sveučilište u zagrebu - digre.pmf.unizg.hrdigre.pmf.unizg.hr/3977/1/diplomski rad vanina...
Post on 30-May-2019
226 Views
Preview:
TRANSCRIPT
Sveučilište u Zagrebu
Prirodoslovno-matematički fakultet
Biološki odsjek
Vanina Pogačar
Raznolikost patogenih bakterija porodice Anaplasmataceae u pasa
na području Republike Hrvatske
Diplomski rad
Zagreb, 2014.
ii
«Ovaj rad izrađen je u Laboratoriju za parazitologiju na Hrvatskom veterinarskom
institutu, pod voditeljstvom dr.sc. Relje Becka i suvoditeljstvom doc.dr.sc. Duje
Lisičića. Rad je predan na ocjenu Biološkom odsjeku Prirodoslovno-matematičkog
fakulteta Sveučilišta u Zagrebu radi stjecanja zvanja magistra eksperimentalne
biologije.»
iii
TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA
Sveučilište u Zagrebu
Prirodoslovno-matematički fakultet
Biološki odsjek Diplomski rad
RAZNOLIKOST VRSTA IZ PORODICE ANAPLASMATACEAE U
PASA NA PODRUČJU REPUBLIKE HRVATSKE
Vanina Pogačar
Rooseveltov trg 6, 10000 Zagreb
Porodica Anaplasmataceae dio je obitelji malih unutarstaničnih proteobakterija koja
obuhvaća rodove Anaplasma, Ehrlichia, Neorickettsia, Wolbachia, Aegiptianella i
Candidatus Neoehrlihia. Ove bakterije preživljavaju kao unutarstanični endosimbionti,
no istovremeno mogu uzrokovati bolesti ljudi i životinja. Bakterije roda Anaplasma
prenose se vektorima (krpelji šikare), a na području Europe najznačajniji je krpelj vrste
Ixodes ricinus. Vrste iz porodice Anaplasmataceae je složeno uzgojiti na staničnim
kulturama kao i dokazati u kliničkim uzorcima različitim bojanjima, stoga se u
istraživanjima koriste molekularne metode. U ovom diplomskom radu analizirani su
uzorci DNA izolirani iz krvi pasa arhive Laboratorija za parazitologiju Hratskog
veterinarskog instituta. DNA je naprije umnožena lančanom reakcijom polimeraze
„nested“ protokolom, a dijelovi 16S rRNA gena potom su sekvencionirani te analizirani
odgovarajućim programima. Budući da ne postoje podaci o vrstama prisutnim u RH,
cilj je bio istražiti koje su vrste iz roda Anaplasmataceae prisutne u pasa u Hrvatskoj te
utvrditi učestalost pojedinih vrsta. Od ukupno 68 uzoraka pasa u njih 22 pronađena je
DNA bakterija iz porodice Anaplasmataceae. Najzastupljenija je bila vrsta A. platys
(64 %) a pronađene su i vrste A. phagocytophilum (18 %) te Wolbachia, endosimbiont
Dirofilaria repens (18 %).
( 30 stranica, 11 slika, 4 tablice, 33 literaturnih navoda, jezik izvornika: hrvatski)
Rad je pohranjen u Središnjoj biološkoj knjižnici
Ključne riječi: unutarstanične bakterije, endosimbionti, Anaplasma platys, Anaplasma
phagocytophilum, Wolbachia, 16S rRNA
Voditelj: Dr. sc. Relja Beck
Suvoditelj: Dr.sc Duje Lisičić, doc.
Ocjenitelji: Dr. sc. Jasna Hrenović, izv. prof., Dr. sc. Božena Mitić, red. prof.
Rad prihvaćen: 10. listopada 2014.
iv
BASIC DOCUMENTATION CARD
University of Zagreb
Faculty of Science
Department of Biology Graduation Thesis
THE DIVERSITY OF PATOGENIC BACTERIA WITHIN THE
ANAPLASMATACEAE FAMILY IN DOGS FROM CROATIA
Vanina Pogačar
Rooseveltov trg 6, 10000 Zagreb, Croatia
Anaplasmataceae is part of a family of small intracellular proteobacteria which
includes the genera Anaplasma, Ehrlichia, Neorickettsia, Wolbachia, Aegyptianella
and Candidatus Neoehrlihia. These bacteria survive as endosymbionts in other cells,
but at the same time can cause diseases in humans and animals. Bacteria of the genus
Anaplasma are transmitted by vectors (ticks), and the most important in Europe is the
tick species Ixodes ricinus. Species of family Anaplasmataceae are complicated to
grow in cell cultures as well as to prove them in clinical samples by different coloring,
therefore the research is based on molecular methods. This thesis analyzed the samples
of DNA isolated from the blood of dogs belonging to the archives of the Laboratory of
parasitology of the Croatian veterinary institute. DNA was amplified by polymerase
chain reaction "nested" protocol, 16S rRNA gene parts sequenced and analyzed in the
appropriate programs. As there are no data on the species present in Croatia the goal
was to investigate which species of the genus Anaplasmataceae are present in dogs
from Croatia and to determine the frequency of certain species. From a total of 68
samples of dogs in 22 of them the DNA of bacteria from the family Anaplasmataceae
was found. The most abundant species was A. Platys (64 %) and species A.
phagocytophilum (18 %) and Wolbachia, endosimbiont of Dirofilaria repens (18 %)
also were found.
(30 pages, 11 figures, 4 tables, 33 references, original in: Croatian)
Thesis deposited in the Central Biological library
Key words: intracellular bacteria, endosymbiont, Anaplasma platys, Anaplasma
phagocytophilum, Wolbachia, 16S rRNA
Supervisor: Dr. Relja Beck
Co-supervisor: Dr. Duje Lisičić, Asst. Prof.
Reviewers: Dr. Jasna Hrenović, Assoc. Prof., Dr. Božena Mitić, Prof.
