transgĒnu dzĪvnieku iegŪŠana un izmantoŠana biotehnoloĢijĀ

TRANSGĒNU DZĪVNIEKU IEGŪŠANA UN IZMANTOŠANA

BIOTEHNOLOĢIJĀ

Transgēni, cilmes šūnas, nokauti un kloni

1.Agrīnā embrioģenēze un cilmes šūnas

2.Vienkāršie transgēni

3.Gēnu nokauti

4.Dzīvnieku kloni

5.Pieaugušās cilmes šūnas un audu inženierija

JAUTĀJUMI

Transgēnie dzīvnieki tiek iegūti, izmantojot trīs metodes:

1.Gēnu mikroinjekcija apaugļotas olšūnas pronukleusā,

2.embrionālo cilmes šūnu injekcija blastocistā,

3.apstrāde ar retrovīrusiem. http://www.ag.uiuc.edu/~vista/html_pubs/irspsm91/transfor.html

Transgēnu dzīvnieku iegūšana

Transgēnu dzīvnieku iegūšana

Transgēnu dzīvnieku iegūšana

Pirmo metodi plaši izmanto transgēnu peļu iegūšanai. Pēc mikroinjekcijas no peles izņem nesen apaugļotus vienšūnas embrijus. šim nolūkam izmanto mikromanipulatorus un īpaši aprīkotu mikroskopu. Ar speciālu pipeti un vakuma palīdzību embriju fiksē, un tās pronukleusā ar kapilāru adatu ievada klonējamo DNS. Pēc tam embrijus pārnes aizvietotājmātēs, kuras tos iznēsā. 1 – 4 % no injicētajiem embrijiem dod transgēnus pēcnācējus.

bartleby.com/

107/5.html

Olšūnas ietver apvalki: vitelīna membrāna (zona pellucida zīdītājdzīvnie-kiem) un folikulāro šūnu slānis (corona radiata zīdītājdzīvnie-kiem).

Zigotas veidošanās

Agrīnā embrioģenēze

Agrīnā embrioģenēze

Oocīts > Zigota > Blastomers/Pāršūnu stadijas > Morula > Blastocists > Gastrula > Embrijs

Transgēnu dzīvnieku iegūšana

Otrā metode. No blastocista (dažas dienas pēc apaugļošanas) iegūst embrionālās cilmes (EC) šūnas. Tās var audzēt neierobežoti ilgi laboratorijā un tās nezaudē spēju augt un diferencēties par jebkuru dzīvnieka audu tipu, veidot veselu jaunu dzīvnieku. EC šūnas in vitro transformē ar svešajiem gēniem un ar mikroinjekciju ievada citā blastocistā. Aizstājējmātes iznēsā dzīvniekus, kurus veido divu dažādu tpu šūnas, transgēnās un parastās. Ja transgēnās EC šūnas ir veidojušas dzīvnieku spermatozoīdu vai olšūnu priekštečus – šadu dzīvnieku pēcteči visi būs transgēni.

Transgēnu dzīvnieku iegūšana

Cilmes šūnas

Cilmes šūnas ir relatīvi vienkāršas šūnas, kuras spēj ātri augt, neierobežoti ilgi dalīties šūnu kultūrā un diferencēties par specializētām šūnām.

Izšķir:

embrionālās cilmes šūnas

pieaugušās (somātiskās) cilmes šūnas

Cilmes šūnu diferencēšanās potenciāls:

totipotentas (zigota);

pluripotentas; (embrionālās);

multipotentas (pieaugušās).

Embrionālās cilmes šūnas

Priekšrocības:

vieglāk izmantot; neierobežoti ilgi aug kultūrā; nerada imūno atbildi.

Trūkumi:

teratomas (?);ētiskas problēmas.

EC ŠŪNAS

EC ŠŪNAS

Transgēnu dzīvnieku iegūšana

ES ŠŪNAS

Trešā metode – ar retrovīrusu palīdzību

Vienkāršie transgēni

Nejauša integrācija

Tandemu un polimeru veidošanās

Regulēšanas problēmas

Apklusināšana / delēcijas / metilēšana

Vienkāršie transgēni

Transgēnu identificēšana un integrācijas vietas lokalizēšana:

fenotips

Southern analīze

PCR

FISH

Vienkāršie transgēni

Pārnesto gēnu regulēšanas problēmas:

inducējami promoteri

enhanseru lokalizācija

izolatoru -MAR domēnu loma

lokusa (pozīcijas) efekts

lokalizācijas sekvences

Transgēna ekspresiju kavē:

(1) cDNS, nevis hromosomālās DNS klonēšana;

(2) integrācija lielā kopiju skaitā; (3) bagātas sekvences (dzīvniekiem

neraksturīgas); (4) integrācija vāji ekspresējamā rajonā-

“pozīcijas efekts”.

