rna-interferenca (rnai) v temeljnih raziskavah in biomedicini
Post on 23-Nov-2021
1 Views
Preview:
TRANSCRIPT
Genetski koncepti 2011-12 1
RNA-interferenca (RNAi)
v temeljnih raziskavah
in biomedicini
1 Genetski koncepti 2011-12,
doc. dr. Tanja Kunej
1. Koncept “Forward” in “Reverse” genetike
2. Mejniki pri odkrivanju mehanizma RNAi
3. Mehanizem fenomena RNAi
4. Primeri uporabe RNAi v genomiki, molekularni biologiji in
biomedicini
5. Nekodirajoče RNA
siRNA
miRNA
piRNA
snoRNA
Vsebina
2
Genetski koncepti 2011-12 2
PTGS: potranskripcijsko utišanje genov; Post-Transcriptional Gene Silencing
RNAi: RNA-interferenca
dsRNA: double stranded; dvoveriţna RNA, ssRNA: single stranded; enoveriţna RNA
siRNA: mala interferenčna RNA; small interfering RNA;
shRNA: kratka lasnična RNA; short hairpin RNA
miRNA: mikro RNA; microRNA
Dicer: citoplazemski proteinski kompleks, ki cepi dsRNA
RISC: z RNA inducirani kompleks za utišanje genov; RNA-Induced Silencing Complex
Drosha: proteinski kompleks, ki cepi primarne miRNA (primary miRNA; pri-miRNAs), da
nastanejo prekurzorske miRNA (precursor miRNAs; pre-miRNAs)
RdRP: od RNA odvisna RNA polimeraza; RNA-dependent RNA polymerase
Novi izrazi:
3
Argonavt: katalitična komponenta kompleksa RISC
piRNA : Piwi-interacting RNA
PIWI: P-element induced wimpy testes
• Hiwi: homolog pri človeku
• Miwi, Mili: homolog pri miši
Novi izrazi:
4
Genetski koncepti 2011-12 3
Odkritje leta, breakthrough of the year for the most significant development in scientific research
Science
1996 understanding HIV
1997 Dolly, the first mammal to be cloned from adult cells
1998 the accelerating universe, dark matter
1999 capturing the promise of youth with stem cells
2000 full genome sequencing
2001 nanocircuits
2002 small RNAs
2003 dark energy
2004 Spirit rover landed on Mars
2005 evolution in action
2006 proof of the Poincaré conjecture
2007 human genetic variation
2008 cellular reprogramming
2009 Ardipithecus ramidus
2010 The first quantum machine
5
Molekula leta
1989 PCR and DNA polymerase
1990 the manufacture of synthetic diamonds
1991 buckminsterfullerene
1992 nitric oxide
1993 p53
1994 DNA repair enzyme
2002 All-trans-Retinoic Acid
2003 Adenovirus GP&NP of the Ebola Vaccine
2004 Imidazoleacetic acid-ribotide
2005 4E10
2006 hsa-mir-155 and hsa-let-7a-2
2007 PKD2L1
2008 anti-SAG 421-433 catalytic IgA
2009 Sleeping Beauty Transposase SB 100X
2010 FOXM1
Awarded by the International
Society for Molecular and Cell
Biology and Biotechnology
Protocols and Researchers
Yanaihara in sod. Unique microRNA molecular profiles in lung cancer diagnosis and
prognosis. Cancer Cell. 2006;9:189-98.
• miRNA expression profiles are diagnostic and prognostic markers of lung cancer
• High hsa-mir-155 and low hsa-let-7a-2 expression correlated with poor survival in
lung cancer.
6
Genetski koncepti 2011-12 4
1. Koncept “Forward” in “Reverse” genetike
2. Mejniki pri odkrivanju mehanizma RNAi
3. Mehanizem fenomena RNAi
4. Primeri uporabe RNAi v genomiki, molekularni biologiji in
biomedicini
5. Nekodirajoče RNA
Vsebina
7
“Forward genetics”
Genetska analiza
od fenotipa do genotipa:
-analiza kandidatnih genov.
“Reverse genetics”
Genetska analiza
od genotipa do fenotipa:
-tehnologija “knock-out”,
-tehnologija “antisense”,
-tehnologija z ribocimi,
-RNAi. McManus in Sharp, 2002
Koncept “Forward” in “Reverse” genetike
8
Genetski koncepti 2011-12 5
1. Koncept “Forward” in “Reverse” genetike
2. Mejniki pri odkrivanju mehanizma RNAi
3. Mehanizem fenomena RNAi
4. Primeri uporabe RNAi v genomiki, molekularni biologiji in
biomedicini
5. Nekodirajoče RNA
Vsebina
9
Namen: pridobiti petunije s cvetovi temnejše barve.
