tema-14. las enzimas en el interior celular
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Tema-14. Las enzimas en el interior celular
1.- Velocidad total para el modelo S P
2.- Resolución de la ecuación de velocidad en el estado
estacionario
3.-Resolución gráfica de ecuaciones cinéticas:
Método de King y Altman
4. Análisis de la ecuación
1. Velocidad total
* Hasta ahora hemos considerado cinéticas sencillas, in vitro, descritas por el modelo:
E S <===> P
Modelo que cumple la condiciones de partida de M&M:
Las reacciones se han estudiado en condiciones de velocidades iniciales, que son velocidades unidireccionales
extrapoladas a tiempo cero.
La velocidad total, vt, no es la suma algebraica de dos
velocidades iniciales.
* Por otro lado, en el interior de la célula, es decir, in vivo, el producto de reacción, P, siempre está presente, por lo que no
es posible extrapolar el comportamiento de la enzima en la célula a las condiciones de velocidades iniciales de las
condiciones in vitro.
* Para intentar acercarnos a las condiciones de in vivo,
intentaremos estudiar la velocidad de reacción total, vt,
S <===> PPara el que, en este caso, si se cumple:
vt = v1 - v2Donde:
v1 es la velocidad actual de la reacción S --> P v2 es la velocidad actual de la reacción P --> S
* Teniendo en cuenta los distintos complejos que se pueden formar, podemos escribir el modelo, de una manera más realista,
de la siguiente manera:
k1 k3 k5 E + S ES EP E + P k2 k4 k6 Para este modelo se cumplirá:
[Eo] = [E] + [ES] + [EP]dt
dP
dt
dSvt
PEkEPkdt
dPv
ESkSEkdt
dSv
t
t
65
21
Calculo vt necesitamos conocer las concentraciones siguientes:
[E] y [ES] o [E] y [EP]
Plantear las correspondientes ecuaciones diferenciales y resolverlas asumiendo una situación de estado estacionario:
vt = k1[E ][S] - k2[ES] = k5[EP] - k6[E][P]
[So] >>>[Eo] [ES] despreciable frente a [S]
EPESEEdt
EPddt
ESddt
Ed
0
0
0
0
2.- Resolución de la ecuación de velocidad en el estado
estacionario
k1 k3 k5 E + S <===> ES <===> EP <===> E + P k2 k4 k6
Cálculo del valor de las concentraciones de las diferentes formas de las Enzimas en el estado estacionario. Plantea un sistema de ecuaciones
EPkESkEPkSkdt
Ed
vvdt
Edconsumoformación
5261 )(0
0
Empezamos por la enzima libre
k1 k3 k5 E + S <===> ES <===> EP <===> E + P k2 k4 k6
k1 k3 k5 E + S <===> ES <===> EP <===> E + P k2 k4 k6
EPkESkkESkdt
ESd
vvdt
ESdconsumoformación
4321 )(0
0
EPkkESkEPkdt
EPd
vvdt
EPdconsumoformación
)(0
0
5436
[ES]
[EP]
Tenemos un sistema de 4 ecuaciones y tres incógnitas (E, ES, y EP), que de acuerdo con el Teorema de Rouché tendrá solución si
una de las ecuaciones es combinación lineal de otras dos.