Vienkāršie transgēni

Pārnesto gēnu apklusināšana:

delēcijas (Southern analīze)

metilēšana

5-meC atlikums 5’-CCGG-3’ secībās, pierādīšana ar genoma un ķīmisko sekvenēšanu (DMS un tiosulfāta apstrādes jūtība)

Izolatori = LCR secības (locus control regions)

Gēnu grupas tiek nodalītas no pārējās hromosomas ar specifiskām izolatoru DNS secībām.

Izolatorus veido vairāki elementi: a) sailenseri, kas bloķē integrētā transgēna tuvumā esošo enhanseru darbību;b) hromatīna atšķetinātāji, kas inducē histonu deacetilēšanu, ko pavada lokāla histonu un DNS demitelēšana;c) AT- bagāti matriksa saistības rajoni (MAR, matrix-attached regions).

Pārnesto gēnu regulēšanas problēmas:

TRANSGĒNIE DZĪVNIEKI

Nozīmīgākie procesi:

attīstības bioloģija; no farming uz pharming ; klonēšana;akvakultūra;

Izmantojamie organismi un produkti:

visbiežāk zivis;

govis un jaunus proteīna veidus saturošs piens; perspektīvā: dzīvnieki ar iznīcinātu prionu proteīnu gēnu.

Mērķi: ražošanas efektivitāte; funkcionāla (terapeitiska) pārtika, pārtikas drošība.

Perspektīvie preparāti

Pielietojums

AAT Alfa-1-antitripsīns, iedzimts deficīts izraisa emfizēmu.

tPA Audu plazminogēna aktivators, asins sarecēšanas kontrole.

Faktors VIII Asins recēšanas faktors, hemofīlijas ārstēšana. Hemoglobīns Asins olbaltumviela asins pārliešanas preparātos. Laktoferīns Bērnu barības piedeva.

CFTR Cistiskās fibrozes transmembrānu vadītspējas regulators, CF ārstēšana.

Cilvēka C proteīns

Antikoagulants, trombu šķīdināšna.

http://www.nal.usda.gov/bic/Education_res/iastate.info/bio10.html

“FARMING” VIETĀ “PHARMING”

Preparāts Dzīvnieks Peļņa/Dzīvnieks/ gadā (USD)

AAT aita 15,000 tPA kaza 75,000 Faktors VIII aita 37,000 Faktors IX aita 20,000 Hemoglobīns cūka 3,000 Laktoferīns govs 20,000 CFTR aita 75,000 Cilvēka C proteīns

cūka 1,000,000

“FARMING” VIETĀ “PHARMING”

Trusis Cūka Aita Kaza GovsGrūtniecības laiks, mēneši 1 4 5 5 9

Dzimumbrieduma sasniegšanas laiks, mēneši 5 6 8 8 15

Laiks no transgēna indukcijas līdz pirmajai dabiskajai laktācijai, mēneši

7 16 18 18 33

Pēcnācēju skaits 8 10 1–2 1–2 1Piena produkcija, kg/ gadā 4–5

a 300

b 500 800 8000

Neattīrīts rekombinantais proteīns, kg/ mātīte x gads

0,02 1,50 2,50 4,00 40,00

Vidēji no 2 - 3 laktācijām gadā

Vidēji no 2 laktācijām gadā

GM DZĪVNIEKU PIENĀ SINTEZĒTIE PROTEĪNI

Pelēm intraperitoneāli injicē oksitocīnu (līdz 5 IU). Pēc tam, ar precīzi regulējama vakuma pievadīšanu piena dziedzeriem, iespējams iegūt līdz 1 ml piena. Izmantojot līdzīgu metodi, no trušu mātēm laktācijas periodā iespējams iegūt līdz 100 ml piena dienā.

Līdzīgus daudzumus piena iespējams iegūt arī no izolētiem piena dziedzeriem.

PEĻU SLAUKŠANA

PIRMAIS TRANSGĒNAIS DZĪVNIEKS

Cūkas, kas siekalās ekspresē baktēriju enzīmu fitāzi izdala vidē ap 75% mazāk fosfātu nekā parastās cūku šķirnes, tādejādi ievērojami samazinot lopkopības radīto piesārņojumu.

Golovan SP, Meidinger RG, Ajakaiye A, Cottrill M, Wiederkehr MZ, Barney DJ, Plante C, Pollard JW, Fan MZ, Hayes MA, Laursen J, Hjorth JP,Hacker RR, Phillips JP, Forsberg CW. Pigs expressing salivary phytase produce low phosphorus manure.

Nat Biotechnol 2001, 19: 741–745.