Metode: vnos gena za ključni encim pigmentacije.
Rezultat: Rastline z dodatno kopijo gena za pigmentacijo imajo bele in belo-vijolične cvetove in ne temno vijolične.
Zniţano izraţanje endogena in transgena.
Pojav so poimenovali:
ko-supresija izraţanja genov;
"co-suppression of gene expression“.
Napoli in sod. Plant Cell 1990;2: 279-289.
Jorgensen in sod. Trends Biotechnol. 1990;8: 340-344.
Odkritje RNAi
Griffiths in sod., str. 445 10
Genetski koncepti 2011-12 6
Inaktivacija mex-3B ustavi embrionalni
razvoj: a: negativna kontrola,
b: embrio starša brez injicirane dsRNA
(normalen vzorec endogene mex-3 RNA),
c: embrio starša z injicirano mex-3B
antisense RNA,
d: embrio starša z injicirano mex-3B dsRNA
(ni detekcije mex-3 RNA).
Odkritje RNAi
Guo in Kemphues, 1995
Vnos protismerne “antisense” molekule RNA za inaktivacijo gena.
Enak rezultat z vnosom smerne “sense” molekule RNA!
Fire in Mello, 1998:
Vnos dvoveriţne RNA (dsRNA) v C. elegans, kar povzroči
sekvenčno-specifično utišanje gena.
Pojav poimenujejo RNA interferenca (RNAi). Caenorhabditis elegans
Fire A. in sod. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in
Caenorhabditis elegans. Nature 1998; 391: 806-811. 5209 citatatov (11/2011).
11
Mejniki v odkrivanju mehanizma RNAi
-1990: Ko-supresija vijolične barve cvetov pri petunijah
Napoli in sod. Plant Cell 1990; 2:279-289.
-1995: “Antisense” in “sense” mRNA zavirata izraţanje (ekspresijo)
Guo in Kemphues. Cell 1995; 81:611-620.
-1998: Vnos dvoveriţne RNA v celico sproţi utišanje genov (RNAi)
Fire A in Mello CC. Nature 1998; 391:806-811.
-2000: Vnešena dsRNA se razcepi na 21-23 bp dolge molekule (siRNA)
Zamore in sod. Cell 2000; 101:25-33.
-2001: Vnos siRNA omogoči RNAi v sesalskih celičnih kulturah
(vnos dsRNA je sproţal interferonski odgovor).
Elbashir in sod. Nature 2001; 411:494-498.
-2001: Encim Dicer cepi dsRNA v siRNA
Bernstein in sod. Nature 2001; 409:363-366. 12
Genetski koncepti 2011-12 7
-2001: Odkrit nov razred majhnih RNA s potencialno regulatorno vlogo, ki
jih poimenujejo mikro RNA (microRNA; miRNA)
Bartel,Tuschl, Ambros Lab
-2006: Nobelova nagrada za fiziologijo in medicino
Fire A in Mello CC.
-2006: Odkritje fenomena RNAa (small RNA-induced gene activation)
Li LC s sod. Small dsRNAs induce transcriptional activation in
human cells. PNAS 2006; 103:17337-42.
http://www.rnaiweb.com/RNAi/RNAi_Timeline/ 13
Mejniki v odkrivanju mehanizma RNAi
Obstoj mehanizma RNAi so lahko potrdili pri večini
evkariontov in ugotovili vpletenost v različne funkcije:
-obramba celice pred virusi,
-preprečevanje razširjanja transpozonov,
-potranskripcijsko uravnavanje (post-transcriptional regulation),
fino uravnavanje količine mRNA,
-embrionalni razvoj.
14
Genetski koncepti 2011-12 8
1. Koncept “Forward” in “Reverse” genetike
2. Mejniki pri odkrivanju mehanizma RNAi
3. Mehanizem fenomena RNAi
4. Primeri uporabe RNAi v genomiki, molekularni biologiji in
biomedicini
5. Nekodirajoče RNA
Vsebina
15
Mehanizem RNAi se sproţi ob vstopu dolge dvojnovijačne RNA
(dsRNA) v obliki:
-endogene dvojnovijačne RNA (A),
-virusa (B),
-mikro RNA (C),
-siRNA, shRNA. Ţe majhne količine siRNA
sproţijo mehanizem RNAi. 16
Genetski koncepti 2011-12 9
Mehanizmi za tvorjenje dsRNA – dvoveriţne RNA
A) Replikacija viralne enoveriţne RNA,
B) prepisovanje (transkripcija) obrnjenih ponovitev (inverted repeats),
C.1) delovanje RdRP (od RNA odvisna polimeraza RNA) pri rastlinah in
C. elegans,
C.2) prepisovanje s promotorjev na nasprotnih straneh (trans)gena ali
transpozona (nastaneta dve komplementarni verigi RNA).
