vesna rakic predavanje 3 master-2012

Spektroskopija u UV-Vis oblasti

teorijske osnove tehnike i primena

Elektromegnetno zračenje (EM) i materija

Transmisija - EM prolazi kroz meteriju bez ikakve interakcijeApsorpcija - EM biva adsorbovan od strane atoma, jona ili molekula podiţući ih na viša energetska stanja Emisija - oslobadjanje energije od strane atoma, jona ili molekula dovodeći ih na niţa energetska stanja

UVEK TREBA IMATI NA UMU DA:

Vizuelna kolorimetrija je jedna od najstarijih analitičkihmetoda; i mada postoje indikacije da je korišćena još uvreme starih Grka, naučna primena začeta je kada je 1729Pierre Bouguer izneo tezu da:

„ako data debljina obojenog stakla apsorbuje polovinusvetlosti koja dolazi sa izvora svetlosti, onda će dvostrukodeblje staklo redukovati tu svetlost na četvrtinu početnevrednosti.”

30 godina kasnije, Jean-Henri Lambert (1728–1777) jepostavio prvu matematičku vezu koja kaţe da je:„logaritam opadanja intenziteta svetlosti jednak proizvoduneprozirnosti (opacity) te sredine i njene debljine”.

Konačno, 1850, nemački fizičar Auguste Beer je postaviorelaciju izmedju koncentracije i optičke gustine (sadanazvane apsorbancija), koja je dovela do današnjeg oblikaLambert–Beer–Bouguer zakona.

Apsorpcija svetlosti iz oblasti od 80 do 1100 nm (bliska UV do bliske IRoblasti), od strane materije je izuzetno opseţno izučavana pojava.

Apsorpcija svetlosti iz ovog dela spektra donosi malo podataka ostrukturi materije, ali je vrlo korisna u smislu kvantitativnih merenja –koncentracija supstance u rastvoru moţe biti odredjena primenomLambert–Beer–Bouguer zakona – metoda je poznata pod imenomkolorimetrija.

Kolorimetrija je primenljiva ne samo na supstance koje pokazujuspektar apsorpcije u ovoj oblasti; već na sve one supstance koje poslemodifikacije odredjenim reagensima, pokazuju takav spektar.

Merenja se vrše primenom čitave pelete različitih instrumenata, odbazičnih kolorimetara do automatizovanih spektrofotometara za multi-komponentne analize.

Potreba za razvijanjem UV-Vis detektora za potrebe tečnehromatografije i kapilarne elektroforeze podstakla je usavršavanje ovevrste instrumenata; dajući na taj način mogućnost da se istovremenodobiju hromatogrami i dobiju informacije u vezi sa prirodom i(kvantitativno) sastavom jedinjenja.

UV-Vis spektralni region i poreklo apsorpcije

Ovaj deo spektra elektromagnetnog zračenja podeljen je na 3 pod-oblasti: bliski UV (185-400 nm), vidljivi (400-700 nm) i bliski IR (700-1100 nm).

Većina komercijalnih spektrofotometara pokriva oblast 185 – 900 nm.

Donja granica instrumenta zavisi od prirode optičkih komponenti kojese koriste u opremi; i značajno, od toga da li je na putu svetlosti (naoptičkom putu) prisutan vazduh ili ne; znajući da kiseonik i vodaapsorbuju intenzivno u oblasti ispod 190 nm.

Neki instrumenti, koji su konstruisani tako da se u njima (u odeljku ukoji se smešta uzorak) moţe izvršiti evakuacija, rade sa gasnimuzorcima do granice od 150 nm. Ovo je domen daleke ili vakuumske UVoblasti.

Što se tiče gornje granice detekcije, ona je odredjena osobinamadetektora spektrofotometra. Postoje komercijalni UV-Visspektrofotometri kod kojih je granica detekcije u bliskoj infracrvenojoblasti pomerena do 3300 n.

Poreklo apsorpcije svetlosti u ovom spektralnom domenu je interakcijafotona svetlosti iz izvora sa jonima (molekulima) uzorka. Kada molekulapsorbuje foton iz UV-Vis oblasti, odgovarajuća količina energije biva„zarobljena” od strane jednog ili više spoljašnjih elektrona te ispitivanematerije.