-1[ii) + iii)] = iv)
ii) 0 = -[k1(S) + k6(P)] [E] + k2 [ES] + k5 [EP]
iii) 0 = k1(S) [E] - (k2+k3) (ES) + k4 (EP)
iv) 0 = k6(P) [E] + k3 [ES] - (k4+ k5) [EP]
i) [Eo] = [E] + [ES] + [EP]
EPESEE
EPkkESkEPkdt
EPd
EPkESkkESkdt
ESd
EPkESkEPkSkdt
Ed
0
5436
4321
5261
)(0
)(0
)(0
iv) 0 = k6(P) (E) + k3 (ES) - (k4+ k5) (EP)
ii) 0 = -[k1(S) + k6(P)] (E) + k2 (ES) + k5 (EP)
iii) 0 = k1(S) (E) - (k2+k3) (ES) + k4 (EP)
0 = - k1(S)(E) – k6(P)(E) + k1(S)(E) + k2(ES) – k2(ES) –k3(ES) + k5(EP) + k4(EP)
0 = – k6(P)(E) – k3(ES) + k5(EP) + k4(EP)
0 = – k6(P)(E) – k3(ES) + (k4+ k5)(EP)
Si multiplicamos por -1
0 = k6(P)(E) + k3(ES) - (k4+ k5)(EP)Que es exactamente igual que la ec:
vt = k1[E][S] - k2[ES]
Por lo tanto, para calcular la velocidad total vt,
Sólo necesitamos calcular [E] y [ES]
* Aplicando la regla de Cramer al sistema formado por las tres primeras ecuaciones:
ii) 0 = -[k1(S) + k6(P)] (E) + k2 (ES) + k5 (EP)
iii) 0 = k1(S) (E) - (k2+k3) (ES) + k4 (EP)
i) (Eo) = 1(E) + 1(ES) + 1(EP)
Luego el sistema tiene solución
Y teniendo en cuenta que la matriz de coeficientes, , viene dada por:
1 1 1
-[k1(S) + k6(P)] k2 k5
k1(S) - (k2+k3) k4
=
El cálculo de [E] y de [ES] lo podemos realizar de la siguiente manera:
[E]=
Eo 1 1
0 k2 k5
0 -(k2+k3) k4
1 1 1
-[k1(S) + k6(P)] k2 k5
k1(S) - (k2+k3) k4
[ES]=
1 Eo 1
-(k1(S) + k6(P) 0 k5
K1(S) 0 k4
1 1 1
-[k1(S) + k6(P)] k2 k5
k1(S) - (k2+k3) k4
Resolución de un determinante de orden 3
PkkkkkkSkkkkkkkkkkkk
SkkPkkSkkEoES
PkkkkkkSkkkkkkkkkkkk
kkkkkkEoE
)()()(
)(
)()()(
)(
646362514131535242
516441
646362514131535242
535242
Las concentraciones en estado estacionario serán
vt = k1[E][S] - k2[ES]
(k1k3k5)[S] - (k2k4k6)[P] vt = Eo
------------------------------------------------------------------------------
(k2k4+k2k5+k3k5) + (k1k3+k1k4+k1k5)[S] + (k2k6+k3k6+k4k6)[P]
PkkkkkkSkkkkkkkkkkkk
SkkPkkSkkEoES
PkkkkkkSkkkkkkkkkkkk
kkkkkkEoE
)()()(
)(
)()()(
)(
646362514131535242
516441
646362514131535242
535242
Llevando a la ecuación de velocidad total
Reorganizando algebraicamente
* Esta es la ecuación de velocidad total obtenida en función de las constantes microscópicas de velocidad
Es una ecuación de manejo complicado
No es fácil obtener las Constantes cinéticas
Solución transformación según el tratamiento de Michelis-Menten
Obtención de constantes cinéticas michaelentianas
(k1k3k5)[S] - (k2k4k6)[P] vt = Eo
------------------------------------------------------------------------------
(k2k4+k2k5+k3k5) + (k1k3+k1k4+k1k5)[S] + (k2k6+k3k6+k4k6)[P]
Transformación función de las constantes cinética características de la enzima
KmS, KmP, VmaxS y VmaxP
Numerador 1 num1= (k1k3k5)
Numerador 2 num2= (k2k4k6)
Constante Cte = (k2k4+k2k5+k3k5)
Coeficiente de Substrato coefs= (k1k3+k1k4+k1k5)
Coeficiente de Producto coefp= (k2k6+k3k6+k4k6)
(k1k3k5)[S] - (k2k4k6)[P] vt = Eo
------------------------------------------------------------------------------
(k2k4+k2k5+k3k5) + (k1k3+k1k4+k1k5)[S] + (k2k6+k3k6+k4k6)[P]
num1[S] – num2 [P] vt = Eo
----------------------------------------------------- cte + Coefs [S] + Coefp [P]
Multiplicando y dividiendo numerador y denominador por
Substituimos
PSCoefCoef
cte
PCoefCoef
CteCoefS
CoefCoefCteCoef
CoefCoefCteCte
PCoefCoefnumCte
SCoefCoefnumCte
Ev
PS
P
PS
S
PS
PSPSt
21
0
Teniendo en cuenta las defiiniciones de las constantes cinéticas de Michaelis para el Substrato y Producto KmS y KmP y las velocidades máximas VmS y VmP
Los valores se deducen en velocidades iniciales por lo tanto [P] = 0
mSS
mS
SmS
VEokkkk
kkkEo
Coef
numEoV
Coef
numEoV
3531
5311
1
)(
PmP Coef
numEoV 2
K6 y k4 son iguales a 0
Coefp es cero
k3 es el paso limitante de la reacción global (despreciable como sumando frente a k5)
Se deduce lo mismo para el lado contrario P S
sS
S Kmk
kk
kkk
kkk
kkkkkk
kkkkkk
Coef
CteKm
1
32
531
325
514131
535242
)(
)(
k4 =0 y k3<<<k5 PP Coef
CteKm
VmS KmP[S] – VmP KmS[P]
vt = ---------------------------------------------- KmS KmP + KmP[S] + KmS[P]
Esta es la ecuación de velocidad total obtenida en función de las constantes de velocidad de Michaelis-Mentem (Vm y Km) y de la concentración de S y de P.