Matheu in
Bender, 2004 17
Processes
pre-miRNA to
mature miRNA
Initiates formation of
RNA-induced silencing
complex (RISC) –
responsible for gene
silencing.
He in Hannon 2004
Shared biosynthetic
pathways of siRNAs
and miRNAs
processes primary
transcripts (pri-miRNA) to
60 bp long pre-miRNA
Drosha
Dicer
18
Genetski koncepti 2011-12 10
a) siRNA
b) DICER razcepi
dsRNA v siRNA.
“Antisense” veriga siRNA
se vgradi v
RISC (RNA-Induced
Silencing Complex)
in omogoči
prepoznavanje
tarčne mRNA.
McManus in Sharp. Nature 2002;
3:737-747.
siRNA in RNAi
19
RNAi je oblika potranskripcijskega utišanja genov
RNase H
RISC
Kurreck J. Antisense technologies.
Eur J Biochem. 2003, 270:1628- 44.
RNase H
Ribozymes and DNA enzymes
possess catalytic activity and cleave
their target RNA. Ribozymes are
RNA molecules that act as enzymes
in the absence of proteins.
DNA
mRNA
Transcription
Regulation Translation
blocked
Ribozyme/
DNA enzyme
AO = Antisense
Oligonucleotide
Translation
miRNA
Translation
Attenuation
siRNA-induced
gene silencing
Degradation
of target
mRNA
siRNA
RISC
RISC
mRNA
cleavage
RNAi
AO (single-stranded DNA or RNA)
block translation of mRNA or induce
its degradation by RNase H.
PTGS= Post-Transcriptional
Gene Silencing
20
Genetski koncepti 2011-12 11
1. Koncept “Forward” in “Reverse” genetike
2. Mejniki pri odkrivanju mehanizma RNAi
3. Mehanizem fenomena RNAi
4. Primeri uporabe RNAi v genomiki, molekularni biologiji in
biomedicini
5. Nekodirajoče RNA
Vsebina
21
-analiza funkcije genov,
-analiza metabolnih poti,
-gensko kartiranje,
-zdravljenje bolezni.
Uporaba tehnologije RNAi
22
Genetski koncepti 2011-12 12
Tehnologija RNAi je koristno orodje v funkcijski genomiki
•tehnologija RNAi:
-enostavnejša, cenejša
-isto ţival lahko v poskusu
uporabimo večkrat
-utišanje genov; “knock down”
-5-10% izraţanja gena ostane
-poskus traja 1 teden
Sirna Therapeutics preimenovana
•tehnologija antisense
•tehnologija z ribocimi
•izničenje genov; “knock out”
-izraţanja genov ni
-poskus traja 6 mesecev ali več
Ribozyme Pharmaceuticals 23
Primer uporabe tehnologije RNAi pri genskem kartiranju
Identifikacija gena za vitamin K epoksid reduktazo (VKOR),
ki je tarča za antikoagulant varfarin (zdravljenje infarktov in
tromboz).
Rost, S. in sod.
Mutations in VKORC1 cause
warfarin resistance and
multiple coagulation factor
deficiency type 2. Nature 2004; 427: 537-41
Li, T. in sod.
Identification of the gene for
vitamin K epoxide reductase.
Nature 2004; 427: 541-44
Klasične metode kloniranja za
lokalizacijo gena.
siRNA proti kandidatnim
genom in testiranje aktivnosti
za inhibicijo VKOR. 24
Genetski koncepti 2011-12 13
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=OMIM 25
VK
OR
activity (
%)
siRNA pools
26
Genetski koncepti 2011-12 14
Podjetje Področje raziskav za zdravjenje z RNAi
Acutty Pharmaceuticals makularna degeneracija, diabetična retinopatija
AGY Therapeutics RNAi v nevronih
Alnylam Pharmaceuticals makularna degeneracija, Parkinsonova bolezen, cistična
fibroza, gripa
Atugen AG rak, očesne bolezni, koţne bolezni
Benitec Australia hepatitis C, HIV, rak, diabetes, debelost
Cytrx Corporation diabetes/debelost
Devigen diabetes/debelost
Genesis R&D alergije
Genta Incorporated rak
Intern. Therapeutics HIV, hepatitis B
Intradigm Corporation rak, SARS, artritis
Nucleonics, Inc. hepatitis B, hepatitis C
Sirna Therapeutics hepatitis C, astma, diabetes, rak, gluhost,
Huntingtonova bolezen
Raziskave terapevtske genske supresije
Uprichard, 2005
27
RNAi – velik potencial za zdravljenje bolezni
-Specifičnost
-alelno-specifično utišanje genov (selektivno zaviranje
izraţanja mutantnega alela),
-onkologija in zdravljenje nevromiopatij, ki so posledica
nukleotidne zamenjave.