Thesis accepted: October 10, 2014
v
SADRŽAJ
1. UVOD .............................................................................................................................................. 1
1.1. Porodica Anaplasmataceae ................................................................................................................ 1
1.2. Najvažniji predstavnici ...................................................................................................................... 2 1.2.1. Anaplasma phagocytophilum ..................................................................................................... 2 1.2.2. Anaplasma platys ....................................................................................................................... 3 1.2.3. Erlichia canis ............................................................................................................................. 4
1.3. Rasprostranjenost vrsta bakterija iz porodice Anaplasmataceae ....................................................... 4
1.4. Prijenos vrsta bakterija iz porodice Anaplasmataceae ...................................................................... 6
1.5. Patogeneza bakterija iz porodice Anaplasmataceae .......................................................................... 7
1.6. Klinička slika ..................................................................................................................................... 9
1.7. Genetska identifikacija ...................................................................................................................... 9
1.8. Cilj istraživanja ................................................................................................................................ 10
2. MATERIJAL I METODE ....................................................................................................... 11
2.1. Materijali ......................................................................................................................................... 11 2.1.1. Uzorci DNA pasa ..................................................................................................................... 11 2.1.2. Specifične početnice ................................................................................................................ 11
2.2. Metode ............................................................................................................................................. 12 2.2.1. Protokol ................................................................................................................................... 12 2.2.2. Izdvajanje DNA ....................................................................................................................... 12 2.2.3. Lančana reakcija polimeraze.................................................................................................... 12 2.2.4. „Nested“ PCR .......................................................................................................................... 13 2.2.5. Pročišćavanje PCR produkata .................................................................................................. 14 2.2.6. Sekvenciranje ........................................................................................................................... 15 2.2.7. Analiza sekvenci ...................................................................................................................... 16
3. REZULTATI ............................................................................................................................... 17
4. RASPRAVA ................................................................................................................................ 23
5. ZAKLJUČAK ............................................................................................................................. 26
6. LITERATURA ........................................................................................................................... 27
ŽIVOTOPIS ......................................................................................................................................... I
vi
POPIS KRATICA
ATL – pufer za razgradnju tkiva i stanica (prema eng. animal tissue lysis)
BLAST – algoritam za pretraživanje sličnosti u slijedovima (prema eng. basic local
alignment search programme)
DNA – deoksiribonukleinska kiselina
HGE – humana granulocitna erlihioza
HME – humana monocitna erlihioza
PCR – lančana reakcija polimerazom (prema eng. polymerase chain reaction)
PSGL-1 – P selektin glikoprotein ligand 1
RNA – ribonukleinska kiselina
rRNA – ribosomalna RNA
TBF – groznica uzrokovana krpeljima (prema eng. tick borne fever)
1
1. UVOD
1.1. Porodica Anaplasmataceae
Porodica Anaplasmataceae je skupina malih intracelularnih proteobakterija,
visoko srodnih mitohondrijima, koja obuhvaća rodove Anaplasma, Ehrlichia,
Neorickettsia, Wolbachia, Aegyptianella i Candidus Neoehrlichia unutar reda
Rickettsiales (Slika 1) (Dunning Hotopp i sur. 2006). Ove bakterije preživljavaju kao
endosimbionti pretežno u krvotvornim stanicama sisavaca te mogu, ali i ne moraju,
uzrokovati bolesti ljudi i životinja. Bakterije iz porodice Anaplasmataceae inficiraju
beskralješnjake koji su u izobilju prisutni u okolišu, poput krpelja, kukaca, metilja,
oblića ili mekušaca. Za sve rodove osim Wolbachie poznato je da inficiraju
kralješnjake, sisavce ili ptice. Bakterije napadaju samo određene stanice domaćina, kao
što su neutrofili, monociti i makrofagi, trombociti, eritrociti ili endotelne stanice, gdje
se umnažaju i stvaraju makrokolonije u citoplazmatskim vakuolama. Tip stanice koju
će bakterija napasti ovisi o vrsti bakterije (Pruneau i sur. 2014).
Slika 1. Rodoslovno stablo porodice Anaplasmataceae izrađeno na temelju
sekvenca 16S rRNA gena (Rikihisa 2010)
2
Unutar porodice Anaplasmataceae najbolje su proučene bakterije Anaplasma
phagocytophilum i Ehrlichia chaffeensis, koje inficiraju ljude. Ovisno o vrsti stanica u
kojoj bakterija parazitira, u ljudi su opisana dva oblika bolesti: humana monocitna
erlihioza (HME) i humana granulocitna erlihioza (HGE). Uzročnici humane monocitne
erlihioze su: Ehrlichia canis, E. caffeensis i Neorickettsia sennestsu, dok su uzročnici
humane granulocitne erlihioze A. phagocytophilum i A. ewingii. Humana monocitna i
granulocitna erlihioza zabilježene su u mnogim dijelovima SAD-a, a u posljednjih
nekoliko godina zabilježeni su slučajevi humane anaplazmoze u nekim europskim
zemljama pa i u Hrvatskoj. Najvažniji rezervoari A. phagocytophilum su glodavci,
osobito vrste Apodemus sylvaticus, A. flavicolis te Chletrinomys glereolus (Cvetnić
2013).
Trenuto je poznato osam vrsta iz porodice Anaplasmataceae koje inficiraju pse:
Ehrichia canis, E. chaffeensis, E. ewingii, E. ruminantium, Anaplasma platys, A.
phagocytophilum, Neorickettsia helminthoeca i N. risticii (Hisashi 2005).
1.2. Najvažniji predstavnici
1.2.1. Anaplasma phagocytophilum
Najučestaliji predstavnik je Anaplasma phagocytophilum, bakterija koja uzrokuje
granulocitnu anaplazmozu različitih životinja (pasa, konja, goveda, ovaca, koza) i ljudi.
Uzročnik je sistematiziran 2001. godine u jedinstvenu vrstu temeljem genske tipizacije,
a do tada je bio poznat kao Ehrlichia equi u konja, uzročnik humane granulocitne
erlihioze te kao A. phagocytophila. Ovaj unutarstanični parazit inficira granulocite gdje
stvara makrokolonije („morule“) u citoplazmatskim vakuolama. Naziv „morula“ uzet
je iz latinske riječi za dud na kojeg izgledom podsjeća (Slika 2). Citoplazmatske morule
i vakuole variraju u veličini od 1.5 µm do 6 µm promjera. Bakterije su pleomorfne, ali
većinom dolaze u kokoidom ili elipsoidnom obliku. Ponašanje A. phagocytophilum
izvan stanice domaćina, s obzirom na obligatni parazitizam, nije dovoljno dobro
proučeno. Jedini učinkovit način da se organizam očuva izvan žive stanice jest
3
krioprezervacija na -114 °C. Na taj način stanice mogu ostati infektivne više od šest
mjeseci nakon smrzavanja (Stuen 2007).
Slika 2. Morula unutar granulocita (preuzeto: https://lookfordiagnosis.com)
1.2.2. Anaplasma platys
Bakterija Anaplasma platys vrlo je patogena za pse te uzrokuje pseću cikličku
trombocitopeniju. Prvi put je detektirana 1978. godine u SAD-u (Harvey i sur. 1978),
a dokazana je u svim dijelovima svijeta. U literaturi je možemo pronaći pod starim
imenom Erlichia platys. Prenosi se krpeljima, prvenstveno vrstom smeđeg psećeg
krpelja Rhipicephalus sanguineus, ali je moguć prijenos i nekim drugim
člankonošcima. Uništava trombocite te izaziva letargiju, anoreksiju, petehije, groznicu.