Kao posledica tog dogadjaja, dešava se promena energetskog stanja togelektrona (Eelec), i takodje promena komponenti ukupne (mehaničke, tojest, kinetičke) energije molekula: energije rotacije i energijevibracije: Erot i Evib.

Promena ΔEelec dovešće do promena i u ΔErot and ΔEvib, što će ukupnodati veliki broj mogućnosti za posebne pojedinačne različite prelaze(skokove) elektrona; a kako će time još biti i izmenjena polarnost(kovalentne) veze izmedju molekula; spektri koji će na ovaj način nastatinazivaju se: charge transfer spectra.

ΔEtot =ΔErot +ΔEvib +ΔEelec

gde je ΔEelec >ΔEvib>ΔErot.

Energetska kvantifikacija molekula. Dijagram pokazuje elektronska, rotaciona i vibraciona energetska stanja molekula.

Svaka horizontalna linija odgovara različitom energetskom stanju. Hijerarhijska struktura je sledeća: izmedju svaka dva elektronska stanja, obeleţena sa S, postoji više vibracionih (V) nivoa, koji su svaki dalje podeljeni na rotacione (R) podnivoe (skala ovog dijagrama nije realna – vibracioni i rotacioni nivoi su daleko bliţi jedan drugom nego što je pokazano), a realan odnos izmedju ΔEelec:ΔEvib:ΔErot je 1000:50:1.

U kondenzovanim stanjima, kako su molekuli vrlo blizu jedan drugom, ni jedan instrument, bez obzira na njegovu rezoluciju, ne moţe da registruje pojedične elektronske prelaze.

VEOMA VAŢNO: RAZLIKUJEMO:

-Atomsku i molekulsku spektroskopiju (po mestu gde sedešava kvantni prelaz);

-Apsorpcionu i emisionu spektroskopiju (po tome da lidetektujemo energiju koja je apsorbovana ili emitovana;ovo zavisi SAMO od toga kako konstruišemo instrument);

-Refleksionu i transmisionu spektroskopiju (instrumenti sekonstruišu da bi radili na jedan od ova dva načina, zavisnood toga da li treba da sluţe za analizu transparentnih ilinetransparentnih uzoraka).

-Takodje, metode mogu da budu destruktivne inedestruktivne!

ATOMSKA APSORPCIONA SPEKTROSKOPIJA - AAS

-Tehnika je zasnovana na tome da atomi apsorbuju svetlost specifičnihtalasnih duţina – kvantiranost energije! – ~ 1800 zakon Kirchoff-a, Bunsen-a,Angstrom-a, Rowland-a, Michelson-a i Balmer-a: “Materija apsorbujesvetlost na istim talasnim dužina na kojima je i emituje “ – princip nakome funkcioniše metoda AAS.

AAS koristi pojavu apsorpcije svetlosti u svrhu merenja koncentracijeatoma koji se nalaze u gasnoj fazi. Kako su uzorci najčešće u tečnom iličvrstom stanju, uzorci najpre moraju biti prevedeni u gasno stanje.Atomi apsorbuju UV ili Vis fotone, zbog toga njihovi elektroni prelaze na višeenergetske nivoe. Količina apsorbovane energije je specifična za odredjenielektronski prelaz u konkretnom, pojedinačnom atomu (elementu).Koncentracija analita moţe biti odredjena iz količine apsorbovane svetlosti,primenom Lambert-Beer-ovog zakona (odredjivanjem standardne prave).

Uzorak je preveden u atomskostanje najčešće primenom plamena.Apsorbovana svetlsot dolazi izzivora (lampe).

AAS je spektroskopska tehnika koja omogućava kvalitativna i kvantitativnaodredjivanja hemijskih elemenata; zahvaljujući apsorpciji radijacije(elektromagnetnog zračenja) od strane slobodnih atoma u gasnom stanju. → Uanalitičkoj hemiji ova tehnika se koristi da bi bila odredjena koncentracijaanaliziranog uzorka. Moguće je analizirati preko 70 elemenata iz PSE.