-Učinkovitost
Utišanje gena je moţno z niţjimi koncentracijami efektorskih
molekul kot pri “antisense” tehnologiji (RNAi je naravni
biološki proces in predstavlja bolj naravno strategijo
manipulacije genov).
-Širok spekter delovanja
RNAi lahko sproţimo z vnosom več siRNA za utišanje
enega gena ali več genov hkrati.
Uprichard, 2009. The therapeutic potential of RNA interference
28
Genetski koncepti 2011-12 15
Brummelkamp s sod. Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA
interference. Cancer Cell 2002; 2:243-247.
Selektivno utišanje alela K-rasV12 povezanega z razvojem raka jeter
(nukleotidna zamenjava G>T).
Uporaba retroviralnih vektorjev za prenos siRNA, ki utiša alel K-rasV12,
na alel K-rasWT pa nima vpliva.
ni inhibicije
inhibicija
Za alel-specifično utišanje z RNAi pri zdravljenju raka
kodon 12:
wild-type (wt) = GGT (glicin)
K-ras = GTT (valin)
29
Prenos efektorskih molekul do tarčnega gena
-RNAi efektorji:
-siRNA vnešena kot zdravilo,
-z vektorji posredovano intracelularno izraţanje shRNA, ki se
procesira v aktivno siRNA v gostiteljski celici (dolgotrajnejši efekt
utišanja genov).
-Lokalni vnos:
-vnos v oči, intranazalno, v centralni ţivčni sistem.
-Sistemski vnos:
-stabilizacija molekul siRNA (kemijske spremembe molekul,
pakiranje v liposome),
-prenos do tarčnega tkiva in vstop v celico (na efektorsko
molekulo vgrajeni/konjugirani ligandi ali protitelesa),
-uporaba viralnih vektorjev: lentivirusi, adenovirusi, retrovirusi.
30
Genetski koncepti 2011-12 16
Pridobivanje siRNA
Razgradnja in vitro z
dicerjem ali RNAzo III
dicer
transkripcija in vitro/
kemična sinteza plazmid,
retrovirus,
adenovirus,
lentivirus
transkripcija
in vivo
siRNA
RISC
Vektorji, ki vsebujejo
zapis za shRNA
(short hairpin RNA).
Kurreck, 2003
Griffiths in sod., str. 533. 31
Clark in Whitelaw, 2003
Vnos shRNA v embrije miši z lentivirusom
1. V ţivali so vnesli gen za
GFP (Green Fluorescent
Protein) (transgene ţivali).
2. Lentivirus z zapisom za
GFP shRNA so vnesli v
oocite transgenih ţivali s
funkcionalnim transgenom
GFP.
3. Očitno zmanjšanje
fluorescence GFP v
embrijih in transgenih
ţivalih.
32
Genetski koncepti 2011-12 17
Omejitve pri uporabi RNAi
-Zgrešitev tarče; učinek “off-target”
Problem, da bi prišlo do utišanja ne-tarčnega gena (zaradi delne
komplementarnosti). Ta efekt je odvisen od koncentracije in se mu
izognemo z niţanjem koncentracije siRNA.
-Nespecifičen učinek
-Interferonski odziv, ki je lahko citotoksičen.
-Izogibanje nevarnim zaporedjem pri izbiri zaporedja za siRNA;
“9 bp danger motif” (Hornung in sod., 2005).
-Zasičenost mehanizma RNAi
-siRNA vstopajo v naravne celične poti miRNA in lahko motijo
njihovo regulatorno vlogo. Za miRNA so ugotovili vpletenost v
razvoj nevroloških bolezni in raka.
-Potrebno bo določiti največjo še varno količino siRNA, ki jo lahko
vnesemo v določen celični tip. 33
Učinkovitost terapije z RNAi
-Rezistenca
-Za RNAi je značilna visoka (z nukleotidnim zaporedjem
pogojena) specifičnost, ki pa je lahko tudi njena pomanjkljivost;
RNA in DNA virusi lahko zelo hitro razvijejo mutacije za rezistenco
na siRNA; “escape mutations”.
-Nekateri virusi kodirajo proteine, ki inhibirajo mehanizem RNAi. Bennasser in sod. Evidence that HIV-1 encodes an siRNA and
suppressor of RNA silencing. Immunity 2005; 22:607-619.