Fitāts – inozitolheksafosfāts;

Viena no galvenajām fosfora uzkrāšanas formām augos, īpaši kviešos. Stiprs helatējošs savienojums, saista divalentos katjonus, piem., Ca2+.Tiek noārdīts atgremotāj dzīvnieku

kuņģī, citu dzīvnieku gremošanas traktā – nē. Baktērijas, noārdot fitātu fermu atkritumos, piesārņo notekūdeņus ar fosforu.

Cūkas, kas ekspresē spinātu enzīmu desaturāzi uzkrāj vairāk nepiesātinātu taukskābju, tādejādi paaugstinot gaļas kvalitāti.

Saeki K, Matsumoto K, Kinoshita M, Suzuki I, Tasaka Y, Kano K, Taguchi Y, Mikami K, Hirabayashi M, Kashiwazaki N, Hosoi Y, Murata N, Iritani A. Functional expression of a Delta12 fatty acid desaturase gene fromspinach in transgenic pigs. Proc Natl Acad Sci USA 2004, 101: 6361–6366.

Paredzams, ka kazas un govis, kas pienā ekspresēs tādus baktērijas nonāvējošus proteīnus kā cilvēka lizocīmu, laktoferīnu un lizostafīnu būs mazāk jūtīgas pret mastītu. To piens būs izturīgāks pret bojāšanos baktēriju iedarbībā un to varēs lietot cilvēki, kas slimo ar bakteriālām infekcijām. Kerr DE, Plaut K, Bramley AJ, Williamson CM, Lax AJ, Moore K, Wells KD, Wall RJ.Lysostaphin expression in mammary glands confers protection against staphylococcal infection in transgenic mice. Nat Biotechnol 2001, 19: 66–70.

Murray J, Reh W, Anderson G, Maga E. Changing the composition of milk to improve human health. In: Transgenic Animal Research, Conference IV, Tahoe City California, 2003, p 32.

Transgēnas vistas

Vistas aug ātrāk nekā aitas un tās var turēt lielā skaitā salīdzinoši mazās platībās. Vistas olas baltums satur vairākus gramus proteīna. Līdz šim izmantotas divas metodes, lai iegūtu vistas, kas nes un ekspresē svešus gēnus.

1 ) Embrijus inficē ar vīrusa nesēju, kas satur terapijā izmantojama cilvēka proteīna gēnu un vistas gēna (piem., lizocīma) promotera secības, kas nodrošina proteīna uzkrāšanu olas baltumā.

2) Ar cilvēka gēnu un atbilstošiem promoteriem transformē gaiļu spermatozoīdus.

Orientējoši dati rāda, ka vistas var producēt līdz 0,1 gramam cilvēka proteīna katrā izdētajā olā

TRANSGĒNI DZIVNIEKI PĀRTIKAI UN SKAISTUMAM

Aqua Bounty Technologies, Bostonas priekšpilsēta, 2003. g. oktobrī pieprasījums FDA;

In September 2010, an FDA advisory panel indicated that the fish is "highly unlikely to cause any significant effects on the environment" and that it is "as safe as food from conventional

Atlantic salmon"

Ātri augošs, lēts, “barojošs un videi draudzīgs” "AquAdvantage" lasis

Sārti fluorescējošas zebru zivtiņas: ir vai nav pārtika ?

TRANSGĒNI DZIVNIEKI PĀRTIKAI UN SKAISTUMAM

TRANSGĒNI DZIVNIEKI PĀRTIKAI UN SKAISTUMAM

GĒNU NOKAUTI

Gēnu nokauts – organisma modifikācija, kas ar mērķētu delēciju vai inserciju palīdzību inaktivē specifisku gēnu.

Gēnu nok-ins – organisma modifikācija, kas ar mērķētu inserciju novieto funkcionējošu gēnu lokusā, kur atrodas tā paša gēna nefunkcionējoša kopija.

NOKAUTI

NOKAUTI

NOKAUTI

CRE - LOX SISTĒMA NOKAUTOS

CRE - LOX SISTĒMA NOKAUTOS

CRE - LOX SISTĒMA NOKAUTOS

ESTROGĒNU-INDUCĒJAMI NOKAUTI

TET-INDUCĒJAMI NOKAUTI

ĢENĒTISKAIS FONS UN NOKAUTU FENOTIPS

KLONĒŠANAOrganismu vai šūnu kopiju savairošana veģetatīvā (bezdzimuma) ceļā

Reproduktīvā klonēšanaReproduktīvās klonēšanas mērķis ir radīt dzīvnieku, kuram ir tāda pati DNS kā kādam citam dzīvniekam. To panāk pārnesot somātiskās šūnas kodolu uz olšūnu, kuras pašas kodols ir iznīcināts.

Terapeitiskā klonēšanaTerapeitiskās klonēšanas mērķis ir radīt slimas personas audu vai orgānu veselu kopiju transplantācijas nolūkam.