U postupku emisione spektroskopske analize, ispitivanamaterija se dovede do usijanja, a potom se emitovanasvetlost detektorskim sistemom razčlani na emisionispektar, koji se dalje analizira. Kako svaka pojedinavrsta atoma emituje svoj karakteristični spektar,emisioni spektar neke smese (na primer, legure)odgovaraće adiciji (zbiru) spektara prisutnih sastojaka.

Za dokazivanje prisustva pojedinih elemenata, dovoljnoje pronaći na fotografskoj ploči njihove spektralnelinije u UV ili Vis području. Za ovu vrstu analize posebnosu pogodni (osetljivi) alkalni metali, koji se ovakvom,emisionom spektroskopskom analizom, mogu otkriti jošod koncentracija od 0.0001%.

Ima više vrsta atomizera, ali se najčešće koriste plamen i/ili elektrotermalni atomizeri.U plamenu se dešavaju sledeći procesi:-Sušenje (evaporacija rastvarača), uzorak ostaje u obliku nano čestica;-Isparavanje u gasnu fazu;-Atomizacija – molekuli disosuju do slobodnih pojedinačnih atoma;-Jonizacija – zavisno od njihovog jonizacionog potencijala, neki atomi analita mogu da budu prevedeni u jonsko stanje.

Izvori svetlosti su: katodne lampe, lampe sa praţnjenjem,deuterijumske lampe, kontinualni izvori zračenja.

Najpoznatiji i najčešće korišćeni plamen je onaj nastao od mešavine vazduha i acetilena (2100 C) i onaj nastao od N2O i acetilena (2700 C).

MOLEKULSKA SPEKTROSKOPIJA

NASTANAK SPEKTRA

Apsorpcioni spektar u UV-Vis oblasti nastaje tako što se svetlost saizvora upućuje na uzorak koji zbog prethodno objašnjenih fenomenavrši apsorpciju u odredjenim „porcijama”, tako da detekcioni sistemregistruje „smanjenje” u intenzitetu svetlosti koja izlazi iz uzorka.

Bilo koji snimljeni spektar dobijen je od uzorka koji sadrži ogromanbroj molekula koji nisu svi na istom energetskom stanju.

Zbog toga, iako je elektronski skok kvantiran i odredjen, dobijenigrafički prikaz spektra je u obliku trake a ne linije, pa ta traka„pokriva” linije nastale od elektronskih, vibracinih ili rotacionih prelazaindividualnih molekula.

Energija koja je apsorbovana (“zarobljena”) tokom apsorpcije fotonamoţe naknadno biti oslobodjena u više različitih procesa koji sedešavaju medjusobno konkurentno: emisija, fosforescencija,fluorescencija; i one predstavljaju osnove drugih metoda.

Instrumenti koji se koriste u UV-Vis regionu

Spektrofotometri imaju obavezno tri osnovna dela (modula):

- izvor- disperzivni sitem- detekcioni sistem.Uzorak se ”umeće” na optički put, bilo ispred ili iza disperzionogsistema.

Bitna osobina instrumenata je rezolucija. Neki instrumenti, koji se koriste zarutinske analize, ne moraju obavezno da imaju visoku rezoluciju. Medjutim, zasve spektrofotometre je vaţno da daju mogućnost kvantitativnogodredjivanja.

UV/Vis spektar daje skup podataka o apsorbovanoj količini zračenja ufunkciji od talasne duţine i predstavlja se kao transparencija (iliapsorbancija) vs. talasna duţina (preporučeno izraţena u nm, madamoţe da bude izraţena i u cm-1).

U spekroskopiji, transparencija T, predstavlja meru “propustljivosti”sredine (uzorka) za monohromatski zrak, to jest pretstavlja količnikintenziteta svetlosti koja je prošla kroz uzorak (I) sa intenzitetomsvetlosti koja je na uzorak upućena (I0).

Dobijeni spektar je sastavljen od traka, i moţe biti relativnojednostavan (jedna ili nekoliko širokih traka, najčešće dobijenrastvaranjem čvrstog materijala) ili moţe da pokazuje “finu”strukturu (više dobro definisanih, uzanih traka, kao u slučaju spektaragasova).