-Pri nekterih vrstah raka je okvarjen dicer in spremenjeno
izraţanje miRNA, terapija z RNAi je zato neučinkovita.
-Nepopolno utišanje genov
RNAi utiša in ne izniči izraţanja genov. Za zdravljenje nekaterih
bolezni je to dovolj, pri drugih pa RNAi samo zmanjša
napredovanje bolezni (potrebna kombinacija z drugimi oblikami
zdravljenja).
34
Genetski koncepti 2011-12 18
Haasnoot in sod. Inhibition of virus replication by RNA interference. J. Biomed. Sci.
2003; 10:607-616.
RNAi v raziskavah preprečevanja infekcij s HIV
Tarča siRNA je lahko :
-viralna RNA ali
-geni gostitelja* (za celične receptorje; preprečen vstop virusa v celico)
Tarčni gen RNAi efektor Tip celic x zmanjšana
replikacija virusa
35
Xu in Xia. RNAi therapy: dominant disease gene gets silenced.
Gene Ther. 2005;12:1159-60.
Terapija z RNAi Potencial za zdravljenje bolezni,
kot je Amiotropna Lateralna
Skleroza (ALS) (1:50.000);
degeneracija motoričnih
nevronov.
ALS je posledica mutacij v genu
SOD1 (SuperOxide Dismutase).
36
Genetski koncepti 2011-12 19
RNAi pri zdravljenju nevromiopatij, ki so posledica
nukleotidne zamenjave
Ding in sod., 2003; Ralph in sod., 2005; Xia in sod., 2005.
siRNAG256C
siRNAWT
sod1G256C
sod1wt
Načini terapije za ALS:
1. Selektivno utišanje mutiranega alela z sod1 G256C siRNA.
2. Na mišjem modelu za ALS so z lentiviralnimi vektorji vnesli shRNA
za sod1 G93A ter podaljšali ţivljenjsko dobo ţivali.
3. ALS lahko povzroči
> 100 različnih mutacij
v genu SOD1, zato so
izvedli
“Replacement RNAi
strategy”
(inhibicija obeh alelov
in vnos funkcionalnega
gena SOD1 ).
37
RNAi pri zdravljenju nevromiopatij, ki so posledica
povečanja števila trinukleotidnih ponovitev
Normalno: 10-35 ponovitev CAG
Mutacija: >40 ponovitev CAG
-Sindrom fragilnega X (CGG)n, (1:2.000)
-Spinobulbarna mišična atrofija; SBMA (CAG)n, (<1:50.000)
-Miotonična distrofija (CTG)n, (1:8.000)
-Huntingtonova bolezen (CAG)n, (1:10.000)
-Spinocerebralna ataksija tipa 3; SCA3 (CAG)n
Alelno specifičnost doseţemo s
siRNA proti SNP, ki je/ni
funkcionalno povezan z
bolezenskim alelom.
Griffiths in sod. Miller in sod. 2003. Allele-specific
silencing of dominant disease genes 38
Genetski koncepti 2011-12 20
VEGF= vascular endothelial growth factor;
ţilni endotelni rastni dejavnik
Za VEGF-specifična siRNA - pomen za zdravljenje raka, saj je
vaskularizacija prisotna pri nastanku tumorjev.
vaskularizacija
rast tumorja
sinteza VEGF
VEGF
tumor
RNAi pri zdravljenju raka
39
RNAi pri zdravljenju očesnih bolezni
VEGF je vzrok za vaskularizacijo pri očesnih boleznih
(diabetična retinopatija, makularna degeneracija).
Vnos vegf-specifičnih siRNA zmanjša obseg vaskularizacije pri
miškah.
Kontrola Vegf siRNA
µm2 Kontrola Vegf siRNA
Reich in sod. Mol. Vision 2003; 9: 210-216. 40
Genetski koncepti 2011-12 21
1. Koncept “Forward” in “Reverse” genetike
2. Mejniki pri odkrivanju mehanizma RNAi
3. Mehanizem fenomena RNAi
4. Primeri uporabe RNAi v genomiki, molekularni biologiji in
biomedicini
5. Nekodirajoče RNA
Vsebina
41
• Razredi nekodirajočih RNA
• siRNA/miRNA – podobnosti in razlike
• miRNA
• Trije razredi genetske variabilnosti:
• miRNA geni
• miRNA tarče
• mehanizem, ki sodeluje pri utišanju genov
(silencing machinery)
• piRNA
• snoRNA
Vsebina
42
Genetski koncepti 2011-12 22
RNA
Coding RNA
mRNA Involved in translation
rRNA tRNA
Non-coding RNA
UCR
siRNA
piRNA
miRNA
rasiRNA
snRNA snoRNA
tasiRNA scnRNA
ribosomal
RNA
transfer
RNA
messenger
RNA
Druţina RNA
Prirejeno po:
-Buckingham. The major world of microRNAs. 2003.