Infekcija se može dijagnosticirati bojanjem morula unutar trombocita pomoću boje
Giemsa, imunološkim testom ELISA, no najosjetljiviji i najsigurniji test je PCR. Kod
ljudi infekcija bakterijom A. platys nikad nije zabilježena (Cote 2011).
4
1.2.3. Erlichia canis
Bakterija Ehrichia canis uzrokuje pseću monocitnu erlihiozu (CME). Prvi put je
opisana 1935. godine u Alžiru. Bakterija se lokalizira u retikuloendotelnim stanicama
jetre, slezene i limfnih čvorova gdje se replicira prvenstveno u makrofazima i
limfocitima. E. canis prenosi se putem smeđeg krpelja vrste Rhiphicephalus
sanguineus koji je raširen diljem svijeta, a osobito u tropskim i suptropskim
područjima. Kod pseće monocitne erlihioze postoje tri kliničke faze: akutna,
subklinička i kronična. Bolest se očituje povišenom tjelesnom temperaturom,
depresijom, gubitkom tjelesne mase, krvarenjem, gastrointestinalnim poteškoćama te
poremećajima disanja. Laboratorijski nalazi ukazuju na trombocitopeniju, leukopeniju
i anemiju. Bolest je bila od posebnog značaja za vrijeme Vijetnamskog rata zato što je
prouzročila smrt stotina američkih vojnih pasa (Aguirre i sur. 2004; Keysary i sur.
1996).
1.3. Rasprostranjenost vrsta bakterija iz porodice Anaplasmataceae
Bakterija A. phagocytophylum uzrokuje granulocitnu anaplazmozu pasa, jelena,
mačaka, konja, preživača, glodavaca i ljudi, a može se naći na području Europe, SAD-
a i Azije. Bakterija A. chaffeensis inficira jelene, pse i ljude uzrokujući pseću erlihiozu
te humanu monocitnu erlihiozu. Najučestalija je na području SAD-a, Južne Amerike i
Azije. A. marginale i E. ruminantium inficiraju samo domaće i divlje preživače gdje
uzrokuju goveđu anaplazmozu te bolest vodenastog srca (eng. heartwater). Goveđa
anaplazmoza je najrasprostranjenija krpeljna bolest, prisutna je u tropskim i
subtropskim regijama širom svijeta. Bolest vodenastog srca prisutna je u subsaharskoj
Africi, na Karibima te otocima Indijskog oceana, a izaziva smrtnost preživača te
smanjuje produktivnost stada što uzrokuje i vrlo visoke financijske štete uzgajivača.
Rasprostranjenost bakterija iz porodice Anaplasmataceae te njihove pripadajuće
vektore i domaćine prikazuje Tablica 1 (Brenner 2005).
5
Tablica 1. Domaćini, vektori, geografska distribucija te pripadajuće bolesti za navedene
vrste iz porodice Anaplasmataceae (preuzeto iz knjige Bergeyes manual of systematic
bacteriology, 2005)
Vrsta Domaćin Vektor Bolest Geografska distribucija
A.
phagocytophilum
Čovjek, jelen,
pas, mačka,
konj, preživači,
glodavci
Krpelj Ixodes
spp.
Granulocitna
anaplazmoza,
HGA, Krpeljna
groznica
preživača
SAD, Europa, Azija
A. marginale Stoka, divlji
preživači
Krpelj
Rhicephalus
microplus,
Dermacentor
Goveđa
anaplazmoza
Širom svijeta u tropskim
i suptropskim regijama
E. chaffeensis Čovjek, jelen,
pas
Krpelj
Amblyomma
americanum
Monocitna
erlihioza, Pseća
erlihioza
SAD, Južna Amerika, i Azija
E. ruminantium Stoka, ovca,
koza, divlji
preživači
Krpelj African
Amblyomma sp.
uključujući
variegatum i
hebraeum
Vodenasto srce
(Heartwater)
Subsaharska Afrika,
Madagascar, Karibi
Wolbachia spp. oblić Brugia
malayi,
člankonožac
Anopheles
gambiae
nepoznato
nepoznato
Širom svijeta
6
1.4. Prijenos vrsta bakterija iz porodice Anaplasmataceae
Bakterije iz porodice Anaplasmataceae prenose se prvenstveno krpeljima.
Najvažniji su Riphicephalus sanguineus i Ixodes ricinus. Smeđi pseći krpelj
Rhipicephalus sanguineus važan je prijenosnik uzročnika raznih bolesti (Slika 3).
Krpelja R. sanguineus možemo naći širom svijeta no češći je u toplijim područjima.
Kako bi završio svoj životni ciklus ovom krpelju potrebna su mu tri hranjenja: kao
ličinka, kao nimfa te nakon preobrazbe u odrasli oblik. Nakon hranjenja pušta trenutnog
domaćina, a nakon preobrazbe u idući razvojni stadij traži novog (Dantas-Torres 2010).
Na području Europe najčešći prijenosnik je šumski krpelj vrste Ixodes ricinus (Slika 4).
Ixodes ricinus ima sličan razvojni stadij kao R. sanguineus. Krpelj može povećati svoju
masu nekoliko puta nakon hranjenja. Dobro nahranjene ženke mogu izleći i do 5 000
jajašaca (Bedrica i Marinculić 2006). Prevalencija infekcije krpeljem I. ricinus može
varirati od jedne geografske regije do druge kao i od stadija razvoja. Primijećena je
veća učestalost infekcije kod nimfa nego kod larva ili odraslih jedinki. Učinkovitost
prijenosa također ovisi o drugim faktorima koji uključuju istovremeno hranjenje više
krpelja na istoj jedinci te imunitet domaćina (Stuen 2007).
U nekim dijelovima Engleske, otkriveno je da prijenosnik groznice uzrokovane
krpeljima (TBF, prema eng. tick borne fever) može biti i Haemophysalis punctata. U
istočnom dijelu SAD-a češćim prijenosnikom pokazao se I. scapularis.
Vrste iz roda Neorickettsia i Wolbachia mogu se prenositi i transovarijalnim i
transstadijalnim prijenosom, dok kod rodova Anaplasma i Ehrlichia postoji samo
transstadijalni prijenos. Transstadijalni prijenos podrazumijeva prijenos od ličinke
preko nimfe do odraslog stadija krpelja dok se transovarijalni prijenos odnosi na onaj s
roditelja na potomke. Infektivne bakterije mogu preživjeti unutar krpelja i više od
godinu dana. Bakterije roda Anaplasma uspješno preživljavaju proces presvlačenja
krpelja i infektivne su već prilikom idućeg hranjenja (Woldehiwet 2010).