~

1~1

hchE

cmcm

nm4000

17

cm2500cm

nm10

nm4000

1~1

Elektronski prelazi organskih molekula

UV-Vis spektroskopijom se najviše ispituju organskajedinjenja.

Primećeni elektronski prelazi uključuju elektrone iz σ ili πorbitala, ili takodje, nevezujuće elektrone iz orbitala lakihatoma kao što su: H, C, N, O.

Gde god je moguće, vrši se identifikacija apsorpcionihtraka, i traţi veza za molekulskom orbitalom (MO) iz kojeelektron potiče; i takodje, vrši se odredjivanje molarnogapsorpcionog koeficijenta ε (L mol-1 cm-1), na odgovarajućojtalasnoj duţini koja odgovara maksimumu apsorpcije.

Apsorpcija – energetski nivoi

E

N

E

R

G

Y

Elektronski nivo

Rotacioni nivo

Vibracioni nivo

E

N

E

R

G

Y

E = UV/Vis foton

E = IR foton

E = talasni foton

Apsorpcija – energetski nivoi

Postoje sledeći elektronski prelazi:

σ σ* n σ* n π * π π* d d

σ σ*prelaz dešava se u dalekoj UV oblasti, jer pretstavlja skok iz vezujuće MO uantivezujuću MO, i zahteva visoku energiju. Ovo je objašnjenje zašto suzasićeni ugljovodonici, koji poseduju samo ovu vrstu veza, transparentni uoblasti bliskog UV:

hexane (gas state): λmax =135nm

zasićeni ugljovodonici mogu biti rastvarači za supstance koje apsorbuju ubliskoj UV oblasti.

n σ*Skok jednog n elektrona sa atoma O, N, S, Cl u σ* nivo daje prelaz srednjegintenziteta na oko 180nm u slučaju alkohola, oko 190nm u slučaju etara ilihalogenih derivata I oko 220 nm za amine.Methanol: λmax = 183nm; ether: λmax = 190nm;ethylamine: λmax =210nm; 1-chlorobutane: λmax =179nm.

n π *Ovaj prelaz niskog intenziteta nastaje zbog prelaza n elektrona (iznevezujuće MO u antivezujuću π * orbitalu). Ovaj prelaz se sreće kodmolekula koji poseduju hetero atome sa sparenim parom (nevezujućih)elektrona.Najpoznatiji primer je karbonilna veza, čija optička apsorpcijaje nadjena oko 270 do 295 nm. Primer: etanal: λmax =293nm, sa etanolom kao rastvaračem).

π π*Jedinjenja koja poseduju izolovanu etilensku dvostruku vezu, pokazuju jaku apsorpciju na oko 170 nm. Primer: ethylene: λmax =165nm

d dBrojne neorganske soli poseduju elektrone u d orbitalama; oni su odgovoriniza prelaze sa slabom apsorpcijom koja se ispoljava u Vis oblasti. Ovi prelazisu u opštem sluaju odgovorni za boju ovih soli.

Funkcionalne grupe organskih jedinjenja koje su odgovorneza apsorpciju u UV-Vis oblasti, nazivaju se hromofore.

Vrste koje nastaju tako što se na ugljenični niz koji jetransparentan u bliskom UV-u, „nakači” jedna ili višehromofora, naziva se hromogen.

Izolovane hromofore: za seriju molekula koji imaju istuhromoforu, pozicija i intenzitet apsorpcione trake ostajukonstantni. Kada molekul poseduje nekoliko izolovanihhromofora (koje medjusobno ne interaguju zato što surazdvojene sa najmanje 2 jednostruke veze C skeleta),tada se primećuje preklapanje traka koje potiču odizolovanih hromofora.

Sistem konjugovanih hromofora: kada hromoforeinteraguju jedna sa drugom, apsorpcioni spektar je“pomeren” ka većim talasnim duţinama (batohromni efekat),što je praćeno povećanjem intenziteta (hiperhromniefekat).

Uticaj rastvarača

Kako svaki rastvarač ima svoju karakterističnupolarnost, i kako se zna da elektronski prelazi menjajuraspored naelektrisanja jedinjenja u rastvoru, očiglednoje da će pozicija i intenzitet apsorpcionih traka variratiu izvesnoj meri zavisno od prirode rastvarača koji jeprimenjen.