-Ferdin et al. 2010
siRNA small interfering RNA
snRNA small nuclear RNA
miRNA microRNA
snoRNA small nucleolar RNA
tasiRNA trans-acting siRNA
scnRNA small-scan RNA
rasiRNA repeat-associated siRNA
piRNA Piwi-interacting RNA
UCR ultraconserved regions
+ rapidly growing list of new ncRNA classes
43
Nekodirajoče RNA (nkRNA)
Small non-coding
RNAs;
sncRNA
Long non-coding
RNAs;
lncRNA
21-23 bp
miRNA
siRNA
500 bp
Telomerase RNA
17 kb
Xist
108 kb
Air RNAs
24-31 bp
piRNA
>200 bp
UCRs
rasiRNA
• Nomenclature and classification is still in progress.
• Number of ncRNA increases with developmental complexity;
mainly protein-coding mRNAs > mainly non-coding RNAs
70-200 bp
snoRNAs
(X-inactive
specific transcript)
44
Genetski koncepti 2011-12 23
Porast števila člankov, ki opisujejo nkRNA
*through
8/2009
Taft in sod., 2010 45
Matera in sod., 2007
Mattick in Makunin, 2006
Non-coding RNA comprise a
hidden layer of internal signals
that control various levels of gene
expression in physiology and
development, including chromatin
architecture/epigenetic memory,
transcription, RNA splicing, editing,
translation and turnover.
46
Genetski koncepti 2011-12 24
http://research.imb.uq.edu.au/rnadb/
http://www.mirbase.org/
http://www-snorna.biotoul.fr/
http://pirnabank.ibab.ac.in/
http://rfam.sanger.ac.uk.
Podatkovne zbirke nkRNA
47
• Razredi nekodirajočih RNA
• siRNA/miRNA – podobnosti in razlike
• miRNA
• Trije razredi genetske variabilnosti:
• miRNA geni
• miRNA tarče
• mehanizem, ki sodeluje pri utišanju genov
(silencing machinery)
• piRNA
• snoRNA
Vsebina
48
Genetski koncepti 2011-12 25
Processes
pre-miRNA to
mature miRNA
Initiates formation of
RNA-induced silencing
complex (RISC) –
responsible for gene
silencing.
He in Hannon 2004
Shared biosynthetic
pathways of siRNAs
and miRNAs
processes primary
transcripts (pri-miRNA) to
60 bp long pre-miRNA
Drosha
Dicer
49
Types of small RNA-associated Argonaute proteins, and the
origin and mechanism of action of small RNAs
Kim in sod., 2009. Biogenesis of small RNAs in animals.
The name Argonaute comes from phenotypes
observed for AGO1 mutants in Arabidopsis
thaliana. The plants resembled the tentacles of
the pelagic octopus, Argonauta argo.
Bohmert in sod.,1998 50
Genetski koncepti 2011-12 26
• Andrew Fire and Craig Mello
• among the most important
discoveries in molecular biology in
the past few decades
• Nobel prize in physiology/medicine,
2006.
• Victor Ambros
• equally important as RNAi
• deserves recognition by the Nobel
committee
Fire in sod.
Potent and specific genetic interference by
double-stranded RNA in Caenorhabditis
elegans.
Nature 1998; 391: 806-811.
Lee in sod.
The C. elegans heterochronic gene lin-4
encodes small RNAs with antisense
complementarity to lin-14.
Cell 1993; 75, 843–854.
• odkritje RNAi • odkritje miRNA
51
52
Genetski koncepti 2011-12 27
primarna
miRNA
>1000 bp
prekurzorska
miRNA
~60 bp
zrela
miRNA
21-23 bp
miRNA-protein
complex = miRISC
MiRNAs - translational silencing
Novina CD, Sharp PA. The RNAi revolution. Nature 2004;430:161-4.
1. miRNA gen
2. miRNA tarče
3. Mehanizem za utišanje genov
53
Georges M. Polymorphic miRNA-mediated gene regulation: contribution to phenotypic variation
and disease. Curr Opin Genet Dev. 2007;17:166-76
miRNA tarče miRNA geni Mehanizem za utišanje
DSPs altering miRNA
recognition sites in the target
Altering existing target sites
Creating illegitimate target sites
DSPs altering the 3'UTR of the
target (e.g. polymorphic
polyadenylation)
DSPs altering the sequence of
the miRNA
Stabilizing or destabilizing the
interaction with the target
DSPs altering the concentration
of the miRNA
CNVs encompassing the pri-
miRNA
DSPs altering the transcription
rate of the pri-miRNA
DSPs altering the amino acid
sequence of silencing
components
DSPs altering the concentration
of silencing components
CNVs encompassing silencing
components
1. 2. 3.
