slide - aplicaÇÕes da citometria de fluxo no diagnÓstico oncohematolÓgico
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Aplicações da Citometria de Fluxo no diagnóstico oncohematológico
Dra. Nydia Strachman BacalHematologista e Patologista Clínica
Dra. Nydia Strachman BacalHematologista e Patologista Clínica
Aplicações da Citometria de Fluxo no diagnóstico oncohematológico
Essas partículas estão suspensas em meio líquido
CÂMERA DE FLUXOCÂMERA DE FLUXO
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Sistema que gera um fluxo contínuo laminar de partículas, que passam uma a uma frente a um feixe de laser
Orifício com Diâmetro: 50 a 250 �mOrifício com Diâmetro: 50 a 250 �m
Freq
Fluorescence
FSC Sensor
Detector de Fluorescência(FL1,FL2, FL3 e FL4)
(tubos fotomultiplicadores)
Fotomultiplicadores
Impulsos elétricos Sinais analógicos
Sinais digitais
Distribuição por frequênciaHistogramas
Lasers - FluorocromosFluorocromo Laser (nm) Emissão (nm)
FITC 488 525R-PE (PE) 488 575Pe-Cy5 (TC1) 488 667PerCP (BD2) 488 675PerCP/Cy5.5 (BD) 488 6957-AAD 488 655Iodeto de propidium 488 570
Texas Red 595 615
APC 633, 635 660Cy5 633, 635 667
Citometria de Fluxo Imunofenotipagem
• Análise da expressão antigênica das células através da ligação antígeno – anticorpo - fluorocromo
Anticorpos monoclonaisdesignados “CDs”Clusters of differentiationligam-se as células nos determinantes antigênicos ou epítopos em sua membrana, citoplasma e intranuclearmente.
444321XL
6544321FC500
654321FACSCanto
433321FACSalibur
33321FACScan
9876544321CYAN
Alexa450Alexa405APC-Cy7APC/Cy5PE-Cy7PE-Cy5.5PE-Cy5PE-TRPEFITC
Citometros de Fluxo - Fluorocromos
• Análise do conteúdo de DNA• Quantificação de reticulócitos• Análise da Subpopulação Linfocítica•••• Diagnóstico e acompanhamento de Leucemias e Linfomas• Diagnóstico e acompanhamento de Mieloma Multiplo• Mielodisplasia / Doenças Mieloproliferativas• Diagnóstico de Hemoglobinúria Paroxística Noturna• Detecção de Anticorpos Antiplaquetários• Disfunção plaquetária• Quantificação de células progenitoras (stem cell)• Detecção de Células Neoplásicas não hematopoéticas•••• Monitoramento Quimioterapia / Doença Residual Mínima•••• Avaliação imunológico de paciente transplantado e de infusão linfocitária
Outras aplicações : Estudos da função celular, Apoptose, MDR (Múltipla Resistência à Drogas) , Procedimentos em Hemoterapia (Detecção de Anticorpo em Anemia Auto-imune, Detecção de hemorragia feto materna, Controle de Qualidade de Leucodepleção, etc...) , HLA-B27, Teste de Antígeno Leucocitário(HLA) e Cross Match.
ALGUMAS APLICAÇÕES CLÍNICAS ATUAIS
Anti-CD3 PerCP
Anti-CD8 PE
Anti-CD4FITC
Análise da Subpopulação LinfocíticaIMUNODEFICIÊNCIA ADQUIRIDA
Anti-CD3 PerCP
Anti-CD16 /CD56PE
Anti-CD19 FITC
Aplicações:
Monitorar Imunodeficiência Adquirida (AIDS)Imunofenotipagem de LinfomasImunofenotipagem de LeucemiasMonitorar transplantesMonitorar sistema imunológicoFunção plaquetária
Estratégia de Gatesjanelas
1. FS x SSCtamanho x granularidade
2.CD45 x SSC
3. Gates sequenciais•CD19•CD3•CD138•CD34
EXPRESSÃO DO CD45 em Leucemia Aguda
Diagnóstico e acompanhamento de Leucemias, Linfomas e Mieloma
• Leucemias agudas• Linfóides x Mielóides
• Leucemias Crônicas• Linfocítica, Mielomonocítica• Linfomas leucemizados• Discrasia de Células Plasmáticas
Diferenciação Granulocítica – MO normal
Painéis de anticorpos monoclonais
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Dra.Silvia Ines Pires Ferrreira – Hemosc/ Sta Luzia -SC
LMA M3
CD45xSS
HLA-DRxCD45
CD33xCD45
CD2xCD45
CD13xCD45
CD34xCD45
CD117xCD45
CD56xCD45
CD71xCD45
MPO(c)xCD45
Diferenciação Linfóide B – MO Normal
Painéis de anticorpos monoclonais
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Pró B Pré-pre-BI Pré-pre-BII Pré-pre-BIII Madura Plasmáticaimatura B IV
Dra. Silvia Ines Pires Ferrreira – Hemosc/ Sta Luzia - SC
LLA B MADURA
LINFOMA DE BURKITT
CD34xCD45
CD19xCD45 HLA-DRxCD45
CD20xCD45
CD10xCD45
CD22xCD45
TdTxCD19
KAPPA(sup)xCD19
IgM (sup)xCD19
CD45xSS
P.O. 32a – LMA M0
ASF, 28a – LMA M0
LLC- B: Células linfóides B com restrição de cadeia leve monoclonal para kappabaixa expressão e expressão antigênica de CD5+ e CD20+ baixa expressão