Uticaj na poloţaj maksimuma apsorpcije koji se ostvarujekada se promeni rastvarač je vrlo vaţna indikacija za tipelektronskog prelaza koji postoji u uzorku. Postoje dvarazličita slučaja:

Hipsohromni efekat (plavi pomeraj):

Ako je hromofora koja je odgovorna za primećeni prelazpolarnija u svom osnovnom stanju nego kada jeekscitirana, tada će polarni rastvarač solvatacijom(rastvaranjem) stabilisati molekul, pre nego što se desiapsorpcija fotona.

Molekuli rastvaraa će tada okruţiti molekul rastvorka,zbog elektrostatičkih efekata. Zbog toga će bitipotrebno više energije da se izvrši elektronski prelaz okome se radi (λmax kraćim talasnim duţinama), u odnosuna ono što bi se dogodilo u nepolarnom rastvaraču.

Batohromni efekat (crveni pomeraj):

Za manje polarna jedinjenja, uticaj rastvarača je mali.Medjutim, ako dipolni momenat hromoforne grupe rastekao rezultat elektronskog prelaza, konačno dobijenostanje će biti solvatisano u većoj meri. Tako polarnirastvarač moţe da stabiliše ekscitovanu formu iprimećuje se pomeraj λmax većim talasnim duţinama uodnosu na ono što se uočava u nepolarnom rastvarau. Ovoje batohromni (crveni) pomeraj.

Uticaj pH rastvarača:

- moţe biti veliki; i omogućava promenu boje zahvaljućiupotrebi hemijskih indikatora, na primer, tokom,acidimetrijskih merenja.

SPEKTROFOTOMETRI MOGU DA BUDU:

-Emisioni i apsorpcioni;

-Jednozračni i dvozračni;

-Skenirajući i neskenirajući;

-Transmisioni i refleksioni.

-Najvaţnija osobina je: REZOLUCIJA

Izvori zračenja

• za vidljivi deo spektra, lampa sa volframovim filamentom u kvarcu;

• za UV region: deuterijumska lučna lampa pod pritiskom, da biemitovala kontinualno na λ<350nm;

• alternativno, za celi region od 200 do 1100 nm, ksenon lučna lampa.

UV/Vis spektrofotometri se po dizajnu klasifikuju u tri

glavna tipa:

-Jendozračni fiksni spektrofotometar;

-Skanirajući dvozračni spektrometar za automatskoodredjivanje apsorbancije;

-Neskenirajući spektrofotometar sa detektorom zasimulatno merenje više talasnih duţina.

Jendozračni fiksni spektrofotometar

Skanirajući dvozračni spektrometar za automatsko odredjivanje apsorbancije

Dvozračni spektrofotometar omogućava difirencijalna merenja izmedju uzorka i slepe probe***.

Širina trake koja se moţe odrediti ovim instrumentima moţe biti čak 0.01 nm.

VAŢNO!

-Neskenirajući kolorimetar sa detektorom za simulatno merenjeviše talasnih duţina.

Shema refleksionog spektrofotometra

VAŢNO!

Da bi se obezbedila tačna merenja, mora se izvršitikalibracija talasnih duţina u UV/Vis oblasti, i to, i po y osi(T, %) i po x osi (λ).

Koristi se rastvor holmijum oksida (Ho2O3) u razblaţenojperhlornoj kiselini.

KVANTITATIVNA ODREDJIVANJA

Apsorpcija u UV-Vis oblasti je iskorišćenja zapostavljanje metode za kvantitativno odredjivanjekoncentracije.

Metoda se bazira na Lambert–Beer zakonu, koji, pododredjenim uslovima, povezuje apsorpciju svetlosti sakoncentracijom rastvora.

Veza je data kao:

A je apsorbancija, optički parameter bez dimenzija koji secobija merenjem spektrofotometrom; l je debljina (u cm)sloja rastvora koji se analizira, C je molarna koncentraicja iε je molarni apsorpcioni koeficijent (L mol-1 cm-1), natalasnoj duţini λ na kojoj se merenje vrši.