CNV = Copy Number Variation; različica v številu kopij, DSP: DNA sequence polymorphisms
54
Kategorije genetske variabilnosti, ki vplivajo na
z miRNA posredovano uravnavanje genov
Genetski koncepti 2011-12 28
Iwai N, Naraba H. Polymorphisms in human pre-miRNAs. BBRC; 2005 331:1439–44.
Saunders MA. Human polymorphism at microRNAs and microRNA target sites. PNAS 2007;104:3300–5
1. miRNA geni
stem loop
miRNA
miRNA*
stem*
seed
Polymorphisms in both pre-miRNA and mature miRNA modify
various biological processes by influencing the processing
and/or target selection of miRNAs
55
Polimorfizmi v pre-miRNA in zreli miRNA
vplivajo na procesiranje in/ali izbiro tarč
za miRNA in s tem na številne biološke
procese.
Iwai N, Naraba H. Polymorphisms in human pre-miRNAs. BBRC; 2005 331:1439–44.
pre-miRNA
zrela miRNA
hsa-mir-154
(rs41286570)
miRNA geni
56
Genetski koncepti 2011-12 29
Garzon R. et al. Targeting microRNAs in cancer: rationale, strategies and challenges. Nature Reviews Drug
Discovery 2010;9:775-789.
Some miRNAs (miR-29b)
coordinately regulate multiple
targets in different pathways
miR-15a induces
apoptosis by targeting
B-cell lymphoma
protein-2 (BCL-2)
miR-29b suppresses cell
proliferation by blocking
CDK6
Ocenjeno je, da ima miRNA v povprečju 200 tarč. Krek in sod., 2005
57
Lewis in sod.
An ENU-induced mutation of miR-96
associated with progressive hearing
loss in mice.
Nature Genetics 2009;41:614–618.
Mencia in sod.
Mutations in the seed region of human
miR-96 are responsible for
nonsyndromic progressive hearing
loss.
Nature Genetics 2009;41:609-613.
SNP-ji znotraj seed miRNA regij – povezava z gluhostjo
Mouse
A>T substitution in mmu-miR-96
Human
GC>AA substitution in hsa-miR-96
58
Genetski koncepti 2011-12 30
1. growth
associated
quantitative trait
locus (QTL)
2. body mass
associated host
gene Gpc3.
3. conserved
miRNA gene -
Mir717
4. mature miRNA
seed SNP
identified in the
lean mouse strain
129/Sv
Kunej T, Jevsinek Skok D, Horvat S, Dovc P, Jiang Z. The glypican 3-hosted murine Mir717 gene:
sequence conservation, seed region polymorphisms and putative targets. Int J Biol Sci. 2010; 6:769-772.
Seed mmu-mir-717 SNP – nalaganje maščobe
59
2. miRNA tarče
3'-UTR gena
POU5F1 (OCT4)
SEED Out-seed 60
Analiza s programom TargetScan: ohranjeno in delno ohranjeno mesto za vezavo
miRNA na 3„-UTR gena POU5F1.
Genetski koncepti 2011-12 31
2. miRNA tarče
Target site for miR-141/200a in the FTO gene is
conserved in six species.
• Patrocles database
• polymorphic
miRNA target site
• TargetScan
• conserved miRNA target site
3'-UTR of the NANOG gene 3'-UTR of the FTO gene
61
Interakcija med miR-127-3p in tarčo BCL6
je bila ţe eksperimentalno dokazana.
miRecords
1) Eksperimentalno potrjene (validirane) miRNA tarče
• Trenutna verzija vsebuje: 2286 interakcij med 548 miRNA in 1579 tarčnimi geni pri
devetih ţivalskih vrstah.
2) Predvidene miRNA tarče
• Integracija 11 bioinformacijskih orodij
http://mirecords.umn.edu/miRecords/
Samo PITA in RNA22 sta
napovedala interakcijo
med miR-127-3p in BCL6.
2. miRNA tarče
The prediction of the likelihood of formation
of a productive miRNA–mRNA duplex:
-sequence complementarities,
-thermodynamic stability calculations,
-evolutionary conservation.
62
Genetski koncepti 2011-12 32
Exceptional muscularity of the belgian texel sheep
A point mutation (G>A) that creates an illegitimate miRNA target site
for mir-1 and mir-206 in the 3' UTR of MSTN; myostatin gene.
muscular hypertrophy
of Texel sheep
Clop in sod. A mutation creating a potential illegitimate microRNA target site in the myostatin
gene affects muscularity in sheep. Nature Genetics 2006;38:813-818.