El método gráfico, de K&A, consiste en la construcción, en primer lugar, de un polígono de tantos vértices como especies químicas puede presentar la enzima.
Para el sistema más simple:
E + S <==> ES <==> EP <==> E + P
3.- Resolución gráfica de ecuaciones cinéticas: Método de King y Altman
Se utiliza para todos los sistemas: Con más de un Substrato y Producto
ES
E
EP
Método esquemático para la resolución de ecuaciones con mecanismo cinético complejo
En el estado estacionario la concentración total del enzima será igual a la suma de todas las especies químicas de esta
EXiEo
* A continuación se construyen tantos polígonos abiertos como lados tiene el polígono, dejando un lado abierto en cada uno de
ellos.
ES
E
EP
S k1
k2
P k6
k5
k3
k4
ES
E
EP
ES
E
EP
S k1
k2
k3
k4ES
E
EP
S k1
k2
P k6k5
ES
E
EP
P k6k5
k3
k4
* Por otro lado, se cumple que la razón entre una determinada especie química [EXi] y la concentración total de enzima [Eo], [Exi]/[Eo], es igual a la suma de los términos que afectan a la
especie, partido por la suma de todos los términos que afectan a todas las especies.
de los términos que afectan a la especie EXi [EXi]/[Eo] = ----------------------------------------------------------------------- de los términos que afectan a todas las especies químicas
¿Cómo calculamos el numerador y el denominador?
* Los términos que afectan a una especie se calculan en cada polígono abierto recorriendo el camino para llegar a la
especie , multiplicando las constantes de velocidad y las concentraciones de S y P, si hubiera lugar.
ES
E
EP
S k1
k2
k3
k4ES
E
EP
S k1
k2
P k6k5
ES
E
EP
P k6k5
k3
k4
[E] (k2k4) + (k2k5) + k3k5)
ES
E
EP
S k1
k2
k3
k4ES
E
EP
S k1
k2
P k6k5
ES
E
EP
P k6k5
k3
k4
[ES] (k1k4S) + (k1k5S) + (k4k6P)
ES
E
EP
S k1
k2
k3
k4ES
E
EP
S k1
k2
P k6k5
ES
E
EP
P k6k5
k3
k4
[EP] (k1k3S) + (k2k6P) + (k3k6P)
[E] (k2k4) (k2k5) (k3k5)
[ES] (k1k4S) (k1k5S) (k4k6P)
[EP] (k1k3S) (k2k6P) (k3k6P)
TÉRMINOSFORMAS DE LA ENZIMA
EPESE
EXi
Eo
EXi
Así pues,
(k2k4 + k2k5 +k3k5) [E] = [Eo] --------------------------------------------------------------------------- (k2k4 + k2k5 +k3k5) + (k1k4S) + (k1k5S) + (k4k6P) +(k1k3S + k2k6P + k3k6P)
(k1k4S + k1k5S + k4k6P) [ES] = [Eo] ------------------------------------------------------------------------- (k2k4 + k2k5 +k3k5) + (k1k4S) + (k1k5S) + (k4k6P) +(k1k3S + k2k6P + k3k6P)
(k1k3S + k2k6P + k3k6P) [EP] = [Eo] ------------------------------------------------------------------------- (k2k4 + k2k5 +k3k5) + (k1k4S) + (k1k5S) + (k4k6P) +(k1k3S + k2k6P + k3k6P)
- Como vt viene dado por: vt = k1[E][S] - k2[ES]
- Sustituyendo los valores de [E] y [ES] tendremos:
(k2k4 + k2k5 +k3k5) (k1k4S + k1k5S + k4k6P)
vt = k1[Eo] ------------------------ [S] - k2[Eo]
------------------------------ t
tDonde:
t = (k2k4 + k2k5 +k3k5) + (k1k4S) + (k1k5S) + (k4k6P) +(k1k3S + k2k6P +
k3k6P)
y operando, obtenemos:
(k1k2k4S + k1k2k5S +k1k3k5S - k1k2k4S - k1k2k5S - k2k4k6P) vt = [Eo]
[----------------------------------------------------------------]
t
(k1k3k5) (S) (k2k4k6) (P) vt = [Eo] [------------------ - -------------------] t t
-Simplificando
- Si en t ordenamos las contantes y sacamos factor común,
podemos escribir:
t = (k2k4 + k2k5 +k3k5) + k1(k3k4k5) (S) + k6(k2k3k4) (P)
Cte. CoefS CoefP
Usando estas simplificaciones, e introduciendo otras, y operando adecuadamente.