Ovaj parametar, takodje nazvan i apsorptivnost, jekarakteristika jedinjenja i zavisi, izmedju ostalog, odtemperature i prirode rastvarača. Generalno, njegovavrednost se daje za odredjenju talasnu duţinu maksimumaapsorpcije (zauzima vrednosti od 0 do 200000).

Prema Lambert-ovoj hipotezi, intenzitet monohromatske radijacije Iopada za dl (negativna vrednost) posle prolaska svetlosti kroz slojispitivanog materijala debljine dx, a čiji je apsorpcioni koeficijent kza datu λ:

Ako je I0 intenzitet upadne svetlosti, tada je:

Beer: k C

lCkeII'

0

T

I

I

0

Zamenom k sa k’C, dobijena je nova jednačina:

Zakon vaţi pod sledećim uslovima:

1. Upotrebljena svetlost mora biti monohromatska

2. Koncentracije moraju biti niske

3. Rastvor ne sme biti fluorescentan ili heterogen

4. Sa rastvorkom se ne sme dešavati fotohemijska

transformacija

5. Rastvorak ne sme da ulazi u hemijsku asocijaciju ili

reakciju sa rastvaračem.

abCA

0I

IT t

Frakcija (udeo) zračenja koja je propuštena kroz rastvor, ili transparencija (T) definisana je sa:

A = - logT = k’ l C = abC

Aditivnost apsorbancija

Metode kvantitativne analize

Ako jedinjenje ne apsorbuje svetlost iz odredjenogspektroskopskog područja, ono ne moţe biti izkorišeno zakvantitativno odredjivanje; osim ako ne bude hemijskitransformisano na taj način da dobije hromoforu.

Dakle, da bi kvantitativno odredjivanje postalo moguće uslučajevima kada hemijska vrsta ne apsorbuje, ima slabuapsorpciju ili se nalazi u smeši sa supstancama kojetakodje apsorbuju, neophodno je najpre izvršiti njegovuhemijsku transformaciju, koja mora biti:

specifična, potpuna, brza i reproduktivna tako da dovededo stabilne hemijske vrste koja na dalje moţe da sluţi zaapsorpciju zračenja iz UV-Vis oblasti.

Javljaju se dva glavna tipa kolorimetrijskih*** analiza:

1. Supstanca koju treba analizirati je prisutna u “matrici” za ostalimkonstituentima koji takodje apsorbuju u istoj spektralnoj oblasti.Da bi ovaj problem bio prevazidjen, jedinjenje od interesa sehemijski prevodi u vrstu čija apsorpciona kriva je izvan oblastiapsorpcije ostalih konstituenata:

2. Jedinjenje koje se analizira ne apsorbuje (nema hromoforu kojase moţe iskoristiti). Tada je neophodno izvršiti hemijskutransformaciju tako da se hromofora pojavi.

A = ε b c (gde je c u mol/L or M) ili: A = a b c (gde je c = g/l)

U praksi, prvo se odredjuje kalibracioni dijagram.

Ponekad se koristi samo jedan standardni rastvor:

Izračunavanje koncentracije analita moţe da bude pogrešno, akouzorak sadţi nečistoće koje utiču na apsorpciju, odnosno koje takodjeapsorbuju u istoj oblasti.

Tada se vrši provera bazirana na tome da je za čisto jedinjenje, odnosapsorpcionih koeficijenata odredjenih na dve talasne duţinekarakteristika datog jedinjenja.

Dekonvolucija

Nefelometrija & turbidimetrijaMetode su zasnovane na pojavi rasipanja svetlosti od stranesuspendovanih čvrstih čestica u rastvoru. Količina čvrste materije unekoj suspenziji moţe se odrediti merenjem propuštene(turbidimetrija) ili rasute (nefelometrija) svetlosti od strane čvrstihčestica.