KLONĒŠANA

Koloniju veido 108 - 109 šūnu

KLONĒŠANA

DZĪVNIEKU KLONĒŠANA

1997. gada 27. februārī “Nature” publicē rakstu par Dolliju – Finn Dorset šķirnes aitu, kas iegūta, sapludinot 6 gadus vecas aitas tesmeņa šūnas ar bezkodola Skotu melngalvainās aitas oocītu.

DZĪVNIEKU KLONĒŠANA

Dollijas klonēšanu firmas PPL Therapeutics Roslin laboratorijās vadīja skotu zinātnieks Jans Vilmuts (Ian Wilmut)

DZĪVNIEKU KLONĒŠANA

Ian Wilmut un Keith Campbell ar līdzstrādniekiem Roslin Institūtā un Edinburgas biotehnoloģijas firmā PPL therapeutics izmantoja modificētu kodola pārneses metodi, iegūstot dzīvotspējīgu aitu no kodola materiāla, kas bija ņemts no 6 gadus vecas grūsnas aitas tesmeņa šūnas. Olšūnas ar nomainītiem kodoliem uzsāka dalīties un veidoja 29 daudzšūnu embrijus, kurus pārnesa 13 aizvietotājmātēs. Pēc 148 dienām piedzima viena aita, kuru Roslina institūta darbinieki nosauca par Dolliju – par godu savai iemīļotajai kantrī dziedātājai Dolly Parton.

http://www.biochem.arizona.edu/classes/bioc471/pages/Lecture20/Lecture20-text.pdf

DZĪVNIEKU KLONĒŠANA

OLŠŪNAS KODOLA AIZVĀKŠANA

DZĪVNIEKU KLONĒŠANA

Dollija ar tēvu un bērniem

DZĪVNIEKU KLONĒŠANA

1997. gada 7. augustā tika ziņots par pirmā no embrionā-liem fibroblas-tiem klonēta Holšteinas šķirnes teļa iegūšanu.Teļš vārdā “Gēns” tika klonēts firmas Animal

Breeding Systems Global laboratorijās Viskonsinā, ASV

DZĪVNIEKU KLONĒŠANA

AP, 24.01.2000, No aizmugurē stāvošā buļla auss klonētie teļi, Japāna

DZĪVNIEKU KLONĒŠANA

AP, 02.05.2000, Advanced Cell Technologies, Austrālija

DZĪVNIEKU KLONĒŠANA

KLONĒŠANAS ZOOTEHNIKA :

Dzīvnieku iegūšanas efektivitāte

KLONĒŠANAS ZOOTEHNIKA :

Dzīvnieku iegūšanas efektivitāte

KLONĒŠANAS ZOOTEHNIKA :

Dzīvnieku iegūšanas efektivitāte

KLONĒŠANAS ZOOTEHNIKA :

Dzīvnieku iegūšanas efektivitāte

TERAPEITISKĀ KLONĒŠANA, IZMANTOJOT PIEAUGUŠĀS

(SOMĀTISKĀS) CILMES ŠŪNAS UN AUDU INŽENIERIJU

Pieaugušās (somātiskās) cilmes šūnas:

izplatītākais avots – kaula smadzenes (bet arī āda, zarnu epitēlijs, zobu pulpa, aknas utt.)

Par pieaugušu cilmes šūnu avotu var kalpot arī citi audi un orgāni, piem., āda

Dr. J.Ancāns, LU BF; oriģināla ādas cilmes šūnu izdalīšanas metode

Audu inženierijaapvieno terapeitisko klonēšanu un bioinženieriju, lai radītu bioloģiskas aizstājējstruktūras, kuras atjaunotu, saglabātu vai uzlabotu audu funkcijas.                       

www.innovitaresearch.org/ news/03122401.ht

Audu inženierija – varianti.

In vitro

Audu inženierija – varianti.

In vivo

Audu inženierija - shēma

Audu inženierija – piemēri

Audu inženierija – piemēri

Audu inženierija – piemēri

Audu inženierija – piemēri

Audu inženierija – piemēri

Experimental conversion of liver to pancreas.

Horb ME, Shen CN, Tosh D, Slack JM.Curr Biol. 2003 Jan 21;13(2):105-15.

We show that a modified form of Pdx1, carrying the VP16 transcriptional activation domain, can cause conversion of liver to pancreas, both in vivo and in vitro.

LU Biotehnoloģijas inovāciju centrs, Kleisti

Divu ēku rekonstrukcija ar “Phare” projekta atbalstu terapeitiskās klonēšanas un audu inženierijas pētījumu vajadzībām

P.Stradiņa KUS – šūnu transplantācijas laboratorija, VM atbalstīts projekts