univerza v ljubljani - gobe.si delovanje proteinov...vendar se je s tem pri mnogo katerih izgubila...
Post on 14-Jan-2020
1 Views
Preview:
TRANSCRIPT
UNIVERZA V LJUBLJANIFAKULTETA ZA FARMACIJO
LARA KANDIĆ
INSEKTICIDNO DELOVANJE PROTEINOV IZBRANIH GOB IN RASTLIN NA MODELU VINSKE MUŠICE
INSECTICIDAL ACTIVITY OF PROTEINS FROM SELECTED SPECIES OF FUNGI AND PLANTS ON FRIUT
FLY MODEL INSECT
DIPLOMSKA NALOGA
Ljubljana, 2007
Lara Kandić: diplomska naloga Kazalo
KAZALO VSEBINE
SEZNAM OKRAJŠAV VIII
POVZETEK IX
ABSTRACT X
UVOD................................................................................................................................................................. 1
1 GLIVE .............................................................................................................................................................. 1 Splošne značilnosti gliv..............................................................................................................................2 Vloga gliv v ekosistemih in gospodarstvu..................................................................................................2 Filogenetska razvrstitev gliv......................................................................................................................3
Deblo Zygomycota............................................................................................................................................... 4 Deblo Chytridiomycota........................................................................................................................................ 4 Deblo Glomerulomycota...................................................................................................................................... 5 Deblo Ascomycota............................................................................................................................................... 5 Deblo Basidiomycota........................................................................................................................................... 5
Uporabljene vrste gliv............................................................................................................................... 52 ŽUŽELKE ........................................................................................................................................................ 11
Splošne značilnosti žuželk........................................................................................................................11 Vloga žuželk v ekosistemu........................................................................................................................12 Filogenetska razvrstitev žuželk................................................................................................................ 12 Vinska mušica.......................................................................................................................................... 13
3 INSEKTICIDI .................................................................................................................................................... 16 Biopesticidi.............................................................................................................................................. 17 Biopesticidi proteinske narave.................................................................................................................18 Prebavni encimi in njihovi inhibitorji......................................................................................................18
Inhibitorji glikohidrolaz...................................................................................................................................... 19 Proteaze.............................................................................................................................................................. 19 Inhibitorji proteaz............................................................................................................................................... 21
Lektini...................................................................................................................................................... 23
II. NAČRT ZA DELO ...................................................................................................................................... 30
MATERIALI IN METODE........................................................................................................................... 31
1 MATERIALI, UPORABLJENI PRI PRIPRAVI LIOFILIZATOV IN PROTEINOV ........................................................................ 31 1.1 Kemikalije ........................................................................................................................................... 31 1.2 Pufri in raztopine ................................................................................................................................ 32 1.3 Aparature in pripomočki ..................................................................................................................... 33 1.4 Glivni materiali ................................................................................................................................... 34 1.5 Inhibitorji proteaz ............................................................................................................................... 34 1.6 Lektini ................................................................................................................................................. 34
2 MATERIALI, UPORABLJENI PRI PRIPRAVI GOJIŠČ ..................................................................................................... 35 2.1 Gojišča ................................................................................................................................................ 35 2.2 Aparature in pripomočki ..................................................................................................................... 35 2.3 Kulturi vinske mušice .......................................................................................................................... 35
3 METODE .................................................................................................................................................... 36 Gojišča in optimizacija gojenja vinske mušice........................................................................................ 36
Gojišče 1............................................................................................................................................................ 36 Gojišče 2............................................................................................................................................................ 36 Gojišče 3............................................................................................................................................................ 36 Gojišče 4............................................................................................................................................................ 37 Gojišče 5 ........................................................................................................................................................... 37 Gojišče 6............................................................................................................................................................ 37 Gojišče 7............................................................................................................................................................ 38 Izbira gojišča...................................................................................................................................................... 38
Lara Kandić: diplomska naloga Kazalo
Priprava liofiliziranih ekstraktov izbranih gliv....................................................................................... 39 Priprava ekstrakta iz gob.................................................................................................................................... 39 Dializa................................................................................................................................................................ 39 Centrifugiranje................................................................................................................................................... 40 Liofilizacija........................................................................................................................................................ 40
3.1 Izolacija in čiščenje lektinov ............................................................................................................... 40 Priprava ekstrakta iz meglenke........................................................................................................................... 40 Afinitetna kromatografija................................................................................................................................... 41 Gelska filtracija.................................................................................................................................................. 42 RP-HPLC........................................................................................................................................................... 42 Ultrafiltracija – koncentriranje........................................................................................................................... 44 Določitev koncentracije...................................................................................................................................... 44 SDS PAGE elektroforeza................................................................................................................................... 45
Testiranje ekstraktov in proteinov........................................................................................................... 46 Učinkovitost (insekticidno delovanje)................................................................................................................ 46 Testiranje liofiliziranih ekstraktov...................................................................................................................... 46 Presejalno testiranje inhibitorjev in laktozil specifičnih lektinov........................................................................ 47 Testiranje očiščenih lektinov.............................................................................................................................. 48
III. REZULTATI .............................................................................................................................................. 51
1 OPTIMIZACIJA GOJENJA VINSKE MUŠICE ............................................................................................................... 51 2 PRIPRAVA LIOFILIZIRANIH EKSTRAKTOV IZBRANIH GLIV ......................................................................................... 52 3 IZOLACIJA LEKTINOV ....................................................................................................................................... 54
Izolacija in čiščenje lektinov iz ekstrakta meglenke ............................................................................... 54 Gelska filtracija ...................................................................................................................................... 57 RP-HPLC................................................................................................................................................. 58 Določitev koncentracije izoliranih lektinov.............................................................................................60
Kvantitativno merjenje koncentracije po Bradfordu........................................................................................... 60 Merjenje absorbance med 340 in 240 nm.......................................................................................................... 61
4 TESTIRANJE LIOFILIZIRANIH EKSTRAKTOV ............................................................................................................ 62 5 PRESEJALNO TESTIRANJE INHIBITORJEV IN LAKTOZIL SPECIFIČNIH LEKTINOV ............................................................... 64 6 TESTIRANJE OČIŠČENIH LEKTINOV ....................................................................................................................... 65
RAZPRAVA.....................................................................................................................................................68
7 OPTIMIZACIJA GOJENJA VINSKE MUŠICE ............................................................................................................... 68 8 TESTIRANJE LIOFILIZIRANIH EKSTRAKTOV GOB ...................................................................................................... 70 9 PRESEJALNO TESTIRANJE INSEKTICIDNEGA DELOVANJA INHIBITORJEV PROTEAZ IN LAKTOZIL SPECIFIČNIH LEKTINOV .......... 71 10 TESTIRANJE INSEKTICIDNEGA DELOVANJA RAZLIČNIH LEKTINOV ............................................................................. 72
SKLEPI.............................................................................................................................................................77
LITERATURA.................................................................................................................................................78
Lara Kandić: diplomska naloga Kazalo
KAZALO SLIK
Slika 1 Delitev gliv na debla.………………………………………………….. 4Slika 2 Clitocybe nebularis (foto Slavko Šerod)………………………………. 8Slika 3 Shema žuželke, Piotr Jaworski………………………………………… 9Slika 4 Življenjski ciklus vinske mušice………………………………………. 12Slika 5 GSL IV lektin iz Griffonia simplicifolia……………………………….. 22Slika 6 Eluati laktozil specifičnih lektinov iz laktozil afinitetne kroamtografije. 53Slika 7 Eluati laktozil specifičnih lektinov po afinitetni kromatografiji iz soka,
pridobljenega različnimi ekstrakcijskimi raztopinami………………… 53Slika 8 Vpliv prisotnosti Ca2+ in Mg2+ ionov na afiniteto laktozil specifičnih
lektinov………………………………………………………………… 54Slika 9 Izolirani lektini iz ekstratka……………………………………………. 55Slika 10 Laktozil specifični lektini po gelski filtraciji…………………………… 56Slika 11 Ločba laktozil specifičnih lektinov na RP-HPLC……………………… 58Slika 12 Proteinski inhibitorji proteaz, uporabljeni v presejalnem testiranju……. 62
Lara Kandić: diplomska naloga Kazalo
KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica I Uporabljene vrste gliv…………………………………………. 6-7Preglednica II Preglednica najobsežnejših redov žuželk……………………… 11Preglednica III Izbira gojišča…………………………………………………... 36Preglednica IV Izbira posodice in načina zapiranja……………………………. 37Preglednica V Liofilizirani ekstrakti gob, uporabljeni v prvi seriji testiranja… 45Preglednica VI Liofilizirani ekstrakti gob, uporabljeni v drugi serija testiranja.. 45Preglednica VII Liofilizirani ekstrakti gob, uporabljeni v tretji seriji
testiranja……………………………………………………….. 45Preglednica VIII Količine vgrajenih inhibitorjev proteaz in laktozil specefičnih
lektinov………………………………………………………… 46Preglednica IX Teoretične koncentracije lektinov v gojiščih………………… 47Preglednica X Količine raztopin lektinov in zatehte sladkorjev, uporabljene v
testiranju insekticidnega učinka……………………………….. 48Preglednica XI Rezultati izbire gojišča………………………………………. 49Preglednica XII Izračunane povprečne mase bub………………………………. 49Preglednica XIII Rezultati izbire vrste posode in načina zapiranja za izvedbo
testiranj………………………………………………………… 50Preglednica XIV Dobljene mase po liofilizaciji dializiranih ekstraktov gob…….. 51Preglednica XV Primerjava koncentracij lektinov v vzorcih po treh metodah…. 59Preglednica XVI Učinkovitost liofiliziranih ekstraktov v 1. in 2. seriji……..…... 60Preglednica XVII Učinkovitost liofiliziranih ekstraktov v 3. seriji……………….. 61Preglednica XVIII Rezultati presejalnega testiranja proteaznih inhibitorjev in
laktozil specifičnih lektinov…………………………………… 62Preglednica XIX Učinkovitost insekticidnega delovanja lektinov v gojišču 6.….. 63Preglednica XX Učinkovitost insekticidnega delovanja lektinov v gojišču 7.….. 64Preglednica XXI Primerjava LD50 testiranih lektinov v gojiščih 6 in 7…………. 72Preglednica XXII Primerjava vpliva vsebnosti različnih saharidov v gojiščih 6
in 7……………………………………………………………. 73
Lara Kandić: diplomska naloga Kazalo
KAZALO GRAFOV
Graf 1 Elucija laktozil specifičnih lektinov po afinitetni kromatografij.….…..... 52Graf 2 Elucija galaktozil, saharozil in glukozil specifičnih lektinov po afinitetni
kromatografiji……………………………………………………….…… 54Graf 3 Laktozil specifični lektini po gelski filtraciji.….…..…………….…….... 56Graf 4 Preliminarna ločba laktozil specifičnih lektinov na RP-HPLC………….. 57Graf 5 Ločba laktozil specifičnih lektinov na RP-HPLC.……………………..... 57Graf 6 Laktozil specifilčni lektini (A340-A240).…………………….……………. 59Graf 7 Insekticidni učinek v odvisnosti od vsebnosti liofilizata v gojišču……… 61Graf 8 Učinkovitost insekticidnega delovanja lektinov v gojišču 6…………….. 64Graf 9 Učinkovitost insekticidnega delovanja lektinov v gojišču 7…………….. 65
Lara Kandić: diplomska naloga Seznam okrajšav
SEZNAM OKRAJŠAV
A280 absorbanca (negativni logaritem prepustnosti) pri valovni dolžini 280 nmA340-240 absorbanca (negativni logaritem prepustnosti) med valovno dolžino 340 nm
in 240 nmACN acetonitrilBSA goveji serumski albumindH2O destilirana vodaEDTA etilendiamin tetraacetatIJS Inštitut Jožef StefanLMW low molecular weightNaAc natrijev acetatNIB Nacionalni inštitut za biologijoRP-HPLC reverse phase high performance liquid chromatographyRS relativna smrtnostSDS sodium dodecyl sulfateSDS-PAGE sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresisTFA trifluorocetna kislinaTRIS tris (hidroksimetil) amino metanVR variacijski razmik
Lara Kandić: diplomska naloga Povzetek
POVZETEK
Človek z razvojem znanosti skuša zadostiti naraščajočim življenjskim potrebam. Izmed njih
mora zagotoviti boljšo zaščito sebe in vrst, ki jih goji, povečati pridelek in s tem čim manj
škoditi okolju. Rastline in živali so se med evolucijo razvijale hkratiobrambne mehanizma
in rezistenco nanje, medtem pa človek skuša prevzeti kontrolo z uporabo pesticidov in
deugih metod. Med pesticidi zaradi zavedanja krhkosti zdravja nas in narave prihajajo v
ospredje biopesticidi, pri katerih posebno mesto zavzemajo proteini. Še neodkriti vir
biopesticidov predstavlja pozabljeno kraljestvo gliv.
Pri iskanju potencialnih bioinsekticidov smo pri delu uporabili vinsko mušico (Drosophila
melanogaster, Diptera) kot modelni organizem.
Iz kraljestva gliv smo liofilizirali 23 ekstraktov različnih predstavnikov podstavkovnic,
izmed katerih se jih je 6 izkazalo toksičnih za vinsko mušico pri nizki vsebnosti v gojišču.
Nobena izmed izbranih gob ni strupena za človeka, kvečjemu pogojno užitna ali neužitna.
Najbolj toksičen je bil liofilizat ekstrakta meglenke (Clitocybe nebularis).
Vinska mušica ima večino prebavnih proteaz serinskega katalitskega tipa, ustrezno temu so
različni inhibitorji serinskih proteaz dosegli različne insekticidne učinke. Najbolj toksičen
je bil inhibitor PI-2 iz krompirja, sledila sta mu CNSPI iz meglenke in PSPI iz krompirja.
Inhibitorji cisteinskih proteaz za vinsko mušico niso bili toksični.
Ekstrakt meglenke vsebuje tudi več lektinov z različnimi specifikami vezave saharidov,
katerim biološka funkcija ni znana. Izolirali smo jih pótem štirih afinitetnih kromatografij,
gelske filtracije in RP-HPLC.Za vezavo ne potrebujejo dvovalentnih kovinskih kofaktorjev.
Glukozil in saharozil specifična lektina sta čista, galaktozil in laktozil specifični lektini pa
sta mešanici treh proteinov. Izmed njih je bil za vinsko mušico najbolj toksičen laktozil
specifičen lektin z velikostjo 19 kDa, očiščen z RP-HPLC, nato mešanici galaktozil in
laktozil specifičnih lektinov. Glukozil specifični lektini nimajo insekticidnega učinka,
saharozil specifičnim lektinom pa ga je znižala gojišču dodana saharoza in koruzna moka.
Lara Kandić: diplomska naloga Abstract
ABSTRACT
Humans are, by developing sciences, trying to satisfy the increasing needs of life. Among
them we must insure better protection of ourselves and species we cultivate, enlarged food
production and cause minimal harm to the environment. Plants and animals have been
developing simultaneously through evolution, adapting to each other; meanwhile we are
trying to take control by the use of pesticides. Among them biopesticides are, due to health
awareness, gaining in importance, where proteins take special place. Yet uncovered source
of biopesticides is the forgotten kingdom of fungi.
We have used fruit fly (Drosophila melanogaster, Diptera) as a model organism in search
of potential bioinsecticides.
From the kingdom of fungi we have lyophilised 23 extracts of different representatives of
Basidiomycestes; among them we found 6 to be toxic to fruit fly present in a low
concentration in rearing medium. None of these 6 are toxic to humans, at the utmost
conditionaly edible or unedible. The most toxic was liophilised extract of a clouded agaric
(Clitocybe nebularis).
The fruit fly has most of its digestion proteases classified as serine type; corresponding to
that, different serine protease inhibitors exert different insecticidal effect. The most toxic
was PI-2 from a potato, followed by CNSPI from a clouded agaric and PSPI from a potato.
Inhibitors of cysteine proteases were not toxic to fruit fly.
Extract of the clouded agaric contains several lectins with different sugar specificities,
which biological function is not known. These proteins have been extracted by means of
affinity chromatography, gel filtration and RP-HPLC. They do not need two-valent metal
ions for sugar binding. Glucosyl and sucrosyl specific lectins were pure, meanwhile
galactosyl and lactosyl specific lectines were mixtures each consisitng of three proteins..
Among these lactosyl specific lectin 19 kDa, purified by RP-HPLC, was the most toxic to
fruit fly, followed by galactosyl and lactosyl specific lectins. Glucosyl specific lectin did
not show any insecticidal effect. Sucrosyl specific lectin has had lowered insecticidal effect
when sucrose or corn meal were added to rearing medium.
IX
Lara Kandić: diplomska naloga I Uvod
UVOD
Človeška civilizacija je vzklila s prvim semenom, ki ga je naš davni prednik načrtno
posadil, negoval in obral njegove plodove. Od prve kultivacije dalje se je po drobnih
korakih razvijalo varstvo rastlin pred škodljivci, pleveli in boleznimi, ki vplivajo na
pridelek kmetijskih rastlin. Naravna odpornost rastlin je zasnovana na različnih obrambnih
mehanizmih fizikalne ali biokemijske narave. Skozi tisočletja smo z izbiro in križanjem
določenih rastlinskih vrst pridobili poljščine, ki večkrat presegajo prinos izhodiščnih vrst.
Vendar se je s tem pri mnogo katerih izgubila odpornost pred naravnimi plenilci in
zajedavci. Prvi znani pesticid je bilo elementarno žveplo, uporabljeno pred 4500 leti pri
Sumercih [1]. Od takrat se je spekter počasi širil, do odkritij organske sintezne kemije in
masovne uporabe pesticida DDT, vendar so kmalu ugotovili kopico njegovih neželenih
posledic za okolje. V zadnjih letih se srečujemo z vse večjim zavedanjem javnosti o
zdravju, varnosti hrane in varovanju okolja. Biopesticidi v širšem smislu pridobivajo
pomen kot alternativa kemičnim pesticidom. V splošnem so manj toksični in se pogosto
hitro razgradijo. V nasprotju s kemičnimi pesticidi širokega spektra, ki lahko vplivajo
direktno in/ali indirektno na zelo različne organizme (žuželke, ptice in sesalce), običajno v
majhnih količinah delujejo le na tarčnega škodljivca. Vir biopesticidov so živali, rastline,
bakterije in nižje glive, medtem ko so produkti višjih gliv ali gob (bazidiomicet), tako
sekundarni metaboliti kot tudi druge sestavine celic, proteini in polisaharidi, v tem pogledu
manj raziskani.
1Glive
V kraljestvu gliv najdemo mnoge pomembne organizme, tako po njihovi ekološki kot
ekonomski vlogi [2]. Od preostalih evkariontov se na edinstven način razlikujejo v načinu
prehranjevanja, strukturni organiziranosti, rasti in razmnoževanju. Opisanih je približno
100.000 vrst gliv, nekateri pa ocenjujejo, da naj bi obstajalo vsaj 1.5 milijona različnih vrst
[3]. So simbiotski organizmi nekaterim rastlinam, vir tako zdravilnih učinkovin kot strupov,
vzrok prenekaterim obolenjem rastlin, živali ter ljudi in hkrati nepogrešljivi del prehranske
industrije in številnih raziskav [2]. Glive so še vedno neizčrpan vir učinkovin, izmed
insekticidnih najdemo insekticidne antibiotike, sekundarne metabolite, proteaze, inhibitorje
proteaz, lektine, druge toksine itd.
1
Lara Kandić: diplomska naloga I Uvod
Splošne značilnosti gliv
Glive so enocelični, koenocitični in večinoma večcelični evkariontski heterotrofni
organizmi. Celice gliv so obdane s celično steno, katere osnovne gradbene enote so, razen
redkih izjem, hitin (β-1,4 homopolimer N-acetilglukozamina v kristaliničnem stanju) in
glukani (α-1,3 in β-1,6 vezi). Nekatere vrste iz debla Ascomycota (Ophiostomataceae)
imajo celulozo v celičnih stenah, določeni člani debla Chytridiomycota pa sten sploh
nimajo (Coelomomycetales).
Z izjemo enoceličnih gliv, kot so na primer kvasovke, vegetativno obliko večine gliv
sestavljajo nitasti nizi celic (hife), ki imajo v premeru 5 do 10 μm. Vedno se delijo samo
končne celice vsake hife, kar omogoča dolžinsko rast glive. Posamezne hife se vzdolžno
povezujejo in tvorijo micelij, ki ima lahko premer tudi po nekaj kilometrov kar pomeni, da
njegovi začetki lahko segajo pred naše štetje [3]. Celice hif so brez plastidov in klorofila,
med njimi pa je celična stena z večjimi porami (septa) kar omogoča pretok ribosomov,
mitohondrijev in celo jeder med celicami. Glive so v glavnem negibljive, nekatere nižje
glive pa tvorijo gibljive spore za razmnoževanje in razširjanje. Razmnoževanje poteka na
spolni ali nespolni način s sporami, ki se ponavadi raznašajo s pomočjo vetra ali vode. Pred
združevanjem pri spolnem razmnoževanju posamezne glive komunicirajo z drugimi preko
feromonov [4].
Vse glive za energijo in sintezo celičnih sestavin potrebujejo organske snovi, ki jih
pridobivajo z absorpcijo hranil iz svojega okolja: enostavnih topnih hranil (sladkorji,
aminokisline) in z izločanjem encimov za razgradnjo polimerov, ki jih niso sposobne
absorbirati, in tako prispevajo svoj delež v ciklusu kroženja snovi v naravi. Energijo
pridobijo po dveh metabolnih poteh, pri dihalni verigi in/ali fermentaciji.
Vloga gliv v ekosistemih in gospodarstvu
Dinamika ekosistemov je v veliki meri odvisna od gliv. Glive so običajno najpomembnejši
razgrajevalni organizmi v svojih naravnih habitatih in s tem v okolje vračajo anorganska
hranila, nujna za rast rastlin in posledično preživetje živali, ki se hranijo z njimi, ter tako
zaključijo cikel kroženja snovi v naravi [3].
Mnoge vrste so prostoživeči saprofiti (uporabniki ogljika, ki ga proizvedejo drugi
organizmi) v lesu, zemlji, odpadlem listju, mrtvih živalih in živalskih eksudatih. Glive so se
predvsem dobro prilagodile na razgrajevanje rastlinskega materiala. Njihove hife vstopijo v
tkiva in celice mrtvega materiala ter z izločanjem zunajceličnih encimov povzročijo
2
Lara Kandić: diplomska naloga I Uvod
hidrolizo polimerov, najpogosteje sta to celuloza in lignin, pri nekaterih vrstah tudi hitin.
Številne druge vrste gliv so biotrofi. Simbionti, kot so lišaji, mikorize, endofiti na listih in
steblih, uspešno sodelujejo z rastlinami (vključno z algami), živalmi (predvsem artropodi)
in prokarionti [5].
Rje, sneti in mnoge askomicete so najpomembnejši rastlinski patogeni. Glive napadejo med
10 in 50 % vsakoletnega pridelka sadja, kar povzroča veliko ekonomsko škodo človeku.
Živali in ljudje so manj občutljivi na parazitne glive, čeprav so lahko infekcije z njimi
precej resne. Ljudje obolevajo za boleznimi kot so blastomikoze, histoplazmoze, alergije,
kriptokokoze in podobnimi. Oportunistični patogeni, kot je kandida (Candida albicans), ki
so normalno prisotni v človeku, postajajo pomembna skupina življenjsko nevarnih
človeških patogenov zaradi povečanja števila bolnikov z zmanjšano imunsko odpornostjo
(npr. oboleli za virusom HIV), ter vedno večjega števila opravljenih transplantacij.
Določene glive izločajo snovi, ki so toksične za človeka (npr. Claviceps purpurea). Toksini
so po drugi strani lahko v majhni količinah uporabni v medicinske namene, kot so na
primer ergot spojine pri zaustavljanju krvavitve pri porodu. Med sekundarnimi metaboliti
so za farmacijo pomembni antibiotiki (penicilini, cefalosporini, grisoefulvin in drugi),
učinkovine za zniževanje holesterola (lovastatin) in imunosupresivne učinkovine
(ciklosporin A) [4].
Glive imajo velik pomen v vsakodnevnem življenju človeka. Z gobami se prehranjuje
večina ljudstev, številne glive pa se izkorišča pri procesiranju hrane in izboljšanju okusa
(kvasovke in njihova sposobnost fermentacije v pekarstvu, pivovarstvu in vinarstvu; vrsta
Penicillium in druge pri izdelavi sira). Sekundarni metaboliti (etanol, organske kisline,
encimi) pa so našli svojo uporabnost v industriji. Z razvojem tehnik genskega inženirstva je
postalo mogoče pridobivati tudi heterologne rekombinantne hormone in proteine iz gliv,
predvsem kvasovk [4].
Filogenetska razvrstitev gliv
Ugotavljanje natančne filogenetske zgodovine gliv je zaradi nizkega števila fosilov težavno
[2]. V preteklosti so obstajale različne intrepretacije, osnovane le na morfoloških lastnostih
obstoječih gliv, predvsem na obliki micelija in načinu spolnega razmnoževanja. Zaradi
razvoja molekularnih tehnik (npr. analize genov male podenote ribosomalne RNA, visoko
ohranjenih proteinov, kot sta tubulin in aktin) so se hipoteze o filogeniji posameznih skupin
gliv radikalno spremenile. Nekateri taksonomski sistemi delijo glive na prave glive
3
Lara Kandić: diplomska naloga I Uvod
(Eumycota) in na glive sluzavke (Myxomycota). Glive sluzavke se pogostje štejejo k
praživalim (Protozoa). Blackwell, Vigalys in Taylor so modificirali razdelitev gliv (Fungi)
po Burnsu in sod. na debla Zygomycota, Chytridiomycota, Glomerulomycota, Ascomycota
in Basidiomycota [4]. Znotraj posameznih debel se razdelitev vrst in poimenovanje nižjih
taksonov razlikujejo med različnimi avtorji.
Slika 1: Delitev gliv na debla
Deblo Zygomycota
Zigomicete so večinoma zemeljski saprofiti mikroskopskih velikosti, nekatere med njimi so
simbionti, druge pa paraziti, patogeni živali, rastlin in drugih gliv. Zaradi njihove
patogenosti za insekte jih proučujejo v namene biokontrole nekaterih škodljivcev (npr.
škržata). Tipično steljko zigomicet predstavlja dobro razvit, razvejan micelij brez predelnih
sten (aseptati), kar jih uvršča med koenocitične glive. Poznane so vrste, ki imajo večcelični
micelij, oziroma obstajajo v dveh vegetativnih oblikah: enocelična oblika oziroma micelij.
Iz tega debla so izločili arbuskularne mikorizne glive (Glomales) in jih uvrstili v ločeno
deblo Glomerulomycota. Red Entomophthorales vsebuje več entomopatogenih vrst gliv [4].
Deblo Chytridiomycota
Kritidiomicete so zemeljske in predvsem vodne saprotrofne ali parazitne glive. Steljka je
pri nekaterih vrstah enocelična, v obliki vrčka (polnega še nesproščenih zoospor) pri drugih
pa koenocitičen micelij, ki ima s septo ločene le reproduktivne strukture. Spolno
razmnoževanje poteka s fuzijo gibljivih gamet; nespolno pa s citoplazemsko delitvijo
sporangija, pri čemer nastanejo gibljive zoospore z enim bičkom. Celična stena je iz hitina,
čeprav najdemo tudi steno iz celuloze [6, 7].