Da bi se ove metode primenile potrebno je:

1. Utvrditi da li je neka hemijska reakcija moţe da da suspenzijupogodnih osobina;

2. Definisati optimalni postupak za pripremanje suspenzije;

3. Pripremiti radnu krivu.

Emisione tehnike

Neka jedinjenja emituju svetlost kada su pobudjenafotonima iz UV ili Vis oblasti.Ova pojava naziva se fotoluminiscencija, i na njoj subazirane selektivne i vrlo osetljive metode.Kako postoji veza sa koncentracijom, ove metode imajuveliku primenljivost.

-flourimetrija: brzo vraćanje u normalno stanje;

-fosforescencija: postepeno vraćanje u osnovno stanje;

-Hemiluminisenicja: emisija tokom nekih hemijskihreakcija

U bihemiji, fluorescencija ima brojne primene uglavnomza kvantitativna odredjivanja proteina ili nukleinskihkiselina.

Primena UV-Vis spektroskopskih metoda u istraţivanjima i industriji hrane

UV-Vis spektroskopske tehnike koriste se:

-u istraţivačke svrhe;

-u kontroli kvaliteta i bezbednosti hrane;

- u menadţmentu i kontroli procesa.

Ove primene ostvaruju se kroz:

-Kvantitativna odredjivanja;

-Proveru čistoće (stabilnosti) uzorka.

Posebnu klasu primena čine merenja za klasifikacije(sortiranja), provere, ispitivanja… na osnovu bojeuzoraka.

Boja je generalni naziv za senzacije koje potiču od aktivnosti retine.

Boja je, zajedno sa aromom i teksturom, vaţna osobinahrane, bilo da je ona preradjena ili nepreradjena; i igravaţnu ulogu u “prihvatanju” hrane.

Takodje, boja hrane, ili promena boje hrane, moţe da budeznačajna indikacija hemijskih promena (tamnjenje,karamelizacija, …).

Boja hrane potiče od:

- Transmisije (apsorpcije) svetlosti, u slučaju pića i ulja;

- Refleksije svetlosti, u slučaju “mutne” (netransparentne) hrane.

Boja, kao ni tekstura i aroma hrane, ne moţe biti uočena niti ispitivana be ljudskog senzornog sistema.

Boja uočena kada oko vidi osvetljeni objekat u vezi je sa tri faktora:

- spektralnim sastavom svetlosti koja osvetljava objekat;

- hemijskim i fizičkim karakteristikama objekta; i

- spektralnom osetljivošću oka.

Na sreću, sposobnost ljudskog čula vida (različitihjedinki) je prilično ujednačena, pa nije suviše teško da seza potrebe istraţivanja ili industrijske primene ljudskooko zameni instrumentom – senzorom, ili fotoćelijom.

SPEKTROFOTOMETRI

Ima više načina za klasifikaciju boja; najpoznatiji inajznačajniji je CIE sistem - (Commission International de1'Eclairage).

Kada različito obojeni objekti reflektuju svetlostrazličitih boja, spektrofotometriranjem se dobijajurazličite krive:

Standardni posmatrač

Osim boje, od značaja je i SJAJ uzorka – sposobnost refleksije svetlosti. Refleksija moţe biti difuzna ili ne.

Boja uzorka (hrane) potiče od prisutnih pigmenata.

Medjutim, refleksija svetlosti sa mutnih uzoraka zavisiće od odnosaapsorbovane i rasejane svetlosti, kao funkcija vrste i količinepigmenata, indeksa refrakcije i rasejavanja svetlosti sa materijala.

Postoji Kubelka-Munk metod (i istoimene jedinice u kojima seizraţava količina transmitovane, reflektovane ili apsorbovanesvetlosti); on omogućava razdvajanje apsorbovanog i rasejanog delazračenja.

Boja hrane potiče od prisustva prirodnih pigmenata ilidodatih boja (aditivi!)

Prirodni pigmenti mogu (uz par izuzetaka) da budu podeljeni u sledeće 4 grupe:

1. Tetrapirolska jedinjenja (hlorofili, hem)

2. Derivati izoprenoida (karotenoidi)

3. Derivati benzopirana (antocijani i flavonoidi)

4. Melanoidini, karamelizirajuće supstance…

Primer: tetrapirolni pigmenti

pirol

U sveţem mesu, i u prisustvu O2, postoji dinamička ravnoteţa izmedjutri pigmenta:oksimioglobina, mioglobina i metmioglobina. Reverzibilnareakcija sa O2 je:

U oba pigmenta, gvoţdje je u Fe(II) – fero stanju,a po prelaskuuFe(III), feri stanje, pigmen prelazi u metmioglobin. Stoga, sjajnacrvena boja (oksimioglobin) prelazi vremenom u braon boju(metmioglobin):

Oksimioglobin je kovalentno jedinjenje Fe(II), mioglobina i kiseonika.