* Expresión de la ecuación de velocidad total en presencia de P y S
VmS KmP[S] – VmP KmS[P]
vt = ---------------------------------------------- KmS KmP + KmP[S] + KmS[P]
Misma ecuación que la obtenida en mediante la resolución de sistemas de ecuaciones diferenciales en el estado estacionario
4. Análisis de la ecuación:
VmS KmP[S] – VmP KmS[P] vt = -----------------------------------------
KmS KmP + KmP[S] + KmS[P]
1. En condiciones de velocidad inicial [P] = 0, la ecuación se convierte en la ecuación de M-M
VmS KmP[S] – VmP KmS[P] vt = -----------------------------------------
KmS KmP + KmP[S] + KmS[P]
SKm
SVmv
s
s
Tarea. Si consideramos velocidades iniciales, qué forma tomará la anterior ec. general para la reacción en sentido P --> S?
2. En condiciones de velocidad iniciales y unidireccionales si [P] ≠ 0La ecuación tiene el siguiente valor
SKmP
Km
SVmv
Ps
s
1
01
Ecuación similar a la de la Inhibición competitiva. El producto si está presente en velocidades iniciales se comporta como un inhibidor competitivo
Kcat dirección S es 0
VmP = 0
En condiciones de equilibrio químico, vt = 0, se deduce la
siguiente relación:
VmS KmP[S]eq - VmP KmS[P]eq = 0- Donde [S]eq y [P]eq son las concentraciones en el equilibrio.
[P]eq VmS KmP
Keq = --------- = -----------------
[S]eq VmP KmS
3. Relación de Haldane
Relación que recibe el nombre de Relación de Haldane.
VmS KmP[S] – VmP KmS[P] vt = ---------------------------------------------= 0
KmS KmP + KmP[S] + KmS[P]
- La relación de Haldane nos permite obtener la constante de equilibrio, Keq, de la reacción a partir de las constantes
cinéticas .
Y por extensión, podemos, también calcular el valor de G’º de la reacción a partir de las constantes cinéticas enzimáticas, ya que:
VmSKmP G’º = -RT ln -------------
VmPKmS
Las constantes cinéticas son fáciles de calcular experimentalmente.
Resumen
• El análisis cinético de M-M está referido a velocidades iniciales
En el interior celular in vivo el producto de la reacción está siempre presente, habrá que tener en cuenta la velocidad total no las velocidades iniciales
Velocidad total es la suma de las velocidades unidireccionales
Las ecuaciones referidas a las velocidades totales solamente se resuelven en el estado estacionario: Variación de las concentraciones de las diferentes especies químicas en las que se encuentre la enzima respecto al tiempo es cero
Resolución de las ecuaciones de velocidad total se realizada con diferente aproximaciones:
Estado estacionario,se obtiene una expresión de velocidad total en función de las constantes cinéticas Vms, Vmp, Kms Kmp y de las concentraciones de P y S.
VmaxS KmP(S) - VmaxP KmS(P)
vt = -------------------------------------------------
KmS KmP + KmP(S) + KmS(P)
Resolución gráfica propuesta por King y Altman método sencillo permite la resolución de planteamientos enzimáticos complejos
Relación de Haldane, cuando la velocidad total es cero es decir en condiciones de equilibrio relaciona la constante de equilibrio con las constantes cinéticas de la enzima (estudiadas de acuerdo con las condiciones de M-M).
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