4
EVKARIONTI
GLIVE
zigomicete
kritidiomicete
bazidiomicete
glomerulomicete
askomicete
listarice
nelistarice
trebuharice
RASTLINE
ŽIVALI
podstavkovnice
razdelkovnice
Lara Kandić: diplomska naloga I Uvod
Deblo Glomerulomycota
Članice tega debla so arbuskularne mikorizne glive, obligatorni simbionti. S posebnimi,
arbuskularnimi izrastki na neseptiranih (koenocitičnih) hifah iz simbiontske rastline
absorbirajo ogljikove hidrate. V zameno delujejo kot razširjen koreninski sistem in
simbiontski rastlini povečajo možnost privzema potrebnih mineralov. Do sedaj niso našli
spolne oblike razmnoževanja teh gliv, nespolno pa tvorijo velike večjedrne spore, ki ob
ugodni pogojih vzklijejo in poiščejo novega mikoriznega simbionta [4].
Deblo Ascomycota
Zaprtotrosnice (Ascomycota) so zemeljski saprofiti ali paraziti, za katere je značilen
nastanek askospor v askusu. So tudi simbionti z algami (lišaji) in rastlinami (mikorize,
endofiti). Rastejo v obliki razvejanih hif s predelnimi stenami (septa), znani so tudi nekateri
enocelični organizmi in dimorfne vrste [4].
V tem deblu so odkrili entomotoksičen red Hypocreales. Glivo iz tega reda (Metarhizium
anisopliae) so modificirali tako, da izloča večjo količino toksičnih proteaz in na tak način
hitreje ubije gostiteljske insekte. V tej vrsti so našli nekaj insekticidnih antibiotikov; med
drugimi zaprtotrosnicami jih kar nekaj skriva tudi vsem znan Penicillium [8, 10].
Deblo Basidiomycota
Odprtotrosnice (Basidiomycota) so tipični zemeljski saprofiti ali paraziti, ki tvorijo
bazidiospore na bazidiju. Delijo se na dva razreda: podstavkovnice (Basidiomycetes) in
razdelkovnice (Heterobasidiomycetes). Med njih sodijo gobe, rje in sneti. Redke
bazidiomicete so vodni organizmi. Steljko predstavlja dobro razvit micelij iz hif s
predelnimi stenami. Nekatere odprtotrosnice lahko obstajajo v enocelični fazi, številne vrste
oprtotrosnic pa razvijejo plodišča, ki so sestavljena iz beta in klobuka (gobe) [3]. V
nekaterih družinah bazidiomicet so našli tripsinske [11] in cisteinske inhibitorje [12].
Vse gobe, uporabljene v diplomskem delu, so iz debla odprtotrosnic.
Uporabljene vrste gliv
Pri delu smo uporabili gobe, ki se lahko najdejo na različnih področjih Slovenije. Med
njimi so nekatere užitne, druge strupene, v kolikor se znajdejo na našem jedilniku. Iz debla
odprtotrosnic smo pokrili vse podrazrede podstavkovnic: listarice (Agaricomycetideae),
nelistarice (Aphyllophoromycetideae) in trebuharice (Gasteromycetideae). Glavne lastnosti,
navedene v preglednici I, so povzete po dveh virih [13, 14].
5
Lara Kandić: diplomska naloga I Uvod
Preglednica I: Uporabljene vrste gliv
podrazred: AGARICOMYCETIDEAE (Listarice)rod glavne lastnosti in zanimivosti
red
družina
Agaricales(listarji)Agaricaceae(kukmarke)
Agaricus(kukmaki)
Agaricus campestris, travniški kukmak
◦ užiten, vonj mil, okus prijeten◦ raste pozno pomladi in konec poletja◦ prvi hemaglutinin odkrit leta 1966 [15]◦ hipoglikemično delovanje [16]
Macrolepiota (dežniki)
Macrolepiota procera, orjaški dežnik
◦ užiten paniran◦ raste v gozdovih in na gozdnih
travnikih, od sredine poletja do pozne jeseni
◦ znan po visoki vsebnosti kovinred
družina
Boletales(cevarji)Boletaceae(cevarke)
Boletus (gobani)
Boletus calopus, leponogi goban
◦ neužiten, zelo grenak, vonj kiselkast ◦ pogosto ga najdemo v gozdovih◦ vsebuje δ-laktone, lovilce prostih
radikalov [17]Suillus(lupljivke)
Suillus granulatus, ovčarska lupljivka
◦ užitna, vonj mil, okus prijeten ◦ raste pod bori, mikorizna goba◦ vsebuje antioksidantne fenole [18]◦ vsebuje protitumorne substance [19]
red družina
Cortinariales(koprenarji)Cortinariaceae(koprenarke)
Cortinarius(koprenke)
Cortinarius caerulescens, višnjeva koprenka
◦ užitna, vonj neznaten, okus prijeten ◦ raste v senčnatem bukovem gozdu◦ koprenke so najobsežnejši rod gob
Cortinarius glaucopus, kolobarniška koprenka
◦ užitna, vonj neizrazit, včasih nekoliko neprijeten, okus mil
◦ raste pod iglavci, zlasti v gorskem svetu
Hebeloma(medlenke)
Hebeloma radicosum, korenasta medlenka
◦ pogojno užitna, vonj po mandljih, mil vendar grenkoben okus
◦ raste v listnatih gozdovih od poletja do pozne jeseni
Hebeloma sinapizans, redkvičasta medlenka
◦ strupena, vonj po repi, okus grenak◦ raste pod različnim drevjem, od poletja
do pozne jeseni◦ vsebuje citotoksične spojine [20]
red
družina
Russulales(golobičarji)Russulaceae(golobičarke)
Lactarius(mlečnice)
Lactarius deliciosus, užitnasirovka
◦ užitna, vonj kiselkast, okus oster◦ raste pod bori (mikorizna goba), tudi
brini◦ okarakteriziran lektin LDL (O-eritrociti),
domnevno sodeluje pri razvoju mikoriz [21]
Lactarius cilicioides, kocasta mlečnica
◦ neužitna, ostrega okusa ◦ raste v listnatih gozdovih na
apnenčastih tleh
Lactarius piperatus, poprova mlečnica
◦ pogojno užitna, vonj po kruhu, okus pekoč
◦ raste v senčnih in vlažnih gozdovih◦ vsebuje cis-poliizoprene [23]
Lactarius scrobiculatus, jamičasta mlečnica
◦ pogojno užitna, vonj po sadju, okus pekoč
◦ raste pod iglavci, poleti in jeseni◦ vsebuje norlaktaranske in laktaranske
6
Lara Kandić: diplomska naloga I Uvod
seskviterpene [24]Russula (golobice)
Russula albonigra, črnjava golobica
◦ neužitna, vonj rahel, okus grenak in pekoč
◦ raste predvsem v bukovih gozdovih
7
Lara Kandić: diplomska naloga I Uvod
Nadaljevanje preglednice I: Uporabljene vrste gliv
podrazred: AGARICOMYCETIDEAE (Listarice)rod vrsta glavne lastnosti in zanimivosti
red
družina
Tricholomatales(kolobarničarji)Hygrophoraceae(polžarke)
Hygrophorus(polževke)
Hygrophorus pudorinus, hojeva polževka
◦ užitna, vonj in okus po smoli◦ raste pod smrekami in jelkami◦ rod vsebuje higroforone, fungicidne
ciklopentanone [25]red
družina
Tricholomatales(kolobarničarji)Tricholomataceae(kolobarničarke)
Armillaria(mraznice)
Armillaria mellea, sivorumena mraznica
◦ pogojno užitna,vonj neprijeten,okus kisel ◦ raste na štorih kot gniloživka/zajedavka◦ znana tudi pod imenom prava štorovka ◦ vsebuje fibrinolitični proteazo AMMP
[26]Clitocybe (Livke)
Clitocybe geotropa poznalivka
◦ užitna, močen vonj po sivki ali grenkih mandeljnih, okus mil
◦ raste jeseni na gozdnih jasah v obročih◦ v Franciji našli obroč s premerom
600 mClitocybe nebularis, poprhnjena livka
◦ znana pod imenom meglenka; gobo smo podrobneje raziskali v diplomskem delu, zato ji je posvečenih več besed v poglavju 1.4.1.1
Lepista (kolesnice)
Lepista nuda vijoličasta kolesnica
◦ pogojno užitna, vonj aromatičen in okus◦ raste jeseni v iglastih gozdovih◦ MeOH ekstrakt deluje protimikrobno
[27]◦ sveža dobre antioksidantne lastnosti [28]◦ našli so lektin,ki ga inhibira galaktoza
[29]Tricholoma(kolobarnice)
Tricholoma bufonium, krastačja kolobarnica
◦ strupena, vonj po acetilenu, okus mil◦ raste jeseni v listnatih gozdovih◦ definirajo jo kot infraspecifično
varianto T. sulphureum [30]
podrazred : APHYLLOPHOROMYCETIDEAE (Nelistarice)rod vrsta glavne lastnosti in zanimivosti
red
družina
Cantharellales(lisičkarji)Clavariaceae(kijarke)
Ramaria(grive)
Ramaria formosa,Lepagriva
◦ strupena, vonj nezaznaven, okus kiselkast in grenkoben
◦ raste pod listavci poleti in jeseni◦ toksine uvrščajo med gastroiritante
red
družina
Telephorales(bodičarji)Bankeraceae(bodičarke)
Sarcodon (ježevci)
Sarcodon imbricatus, rjaviježevec
◦ užitna, okus kiselkast in grenkoben◦ raste v iglastih in mešanih gozdovih◦ vsebuje antioksidante (fenolne spojine)
[31]
podrazred: GASTEROMYCETIDEAE (Trebuharice)rod vrsta glavne lastnosti in zanimivosti
red
družina
Lycoperdales(trebuharji)Geastraceae(zvezdarke)
Geastrum(zvezdice)
Geastrum sessile, resasta zvezdica
◦ neužitna, ◦ raste jeseni v gozdu◦ imenujejo jo tudi Geastrum
fimbriatum [32]red
družina
Lycoperdales(trebuharji)Lycoperdaceae
Lycoperdon(prašnice)
Lycoperdon perlatum, betičasta
◦ mlada užitna, prijetnega okusa in vonja ◦ raste v gozdovih od pomladi do pozne
jeseni
8
Lara Kandić: diplomska naloga I Uvod
(prašničarke) prašnica
9
Lara Kandić: diplomska naloga I Uvod
Gobe, uporabljene v poskusih, so iz osmih od dvanajst redov podstavkovnic. Iz nekaterih so
izolirali spojine, katerim učinke še odkrivajo, pri drugih so učinek opazili in še iščejo
učinkovine. Največ je takšnih, katere še čakajo, da jih sploh opazijo.
Meglenka
Clitocybe nebularis, meglenka ali poprhnjena livka, spada v rod lisičark oziroma livk
(Agaricales), družino kolobarnic (Tricholomataceae). Ima mesnat klobuk, pokrit s polsteno
kožico, ki jo zlahka olupimo. Klobuk je pogosto ugreznjen v obliki lija z gladkim,
spodvihanim robom, pepelnato ali sajasto sivkast in belkasto poprhnjen. Pod klobukom so
tanki lističi, kjer so tudi bazidiji. Nima ovojnice niti obročka. Vonj je močan in aromatičen,
malce neprijeten, po okusu pa je kiselkasta. Je užitna, vendar lahko povzroča prebavne
motnje. Najdemo jo od poznega poletja do začetka zime na apnenčastih tleh, pri nas
predvsem na Krasu in Istri, na preperelem listju v listnatih in mešanih gozdovih [13, 14].
Leta 1977 so iz nje izolirali lektin, specifičen za N-acetil-α-D-galaktozamin (BI), že leta
1953 pa so že poročali o anti-A1 fitoaglutininu [34]. Slabih 50 let pozneje so iz nje izolirali
nov inhibitor serinskih proteaz CnSPI (Clitocybe nebularis serine protease inhibitor),
odkrili pa so tudi člana nove družine inhibitorjev cisteinskih proteaz, klitocipin [12, 35].
Slika 2: Clitocybe nebularis (foto Slavko Šerod [13])
10
Lara Kandić: diplomska naloga I Uvod
2Žuželke
Izmed 1,2 milijona znanih vrst nevretenčarjev je 950,000 žuželk [37]. Vsako leto popišejo
7000 novih vrst, napovedujejo pa do 50 milijonov vrst vseh žuželk, za zdaj razvrščenih v
30-35 redov, odvisno od avtorjev. Prevladujejo na kopnem, tudi v sladkih vodah (hrošči,
stenice in larve nekaterih vrst). So izjemno prilagodljive: našli so primerke na gorskih
vrhovih, v naftnih mlakah in slanih jezerih.
Splošne značilnosti žuželk
Telo žuželk je sestavljeno iz glave, oprsja in zadka, z zunanje strani utrjeno z hitinskim
ogrodjem. Obustne okončine so iz treh delov (mandibula, maksila in labium) in sestavljajo
grizalo, sesalo (npr. Lepidoptera), lizalo-sesalo ali bodalo-sesalo (npr. Diptera). Za vse
redove so značilni trije pari nog na, po en par vsakem izmed treh delov oprsja. V zadku je
večji del respiratornega sistema (pri večini trahealni - dihalnice), ekskretorni sistem
(Malpighijeve cevke), prebavila in reproduktivni organi. Uporabljajo skoraj vse vire hrane,
večinoma so herbivori, veliko je karnivor, poznamo tako simbiozo kot parazitizem.
Krvožilje je odprt sistem, srce (perforirana mišična cev) prečrpava hemolimfo, zadolženo
za transport hranil; za izmenjavo plinov zadostuje trahealni sistem, ki je po drugi strani
eden omejitvenih dejavnikov velikosti žuželk . Živčni sistem sestavljajo trebušna nevralna
vrvica in centralni gangliji v glavi. Oči so glavno
čutilo in so direktno povezane z optičnim centrom.
S tipalnimi organi zaznavajo premikanja zraka in
vibracije (zvok), preko katerih medsebojno
komunicirajo (fonoreceptorji). Zvok ustvarjajo z
vibriranjem ali potrkavanjem zadka ob podlago ali s
specializiranimi organi (red Orthoptera, kobilice):
z drgnjenjem kril, mandibul ali zadnjega para nog.
Premikajo se z letenjem, hojo, nekatere še s plavanjem. 90% vseh žuželk je krilatih, kar je
bila bistvena prednost pri osvajanju kopna pred 350 milijoni let (konec devona) in
razširjanju na velike razdalje [37]. Večina jih ima dva para kril, pri nekaterih (npr. pri
muhah (Brachycera)) je drugi zakrnel v organa imenovana utripači. Njuna naloga je pomoč
pri krmiljenju in omogoča lebdenje na mestu, neverjetno hitre obrate in boje v zraku [38].
Žuželke se razmnožujejo spolno. Iz oplojenih jajčec se izležejo larve (ovivoparno, redko
vivoparno), ki se hranijo in prestanejo več levitev, katere uravnavajo juvenilni hormoni,
11
Slika 3: Shema žuželke, Piotr Jaworski [CB]
Lara Kandić: diplomska naloga I Uvod
nato se zabubijo. Nimfe so larve, podobne odraslim pripadnikom vrste z manjkajočimi krili,
larve, ki pa so po obliki drugačne od odraslih, pa skozi razvojne faze prestanejo popolno
metamorfozo [3, 37].
Vloga žuželk v ekosistemu
Mnoge žuželke uvrščajo med škodljivce, saj so zajedavci (komarji, uši), uničujejo strukture
(termiti), ter uničujejo kmetijske pridelke (kobilice) [37]. So prenašalke številnih bolezni:
Siphonaptera (kuga, tifus, salmoneloza); Phthiraptera (tifus, mrzlica); Diptera (malarija,
griža, kolera, spalna bolezen, denga virus, mrzlice). Samo diareja vzame dnevno osem tisoč
življenj, SARS pa jih je v celem letu petsto. Malarija je leta 1998 odnesla dober milijon
človeških življenj, več kot rak prostate in dojk, melanom in levkemija skupaj [39]. Mnoge
žuželke imajo takšne reprodukcijske sposobnosti, da bi v eni sezoni lahko dobesedno
prekrile vso Zemljo, vendar jim to preprečujejo njihovi naravni plenilci (druge žuželke -
insektivori, ptiči). Entomofagija, prehranjevanje z žuželkami, rešuje lakoto v nemalo
državah, saj so skoraj neomejen vir beljakovin. Posušene in pomešane z različnim
rastlinjem, so za domorodce Avstralije in Amerike pomenile zdravo in uravnoteženo
prehrano v najneprijaznejših obdobjih. V koevoluciji z rastlinami so herbivorne žuželke ali
širile nabor prehranskih rastlin ali pa so specializirale prehrano le na nekatere vrste; ta
specializacija je vključevala tudi razvoj rezistence na obrambne mehanizme rastlin. Le-te
pa so v nekaterih drugih žuželkah našle obligatorne partnerje: žuželke ob nabiranju nektarja
prenašajo pelod žužkocvetk. 80 % kmetijskih rastlin je žužkocvetk, kar nas dodatno
opozarja na pomembnost selektivne toksičnosti insekticidov [3, 37].
Filogenetska razvrstitev žuželk
Žuželke so razred v poddeblu šesteronožnih členonožcev (Hexapoda). Nadalje jih delijo v
podrazrede, infrarazrede in nadrede. Apterigota so primarno nekrilate žuželke (pražuželke),
ki združuje štiri rede: skakače, proture, dvorepke in ščetinorepke. V zadnji red spadajo t.i.
srebrne ribice (Lepismatide). Pterigota, primarno krilate žuželke, lahko zaradi načina
življenja izgubijo krila (mravlje, uši, bolhe). Le-te delijo najprej na hemimetabolne in
holometabolne in dalje na več redov. V preglednici II so našteti so le najštevilnejši redovi
glede na število vrst in predstavniki, znani večini iz vsakdanjega življenja. Ocenjujejo, da
letno izumre 1000 vrst žuželk iz različnih razlogov (npr. pomanjkanje hrane zaradi
podnebnih sprememb in posegov človeka v okolje); izumrli so tudi že številni redovi [37].
12
Lara Kandić: diplomska naloga I Uvod
Preglednica II: Preglednica najobsežnejših redov žuželk [37]
red slovensko ime ocenjeno št. vrst predstavnikiAnoplura uši 2.400 naglavna ušColeoptera hrošči 500.000 koloradski hrošč, pikapolonicaDiptera dvokrilci 120.000 vinska mušica, navadna muhaHemiptera stenice 55.000 veliki škržat, šuštarji, trtna ušHymenoptera kožokrilci 100.000 čebele, ose, čmrljiIsoptera termiti 2.000 mravlje, faraonke, termitiLepidoptera metulji 180.000 metulji, moljiOdonata kačji pastirji 5.000 prodni modračOrthoptera ravnokrilci 30.000 kobilice; primorska plenilkaSiphonaptera bolhe 2.000 pasja bolha, človeška bolha
Vinska mušica
Drosophila melanogaster je žuželka iz reda dvokrilcev (Diptera) oziroma pravih muh.
Zanje so značilni trije pari nog, en par kril, sesajoči, prebadajoči ali ovijajoči ustni deli ter
popolna metamorfoza. Vrsta izhaja iz vlažnih tropskih predelov, s človekom pa se je
razširila in prilagodila na številna druga okolja. Naseljuje skoraj vso Zemljo, z izjemo
Antarktike, puščav, visokih hribov in gora. Hrani se prvenstveno s sadjem, lahko pa tudi z
lesom, gobami, cvetjem ipd. Pri nas je srečamo največ jeseni, posebno v sadovnjakih in
vinogradih. Sama po sebi je neškodljiva, vendar lahko v velikih količinah nanese kar nekaj
škode v agronomiji [40, 41].
Vstopnica v raziskovalne laboratorije
Za mnoge je neprecenljiv modelni organizem za raziskave na področju biologije, predvsem
genetike in razvojne biologije. V laboratorijih je že skoraj celo stoletje, odkar je T. H.
Morgan razširil veljavnost Mendelejeve teorije kromosomskega dedovanja na živalski svet
[40]. Njene bistvene prednosti so kratek življenjski ciklus (povprečno v dveh tednih je nova
generacija spolno zrela), veliko število potomcev (ena samica odloži do 500 jajčec) in
relativna enostavnost in nezahtevnost gojenja v laboratorijskih pogojih [3]. Njeni 4 pari
kromosomov, sestavljenih iz približno 132 milijonov baznih parov, so bili sekvencionirani
že leta 2000. Genetsko smo ljudje kar v 44% podobni vinski mušici, 61% naših genskih
bolezni se razpoznavno ujema v njenem genskem zapisu. Uporablja se jo kot raziskovalni
model za nekatera človeška obolenja, npr. Parkinsonovo, Alzheimerjevo in Huntingtonovo
bolezen. Vpeljana je tudi v študije diabetesa, raka in mehanizmov imunskega odziva [40].
13
Lara Kandić: diplomska naloga I Uvod
Opis prve mutacije, ki je vplivala na obnašanje živali, je bila mutacija v genu t.i. biološke
ure, ki nadzoruje dnevne aktivnosti vinske mušice. Čeprav je gen prisoten v mnogih
celicah, so nosilne nevronske celice v centralnem živčnem sistemu. Od takrat so našli gene,
ki so vpleteni v vid, voh, sluh, učenje/spomin, bolečino, dvorjenje idr. Na področju
nevrologije, embriologije in razvojne fiziologije so na vinski mušici poglobili marsi katera
spoznanja [40].
Življenjski ciklus vinske mušice
Zrela samička (8-12 ur po prvem vzletu) se pari z večimi samčki in semenčeca hrani v sebi.
Po oploditvi oocita poteče 13 jedrnih delitev (nastane 5000-6000 uporabnih jeder),
citoplazma se deli šele pri zadnji. Samička odloži jajčeca na ugodno gojišče, ki je za večino
pripadnikov te vrste rahlo gnilo ali
načeto sadje. Odložena jajčeca (velika
do 0,5 mm) se v 12-15 urah oblikujejo
v larve. V tej fazi je pomembna izbira
in obdelava jajčec za uporabo v
genetskih raziskavah. Larva se pri
optimalnih pogojih (primerna hrana,
25°C) 4 dni neprestano hrani ter trikrat
levi. Naslednja razvojna stopnja
mušice je nastanek bube, ki se
praviloma nahajajo na bolj suhih
predelih. V laboratoriju je to stena
posode nad gojiščem, v naravi pa bodisi na zunanja stran sadne lupine ali okolica sadeža
(listje, prst), odvisno od vlažnosti okolja. Po 4-5 dneh se iz bube izleže muha, ki aktivno
preživi do 30 dni z izjemami v diapavzi. Na življenjski ciklus vinske mušice ima poleg
dostopnosti hranil še večji vpliv temperatura. Omenjena parametra vplivata tako na velikost
kot na preživetje larv. Najkrajši čas razvoja iz jajčeca do muhe so opazili pri 28°C (7 dni),
ki se pa podaljšuje z dvigom ali spustom temperature (30°C - 11dni, 18°C - 19 dni, 12°C
čez 50 dni). Če je gojišče (sadež) prenaseljeno, se razvojni čas podaljša, prav tako tudi če je
hranil v gojišču malo; izležene mušice so manjše [40, 43]. Prilagoditev je šla tako daleč, da
so na istem kontinentu našli razlike med prehranjevalnimi navadami in celo izraženimi
encimi glede na zemljepisno širino [44]. Pričakovano obstajajo razlike med encimi glede na
14
Slika 4: Življenjski ciklus vinske mušice, [42]
Lara Kandić: diplomska naloga I Uvod
naravno dostopno hrano. V poskusih, kjer so gojili več generacij mušic na gojiščih, ki so se
razlikovala v vsebovanem viru ogljikovih hidratov (škrob in maltoza), so opazili razlike pri
izbiri partnerjev in frekvenci parjenja glede na izhodiščno gojišče. Samičke s škrobovih
gojišč so trikrat pogosteje parile s samčki s škrobovih gojišč, podobno je veljalo za mušice
z gojišč z maltozo. Medtem pa v kontrolnih skupinah ni bilo razlik med frekvenco v
parjenju med mušicami z istega gojišča, kljub temu, da so izhajale iz različnih matičnih
populacij, kar dokazuje zmožnost hitrega prilagajanja in nastajanja razlik med mušicami
glede na nova okolja [3] Vinska mušica živi, kjer jé. Spremembe se odražajo tako v
genotipu kot v fenotipu. Mušice, ki so naselile višje zemljepisne širine, so se prilagodile na
nižje temperature in celo prezimijo v vseh razvojnih oblikah z vstopom v diapavzo (fizična
in metabolna znižanost). Najbolj enostavna rešitev je preživetje zime v kleteh ali drugih
prostorih, kjer ljudje hranijo sadje in drugo zanje primerno hrano [41].
Gojenje vinske mušice
Naravno okolje za razvoj in prehrano vinske mušice predstavlja sadje, ki vsebuje od 10 do
20% ogljikovih hidratov, od 0,2 do 0,4 % maščob in od 0,3 do 1,7% proteinov [45].
Za gojenja vinske mušice se uporabljajo različna gojišča, v katerih najpogosteje najdemo
agar, kvas in/ali ekstrakte kvasa, moko (koruzno, sojino), saharide in konzervanse [46].
Nipagin (10% raztopina para-metilhidroksibenzojske kisline v 96% etanolu) in ponekod še
propanojska kislina sta standardno dodajana gojišču za zaščito pred razvojem plesni in
bakterij, ki so normalno prisotne v okolju. Za dosego ponovljivosti se poskusi izvajajo v
inkubatorju (znana temperatura, vlažnost), nekateri celo simulirajo izmenjavo dan/noč, če
enak poskus traja več mesecev. V večini raziskav z vinsko mušico ni pomembna količina in
konsistenca gojišča, saj je znano, da so jajčeca zmožna preživeti obdelavo in se nato izvaliti
v larve tudi v izjemno neugodnih pogojih (natrijev hipoklorit - varikina, organska topila) in
se nato v ustreznem hranilnem gojišču razviti v odrasle mušice. V genetskih raziskavah se
ne šteje številčno preživetje vseh odloženih jajčec, kajti le-te se pred vnosom spremembe
(povzročitev mutacije, genski material) izbere in obdela. Opazujejo razvojne stopnje, vpliv
mutacij, analizirajo izolati ipd. Sicer pa je viabilnost v različnih stadijih gotovo pomemben
podatek pri novih mutacijah. Kljub impresivnemu spektru odkritij, je malo znanega o
pristnih potrebah, družabnih navadah in ekoloških kontekstih življenja vinske mušice;
mogoče bi s tem lažje razumeli tudi naše skozi evolucijo razvite nevrološke poti [44].
15
Lara Kandić: diplomska naloga I Uvod
3Insekticidi
Insekticidi spadajo med pesticide, fitofarmacevtska sredstva, bodisi spojine bodisi
kombinacijo spojin, ki na različne načine preprečijo uničujoče delovanje ali ubijejo
škodljivce, v našem primeru žuželke. Približno 10.000 vrst žuželk od skoraj milijona se
prehranjuje z rastlinami, ki jih človek goji za prehrano. Insekticidi delujejo proti vsem
razvojnim oblikam, proti jajčecem (ovaricidi) in predvsem proti larvam (larvicidi).
Uporabljajo se v medicini za zatiranje nadležnih oz. zdravju škodljivih žuželk, industriji,
gospodinjstvih, za varstvo kmetijskih in okrasnih rastlin, pridelkov in hrane. Uporaba v
agrikulturi je poleg mehanizacije eden poglavitnih razlogov za povečano produktivnost in
pridelavo v 20. stoletju. Skoraj vsi insekticidi vplivajo na ekosisteme, težave pa nastanejo
pri tem, da mnogi insekticidi na trgu škodujejo ne le škodljivim insektom ampak tudi
koristnim insektom in drugim živalskim vrstam [1, 47].
Njihova strupenost se izraža z LD50, določi pa se jo s poskusi na laboratorijskih živalih
(modelni insekti ter ribe, sesalci).