Mioglobin formira jonski kompleks sa vodom, u odsustvu jakogelektron donora koji bi formirao kovalentni kompleks pokazujedifuznu apsorpciju u zelenom delu spektra, oko 555 nm, purpurnocrvena boja.

U metmioglobinu, glavni apsorpcioni pik je pomeren ka plavom deluspektra, na 505 nm I sa malim pikom na 627 nm uzorak izgledabraonkasto.

Najprecizniji instrumenti kojisluţe za merenje boje (I sjaja)su SPEKTROFOTOMETRI.

U indsutriji hrane, najčešće seupotrebljavaju refleksioni sp,sa integrišućom sferom ili ne(da bi se isključila ili uzela uobzir komponenta prostornograsejanja).

Postupci sortiranja primenljivi u industriji hrane, bazirani na spektrofotometrijskim

merenjima

Primenljive su sledeće metode:

•Spektrofotometija,

•Monohromatsko, bihromatsko i trihromatsko sortiranje

•Fluorescentne tehnike

•IR tehnike

•Optičko sortiranje laserima

Berov zakon - rezime

Absorption Spectroscopy

• Transmittance (T)

0P

PT

0 T 1

T is independent of P0

%T = T x 100

Absorption Spectroscopy

P0 = 1.00 P = 0.50 P = 0.25 P = 0.125

• sample with T = 50%

Absorption Spectroscopy

0

0.5

1

Concentration or Path Length

T

Absorption Spectroscopy

• Absorbance (A)

TlogT

1log

P

PlogA 0

TAT

T %log2 ;100

%

0 A

Absorption Spectroscopy

Concentration or Path Length

A

Beer’s Law

Po P P-dP

dx

Beer’s Law

A = dP = -Pcdx

c = concentration of analyte

probability of a photon being absorbed

dxcP

dP

dxcP

dP

Beer’s Law

• ln P = -cx + C

• at x = 0, ln P = ln P0

• ln P0 - ln P = cx

P

Pxc

P

P 00 log303.2ln

AcxP

P

303.2log 0

Beer’s Law

• = molar absorbtivity

– absorbance of solution when c=1M and

b=1cm (b=x)

– DEPENDS upon

303.2

Beer’s Law

A = bcBeer’s Law

Beer’s Law

A

max

Beer’s Law

MEASURING CONCENTRATION

1. Select - ideally max

2. Determine

3. Measure absorbance of unknown

– measure reference “blank” to correct for

scattering and reflection

Beer’s Law - Example

• A 5.0 x 10-2 M solution of benzene has a %T

of 50 at 254 in a 1 cm cell. An unknown

solution of benzene has a %T of 75 under the

same conditions. What is the concentration of

the unknown?

Beer’s Law - Example

• A = -logT= -log0.50 = 0.30

A = bc

log . .0 75 012

A

bc

.

( . )(. ).

30

10 0506 0

cA

b

..

12

62 0 10 2

Mixtures

• Absorbances are additive

• Asol. = qbcq + rbcr + sbcs + …

• To determine x compounds in a solution you have to make measurements at xdifferent wavelengths and know for eachcompound at each wavelength

Mixtures

A

ArAq

Atotalmax

max

Mixtures - Example

m axq m ax

r

0.10 M “q” 0.50 0.30

0.10 M “r” 0.20 0.80

Mixture 0.70 0.60

rqmax

.

.

2

12

qrmax

.

.

3

13 q

qmax

.

.

5

15

rrmax

.

8

18

Mixtures - Example

A = qbcq + rbcr

0.70 = 5cq + 2cr

0.60 = 3cq + 8cr

2 equations, 2 unknowns

cq = 0.13; cr = 0.025