7
Slika 3. Ixodes ricinus Slika 4. Rhipicephalus sanguineus
(Preuzeto: www.influentialpoints.com) (Preuzeto: www.plagasenred.com.ar)
1.5. Patogeneza bakterija iz porodice Anaplasmataceae
Točni mehanizmi nastanka bolesti koje uzrokuju bakterije roda Anaplasma još su
u procesu istraživanja. Zaražene stanice in vitro podliježu lizi eritrocita te nekrozi ili
apoptozi. In vivo infekcija može biti povezana s hemolitičkom anemijom za vrstu A.
marginale i nespecifičnom bolešću iskazanom leukopenijom, blagom anemijom,
trombocitopenijom i blagim oštećenjem jetre kod vrste A. phagocytophilum. Anemija
uzrokovana A. marginale najčešće je rezultat direktne lize eritrocita. A. platys uzrokuje
cikličku trombocitopeniju povezanu s nastankom morula u trombocitima periferne krvi.
Poznata su dva mehanizma razaranja trombocita: direktno, kao posljedica replikacije
bakterije, ili indirektno, kao posljedica imunološke reakcije (Brenner 2005).
Bakterije roda Anaplasma prianjaju na površinske glikozilirane proteine stanice
svog domaćina. Površinski receptor A. phagocytophilum je P selektin glikoprotein
ligand 1 (PSGL-1) (Troese 2009). Nakon prianjanja, bakterija endocitozom ulazi u
stanicu i ostaje u vakuolama koje su u slučaju A. phagocytophilum rani endosomi.
8
Bakterijske stanice umnožavaju se unutar citoplazmatske vakuole nakon čega nastaju
stanice čvrste jezgre koje zatim egzocitozom izlaze iz stanice (Slika 5). A.
phagocytophilum onemogućava normalnu funkciju neutrofila uključujući motilitet,
fagocitozu, mehanizam oksidativnog praska, interakcije neutrofila s endotelom te
ometa regulaciju apoptoze (Carrade 2009).
Slika 5. Ulazak bakterije iz porodice Anaplasmataceae u stanicu
te stvaranje „morula“ (Rikihisa 2010)
9
1.6. Klinička slika
Karakteristični simptomi u zaraženih sisavaca su visoka temperatura, manjak
apetita, inkluzije u neutrofilima, neutropenija i trombocitopenija (Engvall i Egenvall
2002). Zabilježena je pojava pobačaja i smanjene spermatogeneze kod ovaca i goveda
(Woldehiwet i Scott 1993). Na ozbiljnost infekcije utječe nekoliko faktora kao što su
vrsta anaplazme, drugi patogeni, dob, imunološki status i opće stanje domaćina.
Klinički simptomi kod ljudi variraju od blagih, simptoma sličnih gripi, do infekcije
opasne po život. Međutim, većina ljudskih infekcija rezultira minimalnim ili nikakvim
kliničkim manifestacijama (Dumler i sur. 2005). Infekcija bakterijama porodice
Anaplasmataceae uspješno se liječi antibioticima iz skupine tetraciklina.
1.7. Genetska identifikacija
Identifikacija i klasifikacija bakterijskih vrsta iz porodice Anaplasmataceae vrši se
analizom 16S rRNA, komponenti malih podjedinica prokariotskih ribosoma. 16S
rRNA geni evolucijski su visoko uščuvani pa se stoga koriste za ranu dijagnostiku i
konstrukciju filogenetskih stabala. Izuzev 16s rRNA također se koriste vrlo
konzervirani geni ankA, groESL, msp2 ili msp4 (Stuen 2007).
Osim razlikovanja vrsta na ovaj način moguće je razlučiti i sorte bakterija koje
mogu varirati u stupnju patogenosti. Pa se tako postojanje manjih razlika u 16S rRNA
sljedova koristi za identifikaciju varijanti A. phagocytophilum koje inficiraju ljude. Pet
varijanti A phagocytophilum sa značajnim razlikama u 16S rRNA slijedu je otkriveno
da inficiraju pse (Stuen 2007).
10
1.8. Cilj istraživanja
Vrste iz porodice Anaplasmataceae složeno je uzgojiti na staničnim kulturama te
ih je teško dokazati u kliničkim uzorcima različitim bojanjima. Stoga se u
istraživanjima koriste molekularne metode, a najčešće lančana reakcija polimerazom i
posljedično sekvenciranje umnoženih dijelova 16S rRNA ili drugih gena. Budući da ne
postoje podaci o vrstama prisutnim u Hrvatskoj, cilj ovog diplomskog rada jest istražiti
koje su vrste iz obitelji Anaplasmataceae prisutne u pasa te utvrditi učestalost pojedinih
vrsta.
11
2. Materijal i metode
2.1. Materijali
2.1.1. Uzorci DNA pasa
Korišteni su uzorci DNA iz krvi pasa arhive Laboratorija za parazitologiju
Zagrebačkog veterinarskog instituta. Uzorkovanje je prethodno napravljeno na 68 pasa
stacioniranih u Zagrebu, Splitu, Visu, Puli te Imotskom. U slučaju zagrebačkih pasa
radilo se o vojnim psima koji su se kretali diljem zemlje te nije moguće ustvrditi točnu
lokaciju u trenutku infekcije nekom od bakterija iz porodice Anaplasmataceae.
2.1.2. Specifične početnice
Za dokazivanje vrsta unutar rodova anaplazmi i erlihija umnažan je ciljni odsječak
male podjedinice ribosomalne rRNA. Korišteni su parovi početnica ge3a i ge3r za
primarnu reakciju kojom su dobiveni odsječci veličine oko 932 pb. U sekundarnoj
reakciji „nested“ PCR-a, korištene su početnice ge9f i ge2 za dobivanje manjeg
odsječka od oko 546 pb (Chen i sur. 1994). Slijed nukleotida korištenih početnica
pokazan je u Tablici 2.
Tablica 2. Prikaz početnica, slijeda nukleotida te veličina umnoženog dijela DNA
Početnica: Slijed nukleotida: Veličina odsječka:
ge3a (5′ CACATGCAAGTCGAACGGATTATTC)
ge10r (5′ TTCCGTTAAGAAGGATCTAATCTCC) 932 pb
ge9f (5′ AACGGATTATTCTTTATAGCTTGCT)
ge2 (5′ GGCAGTATTAAAAGCAGCTCCAGG) 546 pb
12
2.2. Metode
2.2.1. Protokol
DNA izolirana iz krvi pasa umnožena je lančanom reakcijom polimeraze. Zatim su
izolirani uzorci koji su se elektroforezom dokazali pozitivnima. Na njima je provedena
sekundarna reakcija metodom „nested“ PCR-a. Dobiveni uzorci pročišćeni su te poslani
na sekvenciranje u tvrtku Macrogen (Amsterdam, Nizozemska). Sekvence su potom
analizirane računalnim programom Lasergen te uspoređene sa poznatim genomima
pohranjenim u bazi podataka GenBank.