Delimo jih lahko po [39, 48]:
▫ mehanizmu delovanja:
regulatorji rasti interferenca pri sintezi hitina in juvenilnega hormona, pri levitvicelični nivo alkilirajoče snovi, inhibitorji glikolize, mitohondrijski strupiživčni aktivatorji Na- oz. blokatorji Cl- kanalčkov; inhibitorji acetilholinske
estereaze; mimetiki acetilholinadrugi fizikalne metode; mišični strupi; narkotiki; citolitiki
▫ načinu aplikacije
sistemski se nahajajo v rastlini: njeni lastni ali biotehnološko vgrajeni; ali pa se
po aplikaciji absorbirajo v rastlino in se razporedijo po celi rastlinikontaktni delujejo od stiku z insektom, najpogosteje aplicirani v obliki aerosola
▫ kemijsko
anorganski SiO2, H3BO3Pb3(AsO4)2, CaSx, Na2B4O5(OH)4×8 H2O, Zn3P2, HCN,
Hg2Cl2, C10H6F17NO2S,…organski sintezne kemijske spojine, predstavljajo večino dostopnih pesticidov:
klorirani ogljikovodiki, organofosfati, karbamati, piretrinoidni
insekticidi, antibiotiki, derivati rastlinskih in drugih toksinov
▫ izvoru
sintezni vse kemijsko modificirane spojine
16
Lara Kandić: diplomska naloga I Uvod
naravni najdemo jih v živih bitjih (piretrini, nikotin, rotenon, limonen,
toksini, mnogi inhibitorji amilaz, inhibitorji proteaz, lektini,…)
Iz mehanizma delovanja lahko sklepamo na možnosti nadaljnje toksičnosti za ostale
organizme, v kolikor pridejo v posredni ali neposredni stik. Poleg neškodljivosti za druge
organizme, torej tarčnega delovanja, je pomembna hitra in visoka učinkovitost,
biorazgradljivost v netoksične produkte, minimalna akumulacija v pridelku in v ekosistemu
ter čim manjši razvoj rezistence. Anorganski pesticidi so obsoletni, nizkomolekularnim
sinteznim pa postopoma tržni delež prevzemajo pesticidi naravnega izvora, ki so strogo
gledano tudi organski.
Malokatera kemijska industrija izpušča toliko potencialno škodljivih snovi v okolje kot
proizvodnja pesticidov. So eden največjih onesnaževalcev biosfere. Enkrat vneseni v okolje
vstopajo v hranilno verigo, katere pogost člen smo tudi mi. Iz teh razlogov je njihova
uporaba strogo regulirana, prav tako tudi analize ostankov pesticidov in njihovih razgradnih
produktov v izdelkih in okolju.
Biološki nadzor škodljivcev lahko izvajamo na več načinov:
1. klasična biokontrola - uporaba naravnih sovražnikov oz plenilcev škodljivca, v kolikor
je škodljivec eksotičnega tipa ali pa je naravni plenilec prešibek. Obstaja nevarnost
prekomernega razširjanja naravnega sovražnika in s tem ogrožanje drugih vrst.
2. konzervativna biokontrola - manipulacija okolja in s tem spodbujanje naravne obrambe.
3. uporaba biopesticidov - poleg transgenih rastlin so po načinih aplikacije podobni kot
kemični pesticidi, prednost je tračno delovanje.
Veliko naravnih substanc, ki nastajajo v različnih organizmih, kaže pesticidno aktivnost in
bi lahko bile potencialno uporabljene kot biopesticidi. Rastline same v ta namen proizvajajo
antibiotike, alkaloide, terpene, cianogene glikozide in nekatere proteine. Človek je začel
razširjati nabor insekticidov: molekulam z nizko molekularno maso (npr. nikotin, piretroidi)
in njihovim derivatom se pridružujejo proteini.
Biopesticidi
Pesticidi se v 75% uporabljajo v kmetijstvu, preostalih 25% se porazdeli med industrijo,
zdravstvo in gospodinjstva. Zavedanje javnosti o krhkosti zdravja nas in našega okolja je
naložilo težke naloge pridelovalcem, predelovalcem in nenazadnje tudi službam za
varovanje zdravja. Znano je, da so se škodljivci prilagajali obrambnim mehanizmom
17
Lara Kandić: diplomska naloga I Uvod
rastlin, se z njimi razvijali. Ravno iz tega razloga je smotrno poiskati nove iz drugih vrst.
Med biopesticide uvrščamo v naravi pojavljajoče se substance, mikroorganizme (bakterije,
viruse, nižje glive in bakteriofage) in substance, ki jih proizvedejo transgene rastline zaradi
dodatnega genskega materiala. Le-te ali same delujejo kot pesticidi ali pa spodbudijo
rastlino k njenemu lastnemu imunskemu odzivu [49]. Med njimi posebno mesto zavzemajo
proteini.
Biopesticidi proteinske narave
Biopesticidi proteinske narave pišejo novo poglavje o varni zaščiti rastlin. Njihovo
delovanje je bistveno bolj specifično in hkrati netoksično za organizme, ki niso njihova
tarča. Hitro se razgradijo in ne puščajo toksičnih razgradnih produktov. Proteine ali njihove
gene lahko z biotehnološkimi metodami vgradimo v rastlino, bakterijo ali bakteriofag.
Mejni kamen je postal zadnji široko uporaben komercialni bioinsekticid Bt toksin (Bacillus
thuringiensis je gram pozitivna bakterija živeča v prsti). Protein - protoksin se lahko izrazi
znotraj kmetijskih rastlin, pridobljenih z genetskim inženirstvom (npr. v koruzi) ali pa ga
očistijo iz bakterijskih izolatov. Deluje preko vezave t.i. δ-toksinov na specifične proteine
in glikolipidne receptorje v epitelu prebavila tarčnega škodljivca, ki so razviti le pri insektih
in nematodih, ne najdemo jih pa pri vretenčarjih. Našli so že več kot 90 vrst bakterij, ki so
vsaj entomospecifične v kolikor ne entomotoksične, vendar jih še večina ni natančneje
preučena (Photorhabdus luminescens, Xenorhabdus nematophilus; Photorhabdus
luminescens) [50, 51]
Med ostalimi proteini z insekticidnim delovanjem so najbolj perspektivni:
◦ inhibitorji prebavnih encimov (inhibitorji glikohidrolaz in inhibitorji proteaz)
◦ lektini (monovalentni lektini, mulivalentni lektini, inhibitorji ribosomov,…)
◦ drugi (inhibitorji hitinaze, arcelini, kanatoksin,…)
Prebavni encimi in njihovi inhibitorji
Insekti spadajo med heterotrofne organizme, ki za svoje energetske in razvojne potrebe
razgrajujejo organske molekule. Le-to omogočajo prebavni encimi kot so glikohidrolaze,
proteaze in lipaze. Nanje lahko delujemo v vseh prehranjujočih se stadijih insekta.
Specifičnost inhibicije za enega ali skupino zajedavcev je pomembna tudi za proizvajalski
(varovani) organizem, da ne prihaja do avtoinhibicije.
18
Lara Kandić: diplomska naloga I Uvod
Inhibitorji glikohidrolaz
Med najpomembnejšimi glikohidrolazami je α-amilaza, ki razgrajuje α-1,4 povezane
polisaharide, kot sta škrob in glikogen, v oligosaharide. Potrebujejo jo vsi organizmi.
Naravno prisotne inhibitorje najdemo predvsem v žitaricah in stročnicah. Med neproteinske
inhibitorje spadajo akarboza, hibiskusna kislina, ciklodekstrini, proteinske pa delijo v šest
razredov [52, 53]:
◦ lektinski tip αAI-1, -2, -3 (α-amilazni inhibitor) iz fižola (Phaseolus vulgaris)◦ knotinski tip AAI iz amaranta (Amaranthus hypocondriacus)◦ taumatinski tip zeamatin iz koruze, proteini R in S iz ječmena (Hordeum vulgare)◦ žitarični tip α-amilazni inhibitor 0.19 iz indijske prosenke (Eleusine coracana),
RBI bifunkcionalni α-amilazno-tripsinski inhibitor iz ječmena◦ Kuniztove α-amilazno-subtilisinski inhibitor BASI iz ječmena, WASI iz
pšenice (Tricitum vulgare) in RASI iz riža (Oryza sativa)◦ γ-purotioninski
tip
SIα-1, 2 in 3 iz sirka (Sorghum bicolor)
Rastlina transgenega graha (Pisum sativu) je bila popolnoma odporna na tri različne
zajedavce (Acantoscelides obtectus, Bruchus pisorum, Callosobruchus chinensis) z 0,8-1 %
vsebnostjo αAI-1. Žitarični tip inhibitorjev pogosto povzroča alergije.
Proteaze
Proteoliza je encimska razgradnja beljakovin, pri kateri pride do hidrolize ene ali več
peptidnih vezi. Encime, ki katalizrajo hidrolizo peptidne vezi imenujemo peptidaze (tudi
proteinaze, proteaze ali proteolitični encimi). Proteaze v splošnem sodelujejo predvsem pri
presnovi proteinov in zagotavljajo vir aminokislin [54]. Uravnavajo življenje celice in
organizma od oploditve, diferenciacije tkiva, odziva celic na zunanje signale in potrebe
vzdrževanja notranjega ravnovesja, opravljanja celičnih funkcij do celične smrti.
Proteaze lahko delimo glede na :
◦ izvor (mikrobne, glivne, živalske, rastlinske)
◦ mesto delovanja (ekstra- in intracelularne)
◦ mesto cepitve vezi - endopeptidaze (cepijo peptidno vez v notranjosti peptidne verige)
in eksopeptidaze (cepijo končno peptidno vez na N- ali C- koncu)
◦ načinu delovanja (različen katalitski tip)
Najsodobnejša razdelitev proteaz je MEROPS klasifikacija (po Barettu in Rawlingsu [54]).
Le-ta razvršča proteaze na osnovi njihove evolucijske sorodnosti. Najprej jih deli glede na
19
Lara Kandić: diplomska naloga I Uvod
katalitski tip, nato po terciarni strukturi, ki je evolucijsko starejša od primarne, v klane, le-ti
pa so sestavljeni iz ene ali večih družin (ujemanje v aminokislinskem zaporedju - primarni
strukturi). Tu se upošteva predvsem ujemanje v segmentih, ki sodelujejo pri tvorbi
aktivnega mesta.
Delitev na katalitske tipe
Katalitski tip določa aminokislina v aktivnem mestu, ki s kisikom kot nukleofilom napade
peptidno vez (S - serinski, T - treoninski, C - cisteinski in P - klan mešanih (C-, S-, T-)
proteaz), oziroma aminokislina ali kovinski ion, ki za nukleofilni napad aktivira molekulo
vode (A - aspartatni, G - glutamatni, M - metaloproteaze). Ostale proteaze z neznanim
mehanizmom delovanja uvršča v neznan katalitski tip U. Do danes je identificiranih več kot
2.300 družin [54].
Obstajajo drugi sistemi za delitev proteaz v različne skupine. NC-IUBMB (Nomenclature
Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology) jih uvršča
med hidrolaze, ki delujejo na peptidno vez (EC.3.4), in jih razdeli na 26 podrazredov in
družin. Delitev temelji na delitvi po Rawlingsu in Barettu, predhodno pa jih razdeli na
ekso- in endopeptidaze [55]. Medtem jih ExPASy (Expert Protein Analysis System) razdeli
v 13 skupin [56]. V obeh sistemih se pojavljajo zgoraj našteti katalitski tip z manjšimi
modifikacijami (dodatni podrazredi glede mesta, mehanizma in specifičnosti delovanja).
Žuželčje proteaze
Iz žuželk je izoliranih le nekaj proteaz, za mnoge ni znana njihova fiziološka vloga. Za
uporabo bioinsekticidov so najzanimivejše proteaze prebavnega trakta. Glede teh je bila
večina raziskav izvedena na izvlečkih prebavil ali deloma očiščenih encimih, bodisi z
uporabo specifičnih inhibitorjev različnega tipa bodisi z identifikacijo cepitvenih mest
specifičnih umetnih substratov ali s primerjalno analizo genoma [57]. Ocenjujejo, da ima
vsaka vrsta žuželk v prebavilih v povprečju 1000 proteolitičnih encimov (skupaj z
izooblikami) z različnimi specifičnostmi [58]. Prisotnost inhibitorjev proteaz spodbudi
sintezo in izločanje neobčutljivih alternativnih prebavnih encimov, ki spadajo v enega ali
več katalitskih tipov [52].
Redovi Lepidoptera, Hymenoptera, Orthoptera in Diptera imajo v prebavilih prevladujoče
serinske proteaze; v redu Coleoptera najdemo poleg cisteinskih še serinske, v redu
Hemiptera pa cisteinske in aspartatne [58]. Vinska mušica je priljubljen modelni insekt in
njen genom je znan že več let. Identificirane ima aspartatne, cisteinske, serinske in
20
Lara Kandić: diplomska naloga I Uvod
metaloproteaze, ter proteaze kombiniranega tipa, v prebavilih pa bi naj bile pretežno
serinske in v manjši meri cisteinske [57, 59, 46]. Vsaki tip proteaz ima svoj pH optimum:
serinske in metaloproteaze pH 9-11, cisteinske pH 5-7 in aspartatne pH 3-5 [58].
Celična razgradnja poteka v večih organelih, v največjem obsegu pa se vrši v lizosomih in
citosolu. Aktivnost proteaz je strogo nadzorovana glede na celične potrebe s hitrostjo
sinteze proteaz, posttranslacijskimi modifikacijami, dostopnimi kofaktorji in alosteričnimi
spremembami. Pomembna je tudi lokalizacija proteaz in njihovih substratov, spremembe
pH in nenazadnje proteazni inhibitorji [54].
Inhibitorji proteaz
Do pred kratkim so inhibitorje proteaz delili glede na katalitski tip proteaze, katero so
inhibirali. Zapleti so nastali pri razvrščanju inhibitorjev, ki so inhibirali več različnih
katalitskih tipov proteaz. Danes jih po MEROPS-u delijo na klane in družine glede na
evolucijsko sorodnost, po enakem principu kot proteaze. Nekatere inhibitorje še niso
uvrstili v klane, saj se po svojem aminokislinskem zaporedju in strukturi ne morejo uvrstiti
v nobeno izmed obstoječih družin; eden izmed teh je tudi klitocipin [54, 12]. Kljub temu,
da imajo proteaze istega tipa podobno aminokislinsko zaporedje v aktivnem mestu, niso vsi
inhibitorji enako učinkoviti.
Katerokoli proteazo lahko inhibirajo majhne kemijske substance in proteinski inhibitorji.
Vsi organizmi jih izdelujejo za kontrolo lastnih proteaz, z evolucijo pa so se razvili tudi v
obrambne namene. Sočasno z razvojem novih obrambnih inhibitorjev se je razvijala tudi
rezistenca nanje [52]. Vmes je posegel človek z raziskovanjem zajedavcev in tarčnih
organizmov in jih s pomočjo sodobnih biotehnoloških postopkov razvija v novo učinkovito
orodje. Pri tem je potrebno preveriti ali bi novonastala transgena rastlina nove inhibitorje
sama razgradila, ali bi bila sinteza pravilno inducirana in lokalizirana v želenih delih
rastline ter neobremenjujoča za rastlino, ali bi se dosegel sinergistični ali celo
kontraproduktivni učinek z endogenimi obrambnimi inhibitorji [46, 54, 58].
Predpostavljena sta dva mehanizma toksičnosti [58]:
◦ znižanje količine dostopnih aminokislin
◦ hiperprodukcija prebavnih encimov, zaradi katerih insekt troši aminokisline, zlasti tiste,
ki vsebujejo žveplo (metionin, cistein).
21
Lara Kandić: diplomska naloga I Uvod
Rastlinski in glivni inhibitorji proteaz proteinske narave
Največ proteinskih inhibitorjev proteaz so iz omenjenih kraljestev izolirali iz semen
stročnic, žitaric, bučk in krompirjevih gomoljev, pri glivah pa so zastopane tako nižje glive
kot gobe [52]. Na primeru napada koloradskega hrošča na krompir so opazili, da se v
rastlini lokalno zviša količina inhibitorjev že nekaj ur po prvi poškodbi in se znatno poveča
ob drugem napadu. Hkrati se signal prenese po celotni rastlini in tudi drugje stimulira
sintezo inhibitorjev. Sistemski učinek pada s starostjo rastline, saj takrat zanjo en napad ne
bi bil tako poguben kot pri mladi rastlini [46].
Če razdelimo rastlinske proteaze glede na katalitski tip, dobimo štiri razrede: serinski,
cisteinski, aspartatni in metaloproteaze [58].
Za inhibitorje serinskih proteaz, ki so najštevilčnejši, so potrdili vlogo obrambnih snovi. Ti
proteini so prisotni v majhnih količinah, ustreznih za zaščito pred plenilci. Vsi rastlinski
inhibitorji serinskih proteaz so kompetetivni inhibitorji in delujejo po podobnem
mehanizmu. Po Laskowskem [60] jih delimo v 13 družin.
Inhibitorje cisteinskih proteaz so izolirali pa so jih iz riža, avokada, papaje, limskega fižola,
ambrozije in krompirja. Največkrat so jih testirali na predstavnikih reda Coleoptera, saj
imajo ti v prebavilih pretežno cisteinske proteaze.
Iz krompirja so izolirali tudi inhibitorje aspartatnih proteaz. Rastline so razvile vsaj dve
družini metaloproteaz, ki so jih izolirali iz paradižnika in krompirja.
Pri glivah so inhibitorje razvrstili v 8 družin, največ je serinskih nato še cisteinskih
inhibitorjev [54]. Samo za primer: iz meglenke (Clitocybe nebularis) so izolirali inhibitor
serinskih proteaz CnSPI [61], še nedefiniran tip inhibitorja, in inhibitor cisteinskih proteaz
klitocipin [12], ki je prvi predstavnik svoje družine, kar priča o še neodkritem bogastvu
kraljestva gliv.
22
Lara Kandić: diplomska naloga I Uvod
Lektini
Splošne lastnosti
Prvi lektin so izolirali že v 19. stoletju iz semen navadnega kloščevca (Ricinus communis
L.; hladno stiskano ricinusovo olje se še danes uporablja kot močno odvajalo). Ta
proteinski toksin, ricin, aglutinira rdeče krvničke. Danes lektine definiramo kot razred
proteinov neimunskega izvora, ki imajo vsaj eno nekatalitično domeno, s katero
reverzibilno vežejo specifične ogljikove hidrate, ne da bi jih pri tem modificirali [62].
Nadalje jih delimo lahko v razrede, skupine ali družine. Poimenovani so glede na izvor z
začetnicama latinskega ali angleškega imena, končnica A pa izvira iz besede aglutinin oz. L
iz besede lektin.
V družine delimo lektine glede na njihov izvor in evolucijsko sorodnost ali pa specifičnosti
za ogljikove hidrate in njihove derivate. Ta specifičnost je primerljiva s specifičnostjo
vezave encima in substrata oz. antigen-protitelo. Lektini se razlikujejo še po
posttranslacijskih modifikacijah (glikoproteini), potrebi po kofaktorjih (kovinski ioni) in
številu podenot. Ravno oligomernost lektinom omogoča multivalenco (vezavo večih in
različnih saharidov z visoko afiniteto), s čem razlagajo zmožnost aglutinacije in
precipitacije.
Med lektine uvrščajo tudi t.i. ribosom-inaktvirajoče proteine (RIP). Sestavljeni so iz dveh
podenot, povečini povezanih z disulfidno vezjo. Lektinska podenota prepozna in se veže na
glikokonjugat na celici, nato protein vstopi v celico z endocitozo, druga podenota pa deluje
kot encim, ki inaktivira ribosome in proizvodnjo celičnih proteinov. Sem spadajo ricin,
lektin kanavanina (ConA) in bele omele (ML-I) ter abrin; slednji lahko inaktivira 1500
ribosomov na sekundo [63]. Najdemo jih v vseh živih bitjih, njihova vloga pa še zdaleč ni
razjasnjena [63, 64].
Mnogi so tesno zviti globularni proteini in zato zelo odporni tudi na toplotno denaturacijo.
Za vse lektine je značilna tudi visoka razistenca na proteolizo in stabilnost preko širokega
območja pH, tudi ko so izolirani iz svojega naravnega okolja.
Mehanizmi vezave in delovanja
Lektini z oligosaharidi ne tvorijo kovalentnih vezi, ampak le tesne reverzibilne asociate.
Aminokislinsko zaporedje v zankah vezavnega mesta je oblikovano za prepoznavo
23
Lara Kandić: diplomska naloga I Uvod
specifičnih oligosaharidov in se na njih veže
s pomočjo vodikovih vezi, Van der
Waalsovih vezi in hidrofobnih interakcij.
Na sliki je rastlinski lektin GSL IV (iz
družine metuljnic) [65], prikazan pa je le del
oligosaharida (sive barve) in nakazane
vodikove vezi.
Lektine se zaradi njihove specifične vezave saharidov uporablja za določevanje krvnih
skupin, tipiziranje bakterij, separacijo in analizo celic, izolacijo glikokonjugatov z
imobiliziranimi lektini, testiranje encimov (glikozidaz in glikoziltransferaz) in mapiranje
nevronskih poti. Pri celicah, kjer se spremeni glikozilacija celične stene, jih lahko uporabijo
za identifikacijo in selekcijo mutiranih celic ter za uničevaje tumorskih celic s toksičnimi
konjugati [64].
V farmaciji imajo veliko vlogo tudi pri načrtovanju novih dostavnih sistemov, ki
omogočajo ciljano dostavo in podaljšano sproščanje učinkovine. Te so lahko proteinske
učinkovine, cepiva, terapevtski geni, citotoksične spojine itd. Uporabni so tako endogeni
lektini (izraženi na tarčnih celicah), ki prepoznajo vnesen (oligo)saharid, kot eksogeni
lektini, ki prepoznavajo saharide na površini tarčnih celic. Nekateri lektini se lahko
internalizirajo v celice z endocitozo in bi nanje lahko vezali učinkovine, za katere želimo,
da se sprostijo v celicah. Takšne lektinizirane učinkovine pa so potencialni imunogeni in/ali
toksini; možne so tudi interakcije o ostalimi saharidi [66]. Velik potencial kažejo tudi za
zdravljenje tumorjev: povzročajo kontaktno inhibicijo s premreženjem rakastih celic,
nekateri spremenijo citoskelet in sprožijo kaskado reakcij, lahko tudi celično apoptozo.
Raziskovali so jih že na nekaterih celičnih linijah [67], kot orodje za klinično spremljanje
raka prostate [68] in raka kolona [69], kot inhibitorje in stimulatorje rasti rakastih tvorb [70,
71, 72]. Lektin CVL iz morskega črva (Chaetopterus variopedatus) inhibira citopatični
učinek, induciran z HIV-1; kaže aktivnost proti HIV-1, in sicer v koncentraciji 0,33 μM
(oz. 0,07μM) zmanjša pripenjanje virusa na celico za 86 % (oz. 21%) [73]. Lektini
24
Slika 5: GSL IV lektin iz Griffonia simplicifolia, [65]
Lara Kandić: diplomska naloga I Uvod
usmerjeni na glikane v bakterijski celični steni tudi lahko delujejo kot zelo specifični
baktericidi.
Pri žuželkah so polisaharidi strukturne komponente hitinskih zunanjih skeletov in
povrhnjice ter mucinov prebavnega trakta, kar v vseh primerih predstavljajo je dobre
potencialne tarče za lektine.
Živalski lektini
Učinek živalskih lektinov so raziskovalci prvič opazili pri reagregaciji disociiranih celic
morske spužve, kjer je potrebna specifična prepoznava celic med seboj, vendar takrat še
niso vpeljali pojma lektini [64]. Naslednji korak je bilo odkritje hemaglutininov v telesnih
tekočinah nekaterih pajkov in rakov. V šestdesetih letih so odkrili, da so se podganji
levkociti, tretirani z bakterijskimi glikozidazami, različno razporedili po organizmu. Prve
lektine (galektine) so izolirali s pomočjo afinitetne kromatografije z asialoglikoproteini in
se dotaknili vrha ledene gore. Začeli so se vrstiti novi saharidi in nove družine ter razredi
lektinov [64, 74].
Tudi za živalske lektine velja, da so večinoma globularni proteini, sestavljeni pretežno iz
beta strukturnih ploskev. Od kovinskih kofaktorjev je kalcij precej pogostejši kot mangan.
Sodelujejo v adheziji in premreženju celic, celičnemu signaliziranju, prepoznavanju
patogenov in naravni imunosti, pretvorbi glikoproteinskih hormonov, oploditvi in
embriogenezi [64]. Preizkusi z njimi (npr. galektini) prav tako kažejo na antiproliferativni
efekt in stimulacijo adhezije celic s povezovanjem ekstracelularnega matriksa z
glikoziliranimi proteini celične površine [63].
Rastlinski lektini
Rastlinski lektini so najbolj raziskani, saj jih dnevno zauživamo v hrani. Najdemo jih npr. v
paradižniku, krompirju, fižolu, arašidih, grahu, soji, korenju, češnjah, borovnicah, bezgu,
koruzi, pšenici, rižu, česnu, peteršilju, oreščkih, čaju in v različnih okrasnih rastlinah. V
večini naštetih rastlin je najvišja koncentracija lektinov v semenih, iz česa sklepajo na
njihovo varovalno vlogo pred nezaželenimi plenilci in patogeni, saj večina lektinov lahko
prednostno veže tudi tuje glikokonjugate [62]. Poleg tega lahko v semenih predstavljajo
tudi obliko skladiščnih proteinov ali pomagajo pri vzdrževanju dormance semen. Pred tem
verjetno nekateri poskrbijo za prepoznavanje peloda oziroma celic med seboj, drugi pa za
mitogensko stimulacijo embrijskih rastlinskih celic [75, 52]. Ena izmed možnih vlog je tudi
komunikacija s simbiotskimi organizmi, mikoriznimi glivami, ali pa sodelujejo pri
25
Lara Kandić: diplomska naloga I Uvod
nodulaciji in vezavi dušika pri stročnicah. Najdemo jih tudi v listju, lubju, deblu ali steblu.
Pri poškodbi ali okužbi rastline s patogenom so opazili povečanje koncentracije lektinov v
prizadetem tkivu, kar je sprožilo raziskave v zvezi s potencialno zaščitno vlogo [64].
Parenteralna toksičnost je znana že iz časov ricina in abrina, vendar so študije na podganah
in miših pokazale tudi na peroralno toksičnost nedenaturiranih lektinov. Eden izmed
mehanizmov delovanja je vezava na receptorje v epitelu prebavil, spremembe v morfološki
sestavi in metabolizmu celic. Hkrati povzročijo razbitje in disorganizacijo najvažnejših
absorbcijskih celic prebavnega trakta; s posledično zmanjšano absorpcijo hranil sprožijo
kaskado signalov, ki spremeni intermediarni metabolizem. Namreč, lektini, ki se ne vežejo
na mukozo, redko povzročajo prehranske motnje. Dodatno se lahko vežejo na topne in
membranske encime, kar negativno vpliva na prebavo proteinov in ogljikovih hidratov in
prispeva k zmanjšanju dostopnih hranil [62].
Sistemski učinki so posledica prehoda lektinov v krvni obtok z endocitozo preko
enterocitov. Pšenični lektin (WGA) so našli v stenah krvnih in limfatičnih žil, PHA je
sprožil močan in selektiven humoralni odziv in produkcijo IgG ter IgA. Po izvedbi
afinitetne kromatografije so v serumu zdravih ljudi našli protitelesa proti lektinom, ki jih
vsakodnevno vnašamo v telo s prehrano. Prav tako lahko lektni sprožijo sproščanje
histamina iz bazofilcev, nekateri celo izločanje interlevkinov (IL-4 in IL-13), ključnih
promotorjev odgovora limfocitov Th2 in tvorbo IgE. Posledice so lahko alergije tipa 1 na
številna hranila. Pri dojemljivejših posameznikih lahko interakcije lektinov z entereociti in
limfociti pripomorejo k nastanku trajne periferne antigenske stimulacije, kar lahko privede
do nastanka npr. revmatiodneg artritisa [62].