2. miRNA tarče
highly expressed in
skeletal muscle controls skeletal muscle mass;
restrains muscle growth
63
3. Mehanizem za utišanje
genov (miRNA silencing
machinery)
nucleus
cytoplasm
=slicer
argonauts
=DiGeorge syndrome
critical region gene 8
=TAR (HIV-1) RNA
binding protein 2
64
Genetski koncepti 2011-12 33
• Razredi nekodirajočih RNA
• siRNA/miRNA – podobnosti in razlike
• miRNA
• Trije razredi genetske variabilnosti:
• miRNA geni
• miRNA tarče
• mehanizem, ki sodeluje pri utišanju genov
(silencing machinery)
• piRNA
• snoRNA
Vsebina
65
Watanabe et al.,
Genes and
Development,
2006
Grivna et al.,
Genes and
Development,
2006 Girard et al.,
Nature, 2006
Aravin et al.,
Nature, 2006
piRNA; Piwi-interacting RNA - odkritje
66
Genetski koncepti 2011-12 34
Types of small RNA-associated Argonaute proteins, and the
origin and mechanism of action of small RNAs
Kim in sod., 2009. Biogenesis of small RNAs in animals.
Piwi:
• P-element induced wimpy testis, which refers to the strong
spermatogenesis and sterility defect observed in piwi
mutant males.
• discovered in Drosophila (Lin in Spradling, 1997).
67
Loss of murine Piwi homologues leads to spermatogenic arrest
Deng and Lin. miwi, a murine homolog of piwi, encodes a cytoplasmic protein essential for spermatogenesis.
Kuramochi-Miyagawa et al. Mili, a mammalian member of piwi family gene, is essential for spermatogenesis.
sg: spermatogonia
sc: spermatocyte
r: round spermatid
e: elongated spermatids Spermatogenesis in miwi -/-
mice is blocked at the early
round spermatid stage.
68
Genetski koncepti 2011-12 35
piRNA; vloga pri razvoju bolezni
-no direct role for piRNAs in human disease,
-hiwi (human piwi homolog), has been implicated in several diseases:
• The hiwi gene locus is linked to the onset of testicular germ cell tumors
• Hiwi is overexpressed in testicular seminomas
Qiao et al., Oncogene, 2002
• Loss of the hiwi gene locus has been associated with ambiguous genitalia and
testicular atrophy.
• Expression of Hiwi is positively correlated with cell proliferation in the setting of
pancreatic and gastric cancers.
69
Lakshmi S, Agrawal S. piRNABank: a web resource on classified and clustered Piwi-interacting
RNAs. Nucleic Acids Research 2008; 36: D173–D177. 70
Genetski koncepti 2011-12 36
• Razredi nekodirajočih RNA
• siRNA/miRNA – podobnosti in razlike
• miRNA
• Trije razredi genetske variabilnosti:
• miRNA geni
• miRNA tarče
• mehanizem, ki sodeluje pri utišanju genov
(silencing machinery)
• piRNA
• snoRNA
Vsebina
71
snoRNAs; small nucleolar RNAs, male nukleolarne RNA
Delujejo kot ribonukleoproteinski (RNP) kompleksi, ki vodijo encimatsko modifikacijo
tarčnih RNA z RNA:RNA interakcijami.
H/ACA box snoRNA
100–200 bp
vodi psevdouridilacijo tarčne RNAs
C/D box snoRNA
70–120 bp
vodi metilacijo tarčne RNAs
Matera in sod. 2007; Makarova in Kramerov; 2007
Pseudo-
uridylated
nucleotide
UGAUGA CUGA ACA ANANNA
pseudouridylated
nucleotide
snoRNA tarče: tRNA, rRNA, snRNA 72
Genetski koncepti 2011-12 37
Znotraj delecije 15q11-13:
• SNORD64
• SNORD107
• SNORD108
• Dve kopiji SNORD109
• 29 kopij SNORD116 (HBII-85)
• 48 kopij SNORD115 (HBII-52)
snoRNAs - povezava s sindromom Prader-Willi
C/D BOX, 116;
SNORD116
Sahoo in sod. Prader-Willi phenotype caused by paternal deficiency for the HBII-85 C/D box small
nucleolar RNA cluster. Nat Genet; 2008;40:719–21. 73
http://www.nature.com/focus/rnai/animations/index.html 74
Genetski koncepti 2011-12 40
The Argonaute family of proteins, specifically Argonaute 2 (also known as Ago2,
eIF2C2 or Slicer) are essential components of RISC, which are involved in mRNA
cleavage. 79
top related