2.2.2. Izdvajanje DNA
Za izdvajanje DNA korišten je komercijalni kit DNA blood and tissue (Qiagen,
Hilden, Njemačka) te automatski sustav za izdvajanje DNA „QIACUBE“ (Qiagen,
Hilden, Njemačka) prema uputama proizvođača. U ranije pripremljene uzorke dodano
je 180 μl pufera ATL i 20 μl proteinaze K. Ovako pripremljena mješavina vrtložena je
15 sekundi i centrifugirana na 14 000 okr/min tijekom jedne minute kako bi se oborile
sve čestice. Uzorci su potom inkubirani 18 sati pri temperaturi od 56 ºC. Nakon
završene inkubacije uzorci su prebačeni u automatski sustav za izdvajanje DNA
„QIACUBE” u kojem su ranije uložene i obilježene kolone te puferske otopine AL,
AW1 i AW2, 99,6 % etanol te otopina AE za ispiranje vezane DNA. Nakon završetka
automatske izolacije dobiveno je 200 μl izdvojene DNA koja će dalje biti korištena za
analizu PCR-om.
2.2.3. Lančana reakcija polimeraze
Lančana reakcija polimeraze korištena je kako bi se specifično umnožili ciljani
odsječci DNA pojedinih uzročnika. U svakoj reakciji korištene su specifične uzvodne i
nizvodne početnice, smjesa za PCR Emerald (Takara, Japan), voda slobodna od
RNA/DNA-za i ranije izdvojena DNA. Ukupan volumen po PCR reakciji bio je 50 μl,
a sastojala se od 25 μl smjese za PCR, po 1 μl svake početnice specifične za ciljane
mikroorganizme, 18 μl vode te 5 μl DNA. Reakcije su se odvijale u uređajima za PCR
13
Veriti, 2720 i 9700 (Applied Biosystems). Pri umnažanju ciljanih uzročnika korištene
su i pozitivne te negativne kontrole.
Nakon inicijalne 15-minutne denaturacije DNA, uslijedilo je 40 ciklusa kao što je
prikazano u Tablici 3.
Tablica 3. Protokol lančane reakcije polimerazom
Ciklusi PCR reakcije: Temperatura: Vrijeme:
1. denaturacija DNA 94 ºC 30sec
2. prihvaćanje početnica 55 ºC 30sec
3. sinteza komplementarnih lanaca 72 ºC 60sec
4. završno produženje lanaca 72 ºC 7min
reakcija je zaustavljena 4 ºC
2.2.4. „Nested“ PCR
Pomoću lančane reakcije polimerazom moguće je umnožiti specifične sljedove
DNA iz složene mješavine DNA. Moguće je dizajnirati početnicu kako bi se umnožio
određeni lokus iz čitavog genoma. Od jednog predloška molekule moguće je umnožiti
više od milijardu kopija PCR produkta, i to u relativno kratkom periodu. Međutim,
specifičnost PCR-a određena je specifičnošću početnica pa tako, ako se zadana
početnica može vezati za više nego jedan lokus, postoji mogućnost umnožavanja više
od jednog odsječka DNA.
Kako bi se kontrolirala specifičnost željenog produkta, koristi se sekundarna PCR
reakcija odnosno „nested“ PCR. „Nested“ PCR koristi početnice specifične za regiju
unutar već umnoženog dijela DNA. U slučaju da se u primarnoj PCR reakciji umnožio
krivi odsječak vjerojatnost da će se ista pogreška ponoviti i u sekundarnoj reakciji vrlo
je malena. Tako se dobivaju visoko specifični i kraći PCR produkti (Slika 6).
14
Slika 6. Shematski prikaz metode „nested“ PCR ( preuzeto:
http://www.ivpresearch.org/nested_pcr.htm)
2.2.5. Pročišćavanje PCR produkata
Prije određivanja nukleotidnog slijeda nužno je provesti pročišćavanje proizvoda
PCR reakcije. Za pročišćavanje proizvoda PCR-a korišten je QIAquick PCR
Purification Kit (Qiagen, Hildden, Njemačka) prema uputama proizvođača. QIAquick
PCR Purification Kit omogućuje pročišćavanje PCR proizvoda veličine od 100 bp do
10 kb uklanjanjem svih zaostalih molekula. Metoda se bazira na svojstvu silikonske gel
membrane, koja se nalazi u kolumnama, da selektivno veže DNA u uvjetima visoke
koncentracije soli dok sve druge molekule prolaze kroz membranu.
15
2.2.6. Sekvenciranje
Sekvenciranje je metoda određivanja slijeda nukleotida u željenoj sekvenci DNA
ili RNA. Najčešće je korištena Sangerova dideoksi metoda otkrivena 1977. godine, a
koristi se i danas (Slika 7). Klasična metoda zahtijeva kalup DNA, DNA-polimerazu,
početnicu, deoksiribonukleotide (dNTP) i dideoksiribonukleotide (ddNTP) koji
zaustavljaju replikaciju DNA. DdNTP-ovi mogu biti radioaktivno ili, u ovom slučaju,
fluorescentno obilježeni. Kako bi se odredile sve četiri baze, provode se četiri različita
reakcijska postupka. Pritom se dobivaju lanci različite duljine, a završni nukleotid je
označen bojom. Lanci se razdvajaju po veličini i tako se određuje točan slijed
nukleotida (Sanger 1977).
Slika 7. Sangerova metoda sekvencioniranja (preuzeto iz rada: Sequencing: how is
DNA read?, Olena Morozova, Genome BritishColumbia, 2009)
16
Tvrtka Macrogen koristi automatski sustav ABI 3730xl (Applied Biosystems) koji
se bazira na Sangerovoj metodi. Fragmenti se odvajaju pomoću kapilarne elekroforeze,
a ddNTP-ovi se očitavaju pomoću fluorescentnih signala eksicitranih laserom,
sprektralno odvojenih i uhvaćenih CCD kamerom.
2.2.7. Analiza sekvenci
Dobivene sekvence su obrađene u programu Lasergen s pripadajućim
potprogramima SeqMan i EditSeq. Obrađene sekvence provučene su kroz internetsku
bazu poznatih genoma GenBank pomoću tražilice BLAST (Basic Local Alignment
Search Tool) te je određena pripadnost vrsti bakterije iz porodice Anaplasmataceae.
17
3. Rezultati
U svrhu ovog istraživanja analizirano je 68 uzoraka DNA metodom „nested“
lančane reakcije polimeraze. Metodom kapilarne elektroforeze pozitivnima su se
pokazala 22 uzorka što čini 32 % ukupnog broja uzoraka. Drugim riječima, gotovo
jedna trećina uzoraka sadržavala je DNA neke od bakterija iz porodice
Anaplasmataceae (Slika 8).