Leucemia de Células Cabeludas - Hairy cell
Mieloma Múltiplo
Histograma de Tamanho x Complexidade Histograma CD138 x Complexidade
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Histograma de Monoclonalidade em Kappa intracitoplasmática
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CD56 x CD138 CD19 (-) nas células CD138 (+)
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Histograma CD45 x CD138 Histograma HLA-DR x CD138
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Histograma de Conteúdo de DNA com Hiperdiploidia
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Mielodisplasia
• PAPEL DA IMUNOFENOTIPAGEM POR CITOMETRIA DE FLUXO
• Técnica complementar / análise dentro de um contexto
• Quantificar blastos de forma exata • Discriminar Mieloblastos de Promielócitos e dos
Pró-monócitos• Estudo de mudanças fenotípicas na MDS
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M.C.DelCanizo et al Immunophenotypic analysis of myelodysplastic syndromesHaematologica/Journal of hematology vol.88(04):april 2003
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CD13
CD33CD11b
CD15
CD64CD65
CD54
CD10
CD16
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Dr Alberto Orfao - Contribuição dos Estudos Imunofenotípicos na caracterização das Síndromes Mielodisplásicas – Florianópolis - Setembro de 2004
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Dr Alberto Orfao - Contribuição dos Estudos Imunofenotípicos na caracterização das Síndromes Mielodisplásicas – Florianópolis - Setembro de 2004
HPN - Hemácias
Ausência de expressão antigênica do CD55 em 46,5% das células identificadas por Glicoforina A
Ausência de expressão antigênica do CD59 em 34,9% das células identificadas por Glicoforina A
HPN - Neutrófilos
Controle normal: CD55(+) = 99,8% Ausência de expressão antigênica do CD55 em 97,7% dos neutrófilos.
HPN - Neutrófilos
Controle normal: CD59 (+) = 100,0%
Ausência de expressão antigênica de CD59 em 82,7% das células identificadas pelo CD13.
HPN - Monócitos
Controle normal: CD14(+) = 99,8% Ausência de expressão do CD14 em 98,3% das células CD 64 (+)
Pesquisa de Anticorpo Anti-plaquetas Método Direto
Total de casos 115 pacientes com plaquetopenia.
Amostra: 10 ml de sangue em EDTA.
Equipamento: Citômetro de Fluxo – EPICS XL-MCL da Beckman Coulter
Material:
- Anti-Human IgG FITC conjugate SIGMA (F-1641)
- CD41 ou CD61 PE Immunotech (PN – IM1416)
- Tampão PBS-EDTA
Método:
As Plaquetas separadas do sangue total coletada em EDTA, são lavadas e marcadas com CD41PE e IgG FITC e analisadas no Citômetro de Fluxo.
João Carlos C. Guerra, MD, Ruth H Kanayama, PhD, Sonia S.Nozawa, PhD, Márcia R. Ioshida, PhD, Irina Y Takiri, PhD, Robson J. Lazaro, PhD, Nelson Hamerschlak, MD, Luiz Gastão M. Rosenfeld, MD, Celso Carlos C. Guerra MD and Nydia S. Bacal, MD. Low Platelet Counts: Diagnosis Using Flow
Cytometry and Anti Platelet Antibody – Blood (ASH Annual Meeting Abstracts) 2006 108: abstract 3966.
0.114
1.47
Controle Negativo
Plaquetas – 375.000/mm³ CSMCSM, 20 anos ,masc.
Plaquetas – 65.000/mm³
AVS, 31 anos, fem.
Plaquetas – 16.000/mm³
AVS
O antígeno está ausente ou presente em baixa expressão em pacientes com Síndrome de Bernard-Soulier é identificado pelo anticorpo CD42b que éespecífico para a glicoproteina plaquetária GPIbEssa glicoproteina plaquetária serve como receptor para o Fator Von Willebrande tem alta afinidade ao receptor de trombina.CD42a(GPIX), CD42d(GPV) raramente utilizadas.
CD41 (GPIIb) and CD61 (GPIIIa) – TrombasteniaTrombastenia de de GlanzmannGlanzmann
Quantificação de células progenitorasCD34 (+) - Citometria de Fluxo
Protocolo “ISHAGE”Plataforma dupla
Sangue periféricoMedula ÓsseaAféreseCordão Umbilical
Marcação fluorescente ligada aocálcio permite o estudo deativação celular
Imunofenotipagem – PaineisProliferativos - utilizados no HIAE
1. Leucose Aguda :• MPO, CD79a, CD3intra e/ou
• CD45 x SS
• Primeiro passo : 2 CD por linhagem
CD2-CD7 / CD10-CD19 / CD13-CD33 /CD4-CD14(My4) e CD34 / HLA-DR
• Conforme linhagem segue com outros Atc específicos :– CD20, CD22, IgM intra, Kappa e Lambda intra e/ou sup.