V študijah s podganami so odkrili še spremembe povečanje jeter in pljuč, atrofijo priželjca,
hipertrofijo trebušne slinavke in porušeno ravnovesje med sintezo in izločanjem insulina.
Kljub nižjim koncentracijam insulina v krvi je koncentracija glukoze ostala normalna.
Vplivajo tudi na povečan metabolizem maščob (verjetno preko znižane koncentracije
insulina v krvi) in znižajo sintezo mišičnih proteinov (PHA). Po drugi strani pa lektin iz
arašidov (PNA) kaže afiniteto do glikoproteinov v gladkih mišicah arterij, stimulira njihovo
rast in prispeva k nastanku ateromov [62].
Možnost uporabe rastlinskih lektinov kot bioinsekticidov je bila pokazana v večih študijah.
Peroralna toksičnost, testirana na različnih insektih, variira med 5-1500 μg/ml oziroma med
1-50 mg/ml hrane odvisno od načina aplikacije. Opazovali so različne parametre: smrtnost,
velikost, težo, barvo, plodnost, podaljšanje časa razvoja insektov in podobno. Uporabljeni
26
Lara Kandić: diplomska naloga I Uvod
so bili modelni insekti iz družin Homoptrea, Diptera, Colepotera in Lepidoptera.
Mehanizem delovanja ni razjasnjen, sklepajo pa na vmešavanje v prebavno, zaščitno in
sekretorno delovanje preko vezave lektinov na prebavila insektov, pri čemer je pomembna
njihova odpornost na proteolizo. Pomembno vezavno domeno predstavlja hitin, poleg tega
lahko lektini interagirajo tudi z encimi v prebavilih. Še več, lektine niso našli le v
prebavilih, ampak tudi v maščobnih telescih, jajčnikih, v Malpighijevih tubulih in po
celotni hemolimfi [62].
Prve transgene rastline so vsebovale lektine iz graha (Pisum sativum – PSA),
spomladanskega zvončka (Galanthus nivalis - GNA), pšenice (Tricitum aestivum oz. Wheat
Germ - WGA), kanavanina (Concavalia ensiformis - ConA) in fižola (Phaseolus vulgaris -
PHA). Če se že sama proizvodnja lektinov v transgenih rastlinah ne pokaže za popolnoma
učinkovito zaščito, lahko z izraženimi lektini dosežemo sinergistični učinek z drugimi
insekticidi in tako zmanjšamo uporabo le-teh. Do sedaj niso odkrili negativnega učinka na
ostale udeležence v ekosistemu, ki bi zaužili lektini direktno iz rastline ali indirektno preko
uživanja tarčnih insektov. Kljub temu je potrebno v načrtovanju nove transgene rastline
posvetiti pozornost tudi možnim vplivom na okolje [62].
Glivni lektini
Navzočnost lektinov v glivah je pogostejša kot v višjih rastlinah. Nekatere vrste gob
vsebujejo po več lektinov npr.: gobani, mavrahovci, golobice, mlečnice, polžarke. Vsebnost
lektinov se povezuje s fiziologijo in z ekološko vlogo posameznih vrst. Nekateri lektini se
lahko razlikujejo v specifičnosti kljub strukturni podobnosti, še bolj pogosto pa so lahko
strukturno zelo različni lektini specifični za isti saharid [76].
V sporomu so opazili drugačno količino lektinov v betu kot v klobuku, prav tako pa so
našli razlike glede na starost, letni čas, razvojno stopnjo in lokacijo (mikrookolje: teren,
prst, klimatski pogoji, drevesa). Fiziološke vloge v gobah segajo od metabolizma,
simbiotskih (mikorize) in parazitskih odnosov (gliste, insekti), združevanja hif v času rasti
bazidioma (gobe), dormance gob in nenazadnje služijo za obrambo pred paraziti. Tudi
zanje veljajo splošne lastnosti lektinov (stabilnost, kofaktorji, specifične reverzibilna
vezava na saharide). Malo glivnih lektinov povzroča zastrupitve s hrano; do sedaj so to
dokazali le za bolesatin (Boletus satanas, vražji goban) [76].
V splošnem so večini gobjih lektinov določevali le aglitunacijske sposobnosti in
specifičnost na saharide [77]. Zadnji večji pregled so naredili Konska in sod. leta 1997 [77],
27
Lara Kandić: diplomska naloga I Uvod
tekoče se pa posodoblja baza identificiranih lektinov z znano terciarno strukturo [78], s
katero pa se lahko pohvalijo le redki lektini pridobljeni iz gob. Na osnovi 3D strukture so
jih v zadnjih par letih razvrstili v sedem strukturnih tipov. Nekateri od teh so homologni
živalskim in rastlinskim proteinskim družinam, kot so galektini (Agrocybe cylindracea
[79], Coprinus cinerea [80]), fibronektini (Flammulina velutipes [81]), podenote integrinov
(Psathyrella velutina lektin [82]) in ricini (Laetiporus sulphureus [84]), s tem da vsi našteti
homologni proteini nimajo nujno lektinskih lastnosti. XCL (Xerocomus Chrysenteron) in
par podobnih lektinov iz drugih gob spadajo v lektinsko družino, za katero je doslej edini
homolog aktinoporin z zmožnostjo perforacije celičnih membran iz morske veternice [84].
Nedavno odkrit lektin in Aleurie amantie pa po drugi strani kaže originalno terciarno
strukturo (6-listni β-propeler) [85].
Paquereau in sod. (2003) [86] so na modelu vinske mušice dokazali, da je LD50 za XCL
0,40 ± 0,10 mg/ml, LD50 za lektin zvončka GNA 0,87 ± 0,17 mg/ml, za lektin grahora LOL
LD50 8,5 ± 0,6 mg/ml, torej se je XCL izkazal kot najbolj toksičen. Pokazali so tudi, da je
rekombinantni XCL toksičen še v nižji koncentraciji LD50=0,068 ± 0,02 mg/ml, ravno
obratno pa je veljalo za drugi modelni insekt, Acyrthosiphon pisum. Predpostavljen
mehanizem delovanja je vezava na peritrofični matriks insektov.
3.5 Inhibitorji hitinaze, arcelini, kanatoksini
Inhibitorji hitinaze
Že samo ime encima (EC 3.2.1.14) je dovolj zgovorno, saj omogoča hidrolitično razgradnjo
hitina. Hitin najdemo le pri žuželkah in glivah. Je njihov strukturni oziroma zaščitni
polimer, vendar je za rast potrebna razgradnja obstoječega hitina in nato sinteza novega. V
primeru insektov se inhibitor aplicira v zgodnjih stadijih rasti larv, da se ne morejo preleviti
v bube in odrasti. Na trgu so dostopne le manjše kemijske molekule (npr.: heksaflumuron,
teflubenzuron), med proteinske pa spadata ciklopentapeptida argifin in argadin (IC50 sta
100 nM in 1 nM za hitinazno družino 18), izolirana iz kultur Gliocladium in Clonostachys
[87, 52].
Arcelini
So insekticidni proteini iz divje vrste fižola, za katere so se geni v kultiviranih vrstah
izgubili verjetno kot posledica kromosomske rekombinacije in izbire pri križanju vrst.
Spadajo v lektinom-podobno družino, ki vključuje dva tipa fitohemaglutininov in α-
28
Lara Kandić: diplomska naloga I Uvod
amilaznih inhibitorjev. Našli so 7 alelnih različic arcelinov, od katerih Arc 5 in Arc 1
omogočata najboljšo zaščito proti škodljivcu. Ker so sestavljeni iz polipeptidov, ostaja
vprašanje, če so vse izooblike najučinkovitejšega Arc5 enako učinkovite. Predpostavljeni
mehanizmi toksičnega delovanja temeljijo na interakcijah z glikoproteini (hrana, površina
celic prebavil ter z glikoziliranimi prebavnimi encimi). Našli so jih tudi v hemolimfi [52].
Kanatoksin
Iz kanavalina so izolirali prvo naravno ureazo in lektin ConA, odkrili pa so še kantoksin, ki
je nevrotoksični protein. Obnaša se kot hemilektin - pri poskusnih živalih povzroča
aglutinacijo eritrocitov šele ob prisotnosti protiteles proti kanatoksinu, povzroča pa tudi
konvulzije in smrt, apliciran intravensko. Interagira s kompleksnimi glikokonjugati kot so
gangliozidi, še posebej polisializiranimi. Toksičen je za insekte, ki so odvisni od uporabe
katepsina B in D kot glavnih prebavnih encimov (Hemiptera, Coleoptera), ne pa na tiste z
tripsinskimi encimi (Diptera). Pri C. maculatus (Coleoptera) je primerljivo toksičen z α-
amilaznimi inhibitorji, lektini in določenimi proteaznimi inhibitorji. Kanatoksinski proteini
delujejo komplementarno BT endotoksinu [52].
29
Lara Kandić: diplomska naloga II Načrt za delo
II.Načrt za deloCilj našega dela je poiskati nove potencialne bioinsekticide, ter jih razvrstiti po
učinkovitosti. Merilo za učinkovitost je relativna smrtnost (RS) modelnega insekta glede na
potrebno koncentracijo potencialnega bioinsekticida v gojišču (LD50) v primerjavi s
kontrolo.
V ta namen bomo
1.) optimizirali gojišče za gojenje našega modelnega insekta, vinske mušice.
2.) testirali liofilizirane ekstrakte 23 izbranih gliv iz debla odprtotrosnic (Basidomycota),
razred: podstavkovnice (Basidiomycetes)
3.) izmed liofiliziranih ekstraktov gob izbirali tiste, ki bodo toksične za vinsko mušico ter
nižali vsebnost liofilizata v gojišču in tako izbrali gobo za natančnejšo obdelavo
4.) hkrati preizkušali tudi insekticidno delovanje nekaterih proteinskih inhibitorjev proteaz,
tako iz izbrane gobe, kot iz drugih izbranih rastlin, ki so komercialno dostopni.
5.) iz izbrane gobe izolirali lektine, ki so specifični za različne sladkorje (monosaharide in
disaharide) ter skušali poiskati njihovo minimalno potrebno koncentracijo za dosego
50% smrtnosti (RS=0,5), torej LD50 .
Zaradi omejene količine dosegljivih gob bomo morali poiskati takšno gojišče, ki bo
omogočalo vgraditev vzorca v gojišče v raziskovani koncentraciji, a hkrati dovolj majhni
količini ter v pogojih, ki bodo čim manj destruktivni za potencialne bioinsekticide (npr.
temperatura priprave gojišča). Seveda so pomembne tudi sama topnost vzorca (predvsem
liofilizata) in enakomerna razporeditev vzorca po gojišču. Upoštevati bomo morali tudi, da
različne razvojne stopnje vinske mušice zahtevajo različne pogoje za razvoj (npr. vlaga,
količina in sestava hrane).
30
Lara Kandić: diplomska naloga III Materiali in metode
Materiali in metode
1Materiali, uporabljeni pri pripravi liofilizatov in proteinov
1.1Kemikalije
kemikalija kakovost kratica proizvajalec
acetonitril p.a. ACN Sigma-Aldrich
destilirana voda dH2O
pridobljena z Mr Slim Mitsubishi
Electronics Reverse Osmosis
LC010M Nobel
dinatrijev etilendiamin tetraacetat p.a. EDTA Serva
divinilsulfon 98,0% / Fluka
etanol 99,8% / Carlo Erba
galaktoza ≥99% / Fluka
glukoza ≥99% / Fluka
goveji serumski albumin BSA Serva
kalcijev klorid dihidrat ≥99,5% / Serva
klorovodikova kislina 37% / Merck
laktoza ≥99% / Fluka
magnezijev klorid p.a. / Sigma
natrijev acetat p.a. NaAc Merck
natrijev bisulfit p.a. / Parchem
natrijev hidroksid ≥99% / Sigma-Aldrich
natrijev karbonat ≥99,9% / Fluka
natrijev klorid ≥99,9% / Merck
ocetna kislina 100% / Merck
saharoza ≥99% / Fluka
Sepharose 4B / Pharmacia Fine Chemicals
Sephacryl S-200 / Pharmacia Fine Chemicals
tekoči dušik / Tehnični plini Jesenice
trifluorocetna kislina ≥99,5% TFA Pierce Chemical Company
tris-(trihidroksimetil)aminometan) p.a. TRIS Serva
31
Lara Kandić: diplomska naloga III Materiali in metode
1.2Pufri in raztopinepufer ali raztopina sestava proizvajalecratopina za ekstrakcijo 1 0,003 M Na2S2O3
0,3 M NaCl
raztopina za ekstrakcijo 2 0,003 M Na2S2O3
0,3 M NaCl0,2 M TRIS
raztopini za spiranje sefaroze 0,5 M Na2CO3,0,02 M NaOH
pufer za afinitetno 1 0,3 M NaCl, 0,05 M EDTA, 0,05 M TRIS/HClpH 7
pufer za afinitetno 2 0,3 M NaCl0,005 M CaCl2
0,005 M MgCl2
0,05 M TRIS/HClpH 7
raztopina za elucijo 0,02 M NaOH pufer za nevtralizacijo 2 M TRIS/HCl
pH 6,5pufer za gelsko 0,1 M NaAc
0,3 M NaCl0,001 M EDTApH 5,5
BioRad fosforna kislinametanolCoomassie Brilliant Blue 250
BioRad Laboratories
Phast SDS PAGEgradientni poliakrilamidni gel PhastGel™ Gradient 8-25 GE Healthcare Bio Science AB2x nanašalni pufer 0,02% bromfenolmmodro
0,002 M EDTA5 % SDS0,02 M TRIS/HCl pH 8
pufer za elektroforezo PhastGel™ SDS Buffe Strips Amersham Bioscienceraztopina za barvanje gela C45H44N3NaO7S2
(Coomassie Brilliant Blue)Sigma-Aldrich
raztopini za razbarvanje gela 30 % etanol10 % ocetna kislina10 % etanol5 % ocetna kislina
32
Lara Kandić: diplomska naloga III Materiali in metode
Standardi za Phast SDS-PAGE:fosforilaza B 94 kDa karboksianhidraza 30 kDagoveji serumski albumin 67 kDa tripsinski inhibitor 20,1 kDajajčni albumin 43 kDa α-laktalbumin 14,4 kDa
1.3Aparature in pripomočkiaparatura oz. pripomoček proizvajalec
centrifuga Sorvall RC 5C PLUS, Kendocentrifuga za epice Eppendorf Centrifuga 5410črpalka za gelsko elektroforezo Technica AutoAnalyser Proportioning Pumpčrpalka za ustvarjanje podtlaka AEG, tip: AMEB08FY4R3N1dializno črevo Servapor, Servasistem za elektroforezo Phast System Separation and Control Unit, LKBaparatura za slikanje gela intiskalnik
UVI tec,Mitsubishi P90
HPLC Helwett Packard Sunic 1100HPLC kolona Chromsep C8 HPLC column 100 × 3,0 mmliofilizator Hetosicc, Heto Lab equipmentmagnetna mešala Rotamix 560 MM,
Rotamix 606 MMMikrovalovna pečica Daewoo KOR 618TpH meter Mettler Toledo Seven Easypipete BioHit (0,5-10; 10-100; 100-1000),
Eppendorf Researchrotor za centrifugo Sorvall GSAstresalnik za barvanje gela Grant Boekel BFR25tehtnica Mettler Toledo PC 200,
Mettler Toledo AG 245ultrafiltri (in membrane) Amicon 8400 oz. 8200 (Amicon 3,5 kDa)UV/VIS spektrofotometer (A280) Perkin Elmer UV/VIS Spectrometer Lambda 11UV/VIS spektrofotometer (A340-240) Perkin Elmer UV/VIS Spectrometer Lambda 18UV/VIS spektrofotometer (Biorad) Tecon, Safire (V 2.20 08/02)vakuumski sušilnik Savant SpeedVac Plus SC110Avorteks MS1 Minishaker, IKAzamrzovalnik Gorenje
33
Lara Kandić: diplomska naloga III Materiali in metode
1.4Glivni materialiAgaricus campestris travniški kukmakArmillaria mellea sivorumena mraznica; prava štorovkaBoletus calopus leponogi goban; rdečebetni gobanClitocybe geotropa pozna livkaClitocybe nebularis meglenka; poprhnjena livkaCortinarius caerulescens višnjeva koprenkaCortinarius glaucopus kolobarniška koprenkaGeastrum sessile resasta zvezdicaHebeloma radicosum korenasta medlenkaHebeloma sinapizans redkvičasta medlenkaHygrophorus pudorinus hojeva polževkaLactarius cilicioides kocasta mlečnicaLactarius deliciosus užitna sirovkaLactarius piperatus poprova mlečnicaLactarius scrobiculatus jamičasta mlečnicaLepista nuda vijoličasta kolesnicaLycoperdon perlatum betičasta prašnicaMacrolepiota procera orjaški dežnikRamaria formosa lepa grivaRussula albonigra črnjava golobicaSarcodon imbricatus rjavi ježevecSuillus granulatus ovčarska lupljivkaTricholoma bufonium krastačja kolobarnica
1.5Inhibitorji proteaz
vir inhibitorja ime inhibitorjabučka Curcubita maxima Trypsin Inhibitorkrompir Potato Serine Protease Inhibitorkrompir Protease Inhibitor 2krompir Potato Cysteine Protease Inhibitormeglenka Clitocybe nebularis Serine Protease Inhibitormeglenka klitocipin
1.6Lektini
Lektine smo izolirali iz vodnega ekstrakta meglenke (Clitocybe nebularis), nabrane na
Krasu leta 2005. Ločili in poimenovali smo jih glede na specifičnost za saharide in velikost
oziroma navidezno maso, določeno z Phast elektroforezo.
34
Lara Kandić: diplomska naloga III Materiali in metode
2Materiali, uporabljeni pri pripravi gojišč
2.1Gojišča
sestavina proizvajalecdestilirana voda pridobljena z MiliQ plus 185, Milliporeagar Agar Technical Biolife Italianasladkor Kandit, kuhinjski sladkor (saharoza)sadni sok Fructal, 100% sok jabolko kvas Alltech Fermin a.d.Nipagin (para-metilhidroksibenzojska kislina),
10%
Clariant
Propionska (propanojska) kislina Sigma-Aldrichkoruzna moka Mlinotest saharoza, p.a. Flukalaktoza, p.a. Flukagalaktoza, p.a. Flukaglukoza, p.a. Fluka
2.2Aparature in pripomočki
aparatura proizvajalectehtnica Mettler Toledo AB304-S/FACTgrelna električna plošča Corona EKA 10 KSvodna kopel brez oznake, grelno območje 35-80°Chladilnik Gorenjelupa Leica MZ 95
vir svetlobe za lupo Leica CLS 100xinkubator Kambič I-190 EK
2.3Kulturi vinske mušice
Kultura 1 divji tip, Univerza v Queenslandu, AvstralijaKultura 2 divji tip - Canton S, Univerza v Indiani, ZDA
35
Lara Kandić: diplomska naloga III Materiali in metode
3METODE
Gojišča in optimizacija gojenja vinske mušice
Testna gojišča smo pripravili na NIB največ en dan pred prenosom jajčec in jih hranili v
hladilniku (5-8°C). Na zalogi smo imeli pripravljena gojišča za vzdrževanje kulture vinske
mušice ter gojišča za odlaganje jajčec.
Nipagin je 10% raztopina para-metilhidroksibenzojske kisline v 96% etanolu.
Gojišče 1
3,5 g agarja
3,4 g sladkorja
65 ml dH2O
35 ml sadnega soka
Vodo in agar smo zmešali v čaši in zavreli na električni
plošči. Dodali smo sladkor in sadni sok ter ponovno zavreli.
Odstranili smo z ognja in z enakomernim mešanjem
zmanjšali količino mehurčkov. Gojišče smo ulili v petrijevke
oziroma izbrano posodo. Količina zadostuje za 20 petrijevk.Uporabili smo ga predvsem za podlago, na katero so mušice odlagale jajčeca. Preizkusili
smo ga tudi kot gojišče za preživetje larv in dozorevanje v odrasle mušice (preglednica III).
Gojišče 2
1,2 g agarja
3,2 g sladkorja
8,5 g kvasa
5 g koruzne moke
100 ml dH2O
1,1 ml Nipagina
0,5 ml propanojske kisline
Agar, sladkor, kvas in moko smo suspendirali v vodi in
zavreli. Počakali smo, da se shladi na približno 60°C, nato
dodali še Nipagin in propanojsko kislino. Preden se je gel
strdil, smo ga ulili v izbrane posode.
Opisano gojišče se uporablja za gojenje in vzdrževanje
kulture vinske mušice na NIB-u. Uporabili smo ga v več
poskusih (preglednica III, IV,…).
Gojišče 3
2 g agarja
10 g kvasa
0,5 ml Nipagina
100 ml dH2O
Sestavine smo zmešali v vodi in zavreli. Ko so se shladile na
60°C, smo dodali Nipagin. Preden se je gel strdil, smo ga
ulili v izbrane posode (preglednica III, IV).
Gojišče smo zasledili v znanstvenem članku [77], kjer so
prav tako gojili vinsko mušico in merili insekticidni učinek.
36
Lara Kandić: diplomska naloga III Materiali in metode
Gojišče 4
Osnovno gojišče, ki smo ga izbrali po optimizaciji, smo priredili tako, da smo sestavine
zavreli v 75% predpisane vode in s tem pridobili topilo (preostalih 25% vode) za liofiliziran
ekstrakt. Tako pripravljeno gojišče smo ohladili na 50°C in ga vzdrževali na tej temperaturi
v vodni kopeli.
V manjšo čašo smo odpipetirali 75% končnega volumna gojišča (4,5 ml) in dodali
raztopljen vzorec (1,5 ml) in tako dobili 6 ml končnega gojišča za 5 paralel (5x1 ml). 1 ml
rezerve smo imeli zaradi morebitnih izgub (npr. oprijemanje gojišča na stene čaše).
Količine vgrajenih liofiliziranih ekstraktov so navedene v preglednicah V, VI, VII v
podpoglavju III.3.4.2.
Gojišče 5
Gojišče, izbrano po optimizaciji, smo pripravili po postopku opisanem v (III. 2. 1. 4), le da
smo ga pripravili v 50% predpisane dH2O. Ostalih 50 % tekoče faze so bili raztopljeni
proteini: inhibitorji proteaz, laktozil specifični lektini, BSA. Natančnejši podatki o
vgrajenih proteinih so navedeni v preglednici VIII v podpoglavju III.3.4.3.
Gojišče 6
dve mešanici izoliranih lektinov (laktozil in galaktozil specifični lektini) ter trije čisti lektini
(glukozil, saharozil in en očiščen laktozil specifičen lektin 19 kDa) (slika 9, IV.3.1).
V dveh koncentracijah vseh petih vzorcev (C2, C4) smo preizkusili tudi insekticidni učinek
raztopine lektinov v prisotnosti sladkorja (C2+, C4+), komplementarnega vzorčnemu lektinu
(preglednica IX, X; III.3.4.4).
Opazovali smo vpliv samih sladkorjev na razvoj vinske mušice. Pripravili smo 5 kontrolnih
gojišč: v prvo kontrolno gojišče smo dodali le dH2O. Za preostala 4 kontrolna gojišča smo v
dH2O raztopili ustrezno količino laktoze, galaktoze, saharoze ali glukoze (preglednica IX,
X; III.3.4.4) in vmešali v pripravljeno gojišče 6.
37
1 g agarja
10 g kvasa
100 ml dH2O
1,1 ml Nipagina
0,5 ml propanojske kisline
Kvas in agar smo suspendirali v 75% predpisane dH2O,
ohladili na približno 60°C, dodali Nipagin ter propanojsko
kislino in tako pripravljeno gojišče vzdrževali na 50°C na
vodni kopeli. Preostalo dH2O smo uporabili kot topilo za
lektine (in sladkorje). V preglednici IX (III.3.4.4.) so
navedene koncentracije vmešanih lektinov v gojišče 6:
Lara Kandić: diplomska naloga III Materiali in metode
Gojišče 7
Sestavine gojišča 7 so ustrezale sestavinam gojišča 2 (III.3.1.2) brez sladkorja (saharoze),
postopek priprave pa je že opisan pri gojišču 6 (III.3.1.6). Prav tako smo pripravili tudi 5
kontrolnih gojišč, brez sladkorja in s saharozo, laktozo, galaktozo in glukozo (preglednica
IX, X; III.3.4.4).
Izbira gojišča
Pri vseh poskusih smo na testno gojišče prenesli po 10 jajčec, ki so jih samice vinske
mušice odložile na gojišče 1. Da bi se izognili prevelikemu vplivu drugih dejavnikov (npr.
genetska kakovost jajčec), napakam pri prenosu jajčec na gojišča in ostalim napakam pri
delu, smo vse teste izvedli vsaj v 5 paralelah.
Za odlaganje jajčec, ki smo jih uporabili v raziskovalne namene, smo uporabili gojišče 1 v
petrijevkah, na katerega smo kanili kapljico kvasa in tako stimulirali samice k odlaganju.
Jajčeca vinske mušice smo gojili v inkubatorju (Kambič I-190 EK) pri stalni temperaturi
25°C in po prvem poskusu še ob največji možni vlažnosti. Zagotovili smo jo s stalnim
dodajanjem vode v petrijevko na dnu inkubatorja do nastanka bub. Občasno smo gojišča z
razvijajočimi mušicami prezračili in ob tem zapisali skladnosti in odstopanja od
pričakovanj. Preživele muhe smo prešteli 14. dan.
Uporabili smo dve kulturi vinske mušice: prva je bila kultura divjega tipa vinske mušice,
prinesena iz raziskovalnih laboratorijev Univerze v Queenslandu, Avstralija, druga je bila
kultura divjega tipa Canton S, pridobljenja iz zaloge iz Bloomingtona, Univerza v Indiani,
ZDA. Slednjo smo uporabili pri testiranju insekticidnega delovanja očiščenih lektinov
(III.3.4.4)
Za izvedbo testiranja insekticidnega delovanja liofilizatov in proteinov smo izbirali med
tremi gojišči različne sestave (III.3.1.1 - III.3.1.3). Zanimalo nas je, na katerem gojišču se iz
odloženih jajčec razvije največ odraslih mušic z najmanjšim variacijskim razmikom.
Uporabili smo posodice s 2r=2,5 cm in h=3,5 cm, zaprli smo jih s plastičnim zamaškom, na
katerem smo naredili 10 luknjic z iglo. Poskus smo izvedli v 10 paralelah.
Preglednica III: Izbira gojišča za testiranja na modelu vinske mušice; sestava podana v III.3.1.1 - III.3.1.3
vrsta gojišča gojišče 1 gojišče 2 gojišče 3 gojišče 3 gojišče 3volumen uporabljenega gojišča 1 ml 1 ml 1 ml 1,5 ml 2 ml
38
Lara Kandić: diplomska naloga III Materiali in metode
Vzporedno smo naredili še 5 paralel gojišča 2. Stehtali smo posodice z gojiščem in bubami
(m1), nato iz njih prenesli bube in stehtali posodice brez bub (m2) in bube (m3). Izračunali
smo povprečno maso ene bube iz razlike mas (m1-m2) oziroma iz mase samih bub (m3).
Pri optimizaciji pogojev gojenja smo izbirali še med različnima načinoma zapiranja posode
in med dvema vrstama posod za gojenje. Posodice 1 so imele dimenzije 2r=2,5 cm in
h=3,5 cm, zaprli smo jih bodisi s plastičnim zamaškom, bodisi s kosmom vate, ki smo ga
navlažili. Na zamaških smo naredili 10 luknjic z iglo. Posodice 2 so imele dimenzije
2r=1 cm in h=3,5 cm, zapirali smo jih s kosmi navlažene vate. Poskus smo izvedli v 10
paralelah. Uporabili smo gojišče 2.
