawa Tengah dengan suhu 90°C dan pH 4,0 telah dipilih sebagai sumber bakteri dalam penelitian ini. Bakteri dari lumpur kawah ini telah berhasil ditumbuhkan secara optimum pada media LB yang dimodifikasi pada suhu 70°C, walaupun dapat tumbuh pada suhu 80°C. Hasil identifikasi bakteri hipertermofilik isolat asal kawah Sikidang Dieng lalui pendekatan filogenetik gen 16S RNA menunjukkan bahwa gen 16S rRNAbakteri ini mempunyai kedekatan sangat tinggi dengan gen 16S rRNA genus Brevibacillus yang tergolong mesofilik (Wibawa, 2008). Isolasi DNA genom bakteri hipertermofilik isolat Brevibacillus sp. dilakukan untuk

mendapatkan DNA genom yang digunakan sebagai cetakan DNA dalam proses PCR. Adapun primer eksternal yang digunakan sebagai berikut : FPEXT (primer forward) = 5’-YCG AGG AGG GAT GAG ATT G-3’ dan RPEXT (primer reverse) = 5’-TTATTT SGC RTC RTA CCAYG-3’. Primer ini memiliki homologi dengan primer gen DNA polimerase dari Bacillus caldotenax.

Elektroforesis produk PCR gen DNA polimerase isolat Brevibacillus sp. dengan

menggunakan primer forward FPEXT dan prime reverse RPEXT disajikan pada gambar 1. Berdasarkan hasil amplifikasi dengan metode PCR gen DNA polimerase Brevibacillus sp. memiliki ukuran + 2700 bp. Hasil elektroforesis ini menunjukkan bahwa gen penyandi DNA polimerase Brevibacillus sp. telah berhasil diisolasi. Hal ini ditunjukkan dengan ukuran basa

nukleotida berukuran + 2700 bp, hampir sama dengan ukuran basa nukleotida DNA polimerase I sepanjang 2634 bp dari Geobacillus caldoxylosilyticus (Sandalli, dkk., 2009), DNA polymerase berukuran 2616 bp dari Thermoanaerobacter yonseiensis (Kim, dkk.,

2002) dan kelompok bakteri hipertermofilik maupun termofilik yang telah berhasil diketahui urutan basanya melalu penelusuran di Gen Bank NCBI (ww.ncbi.nlm.nih.gov)

2700 bp

10.0008.0006.0004.0003.0002.000

1.500

1.000

750

500400300

bp M 1 2 3

Gambar 1. Elektroforesis produk amplifikasi gen DNA polimerase isolat Brevibacillus sp.

menggunakan primer FPEXT (primer forward) = 5’-YCG AGG AGG GAT GAG ATT G-3’ dan RPEXT (primer reverse) = 5’-TTATTT SGC RTC RTA CCAYG-3’. Elektroforesis dilakukan pada gel agarose 1% (g/v), voltase 100 volt. Lajur 1: DNA Ladder 1kb Perfect DNATMMarker (Novagen), Lajur 2, 3, 4 = produk amplifikasi gen DNA Pol I Brevibacillus sp.

Kloning membutuhkan insert gen yang bersih dari pengotor, untuk itu produk PCR

yang diperoleh dimurnikan. Pemurnian produk PCR dilakukan dengan menggunakan

QIAQuick Gel Extraction Kit (Qiagen). Gambar 2 menunjukkan elektroforesis produk PCR gen DNA Pol dari Brevibacillus sp. yang akan dimurnikan.

Gambar 2. Produk PCR gen DNA Pol I isolat DS3.

2700 bp

10.0008.0006.0004.0003.0002.000

1.500

1.000

750

500400300

bp 3M 1 2

Gambar 3 . Produk PCR gen DNA Pol I isolat DS3 yang sudah dimurnikan dengan

QIAQuick Gel Extraction Kit.