Slika 8. Grafički prikaz udjela inficiranih jedinki u ukupnom broju testiranih pasa
Kao negativna kontrola korištena je voda bez RNA/DNA-za, a kao pozitivna
kontrola DNA A. phagocytophilum iz arhiva Laboratorija za parazitologiju Hrvatskog
veterinarskog instituta. Rezultati elektroforeze prikazani su na Slici 9. Negativna
kontrola ukazuje na to da pri provođenju reakcije PCR nije bilo kontaminacije.
Pozitivna kontrola s uzorkom DNA A. phagocytophilum dokazuje dobru provedbu svih
koraka PCR-a.
neinficirani psi68%
inficirani psi32%
Udio inficiranih jedinki u ukupnom uzorku
neinficirani psi inficirani psi
46
22
18
Slika 9. Rezultati elektroforeze nakon sekundarne reakcije “nested” PCR-om.
Pozitivni rezultati označeni su plavim kružićem, negativna kontrola zelenim
kvadratićem a pozitivna kontrola ružičastim peterokutom.
Slika se nastavlja na idućoj stranici.
19
Slika 9. Rezultati elektroforeze nakon sekundarne reakcije “nested” PCR-om.
Pozitivni rezultati označeni su plavim kružićem, negativna kontrola zelenim
kvadratićem a pozitivna kontrola ružičastim peterokutom
20
Pozitivni uzorci (n = 22) umnoženi PCR metodom pomoću selektivnih početnica
poslani su dalje na sekvenciranje. Analizom dobivenih sekvenci pronađeno je
podudaranje s tri različite vrste iz porodice Anaplasmataceae: A. platys, A.
phagocytophilum i Wolbachia sp. Prema dobivenim sekvencama, u 14 uzoraka
potvrđena je 100 % podudarnost s izolatom A. platys. Navedeni izolat pohranjen je u
bazi podataka GenBank pod pristupnim brojem: KC525894.1. Za 4 uzorka tražilicom
BLAST pronađena je 100 % podudarnost s izolatom A. phagocytophilum, pohranjenim
pod pristupnim brojem: NC_007797. Također, u 4 uzorka dokazana je vrsta Wolbachia
endosimbiont oblića Dirofilaria repens. Dobivena sekvenca imala je 100 %
podudarnost s izolatom pohranjenom u GenBank-u pod pristupnim brojem: AJ276500.
Zastupljenost pojedine vrste u ukupnom broju testiranih uzoraka iznosi 64 % za A.
platys te 18 % za vrstu A. phagocytophilum, kao i za vrstu Wolbachia sp. Grafički
prikaz raspodijele pronađenih vrsta prikazuje Slika 10.
Slika 10. Grafički prikaz raspodjele pronađenih vrsta Anaplasmataceae
A. platys64%
Wolbachia18%
A. phagocytophilum
18%
Pronađene vrste
A. platys
Wolbachia
A. phagocytophilum
21
Uzorci krvi pasa uzeti su s područja Pule, Splita, Imotskog, Visa te Zagreba. U
slučaju većine zagrebačkih pasa radilo se o vojnim psima koji su putovali diljem zemlje,
pa ne možemo ustvrditi točnu lokaciju gdje je došlo do ugriza krpelja. Od 22 pozitivna
uzorka, 13 jedinki pasa ima nepoznatu lokaciju ugriza krpelja, a za 8 jedinki lokacija
ugriza je poznata. Broj pronađenih vrsta iz porodice Anaplasmataceae prema mjestu
prebivališta pasa prikazano je u Tablici 4.
Tablica 4. Broj pronađenih vrsta iz porodice Anaplasmataceae prema mjestu
prebivališta pasa
Na Slici 11. možemo vidjeti geografsku rasprostranjenost uzoraka poznatog
podrijetla u Hrvatskoj. Deset uzoraka krvi pasa A. platys bilo je nepoznatog podrijetla,
no za dva uzorka poznato je da su iz Splita, a po jedan s Visa te iz Imotskog. Krv pasa
u kojima je pronađena Wolbachia sp. uzorkovana je u Puli, Zagrebu te Imotskom, dok
jedna lokacija nije poznata. Bakterija A. phagocytophilum utvrđena je u jednom uzorku
krvi psa iz Zagreba te tri uzorka nepoznatog podrijetla.
22
Slika 11. Geografska rasprostranjenost vrsta bakterija iz porodice Anaplasmataceae u
Hrvatskoj prema poznatim lokacijama uzorkovanja krvi pasa
23
4. Rasprava
Ovo istraživanje o raznolikosti i učestalosti vrsta iz porodice Anaplasmataceae u
pasa prvo je takvo provedeno u Hrvatskoj. S obzirom na to da do sada nisu napravljena
slična istraživanja u Hrvatskoj, dobivene rezultate možemo usporediti jedino s
istraživanjima u Europi te dijelovima svijeta podneblja sličnog ovim prostorima te s
istraživanjima o prevalenciji krpelja prijenosnika. Poznato je osam vrsta koje su
patogene za pse, od kojih četiri obitavaju na području Europe. To su: A. platys, A.
phagocytophilum, E. canis i E. chaffeensis. S obzirom na to, moglo bi se pretpostaviti
da su prisutne i u Hrvatskoj. Pronađene su bakterije A. platys i A. phagocytophilum, te
bakterija Wolbachia endosimbiont oblića Dirofilaria repens. U ovom istraživanju
nismo naišli na vrste A. chaffeensis i E. canis.
Psi su bili testirani bez obzira na prisutnost ili odsutnost simptoma. Od 68 uzoraka
22 uzorka dokazala su prisutnost traženih vrsta. Ispostavilo se da je gotovo jedna trećina
pasa u Hrvatskoj inficirana nekom od bakterija iz porodice Anaplasmataceae.
Poznato je da A. platys, uzročnik cikličke trombocitopenije, obitava pretežno u
mediteranskim zemljama, no postoji vrlo malo zapisa o pojavljivanju ove bakterije na
području Balkana. Pseća infekcija A. platys dokazana je u SAD-u, Italiji, Francuskoj,
Grčkoj, Španjolskoj, Tajvanu, Tajlandu i Venezueli. Dijelomične sekvence 16S rRNA
gena A. platys potvrđene su također u pasa iz Australije, Kine i Japana (Hisashi i sur.