Preglednica IV: Izbira posode in načina zapiranja, razloženo v besedilu
volumen uporabljenega gojišča 2 1 ml 1 ml 2 ml 2 ml 1 mlvrsta posode,
način zapiranja
posoda 1,
zamašek
posoda 1,
vata
posoda 1,
zamašek
posoda 1,
vata
posoda 2,
vata
Priprava liofiliziranih ekstraktov izbranih gliv
Nabor naših gliv je obsegal 23 pravih gob iz razreda podstavkovnice (Basidiomycetes), in
sicer iz vseh treh podrazredov: listarice, nelistarice in trebuharice. Vse so bile nabrane v
Sloveniji med leti 2002 in 2005. Gobe je determiniral g. Andrej Piltaver. Testirali smo
liofilizirane ekstrakte gob, katerim smo odstranili molekule, manjše od 3,5 kDa.
Priprava ekstrakta iz gob
Gobe so bile po nabiranju strokovno determinirane, označene in hranjene na -70°C. Za
pripravo vodnega ekstrakta smo gobe odtalili v mikrovalovni pečici, dobro premešali,
pregnetli in iztisnili sok. Ekstrakt smo precedili skozi plenično podlago in odstranili večje
koščke gobjega tkiva. Tako pripravljene ekstrakte smo uporabili za pripravo suhega
(liofiliziranega) ekstrakta.
Dializa
Dializno cev, celofansko črevo z velikostjo por, ki zadržijo molekule z relativno molsko
maso večjo od 3,5kDa, smo sprali z dH2O. Odmerili smo do 100 ml našega ekstrakta v
dializno cev, zamašili s stiščki in potopili v 5 l dH2O. Pripravljeno smo postavili na
magnetno mešalo in mešali v hladni sobi (t=16 ur, T=4°C).
39
Lara Kandić: diplomska naloga III Materiali in metode
Centrifugiranje
Dializirane vzorce smo prelili v ustrezne posode za centrifugiranje, jih uravnotežili,
namestili v rotor in centrifugirali 15 minut pri obratih 9,000 min-1 pri 4°C. Po
centrifugiranju smo za liofilizacijo uporabili supernatant, oborino pa smo zavrgli.
Liofilizacija
Liofilizacija je postopek sušenja z dehidracijo pri nizki temperaturi (ponavadi med -30°C
do -50°C, tudi do -70°C) pod znižanim pritiskom (do 200 Pa). Ti pogoji omogočajo
sublimacijo vode in s tem sušenje. Tako posušen material se lažje ponovno rehidrira, kajti
led, ki sublimira, pušča mikroskopske pore. Ustrezno shranjen posušen vzorec je
obstojnejši, saj je preprečeno delovanje tako mikroorganizmov kot encimov.
Vzorec, 50 - 150 ml supernatanta izbrane gobe, smo prelili v bučko z obrusom in vanjo
namestili nastavek, ki nam je omogočal, da smo lahko bučko trdno držali na ustrezni
oddaljenosti (25 - 30 cm) in vrteli okrog vertikalne osi. Med vrtenjem smo bučko pomočili
v tekoči dušik v Dewarjevi posodi in vzorec zamrznili. Vrtenje omogoči, da se vzorec
porazdeli po čim večji površini stene bučke v enakomerni tanki plasti, kar je pomembno za
enakomernost sublimacije. Bučko z zamrznjenim vzorcem smo pritrdili na liofilizator
(Hetosicc). Po določenem času (3-6 ur, odvisno od količine vzorca in higroskopnosti suhe
snovi v vzorcu) smo liofiliziran ekstrakt označili in shranili na -70°C.
V kolikor se je vzorec med liofilizacijo odtalil, smo postopek ponovili.
3.1Izolacija in čiščenje lektinov
Specifičnost lektinov na monosaharide in disaharide je bila osnova, glede na katero smo
lektine izolirali (ločili) in poimenovali.
Priprava ekstrakta iz meglenke
Za izolacijo lektinov smo pripravili več litrov ekstrakta iz meglenke (Clitocybe nebularis).
Gobe smo odtalili v mikrovalovni pečici. Dodali smo 5 g Na2S2O3 in 17,5 g NaCl na 1 kg
gob, dobro premešali, pregnetli in iztisnili tekočino. Gobje tkivo smo nato macerirali
raztopini za ekstrakcijo 1 oz. 2 v količini, ustrezni 30% začetne teže gob, približno
30 minut, in iztisnili nastali sok. Postopek smo še enkrat ponovili. Skupni ekstrakt smo
precedili skozi plenično podlago in odstranili večje koščke gobjega tkiva.
Uporabili smo dve različni raztopini za ekstrakcijo:
40
Lara Kandić: diplomska naloga III Materiali in metode
1. 0,003 M Na2S2O3, 0,3 M NaCl v dH2O
2. raztopina za ekstrakcijo 1 z 0,2 M TRIS, pH 11. Tako pripravljen ekstrakt smo pred
nanosom na kolono za afinitetno kromatografijo nevtralizirali z 1 M HCl.
Ekstrakt smo pred nanosom na sefarozo centrifugirali in uporabili supernatant.
Afinitetna kromatografija
Afinitetna kromatografija je metoda ločevanje biokemičnih mešanic na osnovi visoko
specifične reverzibilne biološke interakcije (npr. antigen-protitelo, encim-substrat,
receptor-ligand). Uporablja se za čiščenje in koncentriranje molekul iz mešanice ali
odstranjevanja le-teh iz raztopine; lahko tudi za ugotavljanje specifičnosti vezave molekul.
Po nanosu vzorca s kolone speremo nevezane molekule, vezane pa izperemo (eluiramo) s
spremembo pogojev (pH, ionska moč, kompetitivni agonist,…). Odvisno od namena
zbiramo izprane, specifično vezane molekule (eluat), redkeje pa tudi sprane, nevezane
molekule. Najpogosteje se za stacionarno fazo uporablja substituirana sefaroza z 2, 4 ali
6% vsebnostjo agaroze (od tod tudi poimenovanje: sefaroza 2B, 4B ali 6B). Tu sefaroza ne
deluje kot matriks za ločevanje po velikosti, saj z aktivacijo (npr. z divinilsulfonom,
CNBr,…) lahko nanjo vežemo različne ligande in tako to vrsto gelske kromografije
nadgradimo v afinitetno kromtografijo. Z divinilsufonom aktivirana sefaroza reagira z
amino, hidroksilimi in sulfhidrilnimi skupinami in omogoča vezavo mnogim ligandom.
Pripravili smo 4 različno substituirane sefaroze po sledečem postopku:
100 ml sefaroze 4B (Sepharose 4B, Pharmacia) smo večkrat sprali na nuči z 1 l 0,5 M
Na2CO3 (pH=11), jo nato suspendirali v 100 ml 0,5 M Na2CO3 in po kapljicah dodajali
10 ml divinilsulfona. Po 70 minutah nežnega stresanja na sobni temperaturi smo jo dobro
sprali s približno 2 l 0,5 M Na2CO3 in ponovno suspendirali v 100 ml 0,5 M Na2CO3, ki je
vseboval 10% sladkorja. Pri našem delu smo uporabili laktozo, saharozo, glukozo in
galaktozo. Stresali smo 15 ur pri sobni temperaturi, nato sprali s približno 2 l 0,5 M Na2CO3
in z 1 l pufra za afinitetno kromatograijo (1 ali 2) in nevtralizirali preostala aktivirana
mesta. Shranjevali smo jo v hladni sobi, kot konzervans pa smo uporabljali 10% NaCl v
ustreznem pufru za afinitetno kromatografijo. Skladno z izbiro pufra za izvedbo afinitetne
kromatografije, smo izbrali tudi pufer za spiranje substituirane sefaroze.
Uporabili smo 4 različne raztopine za izvedbo afinitetne kromatografije:
1. pufer za afinitetno 1 (0,3 M NaCl, 0,05 M EDTA, 0,05 M TRIS/HCl pH 7, dH2O)
2. pufer za afinitetno 2 (pufer za afinitetno 1 brez EDTA z 0,005M CaCl2, 0,005M MgCl2)
41
Lara Kandić: diplomska naloga III Materiali in metode
3. raztopina za elucijo (0,02 M NaOH, pH 12)
4. pufer za nevtralizacijo (2 M TRIS/HCl, pH 6,5).
V stekleno kolono (2r=4 cm, h=15 cm) smo nalili 100 ml s sladkorjem substituirane
sefaroze (laktozil, saharozil, glukozil ali galaktozil substituirana) in sprali s pufrom za
afinitetno (1 oziroma 2). 200 ml ekstrakta smo dodali ali 2,92 g EDTA ali 95,2 mg MgCl2
in 147 mg CaCl2 × 2 H2O in nanašali na kolono s približnim pretokom 6 ml/min. Spirali
smo s pufrom za afinitetno (1 oziroma 2) s približnim pretokom 15 ml/min, dokler A280 ni
padla pod vrednost 0,020. V nevezanem ekstraktu so ostali nespecifični lektini, ostali
vodotopni proteini in polisaharidi ter ostale dragocene molekule, zato smo ga ustrezno
označili in shranili na -70°C. Vezane proteine smo izprali s spremembo pH na pH 12 z
0,02 M NaOH. Eluat smo lovili v epruvete (največ po 10 ml na epruveto), v katere smo
predhodno odpipetirali 1 ml pufra za nevtralizacijo s pH 6,5. Pomerili smo A280 in vrednosti
prikazali v grafu. Proteinske vrhove smo ločeno združili in koncentrirali s pomočjo
ultrafiltracije na koncentracijo približno 1 mg/ml proteina. Dobljene proteine smo
koncentrirali in identificirali s Phast SDS-PAGE elektroforezo.
Gelska filtracija
Gelska filtracija je metoda ločevanja komponent vzorca na osnovi razlik v velikosti
molekul. Manjše molekule lažje vstopajo v tekočino, ujeto v porah v gelu in se tako dalj
časa zadržijo na koloni, večje pa potujejo hitreje. Ob tem se predpostavlja, da ni
elektrostatskih in ostalih interakcij med gelom in sestavinami vzorca. Ločba poteka na
poroznem gelu, ki je običajno agaroza, lahko pa tudi dekstran, poliakrilamid ali polistiren.
Dimenzije por določa stopnja zamreženosti polimera.
Kolono z 2r=1,8 cm in h=120 cm smo napolnili z gelom Sephacryl S-200 (Pharmacia) in
sprali s pufrom za gelsko (0,1 M NaAc, 0,3 M NaCl, 0,001 M EDTA, pH=5,5). Nanašali
smo po 5 ml vzorca. Filtracija je potekala 24 ur na 4°C s pretokom 19,4 ml/uro. Frakcije
smo zbirali na kolektorju na 30 min. Proteinske vrhove smo ločeno koncentrirali in
identificirali s Phast SDS-PAGE elektroforezo.
RP-HPLC
Reverznofazana tekočinska kromatografija visoke zmogljivosti spada med kolonske
kromatografske metode. Bistvena razlika je v pritisku, ki lahko znaša do 300 barov.
Prednosti te metode so visoka ločljivost, ponovljivost, hitrost ločbe, občutljivost in možnost
avtomatizacije. Stacionarna faza je hidrofobna, mobilna pa hidrofilna, tako da se
42
Lara Kandić: diplomska naloga III Materiali in metode
komponente vzorca ločijo glede na razlike v njihovi hidrofobnosti. Uporablja se v analitske
(identifikacijske) in prepartivne namene za preverjanje čistosti oziroma z dodatno čiščenje
substanc.
Stacionarno faz je predstavljal silikagel z vezanimi alifatskimi skupinami C8 (kolona
Chromsep). Mobilna faza je bila sestavljena iz dveh raztopin: A= 0,1% TFA in B= 90%
ACN v 0,1% TFA. Ob vklopu sistema se je le-ta spiral z 50% mobilne faze B. Pretok na
koloni je znašal 1 ml/min, T=23°C; za delo smo uporabili tri gradiente.
Prvi, za izpiranje kolone pred nanosom vzorca in po končani seriji ločevanj, je trajal
tblank=17 min, in sicer
0-2 A: 100% B: 0%
2-10 A: 100% →0% B: 0% →100 %
10-15 A: 0% → 100% B: 100% → 0%
15-17 A: 100% B: 0%
Drugi, za preliminarno določitev retencijskih časov lektinov, je trajal tprelim=23 min:
0-2 A: 100% B: 0%
2-17 A: 100% → 0% B: 0% → 100 %
17-21 A: 0% → 100% B: 100% → 0%
21-23 A: 100% B: 0%
Tretji, za ločeno zbiranje proteinskih vrhov, je trajal tlektini=49 min:
0-5 A: 100% B: 0%
5-10 A: 100% →50% B: 0% →50 %
10-40 A: 50% →40% B: 50% →60 %
40-42 A: 40% →0% B: 60% →100 %
42-47 A: 0% → 100% B: 100% → 0%
47-49 A: 100% B: 0%Na kolono smo nanašali po 1 ml razredčenega vzorca (100 μl mešanice lektinov in 900 μl
0,1% TFA). Proteine smo zaznali z dvigom absorpcije pri 215 nm. Vrhove smo ločeno
zbirali, nato pa sušili pod znižanim pritiskom v sistemu SpeedVac. Proteine smo nato
raztopili v pufru za afinitetno 2, preverili aktivnost po HPLC z rekromatografiranjem na
laktozil sefarozi ter identificirali S pomočjo Phast SDS PAGE.
43
Lara Kandić: diplomska naloga III Materiali in metode
Ultrafiltracija – koncentriranje
V ultrafilter (Amicon 8400 ali 8200) smo vstavili membrano (Amicon), ki prepušča samo
molekule manjše od 3,5 kDa, in nalili vzorec. V hladni sobi (T=4°C) smo ga postavili na
magnetno mešalo in priklopili na jeklenko z dušikom pri nadtlaku približno 4 bare. Za
razsoljevanje vzorca smo dolili približno 100 ml dH2O k vzorcu, ko smo le tega že
skoncentrirali na nekaj ml. Skoncentriranemu vzorcu smo določili koncentracijo, signirali
in ga shranili v zamrzovalniku na -70°C.
Določitev koncentracije
Merjenje absorbance pri λ=280 nm (A280)
Pri določanju vsebnosti proteinov v vzorcu izkoriščamo dejstvo, da aromatske aminokisline
(triptofan, fenilalnin in tirozin) absorbirajo svetlobo valovne dolžine 280 nm. Te
aminokisline so v veliki večini proteinov zastopane v zelo podobnih deležih, tako da lahko z
merjenjem absorbance, ki jo povzročajo, enostavno ocenimo približno koncentracijo
proteinov v bistrih raztopinah vzorca. Težava nastopi pri raztopinah, ki vsebujejo druge
aromatske spojine, saj te ravno tako absorbirajo svetlobo istih valovnih dolžin.
Koncentracijo proteinov v vzorcu smo določali spektrofotometrično z merjenjem
absorbance na spoktrofotometru Lambda 11 (Perkin - Elmer) v kvarčnih kivetah pri
λ=280 nm (A280). Za oceno koncentracije smo uporabili Beer-Lambertov zakonenačba 1:
»l« je dolžina optične poti (širina kvarčne kivete), ki je bila povsod enaka (1,00 cm), »ε« je
absorpcijski koeficient. V povprečju imajo proteini s koncentracijo c=1mg/ml A280=1,000.
Tako smo lahko ocenili koncentracije proteinov v naših vzorcih. Ključna prednost metode
je enostavnost in hitrost izvajanja, moti pa jo motnost vzorca (koloidni delci, mehurčki,
obarvanost).
Kvantitativno določanje koncentracije proteinov v vzorcu po Bradfordovi metodi
Ta metoda temelji na vezavi kisle raztopine barvila Coomassie Brilliant Blue na arginin in
hidrofobne aminokislinske ostanke v proteinu. Pri tem pride do premika absorpcijskega
maksimuma z λ=465 nm na λ=595 nm. Kompleks je časovno obstojen. Metoda je
enostavna, je linearna v območju od 2 µg/ml to 120 µg/ml, kar zahteva ustrezno redčenje
44
A=c×l×ε
Lara Kandić: diplomska naloga III Materiali in metode
vzorca. Ne interagira z mnogimi primesmi, moti pa jo prisotnost detergentov in močno
alkalen vzorec.
Vzorec, kateremu smo ocenili koncentracijo z merjenjem A280, smo pripravili v večih
razredčitvah, da bi prišel v območje linearnosti metode. 160 µl razredčenega vzorca smo
dodali 40 µl BioRadovega reagenta za določevanje proteinov (fosforna kislina, metanol in
barvilo Coomassie Brilliant Blue G-250). Po 10 minutah smo merili dvig absorbance pri
595 nm proti slepemu vzorcu. Koncentracije proteinov smo izračunali s pomočjo
umeritvene krivulje, ki smo jo naredili z raztopinami BSA različnih koncentracij v območju
0-100 µg/ml. Za redčenje vzorcev, pripravo umeritvene krivulje in slepe vzorce smo
uporabili tri različne raztopine: pufer za nevtralizacijo (TRIS/HCl pH 6,5) in PBS (NaCl,
Na2HPO4 in NaH2PO4, pH 6,8) in dH2O.
Kontinuirano merjenje absorbance med λ =340 do λ=240 nm (A340-240)
Za natančnejšo določitev koncentracije proteinov v vzorcu smo uporabili računalniško
obdelano spektrofotometrično metodo merjenja absorbance med 340 in 240 nm. Vrednosti
absorbance pri posameznih valovnih dolžinah smo prenesli v Excelov program. Na
območju med 340 in 320 nm smo izmerili nespecifično sipanje svetlobe zaradi ozadja
(koloidni delci). Vrednosti smo ekstrapolirali po enačbi premice in izračunali absorbanco
ozadja pri 280 nm. Dobljeno vrednost smo odšteli od odčitane absorbance pri tej valovni
dolžini. Koncentracijo proteinov smo izračuna po Beer-Lambertovem zakonu, upoštevajoč
redčenje vzorca.
SDS PAGE elektroforeza
Elektroforeza je metoda ločevanja proteinov, ki temelji na potovanju nabitih delcev v
električnem polju v zamreženem separacijskem gelu. Hitrost potovanja nativnega proteina
je odvisna od njihovega celokupnega naboja, velikosti in oblike. Ob dodatku anionskega
detergenta, natrijevega dodecil sulfata (SDS), je hitrost odvisna samo od velikosti (mase)
proteina. SDS poruši nativno konformacijo proteina in se nespecifično veže na povprečno
dve aminokislini in tvori negativno nabit kompleks.
Za izvedbo Phast elektroforeze smo uporabili gradientni 8–25% poliakrilamidni gel
velikosti (43 × 50 × 0,45) mm (LKB). Proteinskim vzorcem (okrog 1 mg/ml) smo dodali
enak volumen 2x nanašalnega pufra (0,02% bromfenol modro, 0,02 M TRIS/HCl pH 8,
0,002 M EDTA, 5 % SDS), segrevali 5 min pri 100°C in nanesli na gel (približno 1µl).
Elektroforeza je potekala v 0,112 M NaAc, 0,112 M TRIS pH 6,4 pri 250 V 30min. Gel
45
Lara Kandić: diplomska naloga III Materiali in metode
smo obarvali s Coomassie Brilliant Blue, nato pa razbarvali v dveh korakih: 30 minut v
30% etanolu in 10 % ocetni kislini in v 10 % etanolu in 5 % ocetni kislini čez noč.
Testiranje ekstraktov in proteinov
Učinkovitost (insekticidno delovanje)
Učinkovitost smo določali po sledeči formuli: enačba 2
Število preživelih je bilo število živih muh po 14 dneh, RS pa je predstavljal relativno
smrtnost. Kot drugi statistični parameter je podan variacijski razmik, izračunan :enačba 3
Variacijski razmik je pokazatelj razpršenosti vzorca, podan pri povprečju preživelih mušic.
xmax je najvišja številčna vrednost preživelih mušic, xmin pa najnižja.
Testiranje liofiliziranih ekstraktov
V gojišča smo po že opisanem postopku (točka III.3.1.4: gojišče 4) vnašali različne zatehte
liofiliziranih ekstraktov in nižali vsebnost liofilizata od 6% do 0,125% v treh poskusnih
serijah. Vsebnost liofiliziranih ekstraktov je podana v utežno-volumskih odstotkih,
pripravljali pa smo po 6 ml gojišča.
V prvi seriji smo pripravili gojišča s 6% vsebnostjo liofilizata. V epico smo natehtali
360 mg liofilizata in ga s pomočjo vorteksa raztopili v 1,25 ml dH2O, vmešali v 4,5 ml
pripravljenega gojišča, nato epico poplaknili še z 0,25 ml dH2O in dobili 6 ml gojišča.
V drugi seriji smo po enakem postopku raztopili 120 mg liofilizata in dobili 2% vsebnost
liofilizata v gojiščih.
V tretji seriji smo pomerili učinek le petim najučinkovitejšim liofilizatom, vsebnosti pa so
bile sledeče: 2%, 1%, 0,5%, 0,25%, 0,125%. Po zgoraj opisanem postopku smo pripravili
46
(št. preživelih v testnem vzorcu) (št. preživelih v kontroli)
RS= 1-
(xmax
- xmin
) 2VR=
Lara Kandić: diplomska naloga III Materiali in metode
12 ml gojišča z vsebnostjo 2% (240 mg liofilizata), nato izvedli postopek redčenja.
Odpipetirali smo 6 ml 2% gojišča in mu dodali 6 ml gojišča 2, pripravljenega po postopku
opisanem v točki III.3.1.2, in dobili 12 ml 1% gojišča. Postopek redčenja smo še tri krat
ponovili. V preglednicah so navedeni liofilizirani ekstraki gob, testirani v različnih serijah.
Preglednica V: Liofilizirani ekstrakti gob, uporabljeni v prvi seriji testiranja; natančneje razloženo v besedilu
prva serija testiranja s 6% vsebnostjo liofilizata v gojišču 2jamičasta mlečnica leponogi goban redkvičasta medlenkakocasta mlečnica orjaški dežnik rjavi ježeveckorenasta medlenka pozna livka vijoličasta kolesnicalepa griva sivorumena mraznica višnjeva koprenka
Preglednica VI: Liofilizirani ekstrakti gob, uporabljeni v drugi seriji testiranja; natančneje razloženo v
besedilu
druga serija testiranja z 2% vsebnostjo liofilizata v gojišču 2betičasta prašnica lepa griva sivorumena mraznicačrnjava golobica leponogi goban redkvičasta medlenkahojeva polževka meglenka resasta zvezdicakolobarniška koprenka orjaški dežnik travniški kukmakkorenasta medlenka ovčarska lupljivka užitna sirovkakrastačja kolobarnica poprova mlečnica vijoličasta kolesnica
Preglednica VII: Liofilizirani ekstrakti gob, uporabljeni v tretji seriji testiranja; natančneje razloženo v
besedilu
tretja serija testiranja z 2% do 0,125% vsebnostjo liofilizata v gojišču 2 korenasta medlenka meglenka vijoličasta kolesnicaleponogi goban poprova mlečnica /
Presejalno testiranje inhibitorjev in laktozil specifičnih lektinov
Testirali smo dva inhibitorja cisteinskih in štiri inhibitorje serinskih proteaz. Inhibitorje iz
bučke CMTI, krompirja PI-2 in meglenke CNSPI so pridobili po modificiranih postopkih,
opisanih v referenčnih člankih [88, 89, 61], krompirjeva PSPI in PCPI ter klitocipin iz
meglenke pa so izolirali po nemodificiranih postopkih [90, 91, 12] v laboratorijih IJS.
Delno očiščene laktozil specifične lektine smo pridobili z izolacijo iz soka meglenke,
opisano v točkah III.3.3.1-3.3.3, slika 10 (IV.3.3.2)
Vse disperzije proteinov so bile bistre, zato smo koncentracijo ocenili spektrofotometrično
(Lambda 11) pri λ= 280 nm in izračunali potreben volumen raztopin vzorcev (enačba 1,
III.3.3.6.1) . Končna koncentracija dodanih proteinov v gojišču je bila 0,5 mg/ml. Pripravili
47
Lara Kandić: diplomska naloga III Materiali in metode
smo ga po postopku opisanem v (III.3.1.5.). Imeli smo dve kontroli: gojišče brez dodatnih
proteinov in gojišče z 0,5 mg/ml BSA.
Preglednica VIII: Količine vgrajenih inhibitorjev proteaz in laktozil specefičnih lektinov
inhibitor ime Tip inhibitorja A280 Vvz v ml VdH2O v mlbučka CMTI serinski 1,140 2,362 0,368krompir PSPI serinski 1,050 2,857 0,143krompir PI 2 serinski 1,260 2,381 0,619krompir PCPI cisteinski 1,700 1,765 1,235meglenka CNSPI serinski 1,940 1,546 1,454meglenka klitocipin cisteinski 1,960 1,531 1,469meglenka laktozil lektini / 1,550 1,935 1,065kontrola 1 dH2O / 0,000 3,000 /kontrola 2 BSA / 1,000 3,000 0,000Legenda:CMTI [88]: Curcubita maxima Trypsin Inhibitor, RMM= 7,5 kDa,
inhibira tripsin in Hagemanov faktor (XIIa)PSPI [90]: Potato Serine Protease Inhibitor, Kunitzov tip 2, RMM= 22 kDa
inhibira serinske proteazePI-2 [89]: potato Protease Inhibitor 2, RMM= 18 kDa
inhibira tripsin in kimotripsinPCPI [91]: Potato Cysteine Protease Inhibitor, Kunitzov tip 2, RMM= 23 kDa inhibira katepsin I, ne pa tripsina in kimotripsina CNSPI [61]: Clitocybe nebularis Serine Protease Inhibitor, nov, še nedefiniran tip, RMM= 22 kDa
inhibira serinske proteazeklitocipin [12]: prvi v soji družini, RMM= 16,8 kDa
inhibira papain, katepsin L , katepsin B in bromelain, ne pa katepsina Hlaktozil lektini delno očiščeni laktozil specifični lektini,
RMM= 19 kDa, 15 kDa in 14 kDa (slika 10, IV.3.3.2)RMM= relativna molekulska masa
Testiranje očiščenih lektinov
Raztopinam očiščenih lektinov smo ocenili koncentracijo in izračunali volumne raztopin, ki
smo jih uporabili za pripravo gojišč. Ločeno smo redčili gojišča C1, C3 in C5 ter ločeno
C2, C4, C2+ in C4+. V gojišča C2+ in C4+ smo dodali tudi komplementarni sladkor v
končni koncentraciji 0,2 M. Naredili smo tudi 5 kontrolnih gojišč, eno brez sladkorja in 4 s
sladkorji v končni koncentraciji 0,2 M. Uporabili smo gojišče 6 in gojišče 7, pripravljali
smo pa samo po 5 ml gojišča. V posodice 2 smo odpipetirali 0,950 ml gojišča z lektini.
Laktozil in galaktozil specifični lektini so sestavljeni iz 3 komponent (n=3), zato je njihova
koncentracija v vseh gojiščih tri krat višja kot koncentracija enokomponentnih saharozil,
glukozil ali laktozil (19) specifičnih lektinov (n=1).
Preglednica IX: Teoretične koncentracije lektinov v gojiščih
C1 C2 C3 C4 C5
48
Lara Kandić: diplomska naloga III Materiali in metode
V=5 ml, n=1 1 mg 0,315 mg 0,1 0,032 mg 0,010 mgkoncentracija 200 µg/ml 63 µg/ml 20 µg/ml 6,3 µg/ml 2,0 µg/mlV=5 ml, n=3 3 mg 0,945 mg 0,3 mg 0,095 mg 0,030 mgkoncentracija 600 µg/ml 189 µg/ml 60 µg/ml 18,9 µg/ml 6,0 µg/mln…število vidnih lis lektinov na elektroforeznem gelu (slika 9, IV.3.3.1 in slika 11:3, IV.3.3.3 ), C…
koncentracija
Na enem primeru je pokazan izračun potrebnih volumnov vzorca in dH2O. Enaki postopek
smo uporabili tudi za izračun količin za ostale vzorce.
Primer galaktozil specifični lektini:
A280=3,75; n=3
1.) priprava C1, C3 in C5
mkončna= 3,330 mg
V(vz135)= 0,888 ml, dodamo 0,222 ml dH2O
Dobimo 1,110 ml C1=3,00 mg/ml
Odvzamemo 0,110 ml C1, dodamo 0,990 ml dH2O. Ostane 1,00 ml C1
Dobimo 1,100 ml C3=0,30 mg/ml
Odvzamemo 0,100 ml C3, dodamo 0,900 ml dH2O. Ostane 1,00 ml C3
Dobimo 1 ml C5=0,03 mg/ml
2.) priprava C2, C4, C2+ in C4+
mkončna= 2,080 mg (2x 1,040 mg)
V(vz22+44+)= 0,555 ml, dodamo 1,645 ml dH2O
Dobimo 2,200 ml C2=0,945 mg/ml.
Odvzamemo 0,200 ml C1, dodamo 1,80 ml dH2O. Ostaneta 2,00 ml C2.
Dobimo 2,00 ml C4=0,095 mg/ml
K 1 ml C2, k 1 ml C4 in kontrolnemu gojišču dodamo po 180 mg galaktoze
(3 x 180 mg). Dobimo 1 ml C2+ in 1 ml C4+ ter kontrolno gojišče z 0,2 M vsebnostjo
sladkorja.
Vzorec vmešamo v 3,75 ml gojišča 6 ali 7, pripravljenega v 75% predpisane dH2O. Vsako
epico, v kateri smo vzorce pripravili, izplaknemo z 0,250 ml dH2O in to vmešamo v
gojišče.
49
Lara Kandić: diplomska naloga III Materiali in metode
Preglednica X: Količine raztopin lektinov in zatehte sladkorjev, uporabljene v testiranju insekticidnega
učinka; natančneje razloženo v besedilu
laktozil galaktozil saharozil glukozil laktozil (19)A(vzorca)280 4,300 3,750 1,100 1,200 1,130V(vzorca)1,3,5 0,774 ml 0,888 ml 1,011 ml 0,921 ml 0,985 mlV(dH2O/redčenje) 3,534 ml 3,420 ml 3,298 ml 3,388 ml 3,324 mlV(vzorca)2,2+,4,4+ 0,484 ml 0,555 ml 0,631 ml 0,575 ml 0,615 mlV(dH2O/redčenje) 2,208 ml 2,137 ml 2,060 ml 2,116 ml 2,076 mlm(sladkorja) x 3 3 x 360 mg 3 x 180 mg 3 x 342 mg 3 x 198 mg 3 x 360 mgLegenda:
laktozil…laktozil specifični lektini
galaktozil…galaktozil specifični lektini
saharozil…saharozil specifičen lektin
glukozil…glukozil specifičen lektin
laktozil (19)…laktozil specifičen lektin z velikostjo 19 kDa
50
Lara Kandić: diplomska naloga IV Rezultati
III.REZULTATI
1Optimizacija gojenja vinske mušice
Testirali smo tri gojišča, različna po sestavi (opisana v točkah II.3.1.1.-3.1.3, postopek v
III.3.1.8). Poskus smo izvedli v desetih paralelah.
Preglednica XI: Rezultati izbire optimalnega gojišča in zadostnega volumna gojišča
št. gojišča,
V gojišča
gojišče 1,
1 ml
gojišče 2,
l ml
gojišče 3,
1 ml
gojišče 3,
1,5 ml
gojišče 3,
2 mlšt. preživelih mušic ± VR 0 6,6 ± 1,5 4,8 ± 2,0 6,0 ± 2,0 5,4 ± 2,5Izkazalo se je, da se na prvem gojišču larve niti ne zabubijo. Drugo gojišče je dalo boljše
rezultate kot gojišče 3. Pri slednjem je bil tudi variacijski razmik večji. Za testiranje
liofiliziranih ekstraktov smo uporabljali gojišče 2.
Vzporedno smo želeli preveriti razlike med masami bub in metodo uporabiti za natančnejša
opazovanje insekticidnega delovanja vzorcev (npr. zaostanek v rasti, manjša končna masa).
Uporabili smo gojišče 2, ker je vsebovalo največ hranil, v posodicah 1.
Preglednica XII: Izračunane povprečne mase bub, m1=masa posode z gojiščem in razvitimi bubami, m2=masa
posode z gojiščem po odstranitvi razvitih bub, m3=stehtana masa razvitih bub
Preizkusili smo dve možnosti določanja mase bub. V prvi smo jo izračunali iz razlike mas
posodic pred in po odstranitvi bub iz posode (stolpec (m1- m2)), v drugi pa smo odčitali
maso prenesenih bub v starirane posode (m3). Oba rezultata smo delili s številom bub in
dobili povprečne mase ene bube. Mase se med seboj preveč razlikujejo, da bi na osnovi
razlik lahko sklepali na vpliv na razvoj.
Opazili smo, da se gojišča hitro sušijo in strdijo, kar bi lahko negativno vplivalo na razvoj
larv, saj so le-te ponavadi v sočnem sadju, dokler se ne zabubijo. Kot prvi ukrep smo v
51
mase v mgparalela
m1 m2 (m1- m2) m3 št. bub masa 1 bube
iz (m1- m2)
masa 1 bube
iz m3
1 4955 4940 15,0 10,0 8 1,9 1,32 4837 4828 9,0 7,0 5 1,8 1,43 4867 4853 13,0 9,0 6 2,2 1,54 4901 4886 16,0 9,0 7 2,3 1,35 4893 4880 16,0 9,0 6 2,7 1,5skupno / / 67,0 44,0 32 2,1 1,4
Lara Kandić: diplomska naloga IV Rezultati
inkubator namestili petrijevko, v katero smo dolivali vodo, in povečali vlažnost zraka.
Drugi ukrep je bil optimizacija razmerja (površina izhlapevanja)/(volumen gojišča) in s tem
zmanjšanje površine, s katere lahko voda izhalepeva iz gojišča ter sprememba načina
zapiranja posodice.
Preglednica XIII: Rezultati izbire vrste posode in načina zapiranja za izvedbo testiranj, natančneje razloženo v
besedilu
količina gojišča 2,posodica,zapiranje
1 ml, posodica 1, vata
1 ml,posodica 1, zamašek
2 ml,posodica 1, vata
2 ml, posodica 1, zamašek
1 ml, posodica 2, vata
št. preživelih mušic ± VR
7,2 ±1,0 7,4 ±1,0 7,4 ± 0,5 7,4 ± 1,0 8,4 ± 0,5
V ožji posodici se je gojišče najmanj izsušilo. Ne le, da je dozorelo 14% več jajčec kot v
širših posodicah, tudi variacijski razmik je manjši. Zato smo v nadaljnjih poskusih uporabili
te posodice in jih zapirali z navlaženo vato.
2Priprava liofiliziranih ekstraktov izbranih gliv
Z našim naborom gob smo želeli pokriti čim širši spekter predstavnikov različnih družin iz
vseh treh podrazredov podstavkovnic. Nekatere med njimi so dostopne v manjši količini,
kar posledično pomeni manj ekstrakta, zato smo testiranja izvedli v večih serijah z različno
vsebnostjo liofiliziranega ekstrakta (III.3.4.2).
Zanimale so nas vodotopne makromolekularne substance vključno s proteini, ne pa
sekundarni metaboliti. Vodni ekstrakt smo dializirali v dializni cevi z velikostjo por, ki
zadržijo molekule do 3,5 kDa. Tako smo odstranili manjše molekule, soli, sekundarne
metabolite in manjše peptide, ostali pa so vodotopni polisaharidi in proteini.
Do razlik v začetnih volumnih je prišlo zaradi različne količine dostopnega glivnega
materiala, ki je vseboval tudi različno količino vode, odvisno tako od vrste kot mikro in
makrookolja. Po dializi se je volumen ekstrakta povečal za 15 do 40%, saj skozi dializno
cev potuje voda v obe smeri. To povečanje volumna ni vplivalo na končno količino
liofilizata, je le podaljšalo čas sušenja. Različne mase liofilizatov kljub enakemu začetnemu
volumnu ekstrakta kažejo na različno vsebnost suhe snovi v ekstraktu.Preglednica XIV: Dobljene mase po liofilizaciji dializiranih ekstraktov gob
52
Lara Kandić: diplomska naloga IV Rezultati
Vzorec (slovensko ime) Začetni volumen Volumen po dializi Masa po liofilizaciji travniški kukmak 100 ml 133 ml 0,42 gorjaški dežnik 100 ml 135 ml 0,77 gleponogi goban 110 ml 154 ml 0,77 govčarska lupljivka 150 ml 190 ml 0,38 gvišnjeva koprenka 100 ml 135 ml 0,95 gkolobarniška koprenka 100 ml 138 ml 0,70 gkorenasta medlenka 100 ml 145 ml 1,03 gredkvičasta medlenka 150 ml 185 ml 1,42 gužitna sirovka 100 ml 130 ml 0,53 gkocasta mlečnica 100 ml 125 ml 0,99 gpoprova mlečnica 85 ml 115 ml 0,73 gjamičasta mlečnica 150 ml 206 ml 1,38 gčrnjava golobica 67 ml 77 ml 0,25 ghojeva polževka 40 ml 68 ml 0,23 gsivorumena mraznica 150 ml 195 ml 0,81 gpozna livka 86 ml 142 ml 1,29 gmeglenka 100 ml 137 ml 0,42 gvijoličasta kolesnica 150 ml 185 ml 0,93 gkrastačja kolobarnica 61 ml 102 ml 0,40 glepa griva 150 ml 195 ml 1,44 grjavi ježevec 100 ml 155 ml 1,33 gresasta zvezdica 53 ml 76 ml 0,13 gbetičasta prašnica 77 ml 103 ml 0,37 g
53
Lara Kandić: diplomska naloga IV Rezultati
3Izolacija lektinov
Izolacija in čiščenje lektinov iz ekstrakta meglenke
Lektine smo glede na specifičnost vezave štirih različnih saharidov (disaharidov laktoze in
glukoze ter monosaharidov, galaktoze in glukoze) izolirali iz ekstrakta meglenke po
postopkih, opisanih v III.3.3.1-3.3.7.
1 l ekstrakta smo dodali 14,6 g EDTA in spirali s pufrom za afinitetno 1, eluirali pa z
0,02 M NaOH. Postopek smo večkrat ponovili in dobili ponovljive rezultate. Elucijske
vrhove smo ločeno koncentrirali in identificirali s pomočjo Phast SDS-PAGE. Lektine smo
poimenovali glede na specifičnost na saharid in na njihovo navidezno molekulsko maso in
jih uporabili v poskusih, opisanih v točki III.3.4.4.
V primeru laktozil specifičnih lektinov se je po SDS-PAGE izkazalo, da je v prvem vrhu
prisotna lisa z ocenjeno velikostjo 19 kDa (slika 6) v manjši koncentraciji, v drugem pa
smo identificirali tri lise z ocenjenimi velikostmi 19 kDa, 15 kDa in 14 kDa (slika 6).
Koncentrat prvega vrha je bil rjavkasto obarvan in moten, zato ga nismo uporabili v nadalje
obravnavali. Velikost in molsko maso smo ocenili glede na standarde (LMW).
↓
Afinitetna kromatografija laktozil specifičnih lektinov
↓ nanos NaOH ↓sprememba pH
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 5 10 15 20 25 30
epruveta
A28
0
06.09.06/pH 7 07.09.06/pH 7 12.09.06/pH 11
Graf 1: Elucija laktozil specifičnih lektinov po afinitetni kromatografiji; pH 7 = za ekstrakcijo soka uporabljena raztopina za ekstrakcijo 1, pH 11= za ekstrakcijo soka uporabljena raztopina za ekstrakcijo 2
54
Lara Kandić: diplomska naloga IV Rezultati
Lektini imajo v alkalnem mediju manjšo afiniteto do saharidov, zato smo se poslužili
alternativnega postopka priprave soka in zvišali pH raztopine za ekstrakcijo. Tako smo
poskusili izolirati večjo količino lektinov, ki v teh pogojih niso bili več vezani na glivne
saharide. Po nevtralizaciji z 1 M HCl smo vzorec nanesli na pripravljeno sefarozo,
obravnavali po opisanem postopku (III.3.3.3) in identificirali s SDS-PAGE (slika 7).
Na grafu 1 so prikazani elucijski vrhovi laktozil specifičnih lektinov iz soka meglenke,
pripravljenega z raztopino za ekstrakcijo 1 (pH 7) in 2 (pH 11).
1…LMW standard
2…prvi elucijski vrh
3…drugi elucijski vrh
1 2 3
Slika 6: Eluati laktozil specifičnih lektinov
iz laktozil afinitetne kroamtografije
1…LMW standard
2…laktozil specifični lektini
z raztopino za ekstrakcijo 1
(vrh 2 07.09.06/pH 7)
3… laktozil specifični lektini
z raztopino za ekstrakcijo 2
(vrh 2 12.09.06/pH 11)
1 2 3
Slika 7: Eluati laktozil specifičnih lektinov po afinitetni
kromatografiji iz soka, pridobljenega različnimi
ekstrakcijskimi raztopinami
Nekateri lektini za vezavo potrebujejo kofaktorje – ione kalcija, magnezija ali mangana.
Da bi preverili, ali to velja za naše lektine, smo v vzorec dodali EDTA in kelirali prisotne
dvovalentne ione. Izvedli smo afinitetno kromatografijo z laktozil sefarozo s pufrom 1. Kot
protiutež smo drugemu vzorcu dodali CaCl2 in MgCl2, in ga obravnavali enako s pufrom 2.
Lektinom smo po koncentriranju ocenili koncentracijo z A280 in jih identificirali z SDS-
PAGE. Ker se lise na elektroforeznem gelu med seboj niso razlikovale glede na prisotnost
oz. odsotnost ionov, smo sklepali, da laktozil specifični lektini, izolirani iz ekstrakta
meglenke, ne potrebujejo kovinskih kofaktorjev (slika 8).
55
Lara Kandić: diplomska naloga IV Rezultati
1… laktozil specifični lektini z EDTA
2… laktozil specifični lektini s CaCl2 in MgCl2
3….LMW standard
1 2 3
Slika 8: Vpliv prisotnosti Ca2+ in Mg2+ ionov na afiniteto laktozil specifičnih lektinov
Za izolacijo lektinov, specifičnih za galaktozo, saharozo in glukozo, smo uporabili sok,
pripravljen z raztopino za ekstrakcijo 2. Skoncetrirane elucijske vrhove smo identificirali s
SDS-PAGE in lektine poimenovali glede na specifičnost na saharid in njihovo navidezno
velikost glede na LMW standard.
Afinitetna kromatografija - lektini (preostali 3)
↓ nanos NaOH ↓ sprememba pH
0
100
200
300
400
500
600
0 5 10 15 20 25 30 35
epruveta
A28
0
galaktozil saharozil glukozil
Graf 2: Elucija galaktozil, saharozil in glukozil specifičnih lektinov po afinitetni kromatografiji
56
Lara Kandić: diplomska naloga IV Rezultati
1… LMW standard
2… galaktozil specifični lektini
3… laktozil specifični lektin
4… glukozil specifični lektin
5… saharozil specifični lektini
1 2 3 4 5
Slika 9: Izolirani lektini iz ekstratka meglenke
Po afinitetni kromatografiji s saharozil in glukozil substituirano sefarozo smo dobili dva
čista lektina: glukozil specifičen z velikostjo 31 kDa in saharozil specifičen 23 kDa. Pri
drugih dveh sefarozah smo iz ekstrakta meglenke izolirali mešanico treh lektinov: tri
laktozil specifične lektine (14 kDa, 15 kDa in 19 kDa) in tri galaktozil specifične lektine z
velikostimi 14 kDa, 15 kDa in 18 kDa (slika 9). Že pri izvedbi afinitetne kromatografije se
je pri eluciji laktozil lektinov iz mešanice delno ločil lektin z ocenjeno maso 19kDa (graf 1,
slika 6). Iz mešanice smo ga želeli vsaj delno očistiti in ločeno izmeriti njegovo
insekticidno delovanje na našem modelu. Kot možni metodi smo izbrali gelsko filtracijo in
reverznofazno HPLC.
Gelska filtracija
Vzorec laktozil lektinov smo poskušali ločiti po molekulski masi s pomočjo gelske
filtracije. Lovili smo frakcije po 10 ml, dobljene proteinske vrhove, ugotovljene z
merjenjem A280, smo skoncentrirali in identificirali z SDS-PAGE. Iz dobljenih rezultatov je
vidno, da je bila delna ločba uspešna.
57
Lara Kandić: diplomska naloga IV Rezultati
laktozil lektini gelska
0
100
200
300
400
500
600
700
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
epruveta
abso
rban
ca
laktozil lektini
Graf 4: Laktozil lektini po gelski filtraciji
1…začetni vzorec laktozil specifičnih lektinov za gelsko kromatografijo
2…delno očiščen laktozil specifičen lektin 19 kDa (prvi vrh), graf 4
3…vsi trije laktozil specifični lektini (drugi vrh), graf 4
4….LMW standard
1 2 3 4
Slika 10: Laktozil specifični lektini po gelski filtraciji
RP-HPLC
Želeli smo popolnoma ločiti laktozil lektin 19 kDa od drugih dveh (14 kDa in 15 kDa).
Najprej smo morali ugotoviti ali se posamezni lektini med seboj ločijo v gradientu mobilnih
faz (A= 0,1% TFA in B= 90% ACN v 0,1% TFA) od 0% → 100% mobilne faze B in
kakšen retencijski čas imajo oz kolikšen je delež mobilne faze B v gradientu. Za to smo
uporabili preliminarni program (točka III.3.4.2), ki je trajal tprelim=23 min in dobili
58
Lara Kandić: diplomska naloga IV Rezultati
retencijska časa t1= 9,77 min in t2=9,88 min. Vrhova se nista ločila, zato nismo naredili
elektroforeze.
Graf 5: Preliminarna ločba laktozil specifičnih lektinov na RP-HPLC
Lektinska vrhova smo dobili pri približno 52% mobilne faze B, zato smo ustrezno
prilagodili nov gradientni program (točka III.3.4.2), ki je trajal tlektini=49 min. Nova
retencijska časa sta znašala t1= 15,43 min in t2=16,76 min. Vrhove smo ločeno zbirali, nato
pa sušili pod znižanim pritiskom v sistemu SpeedVac. Proteine smo nato raztopili v pufru
za afinitetno 1 ter identificirali z pomočjo SDS-PAGE.
Graf 6: Ločba laktozil specifičnih lektinov na RP-HPLC
59
Lara Kandić: diplomska naloga IV Rezultati
1…LMW standard
2…19kDa
3…14 kDa in 15 kDa, ostanki 19 kDa
1 2 3
Slika 11: Ločba laktozil specifičnih lektinov na RP-HPLC
Določitev koncentracije izoliranih lektinov
Izoliranim lektinom v raztopini smo ocenili koncentracijo z merjenjem A280. Oborjene snovi
smo iz vzorca odstranili s centrifugiranjem. V supernanatnu so lahko ostali manjši koloidni
delci, na katerih se svetloba nespecifično sipa. Za natančnejšo določitev koncentracije smo
se odločali med kvntitativnim merjenjem po Bradfordu (BioRad) in med merjenjem
absorbance med 340 in 240 nm. Skupni rezultati so podani v preglednici XV.
Kvantitativno merjenje koncentracije po Bradfordu
Na IJS se za kvantitativno merjenje koncentracije po Bradfordu uporablja metoda BioRad
Protein Assay (opisano v III.3.3.5.2)
Pri pripravi vzorcev z destilirano vodo smo dobili ustrezno umeritveno krivuljo, izračunane
koncentracije proteinov v vzorcu pa so bile nizke (preglednica XVI), kar se ni ujemalo z
rezultati, vidnimi na elektroforeznem gelu.
Pri meritvi s pufrom za nevtralizacijo TRIS/HCl pH 6,5 nismo uspeli dobili niti umeritvene
krivulje, iz česa smo sklepali, da reagent ni kompatibilen s pufrom TRIS/HCl pH 6,5.
S PBS smo dobili ustrezno umeritveno krivuljo. Izračunane koncentracije proteinov v
vzorcih so bile nizke oz pod mejo detekcije.
60
Lara Kandić: diplomska naloga IV Rezultati
Merjenje absorbance med 340 in 240 nm
S to metodo ocenimo absorbanco ozadja, ki jo odštejemo vrednosti A280. Pri valovni
280 nm dolžini absorbirajo tudi druge aromatske snovi in drugi proteini, katerih
koncentracija je pod mejo detekcije na SDS-PAGE gelu, vendar smo večino odstranili med
dializo in ultrafiltracijo.
Primer A340-A240: laktozil lektini, izračun koncentracije (faktor redčenja = 10)
y= - 0,0003×280 +0,1451=0,0611
A280=0,4917 - 0,0611= 0,4306
c340-240=4,306 mg/ml
laktozil lektini
0,491744
= 0,0611y = -0,0003x + 0,1451
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
230 280 330
Graf 3: Laktozil specifični lektini (A340-A240)
Preglednica XV: Primerjava koncentracij lektinov v vzorcih po treh metodah, natančneje razloženo v besedilu
Pri izračunu potrebnih volumnov raztopin lektinov za dosego teoretične koncentracije v
vzorcu smo upoštevali rezultate merjenja absorbance A340-A240.
61
v mg/ml laktozil galaktozil saharozil glukozil laktozil 19c280 4,930 4,160 1,314 1,467 1,252cBioRad z dH2O 0,278 0,2915 0,065 0,187 0,035cBioRad s PBS 0,194 0,480 pod mejo
detekcijepod mejo detekcije
pod mejo detekcije
c340-240 4,306 3,751 1,098 1,205 1,127
Lara Kandić: diplomska naloga IV Rezultati
4Testiranje liofiliziranih ekstraktov
Iz ekstraktov smo z dializo odstranili molekule, manjše od 3,5 kDa, in tem zožili nabor
potencialnih učinkovin na pretežno proteine in polisaharide. V tej stopnji nismo preverjali
količino proteinov v suhem ekstraktu. V prvi seriji smo pripravili 6% gojišče, za kar smo
potrebovali 360 mg liofiliziranega ekstrakta. V kolikor bi se ekstrakt pokazal kot učinkovit,
bi ga uvrstili v drugo serijo (2% oziroma 120 mg) in nato še v tretjo (od 2% - 0,125%
oziroma 240 mg zaradi postopka priprave gojišča, točka III.3.4.2). Da bi zagotovili
možnosti izvedbe vseh treh serij je bil kriterij za uvrstitev v prvo serijo vsaj 720 mg
liofilizata.
Preglednica XVI: Učinkovitost liofiliziatov dializiranih ekstraktov gob v 1. in v 2. seriji; rezultati podani kot
št. preživelih mušic ± VR in kot RS, enačbi 2 in 3 ► = nadanjevanje testiranja v naslednjo serijo, ◙ = konec
testiranja
Vzorec (slovensko ime) mliofilizata 1. serija RS 2. serija RSkontrola 1 / 7,2±0,5 / 8,2±0,5 /kontrola 2 – albumin / 7,4±0,5 / 8,4±1,0 /travniški kukmak 0,42 g / 6,4±1,5 0,23 ◙orjaški dežnik 0,77 g 0 1 ► 1,2±1,0 0,86 ◙leponogi goban 0,77 g 0,2 ± 0,5 0,97 ► 0 1 ►ovčarska lupljivka 0,38 g / / 8,8±1,0 0 ◙višnjeva koprenka 0,95 g 5 ± 1,0 0,32 ◙ / /kolobarniška koprenka 0,70 g / / 6,6±1,5 0,20 ◙korenasta medlenka 1,03 g 0 1 ► 0,8±0,5 0,90 ►redkvičasta medlenka 1,42 g 0 1 ► 4,8±1,0 0,42 ◙užitna sirovka 0,53 g / / 8,0±1,0 0,04 ◙kocasta mlečnica 0,99 g 2,4 ±1,0 0,68 ◙ / /poprova mlečnica 0,73 g / / 0 1 ►jamičasta mlečnica 1,38 g 5,4 ±1,5 0,27 ◙ / /črnjava golobica 0,25 g / / 6,8±1,5 0,18 ◙hojeva polževka 0,23 g / / 7,8±1,5 0,06 ◙sivorumena mraznica 0,81 g 1 ± 0,0 0,86 ► 5,6±1,0 0,33 ◙pozna livka 1,29 g 6,2 ± 1,5 0,16 ◙ / /meglenka 0,42 g / / 0 1 ►vijoličasta kolesnica 0,93 g 0 1 ► 0 1 ►krastačja kolobarnica 0,40 g / / 7,2±1,0 0,13 ◙lepa griva 1,44 g 0 1 ► 5,6±1,0 0,33 ◙rjavi ježevec 1,33 g 2,6 ± 1,5 0,65 ◙ / /resasta zvezdica 0,13 g / / 7,4±1,5 0,11 ◙betičasta prašnica 0,37 g / / 7,6±1,5 0,08 ◙
62
Lara Kandić: diplomska naloga IV Rezultati
Izmed 12 vrst, preskušanih v prvi seriji, smo v drugo uvrstili 7, ki so imele RS vsaj 0,85.
V tretjo serijo smo uvrstili najučinkovitejše gobe iz druge serije. Z nižanjem vsebnosti smo
opazovali padec učinkovitosti in z antilogaritmiranjem odčitane vrednosti pri RS=0,5
izračunali LD50. Najbolj toksična je bila meglenka, zato smo v nadaljevanju iz njenega
ekstrakta testirali posamezne izolirane proteine lektinske in inhibitorne narave.
Preglednica XVII: Učinkovitost liofilizatov dializiranih ekstraktov gob v 3. seriji testiranja, natančneje
razloženo v besedilu; rezultati podani kot št. preživelih mušic ± VR in kot RS, enačbi 2 in 3
vsebnost 2% (20 mg/ml)
1% (10 mg/ml)
0,5% (5 mg/ml)
0,25% (2,5 mg/ml)
0,125% (1,25 mg/ml)
izračunanavsebnost za LD50
leponogi goban
0 0 0 3,2 ± 1,0 4,6 ± 1,0 0,30%1 1 1 0,48 0,26
poprova mlečnica
0 0 0,2 ± 0,5 2,2 ± 0,5 4,4 ± 0,5 0,23%1 1 0,97 0,65 0,29
korenasta medlenka
1,0 ± 1,0 2,6 ± 1,50 4,4 ± 1,0 4,8 ± 1,0 4,6 ± 1,5 0,83%0,88 0,58 0,29 0,24 0,26
meglenka 0 0 0 1,4 ± 1,0 2,6 ± 1,5 0,1%1 1 1 0,77 0,58
vijoličasta kolesnica
0,0 ± 0,00 0,0 ± 0,00 2,8 ± 1,0 3,8 ± 1,0 4,0 ± 1,0 0,43%1 1 0,55 0,38 0,35
0,1
0,3
0,5
0,7
0,9
1,1
-0,4 -0,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1- log vsebnosti
RS
Leponogi goban Poprova mlečnica Korenasta medlenkaMeglenka Vijoličasta kolesnica
Graf 7: Insekticidni učinek v odvisnosti od vsebnosti liofilizata v gojišču
63
Lara Kandić: diplomska naloga IV Rezultati
5Presejalno testiranje inhibitorjev in laktozil specifičnih lektinov
Vse raztopine proteinov so bile bistre, zato smo koncentracijo ocenili spektrofotometrično
pri λ= 280 nm in izračunali potreben volumen raztopin vzorcev. Pripravili smo gojišča s
končna koncetracija dodanih proteinov 0,5 mg/ml po postopku opisnem v (III. 2. 1. 5.).
Imeli smo dve kontroli: gojišče brez dodatkov in gojišče z 0,5 mg/ml BSA.
Preglednica XVIII: Presejalno testiranje proteaznih inhibitorjev in laktozil specifičnih lektinov, rezultati
podani kot št. preživelih mušic ± VR ter RS, enačbi 2 in 3
Vir Ime/tip št. preživelih RSbučka CMTI /serinski 8,0 ± 0,0 0 krompir PSPI/ serinski 4,2 ± 0,5 0,45krompir PI-2/ serinski 0 1krompir PCPI/cisteinski 7,2 ± 1,0 0,05meglenka CNSPI/serinski 3,2 ± 1,0 0,58meglenka klitocipin/cisteinski 7,2 ± 1,5 0,05meglenka laktozil specifični lektini 0 1kontrola BSA / 7,8 ± 0,5 /kontrola / 7,6 ± 0,5 /Najbolj toksična v koncentraciji 0,5 mg proteinov na 1 ml gojišča sta bila PI-2 in laktozil
specifični lektini.
1…LMW standardi
2…CMTI, 7,5 kDa
3…PSPI, 22 kDa
4…PI-2, 18 kDa
5…PCPI, 23 kDa
6…CnSPI, 22 kDa
7…klitocipin, 16 kDa
1 2 3 4 5 6 7
Slika 12: Proteinski inhibitorji proteaz, uporabljeni v presejalnem testiranju
64
Lara Kandić: diplomska naloga IV Rezultati
6Testiranje očiščenih lektinov
Za testiranje lektinov smo uporabili dve gojišči (III.3.1.6 in 3.1.7), da bi preverili vpliv
dostopnih hranil in komplementarnih sladkorjev. LD50 smo izračinali z antilogaritmiranjem
iz grafa odčitane vrednosti za relativno smrtnost 0,5.
Preglednica XIX: Učinkovitost insekticidnega delovanja lektinov v gojišču 6; rezultati podani kot št.
preživelih mušic ± VR ter RS, enačbi 2 in 3, C=koncentracija, razloženo v besedilu
laktozil (vsi) galaktozil saharozil glukozil laktozil 19C1 1,2±1,5 2,4±1,5 0 4,8±1,5 0
0,76 0,52 1 0,04 1
C2 2,8±1 3,6±1,5 0 5,2±1 1,8±10,44 0,28 1 0 0,64
C3 4,8±1 4,2±1 1±1 5,2±0,5 3,8±1,50,04 0,16 0,8 0 0,24
C4 4,8±0,5 4±1 2,6±1 5±1 4±10,04 0,2 0,32 0 0,2
C5 5±1 4,4±0,5 3,6±0,5 5±1 4±10 0,12 0,28 0 0,2
C2+ 1,6±1,5 3,4±1 0±0,0 4,8±0,5 1,4±0,50,68 0,32 1 0,04 0,72
C4+ 1,2±1 3,6±1 3,8±1 4,8±1 1±10,76 0,28 0,24 0,04 0,80
izračunan LD50 76 μg/ml 182 μg/ml 10 μg/ml / 44 μg/mllaktoza galaktoza saharoza glukoza brez
Kontrola 1,2±1,5 3,6±1,5 4,6±0,5 4,8±1,5 5±2
Pri testiranju insekticidnega učinka letkinov v gojišču 6 je bil najbolj toskičen saharozil
specifičen lektin (izračunan LD50=10 μg/ml), nato očiščen laktozil specifičen lektin 19 kDa
(izračunan LD50=44 μg/ml).
65
Lara Kandić: diplomska naloga IV Rezultati
lektini gojišče 6
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
-2,3 -1,8 -1,3 -0,8 -0,3 - log vsebnosti
RS
Lakt vsi
Galakt
Saharo
Gluko
Lakt 19
Graf 8: Učinkovitost insekticidnega delovanja lektinov v gojišču 6
Preglednica XX: Učinkovitost insekticidnega delovanja lektinov v gojišču 7; rezultati podani kot št. preživelih
mušic ± VR ter RS, enačbi 2 in 3, C=koncentracija, razloženo v besedilu
laktozil (vsi) galaktozil saharozil glukozil laktozil 19C1 4,0±1,5 3,0±1 5,4±1,5 6,2±1,5 0
0,43 0,58 0,23 0,12 1
C2 6,2±1,5 6,2±1,5 6,4±1 7,2±1 2,0±1,50,12 0,12 0,09 0 0,71
C3 7,0±1 6,8±1 6,4±1 6,8±1 5,0±10,0 0,03 0,09 0,03 0,26
C4 6,8±,5 6,8±1 6,8±,5 7,0±1 6,4±0,50,03 0,03 0,03 0,0 0,13
C5 7,0±1 7,0±1 7,2±0,5 6,8±,5 6,6±10,0 0,0 0,0 0,03 0,62
C2+ 6,6±1 6,4±0,5 6,8±1 7,0±1 4,2±1,50,06 0,09 0,03 0,0 0,4
C4+ 7,2±0,5 7,0±1 6,8±0,5 6,8±1 6,8±0,50,0 0,0 0,03 0,03 0,03
izračunan LD50 252 μg/ml 166 μg/ml 1000 μg/ml / 38 μg/mllaktoza galaktoza saharoza glukoza brez
Kontrola 7,0±1,5 6,8±1,5 7,0±1,0 7,0±1,0 6,8±0,5
66
Lara Kandić: diplomska naloga IV Rezultati
lektini gojišče 7
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
-2,3 -1,8 -1,3 -0,8 -0,3 - log vsebnosti
RS
Lakt vsi
Galakt
Saharo
Gluko
Lakt 19
Graf 9: Učinkovitost insekticidnega delovanja lektinov v gojišču 7
Gojišče 7 je vsebovalo več hranil (koruzno moko) kot gojišče 6. Tu se je opazno znižal
insektidicni učinek saharozil specifičnih lektinov (izračunan LD50=1000 μg/ml), medtem
ko je izračunan LD50 za laktozil specifičen lektin 19 kDa ostal skoraj enak (38 μg/ml).
V tem gojišču se je izgubil toksični učinek samih sladkorjev.
67
Lara Kandić: diplomska naloga V Razprava
RAZPRAVA
Populacija Zemlje se bliskovito povečuje, potrebe po donosnejših virih hrane, predvsem v
nerazvitem svetu, zahtevajo tudi učinkovitejšo in varnejšo zaščito, saj zavedanje o krhkosti
zdravja prehaja iz besed v dejanja. Danes se vsak uporabnik, ko stoji v trgovini pred polico
s pesticidi, vpraša, ali bo ta pesticid deloval samo na izbran ogranizem, kako bo to vplivalo
na druge in nenazadnje name. Iskanje sožitja in spoštovanje do narave ni le modna muha, je
edini način ponovne vzpostavitve ravnotežja in dolgoročnejšega preživetja mnogih vrst,
vključno z našo, na modrem planetu. Potrebno je ne samo prisluhniti ampak tudi odkriti,
razumeti in premišljeno uporabiti rešitve, ki nam jih ponuja narava.
Proteinski insekticidi imajo v spektru naravnih obrambnih substanc najnatančnejše tarčno
delovanje; naša naloga je odkriti na katere druge tarče poleg osnovne še lahko delujejo,
vgrajeni v transgeno rastlino, aplicirani v obliki aerosola. V obeh primerih je v testiranje
potrebno vključiti več modelnih organizmov. Nabor teh je odvisen od tarčnega organizma,
mehanizma delovanja, verig drugih organizmov, ki so v stiku ali s tarčnim ali z varovanim
organizmom. V presejalnih raziskavah se uporabljajo žuželke, katerih gojenje v
laboratorijih ni kompleksno, sicer pa tarčni škodljivci.
Mi smo z nižanjem vsebnosti liofiliziranih ekstraktov 23 vrst podstavkovnic v gojišču
našega modelnega insekta, vinske mušice, izbrali pet najbolj toksičnih. Tem smo poiskali
LD50 in iz ekstrakta najučinkovitejše, meglenke, testirali inhibitorja proteaz ter jih
primerjali z nekaterimi rastlinskimi. Prav tako smo iz gobe meglenke pripravili ekstrakte in
iz njih s pomočjo afinitetne kromatografije izolirali lektine, specifične za štiri različne
saharide. Tudi tem smo poiskali LD50.
7Optimizacija gojenja vinske mušice
Vinsko mušico gojijo v raziskovalne namene že dobro stoletje. Posamezne kulture divjega
tipa se med seboj razlikujejo celo na istem kontinentu po zemljepisnih širinah [44], prav
tako tudi njihove potrebe po hranilih. V splošnem se v agarozni gel vmeša sladkor, kvas in
konzervans, glede na potrebe kulture in potrebe raziskave pa še različno sadje, gobe, etanol,
koruzna ali sojina moka in razni ekstrakti. Težava je v nepoznavanju splošnih potreb
posameznega divjega tip vinske mušice, kot so minimalna sestava, konsistenca in količina
gojišča, izbira in manipulacija z jajčeci, saj se vinska mušica uporablja predvsem v
genetskih raziskavah (vplivi mutacij na razvoj, fiziologijo ipd). Začeli smo z izbiro gojišča.
68
Lara Kandić: diplomska naloga V Razprava
Gojišče 1 vsebuje malo hranil, je trše od ostalih, rahlo opalescentno in se ne uporablja v
namene vzreje vinske mušice, ampak kot podlaga, na katero mušice odložijo jajčeca.
Gojišče 2 uporabljajo na NIB-u kot hranilno gojišče za vzdrževanje laboratorijske kulture
vinske mušice, kot tudi drugje (Bloomington, Tuscon,…[34]), gojišče 3 pa so uporabili v
podobni raziskavi insekticidnega delovanja ekstraktov različnih gob [77]. Na prvem gojišču
se larve niso niti zabubile, na drugem, ki je vsebovalo več hranil, pa so rezultati bili boljši
(več preživelih, manjši variacijski razmik) kot na tretjem. Za testiranje liofiliziranih
ekstraktov smo uporabljali gojišče 2.
Opazili smo, da so se nekatera gojišča začela kmalu sušiti. V bolj posušenih gojiščih je
ostalo nekaj več bub, neizleženih v posušenem gojišču, kot v manj izsušenih. Domnevali
smo, da bi večja količina gojišča podaljšala čas izsušitve vzorca, saj je razmerje med
površino, s katere voda lahko izhlapeva, in volumnom ugodnejše. Preverili smo, ali bi z
navlaženo vato namesto luknjičastega zamaška zadržali več vlage v gojišču. S tem bi
ohranili gojišče mehkejše in bolj podobno naravnim pogojem. Zmanjšanje razmerja
površina/volumen je pozitivno vplivalo na število preživelih mušic. To razmerje je bilo
najugodnejše v posodicah 2 (2r=1 cm → površina=0,785 cm2) kot v posodicah 1
(2r=2,5 cm → površina=4,908 cm2), tudi če smo uporabili 2 ml gojišča. Uporaba enkrat
navlažene vate namesto zamaškov ni bistveno vplivala na število preživelih mušic, vendar
posodica 2 ni imela pripadajočega zamaška. Hkrati smo izkoristili možnost, da smo vato
navlažili prvi in tretji dan po nanosu jajčec in s tem dodatno ohranili višjo vlažnost.
S tehtanjem bub bi natančneje ovrednotili insekticidni učinek liofiliziranih ekstraktov in
proteinov (upočasnitev rasti, manjša končna masa). Opazili smo, da se izračunane
povprečne mase bub med seboj preveč razlikujejo, da bi na osnovi razlik lahko sklepali na
vpliv na razvoj. Težave smo imeli pri odstranjevanju in prenosu bub. Larve namreč izbirajo
bolj suha mesta, kjer se zabubijo. Ta so v poskusnih posodicah bila ali stene ali zamašek
posodice. Nekatere so se zabubile na robovih posodic in smo jih z odpiranjem poškodovali.
Prav tako je bilo možno, da smo med odstranjevanjem iz posodic ali med prenosom na
tehtnico strli lupinico in tu izgubili del mase vzorca. Tako bi izgubili tudi možnost
zanesljivega štetja preživelih mušic, saj smo dopustili možnost, da se insekticidni učinek
izrazi tudi v tej razvojni stopnji. Zato smo se morali zadovoljiti z vrednotenjem
učinkovitosti le z izračunom relativne smrtnosti.
Rezultati bi gotovo bili boljši, če bi izležena jajčeca prebirali, saj se pod mikroskopom vidi,
ali se v jajčecu razvija larva, ki jo je potrebno pazljivo prenesti na gojišče, da je ne
69
Lara Kandić: diplomska naloga V Razprava
poškodujemo; vendar je ta postopek časovno zamuden. Težavo bi predstavljala tudi
količina potrebnih jajčec, saj je za samo 5 vzorcev v 5 paralelah potrebnih 250 jajčec.
8Testiranje liofiliziranih ekstraktov gob
Gobe so bile nabrane v različnih letnih časih, kar je pomenilo poleg drugačnega
mikrookolja tudi različno količino padavin. Nekatere vrste že same po sebi ne vsebujejo
toliko tekočine v bazidiomu, tako da smo iz enakih zateht pridobili različne količine soka.
Tudi ta je vseboval različno količino ekstrahiranih suhih snovi, ki so se razlikovale tudi po
svoji tendenci po zadrževanju vode.
Pri pripravi liofilizatov so nekateri vzorci vsebovali higroskopne snovi, zaradi katerih so se
dalj časa sušili (kocasta mlečnica, redkvičasta medlenka). Nekateri posušeni ekstrakti so pri
pripravi disperzije bili viskoznejši, vendar brez oborine (korenasta medlenka). Izbrano
gojišče 2 smo vzdrževali na 50°C, ker smo pričakovali, da so naše potencialne insekticidne
učinkovine krajši čas, kolikor je potrebno, da raztopljen vzorec enakomerno zamešamo v
pripravljeno gojišče, dovolj stabilne. Na tej temperaturi je gojišče bilo še vedno dovolj
tekoče, da smo ga lahko odpipetirali v posodice, v katerih smo gojili vinske mušice.
Testirali smo 23 različnih vrst podstavkovnic in sicer začenši z 6% vsebnostjo liofilizata
(preglednice I; V, VI, VII). Podoben pregled insekticidnega učinka so preverili Mier in sod.
(1996) [92], s tem da so testirali nekoliko drugačen nabor posušenih uprašenih gobe. Mi
smo s pripravo ekstrakta izolirali le vodotopne snovi, z dializo pa smo iz njega izločili
substance manjše od 3,5 kDa . Zato rezultatov obeh raziskav ne moremo direktno
primerjati, našli pa smo enak trend pri gobah, ki so bile obdelane pri obeh: količina
posušenega materiala, potrebnega za dosego LD100 je pri meglenki najmanjša, nato ji sledi
vijoličasta kolesnica in zadnje redkvičasta medlenka. Izmed desetih gob, testiranih v obeh
raziskavah, smo v naši opazili insekticidno delovanje pri 6% vsebnosti še pri sivorumeni
mraznici (RS=0,86) in rjavem ježevcu (RS=0,65), vendar ga lahko pripišemo višji
koncentraciji insekticidnih vodotopnih substanc, ki smo jih dobili s postopkom priprave
liofilizata.
Wang in sod. (2002) [77] so testirali insekticidno delovanje vodnih ekstraktov štirinajsith
gob (dve skupni) in določevali LD50 supernatanta, prve oborine in oborine po treh izpiranjih
z destilirano vodo. V njihovih rezultatih je vilojičasta kolesnica bila nekoliko bolj toksična
v primerjavi z meglenko, pri nas pa ravno obratno, vendar bi to lahko pripisali vplivu
mikrookolja ali pa razliki v sestavi gojišča. V vseh primerih je supernatant v primerjavi s
70
Lara Kandić: diplomska naloga V Razprava
prvo oborino v povprečju nosil 85% insekticidnega učinka, kar kaže na vodotopnost
insekticidnih snovi.
Petim liofilizatom od štirinajstih, ki so pri 2% vsebnosti izkazali relativno smrtnost vsaj 0,9,
smo v tretji seriji določili LD50 (preglednica XVII). Mier in sod. [92] so pri ponovitvah
testiranj nekaterih uprašenih gob opazili variabilnost v insekticidnem delovanju tudi za
faktor 3 in več, zato smo v tretji seriji začeli z nižanjem vsebnosti ponovno pri 2%. Najbolj
toksičen je bil liofilizat meglenke oz. poprhnjene livke (preglednici XVI , XVII).
9Presejalno testiranje insekticidnega delovanja inhibitorjev proteaz in
laktozil specifičnih lektinov
Delež proteaz, ki organizmu zagotavljajo esencialne aminokisline, ni zanemarljiv. Rastline
so v obrambne namene razvile nemalo inhibitorjev plenilskih proteaz, izmed katerih smo
izbrali predstavnike inhibitorjev serinski in cisteinskih proteaz. Iz kraljestva gliv smo
skladno z rezultati testiranj liofoliziranih ekstraktov testirali še inhibitorje, izolirane iz
meglenke (preglednici VIII, XVIII).
Cisteinski inhibitorji (PCPI in klitocipin) so bili neučinkoviti, saj ima vinska mušica
pretežno serinske proteaze v svojem prebavnem traktu. Med serinskimi inhibitorji smo
preizkusili 4 različne, od teh je bil bučkin popolnoma neučinkovit, dva (CNSPI iz meglenke
in PSPI iz krompirja) sta v koncentraciji 0,5 mg/ml dosegla približno LD50. V tej
koncentraciji je serinski inhibitor iz krompirja, PI2 dosegel LD100. Iz tega lahko sklepamo,
da so za vinsko mušico (Diptera) bolj škodljivi inhibitroji serinskih proteaz, kar potrjuje
sestavo prebavnih proteaz, hkrati pa smo z različnim insekticidnim učinkom različnih tipov
serinskih inhibitorjev pokazali tudi na specifičnost delovanja proteinskih insekticidov.
PI2 so že testirali na transgeni rastlini iz reda Brassica na modelu Plutella xylostella
(Lepidoptera), kjer je sicer upočasnil rast, a so jo zeljni molji kompenzirali s povečano
konzumacijo, kar je rastlinam še bolj škodovalo. V kolikor sta bila v rastlino vnesena gena
za Bt toksin in PI2, je bil rezultat za rastlino še slabši [93].
V drugi raziskavi so gen za PI2 so vnesli v več vrst riža in po štirih generacijah izolirali
homozigote. V peti generaciji so ponovno testirali odpornost proti plenilskim insektom
(med njimi je najpomembnejši Sesamia inferens), kjer je bila toksičnost riža za škodljivce
celo višja [94].
71
Lara Kandić: diplomska naloga V Razprava
Proteinske inhibitorje proteaz so testirali na številnih žuželkah (redovi Coleoptera,
Lepidoptera, Hemiptera, Orthoptera in Diptera) na umetnih gojiščih, pri nekaterih
transgenih rastlinah pa so se že pred desetimi leti pojavile odporne kulture žuželk [46].
V presejalnem testiranju smo preskusili tudi delno očiščen laktozil lektin (slika 10). Po
učinkovitosti (LD100) se je kosal z najučinkovitejšim rastlinskim inhibitorjem serinskih
proteaz, PI2 iz krompirja.
10Testiranje insekticidnega delovanja različnih lektinov
V testiranju insekticidnega učinka liofiliziranih ekstraktov smo opazili, da se liofilizatom
niža učinkovitost v obliki sigmoidne krivulje v odvisnosti od logaritma vsebnosti. Zato smo
se odločiti v takšnih korakih preveriti insekticidni učinek izoliranih lektinov.
Prve lektine smo izolirali iz ekstrakta meglenke, ki smo ga za presejalno testiranje priravili
z raztopino za ekstrakcijo 1. Ekstrakt smo nanesli na laktozil substituirano sefarozo in jih
eluirali z dvigom pH na 12.
Z naalkaljenjem raztopine za ekstrakcijo smo želeli iz iste količine gobjega tkiva meglenk
sprostiti lektine, vezane na endogene polisaharide, saj ti niso pri tem pH vezani na
komplementarne sladkorje. Elucijski vrh 2 je bil nekoliko višji po nanosu tako
pripravljenega ekstrakta (graf 1, IV.3.3.1), na sliki 7 (IV.3.3.1) pa ni vidnih dodatnih lis pri
vzorcu 3, iz česa sklepamo, da se pri tem pH izolirajo isti lektini, le da v večji količini.
Ekstraktu smo v enem primeru dodali EDTA, v drugem pa dvovalentne ione, saj smo želeli
preveriti, ali naši lektini za vezavo potrebujejo kovinske kofaktorje. Na sliki 8 ne opazimo
nobenih razlik v lisah izoliranih lektinov, iz česa sklepamo, da le-ti ne potrebujejo
kovinskih kofaktorjev. Za metodo izolacije smo izbrali pripravo ekstrakta s pufrom za
ekstrakcijo 2 z dodatkom EDTA.
EDTA bi lahko keliral dvovalentne ione v gojišču ali v prebavilih vinske mušice, saj jih le-
ta potrebuje za sintezo encimov, vendar ga v našem vzorcu ni bilo oziroma je bil v
zanemarljivih koncetracijah, saj smo lektine eluirali z NaOH, eluat pa razsolili.
Delno očiščeni laktozil specifični lektini, testirani hkrati s proteaznimi inhibitorji, so
izkazali LD100 pri ocenjeni koncentraciji 0,5 mg/ml gojišča, kar jih uvrsti med
najučinkovitejše lektine, testirane na modelu vinske mušice. Zato smo pred testiranjem
učinkovitosti preostalih lektinov želeli kvantitaivno določiti koncentracijo lektinov v
72
Lara Kandić: diplomska naloga V Razprava
vzorcih. Z merjenjem A280 smo koncentracijo le ocenili, z metodo BioRad pa nismo dobili
ne ponovljivih ne pričakovanih rezultatov.
Težave bi lahko povzročal v vzorcu prisoten NaOH, s katerim smo lektine eluirali, zato
smo vzorec nevtralizirali z dvema raztopinama: pufrom za nevtralizacijo pH 6,5 in PBS
pH 6,8. V istih raztopinah smo redčili tudi BSA; prav tako smo jih uporabili tudi za slepi
vzorec. Tudi po tem rezultati niso bili zadovoljivi (preglednica XV, IV.3.4.2).
V proizvajalčevih navodilih [95] najdemo preglednico, v kateri se za nekatere proteine
koncentracije določene po Biorad metodi razlikujejo tudi za več kot 300% v primerjavi z
biuretsko metodo oziroma metodo po Lowry-ju. Nekateri proteini sami slabo vežejo barvo
(npr. želatina) in se jih ne more določati po tej metodi. Ne kot zadnje so bile možne tudi
napake pri redčenju vzorca in standarda, vendar smo meritve večkrat ponovili. Izračunane
koncentracije proteinov v nekaterih vzorcih so bile pod mejo detekcije na SDS-PAGE gelu,
barvanem s Coomassie Brilliant Blue barvilom, lise pa so bile na gelu dobro vidne. Za
barvanje SDS-PAGE gela smo uporabili isto barvilo, vendar je bilo za ta namen dodano v
krepko večji količini (gel barvamo v približno 10 ml raztopine barvila Commassie Brilliant
Blue). Za raziskovane lektine ne obstaja standard, s katerim bi eliminirali vsaj nekatere
naštetih težav.
Čeprav je sama metoda po zagotovilih proizvajalca primerljiva z metodo po Lowryju in
biuretsko metodo, nam ni dala ponovljivih rezultatov, niti so koncentracije bile v
pričakovanih razredih. Zato smo pri izračunavanju potrebnih volumnov raztopin lektinov za
pripravo gojišč (preglednica IX, III.3.4.4) upoštevali meritve A340 - 240.
Za izolacijo lektinov iz ekstrakta meglenke smo uporabili štiri različno substituirane
sefaroze za izvedbo afinitetne kromatografije. Z sefrozama, substiruiranima s saharozo in
glukozo, smo dobili po en lektin, laktozil in galaktozil specifični lektini so mešanica treh
proteinov (slika 9, IV.3.1). Čeprav sta dva, ki se pojavljata pri obeh saharidih, po velikost
navidez enaka, ne gre za nespecifično vezavo na sefarozo (ki vsebuje 4% agaroze), ker se
pojavljata le pri sefarozi, substituirani z laktozo oziroma galaktozo in ne pri glukozil ali
saharozil substituirani sefarozi. Za potrditev ali sta enaka ali različna, so potrebni dodatni
testi, med katerimi je najboljša določitev aminokislinkse sekvence in kristalne strukture.
V testiranju insekticidnega učinka lektinov smo uporabili dve različni gojišči, ki sta se v
grobem razlikovali po vsebnosti hranil - gojišče 7 je vsebovalo koruzno moko (III.3.3.1.6 in
73
Lara Kandić: diplomska naloga V Razprava
III.3.3.1.7). Insekticidni učinek pada z logaritmom vsebnosti pri obeh uporabljenih gojiščih,
kot vidimo v grafih 8 in 9 (IV.6), na osnovi katerih smo izračunali LD50.
Preglednica XXI: Primerjava izračunanih LD50 testiranih lektinov v gojiščih 6 in 7 v μg proteina na ml gojišča
laktozil galaktozil saharozil glukozil laktozil 19izračunan LD50, gojišče 6
76 μg/ml 182 μg/ml 10 μg/ml / 44 μg/ml
izračunan LD50, gojišče 7
252 μg/ml 166 μg/ml 1000 μg/ml / 38 μg/ml
faktor razlike 3,32 0,91 100 / 0,86Legenda:
laktozil…laktozil specifični lektini
galaktozil…galaktozil specifični lektini
saharozil…saharozil specifičen lektin
glukozil…glukozil specifičen lektin
laktozil (19)… laktozil specifičen lektin z velikostjo 19 kDa
Saharozil specifični lektini so bili v gojišču 6 najbolj toksični, vendar je ta učinek padel za
faktor 100 v gojišču 7, kar pripisujemo vsebnosti koruzne moke. Razliko smo opazili tudi
pri laktozil specifičnih lektinih, vendar gre tu za faktor 3,32. Za galaktozil specifične
lektine in laktozil specifičen lektin z velikostjo 19 kDa lahko trdimo, da se toksični učinek
ni spremenil.
Paquereau in sod. (2003) [86] so na modelu vinske mušice testirali tri lektine (XCL
-Xerocomus chrysenteron, LOL - Lathyrus ochrus in GNA - Galantus nivalis) na istem
modelu, na gojišču 3. LD50 nativnih lektinov so znašale XCL= 0,40 mg/ml, LOL= 8,5 mg/l
in GNA= 0,87 mg/ml. Rekombinantni XCL je bil za vinsko mušico imel
LD50=0,068 mg/ml. Za drugi testni model, Acyrthosiphon pisum (Hemiptera) se je
rekombinantni XCL izkazal za manj toksičnega kot nativni (rekombinantni
LD50=0,58 mg/ml, nativni LD50=0,23 mg/ml).
Če rezultate primerjamo z našimi, ugotovimo, da so štirje od petih testiranih lektinov
toksični v nižjih koncentracijah na primerjivem gojišču 6, ter trije od petih na gojišču 7
(preglednica XXI). Še več, za laktozil specifičen lektin 19 kDa je ta koncentracija 10 krat
nižja kot za XCL, ne glede na gojišče. Rezultati za rekombinantni XCL nam sugerirajo
testiranje vsaj rekombinantnega laktozil specifičnega lektina 19 kDa, če ne še ostalih,
vsekakor pa ločbo, identifikacijo in testiranje tudi galaktozil specifičnih lektinov in laktozil
specifičnih lektinov z velikostmi 14 kDa in 15 kDa.
74
Lara Kandić: diplomska naloga V Razprava
Gojiščem z dvema različnima vsebnostima lektinov smo dodali še njihove komplementarne
sladkorje, saj so Fournier in sod. [96] opazili, da se lektinu LOL (Lathyrus ochrus lectin),
specifičnem za glukozo, zniža insekticidni učine, če je gojišču dodana glukoza.