Gambar 3 memperlihatkan pita DNA gen DNA polimerase isolat Brevibacillus sp lebih tipis dari gambar pita DNA pada gambar 1 dan 2, walaupun perlakuan yang dikenakan sama. Hal ini disebabkan pengenceran dalam purifikasi terlalu encer. Presipitasi dengan menggunakan isopropanol akan dapat membuat konsentrasi DNA menjadi lebih tinggi (lebih pekat).

KESIMPULAN

Berdasarkan pada penelitian ini dapat disimpulkan gen penyandi DNA Pol I bakteri hipertermofilik Brevibacillus sp. berhasil diisolasi. Gen DNA Pol I Brevibacillus sp. berukuran

+ 2700 bp.

UCAPAN TERIMA KASIH

Penelitian ini dilakukian atas pembiayaan dari Direktorat Pembinaan Penelitian dan Pengabdian kepada Masyarakat, Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi tahun 2010.

DAFTAR PUSTAKA

1. Ausubel, F, M., Brent, R., Kingstone, R. E., More, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., dan Struhl, K. 1995. Short Protocol In Molecular Biology: A Compendium of Methods

from Current Protocol in Molecular Biology. 3th Edition. John Wiley & Sons, Inc. New

York. USA. 2. Choi, J. J., Jung, S. E., Kim, H. K., dan Kwon, S. T. 1999. Purification and properties of

Thermus filiformis DNA polymerase expressed in Escherichia coli. Biothechnol. Appl. Bochem. 30 :19-25.

3. Erlich, H. A., 1992. PCR Technology. W. H. Freeman and Company. New York. 4. Gueguen Y, Rolland JL, Lecompte O, Azam P, Le Romancer G, Flament D, Raffin JP,

Dietrich J. 2001. Characterization of two DNA polymerases from the hyperthermophilic euryarchaeon Pyrococcus abyssi. Eur. J. Biochem. 268(22):5961-9.

5. Ishino, Y., Komori, K., Cann, I. K .O., dan Koga, Y. 1998. Novel DNA polymerase family found in Archaea. J. Bacteriol. 180:2232-2236.

6. Jokela M., Eskelinen, A., Pospiech, H., Rouvinen, J., dan Syvaoja, J. E. 2004. Characterization of the 3’ exonuclease subunit DP1 of Methanococcus jannaschii replicative DNA Polymerase D. Nucleic Acids Res. 32:2430-2440.

7. Kim, D. J., Jang, H.J., Pyun, Y . R., dan Kim, Y. S. 2002. Cloning, expression, and characterization of thermostable DNA polymerase from Thermoanaerobacter yonseiensis. J. Biochem. Mol. Biol. 35: 320-329.

8. Sandalli, C., Sigh, K., Modak, M. J., Ketkar, A., Canakei, S., Demir, I., dan Belduz , A. O. 2009. A new DNA polymerase I from Geobacillus caldoxylosilyticus TK4 : cloning, characterization, and mutational analysis of two aromatic residues. Appl. Microbiol. Biothechnol. DOI 10.1007/s00253-009-1962-3.

9. Shen, Y., Musti, K., Hiramoto, M., Kikuchi, H. Kawarabayashi, Y. dan Matsui,j. 2001. Invariant Asp-1122 and Asp-1124 are essential residues for polymerization catalysis of family D DNA polymerase from Pyrocccus horikoshii. J. Biol. Chem. 276:273376-27383.

10. Uemori , T., Ishino, Y., Toh, H., Asada, K., dan Kato, I. 1993. Organisation and nucleotide sequence of the DNA polymerase gene from the archaeon Pyrococcus furiosus. Nucleic Acids Res. 21: 259-265.

11. Uemori, T., Sato, Y., Kato, I., Doi, H., dan Ishino, Y. 1997. A Novel DNA Polymerase in the hyperthermophilic archaeon, Pyrococcus furiosus : gene cloning, expression and characterization. Gene Cells 2: 499-512.

12. Wibawa, D., A. A., 2008. DNA Polimerase dari bakteri hipertermofilik hasil isolasi dari kawah Sikidang Dieng, Jawa Tengah. Tesis. Sekolah Pascasarjana Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta.