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Universidade Estadual do CearáFaculdade de VeterináriaPrograma de Pós-Graduação em Ciências VeterináriasBiotécnicas Aplicadas à Reprodução de Fêmeas Caprinas e Ovinas
Transgênese e Clonagem
Vicente José de F. Freitas
Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução
www.uece.br/lfcr
Plano de Aula
• Apresentar conceitos.
• Discutir a transgênese e clonagem em pequenos ruminantes:• Princípios.
• Métodos.
• Apresentar novas técnicas.
• Considerações finais.
➢ Animais ou plantas
• Adição, troca ou inativação de um determinado gene.
• Maioria das vezes: OGMs são organismos transgênicos.
➢ Transgênese animal
➢ Possibilidades sem precedentes
➢ Limitações éticas e legais
• Legalização junto aos orgãos competentes
• Brasil CTNBio
• CQB (Certificado de Qualidade em Biossegurança)
Transgênese
Aplicações da transgênese
Salmão (Salmo salar) transgênico para GH:Precoce para abateAqua Bounty Technologies
➢Peixes transgênicos com fins comerciais
GloFish com fluorescência vermelha: PET nos EUA
Aplicações da transgênese
Camundongo transgênico para estudo de hipertrofia cardíaca (Dr. João Bosco Pesquero - UNIFESP).
➢Camundongos transgênicos como modelo de estudo defunções gênicas e doenças humanas
Aplicações da transgênese
➢Suínos transgênicos para produção de órgãos“humanizados” para uso em xenotransplantes.
Aplicações da transgênese
➢Caprinos transgênicos para produção de proteínasrecombinantes no leite.
Lizosima humana (Dr. James Murray - EUA).
Proteína da teia de aranha(Nexia Biotechnologies - Canadá)(Universidade de Wyoming - EUA).
Aplicações da transgênese
• 1º medicamento aprovado para uso humano a partir do leite deanimais transgênicos.
• Prevenção de eventos trombo-embólicos em cirurgias e no peripartode pacientes com deficiência hereditária de anti-trombina.
Anti-trombina III humana GTC Biotechnologies➔ rEVO
Por que a produção em animais?
Houdebine, 2008
Aspectos Bactéria Levedura Cél. de inseto + baculovirus
Cél. CHO
Plantas transgênicas
Animais transgênicos
Nível de Produção
++(+) ++(+) + + ++ ++++
Custo de Produção
+++++ +++++ ++ ++ +++++ ++++
Scaling up +++++ +++++ ++ + +++++ ++++
Processamento pós-traducional
+ ++ +++ ++++ +++ ++++
Glicosilação + ++ +++ ++++ ++ ++++
Propriedade Intelectual
++++ +++ +++ ++ +++ +++
Produtos no mercado
++++ +++ +++ +++++ + +++
Por que a produção em animais?
Houdebine, 2008
Fucose
Galactose
Ác. Siálico
Glic-Nac
Manose
Xilose
Bactérias
Insetos
PlantasMamíferos
Proteína
Qual espécie escolher?
• 1 L de leite/lactação
• 5 a 8 lactações/ano
• 1ª lactação: 6 meses
• 8.000 L de leite/lactação
• 1 lactação/ano
• 1ª lactação: 2,5 anos
• 800 L de leite/lactação
• 1 lactação/ano
• 1ª lactação: 1 ano
Transgênese na espécie caprina
➢Principais características:
• Boa aptidão leiteira
• Gestação: 5 meses
• prolificidade (cabritos/parto)
• custo de manutenção
• eficiência na microinjeção de DNA (x bovinos)
Métodos para obtenção
• Métodos clássicos:
• Microinjeção pró-nuclear
• Produção de zigotos (in vivo ou in vitro)
• Transferência nuclear de células somáticas (TNCS)
• Métodos alternativos:
• Vetores lentivirais
• Transferência de genes mediada por espermatozoides
• Sistema CRISPR-Cas9 (Repetições Palindrômicas Curtas
Agrupadas e Regularmente Interespaçadas)
Microinjeção pró-nuclear
Microinjeção daconstrução de DNA
Purificação
Fundadores
Leite
Rebanhotransgênico
Medicamento
Transferência para receptoras
Doadora de embrião pró-nuclear
Microinjeção de embriões prónucleares colhidos de cabras Canindé (a) ou Saanen (b).
Doadora de embrião pró-nuclear
Efeito da raça da doadora sobre a qualidade da microinjeção.
Doadora de embrião pró-nuclear
Diagnóstico de prenhez, sobrevivência embrionária e parto em receptoras deembriões colhidos de cabras Canindé e Saanen.
Estudos nos fundadores e geração F1
Estudos nos fundadores e geração F1
Dia -20 Dia 0
Dinâmica do hG-CSF no leite de cabra transgênica durante a lactação induzida.
Mean 690 μg/ml
Estudos nos fundadores e geração F1
Teste de formação de colônia de granulócitos. Controle negativo (leite de cabra nãotransgênica), o leite de cabra transgênica (contendo 50, 100 e 200 ng/ml de hG-CSF) e ocontrole positivo (hG-CSF recombinante; Filgrastim, 50 ng ml).
Estudos nos fundadores e geração F1
Prenhezes Descendentes Descendentes por sexo (%)a
Taxa de transgênicos(%)b
Total
M F M F
10M 7 11 6 (54,5) 5 (45,5) 3 (50,0) 3 (50,0) 6 (54,4)
12F 5 8 4 (50,0) 4 (50,0) 2 (66,7) 1 (33,3) 3 (37,5)
Total 12 19 10 (52,6) 9 (47,4) 5 (55,6) 4 (44,4) 9 (47,4)
Transmissão do transgene à descendencia das duas linhagens de caprinos transgênicos.
Transferência Nuclear de Células Somáticas
• Mesmo procedimento para obtenção da ovelha Dolly• Wilmut et al. (1997)
• Eficiência de 7,7%• Keefer et al. (2002)
Transferência Nuclear de Células Somáticas
Antitrombina(Baguisi et al. 1999)
Glucoceribrosidase(Bertolini et al. 2016)
α-lactalbumina (Feng et al. 2015)
Sistema CRISP/Cas9
• Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats• Repetições Palindromicas Curtas Agrupadas e Regularmente
Interespaçadas
• Mecanismo de defesa do sistema imune bacteriano contrafagos e plasmídeos invasores• Ishino et al. (1987)
• Como funciona em transgênese?• Técnica que possibilita cortar, através da nuclease Cas9, uma sequencia
de DNA específica, reconhecida por complementariedade com um RNAservindo de guia.
• Os mecanismos celulares de reparação do DNA permitem chegar àinativação de um gene alvo, a inserção de uma sequencia genética ou amodificação de uma sequencia existente.
Sistema CRISP/Cas9
Sistema CRISP/Cas9
Peptídeos de Penetração Celular (PPCs)
• Moléculas com capacidade de internalizar moléculasbiologicamente ativas em células eucarióticas• (Rádis-Baptista e Kerkis, 2011)
• Crotamina• Miotoxina isolada do veneno da cascavel (Crotalus durissus terrificus) da
América do Sul
Dr. Gandhi-Rádis BaptistaUniversidade Federal do Ceará
Peptídeos de Penetração Celular (PPCs)
• Crotamina:• Liga-se eletrostaticamente ao DNA, formando um complexo peptídeo-DNA e
realizando a entrega no interior das células
• Nascimento et al., 2007
Considerações
• A produção de proteínas recombinantes no leite depequenos ruminantes transgênicos está aos poucostornando-se uma realidade industrial.
• A dificuldade técnica e o custo da transgênese emanimais domésticos são as principais causas de sualentidão de aplicação prática.
• É necessário o desenvolvimento de métodos maiseficientes para melhorar o sucesso da técnica. Noentanto, o sistema CRISPR-Cas9 está facilitando esteprocesso.
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