Z rezultati testiranj mešanic lektinov in njihovih komplementarnih sladkorjev težko z
gotovostjo trdimo, da se je toksični učinek zaradi zasedbe vezavnih mest lektinov zmanjšal,
razen na primeru saharozil specifičnih lektinov. Namreč ne poznamo konstant vezave
saharidov in lektinov, ki je za nesubstituirane saharide gotovo manjša kot za substituirane
saharide in oligosaharide. Poleg tega ne moremo oceniti ali je do razlik prišlo tudi zaradi
same toskičnosti saharida za modelni organizem (preglednica XXII). Podobno tega niso
mogli oceniti tudi Paquereau in sod. (2003) [86] za XCL, ki je tudi specifičen za laktozo.
Preglednica XXII: Primerjava vpliva vsebnosti različnih saharidov v gojiščih 6 in 7 na število preživelih
mušic; rezultati podani kot št. preživelih mušic ± VR, enačba 3
laktoza galaktoza saharoza glukoza brezKontrola gojišče 6
1,2±1,5 3,6±1,5 4,6±0,5 4,8±1,5 5±2
Kontrola gojišče 7
7,0±1,5 6,8±1,5 7,0±1,0 7,0±1,0 6,8±0,5
Hkrati smo s testiranjem na obeh gojiščih dokazali, da so izolirani lektini iz meglenke
učinkoviti tudi v pogojih, kjer je larvam na razpolago več hranil, v pogojih, ki so bolj
podobni pogojem v naravi in kjer celo ni izraženega toksičnega učinka dodanih saharidov
(preglednica XXII). S testiranjem glukozil specifičnih lektinov, čeprav niso pokazali
toksičnega učinka, smo dokazali, da v vzorcu prisotni ostanki soli uporabljenih pufrov
(NaOH, TRIS/HCl, EDTA) ne vplivajo negativno na razvoj vinske mušice, saj so bili
pridobljeni na enak način kot ostali, število preživelih mušic pa je enako kot v kontroli.
Iz meglenke smo izolirali lektine in inhibitor serinskih proteaz (CnSPI), oboji proteini pa so
v izvedenih testiranjeih insekticidnega delovanja bili učinkoviti. Vsekakor bi bilo smotrno
preveriti, ali imajo kombinacije lektini-CnSPI kumulativni ozirima sinergistični učinek, saj
izhajajo iz istega vira – meglenke. Prav tako bi lahko preizkusili delovanje kombinacije
lektini – PI-2. Za testiranje bi lahko uporabili vinsko mušico ali model iz katerega drugega
reda žuželk (npr. koloradski hrošč – Coleoptera).
75
Lara Kandić: diplomska naloga V Razprava
Mehanizem delovanja inhibitorjev proteaz je precej bolje raziskan kot mehanizem
delovanja lektinov. Tega najpogosteje razlagajo z vezavo na peritrofični matriks v lumnu
prebavil in z interakcijo z glikoproteini celičnih sten epitelija prebavil in vplivom na
absorbcijo hranil in/ali motnjami v delovanju teh celic [97, 98]. Možen je tudi sistemski
učinek, saj so lektine našli v hemolimfi v Malpighijevih tubulih in v maščobnih telescih v
nativni obliki [99]. Identifikacija vezavnega mesta in mehanizma delovanja lahko pretvori
tudi lektine brez insekticidnega učinka v pomembno komponento dostavnega sistema
kakšnga drugega toksina ali pa usmeri raziskave na druga področja uporabe.
Insekticidne lektine lahko apliciramo na rastlino v obliki aerosola, lahko jih vgradimo v
nefitotoksične vehikle in dosežemo sistemsko aplikacijo. Prav tako je genski zapis enega ali
večih lektinov možno vgraditi v ekspresijsko kaseto in z ustreznimi promotorskimi regijami
doseči sintezo lektinov ob napadu škodljivca.
Lektini imajo z zmožnostjo specifične vezave, v svoji stabilnosti na širšem območju pH,
temperaturni stabilnosti in odpornosti proti prebavnim proteazam nekaj prednosti pred
proteinskimi inhibitorji proteaz, vsekakor pa več področij in načinov uporabe. So naslednja
stopnička, ki lahko približa zaščito rastllin k naravi in uporabniku prijaznejšim končnim
izidom. Na gobjih proteinih je narejena le peščica raziskav, kažejo pa na nove razrede in
družine proteinov, ki mogoče skrivajo odgovore na marsikatera vprašanja s področij
fiziologije, patologije in ekologije.
76
Lara Kandić: diplomska naloga VI Sklepi
SKLEPI
Na podlagi zbranih podatkov lahko ugotovimo, da:
1. je za poskuse z vinsko mušico potrebna optimizacija eksperimentalnih pogojev gojenja
kljub stoletnim izkušnjam. Na slabšo viabilnost poleg manipulacije z jajčeci vpliva tudi
vlažnost gojišča in vsebnost hranil.
2. izmed 23 liofiliziranih ekstraktov različnih predstavnikov podstavkovnic, jih 6 (iz petih
različnih redov) na modelu vinske mušice doseže RS>0,85 pri vsebnosti 20 mg/ml
gojišča. Nobena izmed njih ni strupena za človeka, kvečjemu pogojno užitna ali
neužitna. Najbolj toksičen je bil ekstrakt meglenke (Clitocybe nebularis).
3. so za vinsko mušico, ki ima večino prebavnih proteaz serinskega katalitskega tipa,
inhibitorji serinskih proetaz pri vsebnosti 0,5 mg/ml dosegli različne insekticidne
učinke. CMTI ni toksičen, PSPI in CnSPI dosežeta približno RS=0,5, PI-2 pa RS=1,0.
Inhibitorji cisteinskih proteaz niso toksični za modelni insekt.
4. ekstrakt meglenke vsebuje več različno specifičnih lektinov. Izolirani so iz ekstrakta
meglenke pótem štirih afinitetnih kromatografij, gelske filtracije in RP-HPLC. Glukozil
in saharozil specifična lektina sta čista, galaktozil in laktozil specifični lektini pa sta
mešanici treh proteinov. Iz mešanice treh laktozil specifičnih lektinov se na RP-HPLC
loči lektin z velikostjo 19 kDa. Za vezavo ne potrebujejo dvovalentnih kovinskih
kofaktorjev.
5. so lektini dosegli RS=0,5 pri različnih vsebnostih v gojiščih. Glukozil specifični lektini
nimajo insekticidnega učinka. LD50 je bil najnižji za saharozil specifičen lektin v
gojišču z manj hranili (10 μg/ml), stokrat višji pa je bil v gojišču z več hranili. Prav tako
je insekticidni učinek inhibirala gojišču dodana saharoza. To ni veljalo za preostale
lektine, izmed katerih je bil najbolj toksičen laktozil specifičen lektin z velikostjo
19 kDa (LD50=44 μg/ml oz. 38 μg/ml).
77
Lara Kandić: diplomska naloga VII Literatura
Literatura1 http://en.wikipedia.org/wiki/Pesticide, 15.12.20062 http://www.ucmp.berkeley.edu/fungi/fungi.html, 1.12.063 Campbell N. A., Reece J. B.: Biology, sixth edition, 20024 http://www.tolweb.org/Fungi, 1.12.06 5 http://herbarium.usu.edu/fungi/FunFacts/factindx1.htm, 2.12.20066 http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Chytridiomycota, 2.12.20067 http://en.wikipedia.org/wiki/Chytrid, 2.12.20068 http://igitur-archive.library.uu.nl/dissertations/2005-0506-200043/c7.pdf, 3.12.200691 http://www.answers.com/topic/metarhizium-anisopliae, 2.12.200610 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=16506697&
dopt=Abstract, 1.12.200611 Vetter J.: Trypsin inhibitor activity of basidiomycetous mushrooms, European Food Research
and Technology 2000; Vol. 211 (5): 346-34812 Brzin J., Rogelj B., Popovič T., Štrukelj B., Ritonja A.: Clitocypin, a new type of cysteine
proteinase inhibitor from fruit bodies of mushroom Clitocybe nebularis, J Biol Chem 2000,
275: 20104-2010913 www.gobe.si, 21.11.200614 Laessqe T, Del Conte A.: Velika knjiga o gobah, DZS, Ljubljana, 199715 Sage H.J, Vazquez J.J.: Studies on a Hemagglutinin from the Mushroom Agaricus
Campestris, J. Biol Chem 1967, Vol. 242 (1): 123-125
http://www.jbc.org/cgi/reprint/242/1/120, 12.12.200616 Gray A. M., Flatt R.P.: Insulin-releasing and insulin-like activity of Agaricus campestris
(mushroom), Journal of Endocrinology 1998; 157 (1), 259–266
http://joe.endocrinology-journals.org/cgi/content/abstract/157/2/259, 12.12.200617 Jin-Woo Kim, Ick-Dong Yoo, Won-Gon Kim: Free Radical-Scavenging delta-Lactones from
Boletus calopus Planta Med. 2006; Vol. 72(15): 1431-1432.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=17091435&
dopt=Abstract, 12.12.200618 Ribeiro B, Rangel J, Valentao P, Baptista P, Seabra RM, Andrade PB.: Contents of carboxylic
acids and two phenolics and antioxidant activity of dried portuguese wild edible mushrooms ,
J Agric Food Chem. 2006; Vol. 54(22): 8530-8537
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=pubmed, 12.12.2006 19 Geraci C, Piattelli M, Tringali C, Verbist JF, Roussakis C.: Cytotoxic activity of
tetraprenylphenols related to suillin, an antitumor principle from Suillus granulatus, J Nat
Prod. 1992 (12):1772-5
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=pubmed, 12.12.200620 Fujimoto H, Takano Y, Yamazaki M.: Isolation, identification and pharmacological studies on
three toxic metabolites from a mushroom, Hebeloma spoliatum, Chem Pharm Bull (Tokyo).
1992, Vol. 40 (4): 869-72
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=1525943&d
opt=Abstract, 12.12.2006
78
Lara Kandić: diplomska naloga VII Literatura
21 Guillot J, Giollant M, Damez M, Dusser M.: Isolation and characterization of a lectin from the
mushroom, Lactarius deliciosus, J Biochem (Tokyo). 1991; Vol. 109 (6): 840-845;
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=pubmed, 13.12.200622 Giollant M, Guillot J, Damez M, Dusser M, Didier P, Didier E.: Characterization of a Lectin
from Lactarius deterrimus (Research on the Possible Involvement of the Fungal Lectin in
Recognition between Mushroom and Spruce during the Early Stages of Mycorrhizae
Formation). Plant Physiol. 1993; Vol. 101 (2): 513-522
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=pubmed 13.12.200623 Tanaka Y, Kawahara S, Eng AH, Takei A, Ohya N.: Structure of cis-polyisoprene from
Lactarius mushrooms. Acta Biochim Pol. 1994; Vol. 41 (3): 303-309
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=pubmed, 13.12.200624 Bosetti A., Fronza G., Vidari G., Vita-Finzi P.: Norlactarane and lactarane sesquiterpenes from
Lactarius scrobiculatus, Phytochemistry 1989, Vol 28 (5): 1427-1431 25 Lubken T, Schmidt J, Porzel A, Arnold N, Wessjohann L.: Hygrophorones A-G: fungicidal
cyclopentenones from Hygrophorus species (Basidiomycetes) Phytochemistry. 2004;
65(8):1061-71,
www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=15110686&dopt=
Abstract, 13.12.200626 Lee SY, Kim JS, Kim JE, Sapkota K, Shen MH, Kim S, Chun HS, Yoo JC, Choi HS, Kim MK,
Kim SJ.: Purification and characterization of fibrinolytic enzyme from cultured mycelia of
Armillaria mellea. Protein Expr Purif. 2005;43(1):10-7
www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=16005640&dopt=
Abstract, 13.12.200627 Dulger B. , Ergul C. C., Gucin F.: Antimicrobial activity of the macrofungus Lepista nuda
Fitoterapia 2002, Vol 73 (7): 695-697,
www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=12490232&dopt=
Abstract, 14.12.200628 Murcia MA, Martinez-Tome M, Jimenez AM, Vera AM, Honrubia M, Parras P.: Antioxidant
activity of edible fungi (truffles and mushrooms): losses during industrial processing. J Food
Prot. 2002; 65(10):1614-22.
www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=12380748&dopt=
Abstract, 14.12.200629 Mikiashvili N., Elisashvili V., Wasser S. P., Nevo E.: Comparative Study of Lectin Activity of
Higher Basidiomycetes. Int. J. Med. Mushr. 2006, Vol 8: 31-38, http://www.edata-
center.com/journals/708ae68d64b17c52,004dba6c170c81d1,5b86e0892f756e7b.html, 14.12.200630 Comandini O., Haug I, Rinaldi A.C., Kuyper T.W.: Uniting Tricholoma sulphureum and T.
bufonium. Mycol Res. 2004; Vol 08 (10):1162-71.
http://journals.cambridge.org/action/displayAbstract;jsessionid=436704A1601137CE854620E4808
4B748.tomcat1?fromPage=online&aid=249505, 14.12.200631 Lillian Barrosa L., Maria-João Ferreiraa M-J., Bruno Queirósa B., Ferreiraa I.C.F.R., Baptistaa P.:
Total phenols, ascorbic acid, β-carotene and lycopene in Portuguese wild edible mushrooms
79
Lara Kandić: diplomska naloga VII Literatura
and their antioxidant activities, Food Chemistry 2007; Vol 103 (2): 413-419 32 http://perso.orange.fr/champyves/champignons/fichier_htm/autres/Geastrum_rufescens.html,
7.12.200633 Horejsi V, Kocourek J.: Studies on lectins. XXXVI. Properties of some lectins prepared by
affinity chromatography on O-glycosyl polyacrylamide gels. Biochim Biophys Acta. 1978;
538(2): 299-15,
www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=563738&dopt=A
bstract, 14.12.200634 Tetry A, Sutton E, Moullec J.: Specific anti-A1 phytoagglutinin in fungus Clitocybe nebularis
(Fr.) Quelet. C R Hebd Seances Acad Sci. 1953; 237(23): 1566-1568,
www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=13127230&dopt=
Abstrac, 14.12.200635 Sabotic J, Trcek T, Popovic T, Brzin J.: Basidiomycetes harbour a hidden treasure of
proteolytic diversity. J Biotechnol. 2007, Vol 128(2): 297-30736 http://stockcenter.arl.arizona.edu/index.php?option=com_content&task=view&id=14&Itemid=28,
24.11.200637 http://en.wikipedia.org/wiki/Insect, 23.11.200638 http://www.gea-on.net/clanek.asp?ID=623 30.1.0739 Schneider D.: Using Drosophila as a model insect, Nature 2002, Vol 1: 218-22640 http://en.wikipedia.org/wiki/Drosophila_melanogaster, 23.11.200641 http://animaldiversity.ummz.umich.edu/site/accounts/information/Drosophila_melanogaster.html,
23.11.200642 http://www.anatomy.unimelb.edu.au/researchlabs/whitington/index.html, 23.11.200643 Bochdanovits Z, de Jong G.: Experimental evolution in Drosophila melanogaster: interaction of
temperature and food quality selection regimes. Functional Ecology 2004; Vol. 18, 952–954
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=14503624&
dopt=Abstract, 27.11.200644 Reaume C.J., Sokolowski M.B.: The nature of Drosophila melanogaster, Current Biology 2006,
Vol 16: R623-R628
http://www.current-biology.com/content/article/fulltext?uid=PIIS0960982206019099, 23.11.200645 http://www.calorie-count.com/calories/browse/0900.html, 27.11.200646 Jongsma M.A., Bolter C.: The adaptation of insect to plant protease inhibitors, J. Insect.
Physiol. 1997; Vol. 43: 885-89547 http://en.wikipedia.org/wiki/Insecticide, 12.11.200648 http://www.alanwood.net/pesticides/class_insecticides.html, 12.11.200649 http://www.epa.gov/pesticides/biopesticides/, 12.11.200650 http://www.nysaes.cornell.edu/ent/biocontrol/pathogens/bacteria.html, 12.11.200651 R. H. ffrench-Constant, D. J. Bowen.: Novel insecticidal toxins from nematode-symbiotic
bacteria, Cellular and Molecular Life Sciences 2000, Vol 57(5): 828-833
http://www.springerlink.com/content/9atur71aeyt10aun/, 12.11.200652 Carlini C.R., Grossi-de-Sa M.F.: Plant toxic proteins with insecticidal properties. A review on
their potentialities as bioinsecticides. Toxicon 2002; 40:1515-153953 Franco O. J., Rigden D. J., Melo F. R., Grossi-de-Sá M. F.: Plant α-amylase inhibitors and their
interaction with insect α-amylases, Eur. J. Biochem. 2002; 269 (2): 397–412
80
Lara Kandić: diplomska naloga VII Literatura
http://content.febsjournal.org/cgi/content/full/269/2/397, 14.1.200754 Rawlings, N.D., Morton, F.R. & Barrett, A.J. (2006) MEROPS: the peptidase database. Nucleic
Acids Res 34, D270-D272 http://merops.sanger.ac.uk/ januar.200755 http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/4/ 14.1.200756 http://www.expasy.org/ 14.1.200757 Ross J, Jiang H, Kanost MR, Wang Y.: Serine proteases and their homologs in the Drosophila
melanogaster genome: an initial analysis of sequence conservation and phylogenetic
relationships. Gene. 2003; Vol. 304: 117-131 58 Lawrence P.K., Koudal K.R.: Plant protease inhibitors in control of phytophagous insects,
Electronic Journal of Biotechnology 2002; Vol 5: 93-109
60 http://www.chem.purdue.edu/LASKOWSKI/#data 18.2.200761 Odani S., Tominaga K., Kondou S., Hori H., Koide T., Hara S., Isemura M., Tsunasawa S.: The
inhibitory properties and primary structure of a novel serine proteinase inhibitor from the
fruiting body of Basidiomycete, Lentinus edodes. Eur J Biochem. 1999; Vol. 262 (3): 915-923.62 Vasconcelos I.M., Oliviera J.T.A: Antinutritional properties of plant lectins, Toxicon 2004; Vol.
44 (4): 385-40363 Perillo N.L:, Marcus M.E., Baum L.G.: Galectins: versatle modulators of cell adhesion, cell
proliferation and cell death. J mol med 1998; Vol 76, (6): 402-412
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=pubmed, 12.1.200764 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=glyco 23.11.200665 http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Gs4_sugar_all.png, 12.1.200766 Kocbek P., Kristl J.: Ciljan vnos učinkovin z uporabo lektinov – korak naprej v razvoju
bioadhezivnih dostavnih sistemov, Farm Vestn 2006; Vol. 57: 162-16867 Zhao C., Sun H., Tong X., Qi-Jun Y.: An antitumour lectin from the edible mushroom
Agrocybe aegerita. Biochem J. 2003; vol. 374(Pt 2): 321–32768 Kosanovic MM, Jankovic MM.: Sialylation and fucosylation of cancer-associated prostate
specific antigen. J Buon. 2005; Vol. 10(2): 247-250
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?DB=pubmed, 14.1.200769 Ytting H., Christensen I.J., Thiel S., Jensenius J.C., Nielsen H.J.: Serum Mannan-Binding Lectin-
Associated Serine Protease 2 Levels in Colorectal Cancer: Relation to Recurrence and
Mortality. Clinical Cancer Research 2005, Vol. 11, 1441-1446
http://clincancerres.aacrjournals.org/cgi/content/full/11/4/1441, 8.1.200770 Ryder S.D., Smith J.A., Rhodes J.M.: Peanut Lectin: A Mitogen for Normal Human Colonic
Epithelium and Human HT29 Colorectal Cancer Cells. Journal of the National Cancer Institute
1992, Vol. 84, (18), 1410-1416
http://jnci.oxfordjournals.org/cgi/content/abstract/84/18/1410?ck=nck, 14.1.200771 Jordinson M., El-Hariry I., Calnan D., Calam J., Pignatellib M.: Vicia faba agglutinin, the lectin
present in broad beans, stimulates differentiation of undifferentiated colon cancer cells. Gut
1999; Vol.44: 709-714
http://gut.bmj.com/cgi/content/full/44/5/709, 14.1.200772 Fritz P, Dippon J, Kierschke T, Siegle I, Mohring A, Moisa A, Murdter TE.: Impact of mistletoe
lectin binding in breast cancer. Anticancer Res. 2004; Vol. 24(2C): 1187-1192
81
Lara Kandić: diplomska naloga VII Literatura
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=15154645&
dopt=Abstract, 14.1.200773 Wang J.H., Kong J., Li W., Molchanova V., Chikalovets I., Belogortseva N., Luk'yanov P., Zheng
Y.T.: A β-galactose-specific lectin isolated from the marine worm Chaetopterus variopedatus
possesses anti-HIV-1 activity. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 2006; Vol 142 (1-2):
111-117 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=pubmed, 14.1.200774 http://www.imperial.ac.uk/research/animallectins, 3.12.200675 http://www.ansci.cornell.edu/plants/toxicagents/lectins/lectins.html, 3.12.200676 Guillot J., Konska G.: Lectins in higher fungi, Biochem Syst Ecol. 1997; 25: 203-23077 Wang M., Triguéros V., Paquereau L., Chavant L., Didier Fournier D.: Proteins as Active
Compounds Involved in Insecticidal Activity of Mushroom Fruitbodies. J. of Econ. Entomol.
2002; Vol. 95(3): 603-60778 http://www.cermav.cnrs.fr/cgi-bin/lectines/list.pl, 3.12.200679 Ban M, Yoon HJ, Demirkan E, Utsumi S, Mikami B, Yagi F.: Structural basis of a fungal
galectin from Agrocybe cylindracea for recognizing sialoconjugate, J. Mol. Biol. 2005; Vol. 351
(4): 695-706 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=pubmed, 7.2.200780 Walser PJ, Haebel PW, Kunzler M, Sargent D, Kues U, Aebi M, Ban N.: Structure and functional
analysis of the fungal galectin CGL2. Structure. 2004; Vol. 12 (4): 689-702.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=pubmed, 27.1.200781 Paaventhan P, Joseph JS, Seow SV, Vaday S, Robinson H, Chua KY, Kolatkar PR.: A 1.7A
structure of Fve, a member of the new fungal immunomodulatory protein family, J. Mol.
Biol., 2003; Vol. 322 (2): 461-470, http://www.medscape.com/medline/abstract/12948495, 7.2.200782 Cioci G, Mitchell EP, Chazalet V, Debray H, Oscarson S, Lahmann M, Gautier C, Breton C, Perez
S, Imberty A.: Beta-propeller crystal structure of Psathyrella velutina lectin: an integrin-like
fungal protein interacting with monosaccharides and calcium. J. Mol. Biol. 2006; Vol. 357 (5):
1575-1591 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=pubmed 7.2.200783 Mancheno JM, Tateno H, Goldstein IJ, Martinez-Ripoll M, Hermoso JA.: Structural analysis of
the Laetiporus sulphureus hemolytic pore-forming lectin in complex with sugars, J. Biol.
Chem. 2005; Vol. 280 (17): 17251-17259
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=pubmed 7.2.200784 Birck C., Damian L., Marty-Detraves C., Lougarre A., Schulze-Briese, C., Koehl P., Fournier D.,
Paquereau L., Samama J-P.: A New Lectin Family with Structure Similarity to Actinoporins
Revealed by the Crystal Structure of Xerocomus chrysenteron Lectin XCL. J. Mol. Biol. 2004;
Vol. 344(5): 1409–1420
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=pubmed, 7.2.200785 Wimmerova M, Mitchell E, Sanchez JF, Gautier C, Imberty A.: Crystal structure of fungal lectin:
six-bladed beta-propeller fold and novel fucose recognition mode for Aleuria aurantia lectin.
J. Biol. Chem. 2003; Vol. 278, 27059-27067
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=pubmed 7.2.200786 Trigueros V., Lougarre A., Ali-Ahmed D., Rahb Y. Guillot J., Chavant L., Fournier D., Paquereau
l.: Xerocomus chrysenteron lectin: identification of a new pesticidal protein, Biochim Biophys
Acta., 2003; Vol. 1621(3): 292-298
82
Lara Kandić: diplomska naloga VII Literatura
87 Houston D.R., ShiomiK., Arai N., Mura Satoshi, Peter M.G., Turberg A., Synstad B., Eijsink
V.G.H., van Aalten D.M.F.: High-resolution structures of a chitinase complexed with natural
product cyclopentapeptide inhibitors: mimicry of carbohydrate substrate. Proc Natl Acad Sci
U S A. 2002, Vol.99(14): 9127-32 http://www.pnas.org/cgi/content/full/99/14/9127, 14.1.200788 Krishnamoorthi R., Gong Y.X., Richardson M.: A new protein inhibitor of trypsin and activated
Hageman factor from pumpkin (Cucurbita maxima) seeds. FEBS Lett. 1990; Vol. 273: 163-16789 Bryant J., Green T.R., Gurusaddaiah T., Ryan C.A.: Proteinase inhibitors II from potatoes:
isoaltion, and characterisation of its protomer components, Biochemistray 1976; Vol 15: 3418 -
342490 Brzin J., Meško P., Kregar I.: Potato tubers contain protein inhibitors of cysteine, serine and
aspartatic proteinases. Acta Pharmacologica 1995; Vol. 45: 181-18691 Brzin J., Popovič T., Drobnič-Košorok M., Kotnik M., Turk V.: Inhibitors of cysteine proteinases
from potato. Biological Chamitry Hoppe-Seyler 1988; Vol. 369 (suppl) 233-23892 Mier N, Canete S, Klaebe A, Chavant L, Fournier D.: Insecticidal properties of mushroom and
toadstool carpophores. Phytochemistry. 1996; Vol. 41 (5): 1293-129993 Winterer J, Bergelson J.: Diamondback moth compensatory consumption of protease inhibitor-
transformed plants. Mol Ecol. 2001; Vol. 10(4): 1069-1074
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?DB=pubmed 17.2.200794 Duan X, Li X, Xue Q, Abo-el-Saad M, Xu D, Wu R.: Transgenic rice plants harboring an
introduced potato proteinase inhibitor II gene are insect resistant. Nat Biotechnol. 1996; Vol.
14 (4): 494-498
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=pubmed , 17.2.200795 Instrictions for the BioRad Protein Assay, 1994 BioRad Laboratories,
tudi http://www.fhcrc.org/science/labs/hahn/met hods/biochem_meth/biorad_assay.pdf, 4.11.2006 95 V. Trigueros V., Wang M., Pere D., Paquereau L., Chavant L., Fournier D.: Modulation of a lectin
insecticidal activity by carbohydrates. Arch Insect Biochem Physiol. 2000; Vol. 45 (4): 175-179.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=11223937&
dopt=Abstract, 3.3.200797 Zhu-Salzman K, Shade RE, Koiwa H, Salzman RA, Narasimhan M, Bressan RA, Hasegawa PM,
Murdock LL.: Carbohydrate binding and resistance to proteolysis control insecticidal activity
of Griffonia simplicifolia lectin II. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998; Vol. 95 (25): 15123-15128.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=pubmed 3.3.200798B Gatehouse JA, M R Gatehouse A, Fitches E.: Effects of snowdrop lectin (GNA) delivered via
artificial diet and transgenic plants on the development of tomato moth (Lacanobia oleracea)
larvae in laboratory and glasshouse trials. J Insect Physiol. 1997; Vol. 43 (8): 727-739.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=pubmed 3.3.200799 Fitches E., Woodhouse S.D:, Edwards J.P.. Gatehouse J.A: In vitro and in vivo binding of
snowdrop (Galanthus nivalis agglutinin; GNA) and jackbean (Canavalia ensiformis; Con A)
lectins within tomato moth (Lacanobia oleracea) larvae; mechanisms of insecticidal action. J
Insect Physiol. 2001; Vol. 47 (7): 777-787.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=pubmed 3.3.2007
83
Lara Kandić: diplomska naloga VII Literatura
84
top related