– CD 3sup., CD38, CD5, CD8
– raramente TdT
– CD11b, CD14(MO2), CD15, CD41,CD64, CD71, Glicoforina A, CD117
Imunofenotipagem – Painéis Proliferativos utilizados no HIAE
2. Doenças Linfoproliferativas B � CD19 (+) ou CD20(+) ou CD138 :
� CD5, CD10, CD11c, CD22,CD23,CD25, FMC- 7; IgM,
� Kappa e Lambda intra ou sup.,CD103, IgG,CD38,
� CD56 e HLA-DR
� 3. Doenças Linfoproliferativas T� -CD2, CD3intra e sup., CD4, CD5, CD7, CD8,
� -CD11b, CD16, CD25, CD38, CD56, CD71 e HLA-DR,
� Outros CD disponíveis:� -CD30, CD1-A, CD79b, IgG, IgD e IgA, TCRαβ/TCRγλ,
� Ti -gamma.
LEUCEMIA AGUDA
FITC PE PE-Cy5MPO c CD79a c CD3 cCD15 CD33 CD45CD2 CD7 CD45HLADR CD34 CD45CD10 CD19 CD45IgG1FITC IgG1PE CD45PE-Cy5
Painel inicial
FITC PE PE-Cy5 FITC PE PE-CY5 FITC PE PE-Cy5CD22 CD20 CD45 CD14 CD45 CD5 CD1a CD45kappa CD19 CD15 CD13 CD45 TCR g//d TCR al/b CD45Lambda CD19 CD71 glicofor. CD45 CD8 CD4 CD3IgM c CD41 CD117 CD45
CD38 CD56 CD45CD22c ? CD64 CD11b CD45
CD4 CD45
LLA-B LMA LLA T
Doenças Linfoproliferativas Crônicas
** Para suspeita de Linfoma de Hodgkin ou Linfomas agressivos de grandes células, marcar com CD30 e CD15.
FITC PE PE Cy-5HLA DR CD20 CD19CD2 CD7 CD3IgG IgG IgG
PlasmocitáriaFITC PE PE Cy-5 FITC PE PE Cy-5 FITC PE PE-Cy5kappa CD19 CD8 CD4 CD3 CD138 CD117 CD19Lambda CD19 CD16 CD56 CD3 CD38 CD56 CD19CD5 CD20 CD19 CD25 CD56 CD3 CD138 CD56 CD117CD22 CD23 CD19 CD5 HLADR CD3 CD138 CD38 CD117FMC7 CD11c CD19CD79b CD38 CD19CD103* CD25* CD19* *somente p/ HCLIgMIgDIgG
CD30 CD15CD15
Painel inicial
linoproliferativa B linfoprolifertativa T
IMUNOFENOTIPAGEM PAINEL PROLIFERATIVO NOVEMBRO/1991 A JULHO/2007
PATOLOGIAS N°DE CASOS
LEUCEMIAS AGUDAS 1954 (31,3%)LMA 1084 (17,4%)LLA 854 (13,7%)L. Bifenotipica 16 (0,2%)
NEOPLASIAS DE CÉLULAS B MADURAS 1441 (23,1%)DLPC-B/LNH-B 1238 (19,9%)NEOPLASIAS DE CÉLULAS PLASMÁTICAS 203 (3,2%)DLPC-T / NK 83 (1,3%)
DOENÇAS MIELOPROLIFERATIVAS CRÔNICAS 55 (0,9%)
SMD e LMMoC 79 (1,3%)Linfoma de Hodgkin 1 (0,02%)MO SEM DOENÇAS ONCOHEMATOLOGICAS, CONTROLES 2589 (41,5%)PÓS TRATAMENTOS, MO NORMAL e OUTRAS PATOLOGIASHEMATOGONIAS 30 (0,49%)
6232 (100%)
Imunofenotipagem de Doenças Oncohematológicas – nov/91 a julho/07
Nºtotal de casos analisados: 6 234
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OBRIGADA PELA ATENOBRIGADA PELA ATENÇÇÃO !ÃO !
Nydia S. Bacal
nsbacal@einstein.br
Grupo de Grupo de CitometriaCitometria de Fluxo do de Fluxo do LaboratLaboratóório Clrio Clíínico HIAE nico HIAE -- 20072007
Ana Claudia Miranda BritoAlexandra M.P. CavalcanteJoão Carlos de C. GuerraSonia Tsukasa NozawaRuth Hissae Kanayama
Citometro de Fluxo- nova geração
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1991 - 1ªgeração Epics Profile II1994 - 2ªgeração Epics XL – MCL2007 - 3ªgeração FC – 500
Laboratórios Externos: 65%
HIAE: 35%
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Dr Alberto Orfao - Contribuição dos Estudos Imunofenotípicos na caracterização das Síndromes Mielodisplásicas – Florianópolis - Setembro de 2004
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Fenotipos alterados Síndrome Mielodisplásica
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