2002). Prvi zabilježeni slučaj infekcije bakterijom A. platys u psa iz Hrvatske opisan je
2012. godine u istraživanju u Njemačkoj, a radilo se o psu uvezenom iz Hrvatske u
Njemačku. Napravljen je krvni premaz te su pronađene bazofilne inkluzije u
trombocitima. Da je riječ o vrsti A. platys potvrđeno je lančanom reakcijom polimeraze
(Dyachenko i sur. 2012). U ovom istraživanju, bakterija A. platys dokazana je na više
lokaliteta, a možemo primjetiti veću učestalost na području Dalmacije. Klimatski uvjeti
u Dalmaciji slažu se s onima u Španjolskoj, Grčkoj, Italiji, Japanu i Izraelu gdje je
dokazana prisutnost ove bakterije. Osim toga, prevalencija vektora Riphicephalus
sanguineus također se ispostavila češćom u toplijim mediteranskim zemljama s
obzirom na to da je krpelj osjetljiv na niske temperature (Dantas- Torres 2010).
24
Bakterija A. phagocytophilum detektirana je u sisavaca i krpelja u gotovo svim
europskim zemljama (Strle 2004). Pronađena je u pasa (Bellstrom 1989), mačaka
(Bjoersdorff i sur. 1999), konja (Bjoersdorff i sur. 1990), lisica (Petrovac i sur. 2003),
divljih svinja (Petrovec i sur. 2002) i mnogih drugih. U ovom istraživanju dokazana je
prisutnost bakterije A. phagocytophilum na području Zagreba. Nalaz A.
phagocytophilum sukladan je informacijama o geografskoj distribuciji vektora ove
bakterije, krpelja Ixodes ricinus. Ixodes ricinus široko je rasprostranjen diljem Europe
pogotovo u kontinetalnim dijelovima no prevalencija mu se pokazala rjeđom u
mediteranskim područjima zbog nižeg stupnja vlage (Beugnet 2009). Za razliku od
krpelja Riphicephalus sanguineus koji je osjetljiv na nisku temperaturu, Ixodes ricinus
osjetljiv je na stupanj vlage, ne podnosi relativnu vlažnost okoliša nižu od 80 %
(Estrada-Pena 2006).
U četiri uzorka dokazan je rod Wolbachia endosimbiont oblića Dirofilaria repens.
Ovaj nalaz nam ukazuje da su navedeni psi bili zaraženi ne samo sa bakterijom
Wolbachia, već i s oblićem koji je prijenosnik. Dirofilaria je parazit iz koljena
Nematoda, a prirodno inficira pse, mačke, rakune i medvjede (Živičnjak i sur. 2006).
Godine 2010. provedeno je istraživanje o raširenosti dirofilarija na Istarskom
poluotoku. Rezultati su pokazali da je gotovo trećina (30.5 %) nasumice izabranih pasa
(n=200) zaražena rodom Dirofilaria, od čega je 45.9 % činila vrsta D. repens (Holler i
sur. 2010). Prema tome, dokaz bakterije Wolbachia endosimbionta D. repens u ovom
istraživanju nije iznenađujuć, posebice jer je jedan nalaz lociran upravo na području
Istre, u Puli. Osim u Istri, Wolbachia je pronađena i u drugim dijelovima Hrvatske.
Uzorak od 68 pasa mogao bi se smatrati preliminarnim istraživanjem koje je nužno
napraviti prvo na manjem broju uzoraka kako bi se ustanovilo da li je šire istraživanje
potrebno. Visoki udio od skoro trećine nasumično testiranih pasa koji su se ispostavili
kao nosioci neke od vrsta iz porodice Anaplasmataceae dobar je indikator kako bi
opsežnije istraživanje itekako bilo potrebno.
S obzirom na to da posljedice zaraze vrstama bakterija iz porodice
Anaplasmataceae mogu varirati od blagih do letalnih, a slično istraživanje do sad nije
rađeno, ispitati učestalost infekcije te identificirati vrste patogena prvi je važan korak
ka zaštiti pasa.
25
Ovim istraživanjem ukazana je potreba za daljnjim ispitivanjima
rasprostranjenosti, prevalencije, infektivnosti te vektorskog prijenosa bakterija iz
porodice Anaplasmataceae na većem broju uzoraka kako bi se dobili statistički
precizniji podaci o stanju zaraze pasa u Hrvatskoj. Buduća istraživanja trebala bi se
usmjeriti također na prevenciju zaraze. Jedan od pristupa mogao bi biti razvoj
učinkovitije zaštite od ugriza krpelja koji prenose zarazu. Unatoč mnogobrojnim
oblicima repelenata, ugrizi krpelja i dalje su vrlo česti. Drugi pristup mogao bi biti
razvoj cjepiva koja bi pružala zaštitu od same infekcije bakterijama. Trenutno
učinkovito cjepivo ne postoji.
26
5. Zaključak
Istraživanje je provedeno na 68 nasumično izabranih uzoraka krvi pasa arhive
Laboratorija za parazitologiju veterinarskog instituta. Cilj istraživanja bio je utvrditi
koje su vrste bakterija iz porodice Anaplasmataceae prisutne kao i utvrditi učestalost
pojedinih vrsta u pasa u Hrvatskoj.
Dokazana je prisutnost vrsta iz porodice Anaplasmataceae u 22 uzorka, odnosno
32 %. Utvrđena je prisutnost tri vrste: A. platys, A phagocytophilum i Wolbachia
endosimbiont oblića Dirofilaria repens.
Najučestalija vrsta sa 68% pokazala se A. platys, dok su A. phagocytophilum i
Wolbachia endosimbiont D. repens bile podjednako zastupljene sa udijelom od 18 %
PCR-om pozitivnih pasa.
Kako bi se detaljnije ispitala pojavnost i učestalost vrsta bakterija iz porodice
Anaplasmataceae u populaciji pasa u Hrvatskoj potrebno je napraviti šire istraživanje
na većem broju uzoraka.
27
6. LITERATURA
Aguirre E., Sainz A., Dunner S., Amusategui I., Lopez L., Rodrıguez-Franco F.,
Luaces I., Cortes O., Tesourod M. A. (2004): First isolation and molecular
characterization of Ehrlichia canis in Spain. Veterinary Parasitology 125: 365–372.
Bedrica Lj., Marinculić A. (2006): Krpelji šikare i bolesti uzrokovane nekim krvnim
patogenim organizmima pasa i mačaka. Hrvatski Veterinarski Vjesnik 2: 99-111-
Bellstrom L. (1989): Fastingburna rickettsioser. Svensk Veterinartidning 41: 549–
553.
Beugnet F., Marié J. L. (2009): Emerging arthropod borne diseases of companion
animals in Europe. Veterinary Parasitology 163: 298-305.
Bjoersdorff A., Svendenius L., Owens J.H. and Massung R.F. (1999): Feline
granulocytic ehrlichiosis – a report of a new clinical entity and characterisation of the
infectious agent. Journal of Small Animal Practice 40: 20–24.
Brenner J. D. (2005): Bergeys manual of systematic bacteriology, second edition,
volume two. Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State
University, East Lansing, MI 48824-4320, USA
Carrade D.D, Foley J.E., Borjesson D.L., Sykes J.E. (2009): Canine granulocytic
anaplasmosis: a review. Journal of Veterinary Internal Medicine 23: 1129–1141.
Chen, S. M., Dumler J. S., Bakken J. S., and Walker D. H. (1994): Identification of a
granulocytotropic Ehrlichia species as the etiologic agent of human disease. Journal
od Clinical Microbiology 32: 589–595.
Cvetnić Ž. (2013): Bakterijske i gljivične zoonoze. Medicinska nakada, Zagreb
28
Cote E. (2011): Clinical veterinary advisor dogs and cats. Elsevier, St. Louis
Dantas-Torres (2010): Biology and ecology of the brown dog tick, Rhipicephalus
sanguineus. Parasites & Vectors 3: 26.
Dyachenko V., Pantchev N., Balzer H. J., Meyersen A., Straubinger R. K. (2012):
First case of Anaplasma platys infection in a dog from Croatia. Parasites & Vectors 5:
49.
Dumler J. S., Choi K. S., Garcia J. C., Barat N. S., Scorpio D. G., Garyu J.W., Grab
D. J., Bakken J. S. (2005): Human granulocytic anaplasmosis and Anaplasma
phagocytophilum. Emerging Infectious Diseases 11: 1828–1834.
Dunning Hotopp J. C., Lin M., Madupu R., Crabtree J., Angiuoli S. V., Eisen J. A.
(2006): Comparative genomics of emerging human ehrlichiosis agents. PLoS
Genetics 2: e21.
Engvall E.O., Egenvall A. (2002): Granulocytic ehrlichiosis in Swedish dogs and
horses. Internal Journal of Medical Microbiology 291: 100–103.
Estrada-Pena A., Venzal M., Sanchez C. (2006): The tick Ixodes ricinus: distribution
and climate preferences in the western Palaearctic. Medical and Veterinary
Entomology 20: 189–197.
Harvey J. W., Simpson C. F., Gaskin J. M. (1978): Cyclic thrombocytopenia induced
by a Rickettsia-like agent in dogs. Journal of Infectious Diseases 137, 182–188.
Hisashi I., Kaori F., Koutaro M., Masaru O., Kenji N., Ryusei K., Munetaka H.,
Takafumi O. (2002) : Demonstration of Anaplasma (Ehrlichia) platys inclusions in
peripheral blood platelets of a dog in Japan. Veterinary parasitology 110: 145-52.
Hisashi I., Oyamada M., Kelly P. J., Jacobson L. A., Fournier P. E., Itamoto K.,
Okuda M., Brouqui P. (2005): Molecular Detection of a New Anaplasma Species
29
Closely Related to Anaplasma phagocytophilum in Canine Blood from South Africa.
Journal of Clinical Microbiology 43: 2934-2937.
Holler D., Racz A., Bošnir J., Petrak O. (2010): Raširenost dirofilarioze na području
unutrašnjosti istarskoga poluotoka. Medica Jadertina 40: 67-74.
Keysary A., Waner T., Rosner M., Warner C. K., Dawson J. E., Zass R., Biggie K. L.,
Harrus S. (1996): The first isolation, in vitro propagation, and genetic characterization
of Ehrlichia canis in Israel. Veterinary Parasitology 62, 331-340.
Pruneau L., Moumène A., Meyer D. F., Marcelino I., Lefrançois T., Vachiéry N.
(2014): Understanding Anaplasmataceae pathogenesis using “Omics” approaches.
Frontiers in Cellular and Infection Microbiology 4: 86.
Petrovec M., Bidovec A., Sumner J. W., Nicholson W. L., Childs J. E. and Avsic-
Zupanc T. (2002): Infection with Anaplasma phagocytophila in cervids from
Slovenia: Evidence of two genotypic lineages. Wiener Klinische Wochenschrift 114:
641–647.
Petrovec M., Sixl W., Schweiger R., Mikulasek S., Elke L., Wust G., Marth E.,
Strasek K.Stunzner D. and Avsic-Zupanc T. (2003): Infections of wild animals with
Anaplasma phagocytophilum in Austria and the Czech Republic. Annals of the New
York Academy of Sciences 990: 103–106.
Rikihisa Y. (2010): Anaplasma phagocytophilum and Ehrlichia chaffeensis
subversive manipulation of host cells. Nature Reviews Microbiology 8: 328-339.
Sanger F., Nicklen S., Coulson A. R. (1977): DNA sequencing with chain-terminating
inhibitors. Journal of Molecular Microbiology 94: 441-448.
Strle F. (2004): Human granulocytic ehrlichiosis in Europe. International Journal of
Medical Microbiology 293: 27–35.
30
Stuen, S. (2007): Anaplasma phagocytophilum - the most widespread tick-borne
infection in animals in Europe. Veterinary Research Communications 31: 79–84.
Troese M. J., Carlyon J. A. (2009): Anaplasma phagocytophilum dense-cored
organisms mediate cellular adherence through recognition of human P-selectin
glycoprotein ligand 1. Infection and Immunity 77: 4018- 4027.
Woldehiwet Z. (2010): The natural history of Anaplasma phagocytophilum.
Veterinary parasitology 167: 108-122.
Woldehiwet Z., Scott G. R. (1993): Rickettsial and chlamydial diseases of domestic
animals. Pergamon Press 84: 233–254.
Živičnjak T., Martinkovic F., Beck R. (2006): Canine Dirofilariosis in Croatia. Spread
and public health impact. Proceedings of the 5th Croatian congress on infectious
diseases 23 – 2
Životopis
Vanina Pogačar rođena u Zagrebu 11.10.1988 godine završila je osnovnu školu
Voltino nakon čega upisuje Hotelijersko- turističku strukovnu školu. Po završetku
srednje škole 2007. godine upisuje smjer opće biologije na Prirodoslovno-
matematičkom fakultetu Sveučilišta u Zagrebu. Nakon završene tri godine
preddiplomskog studija nastavlja školovanje na istom fakultetu upisom diplomskog
studija Eksperimentalne biologije, modul fiziologija i imunobiologija. 2011. Dobiva
posebnu Rektorovu nagradu za sudjelovanje u manifestaciji “Noć biologije” te iste
godine odlazi na studentski program “Work and travel” u SAD gdje usavršava engleski
jezik te stječe radno iskustvo. Treći semester diplomskog studija dobiva ERASMUS
stipendiju te odlazi na razmjenu studenata na Sveučilište u Gironi, Španjolska gdje
pohađa stručne kolegije kao i laboratorijsku praksu iz područja genetike. Koristi se
Microsoft Office programskim paketom.
top related