pulz áló mezej őgél elektrofor ézis (pfge) optimaliz álása ...pulz áló mezej őgél...

PulzPulz áállóó mezejmezejőő ggéél l elektroforelektrofor ééziszis(PFGE) optimaliz(PFGE) optimaliz áálláása sa methicillinmethicillin

rezisztens rezisztens staphylococcusokstaphylococcusokklonalitklonalit áássáánaknak vizsgvizsg áálatlat áárara

Pesti Pesti JJóózsefnzsefn éé

Kardos Szilvia, Kardos Szilvia, VolterVolter ImrImr éénnéé, , GhidGhid áánn ÁÁgoston,goston,

Nagy KNagy K áároly, roly, RozgonyiRozgonyi Ferenc Ferenc Semmelweis Egyetem, Orvosi MikrobiolSemmelweis Egyetem, Orvosi Mikrobiol óógiai Intgiai Int éézetzet

Magyar Orvosi LaboratMagyar Orvosi Laboratóóriumi Szakdolgozriumi Szakdolgozóók Egyesk Egyesüületelete(MOLSZE) X. (jubileumi) Nagygy(MOLSZE) X. (jubileumi) Nagygyőőlléésese

Budapest, 2007. augusztus 30 Budapest, 2007. augusztus 30 –– szeptember 01.szeptember 01.

Mit rontottam el ?Mit rontottam el ?

CCéélkitlkit őőzzééss

�� StaphylococcusStaphylococcus aureusaureus ttöörzsek rzsek öösszetartozsszetartozáássáának genetikai vizsgnak genetikai vizsgáálatalata--MagyarorszMagyarorszáágg--AusztriaAusztria--MacedMacedóóniania

�� EnterotoxinEnterotoxinggééneknek�� HaemolysinHaemolysinggééneknek�� RegulReguláácicióós gs gééneknek�� TapadTapadáási faktoroksi faktorok�� KlonalitKlonalitááss vizsgvizsgáálat (PFGE)lat (PFGE)

Metodika I.Metodika I.

Sejtfal feltSejtfal feltáárr ááss�� PlugPlug kkéészszííttéés s

BaktBaktéérium szuszpenzirium szuszpenzióóLysostaphinLysostaphin oldat (40 oldat (40 µµg/mlg/ml-- 80 80 µµg/ml)g/ml)(1 (1 óóra, EC ra, EC ll ííziszis pufferben), 37 pufferben), 37 ooCC

MembrMembr áán protein emn protein eméésztsztééssProteinProteináázz K (67 K (67 µµg/ml), 3 g/ml), 3 óóra, 50 ra, 50 ooCC(ESTN pufferben)(ESTN pufferben)

MosMosááss3* TE pufferben3* TE pufferben

DNS restrikciDNS restrikcióós ems eméésztsztééseseSmaISmaI enzimmel enzimmel (20 (20 U/plugU/plug, 1 , 1 óóra, 25 ra, 25 ooCC))

PulzPulzáállóó mezejmezejőő ggéél l elektroforelektrofor ééziszis

DetektDetektáálláássEtidiumEtidium --bromiddalbromiddal

Metodika II.Metodika II.

ElektroforElektrofor ééziszis

1 x TBE pufferben, (21 1 x TBE pufferben, (21 óóra, 14 ra, 14 ooCC))

(PFGE, (PFGE, BioRadBioRad))

Metodika mMetodika móódosdosííttáása I. a.sa I. a.

Metodika mMetodika móódosdosííttáása I. bsa I. bsejtfal feltsejtfal feltáárr áás 1 s 1 óórara

M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 1 2 M 3 4 1 2 3 4 M1 2 M 3 4 1 2 3 4 M

1.kép2. kép3. kép

11--2: 2: S. S. haemolyticushaemolyticus , , 33--4: 4: S. S. aureusaureus

40 µg/ml lysostaphin80 µg/ml lysostaphin40 µg/ml lysostaphin+ 550 µg/ml lizozim

Metodika mMetodika móódosdosííttáása II. sa II. sejtfal feltsejtfal feltáárr áás 2 s 2 óórara

1 2 3 4 1 2 3 4 M1 2 3 4 1 2 3 4 MM 1 2 3 4 M 1 2 3 4

1.kép2. kép3. kép

11--2: 2: S. S. haemolyticushaemolyticus , , 33--4: 4: S. S. aureusaureus

40 µg/ml lysostaphin80 µg/ml lysostaphin40 µg/ml lysostaphin+ 550 µg/ml lizozim

1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 M1 2 3 4 M

Metodika mMetodika móódosdosííttáása III.sa III.sejtfal feltsejtfal feltáárr áás 3 s 3 óórara

M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 M1 2 3 4 1 2 3 4 M

1.kép2. kép3. kép

11--2: 2: S. S. haemolyticushaemolyticus , , 33--4: 4: S. S. aureusaureus

40 µg/ml lysostaphin80 µg/ml lysostaphin40 µg/ml lysostaphin+ 550 µg/ml lizozim

Metodika mMetodika móódosdosííttáása IV.sa IV.

••Sejtfal feltSejtfal feltáárr áás: 18 s: 18 óórara

••MembrMembr áán fehn fehéérje emrje eméésztsztéés: 18 s: 18 óórara

••RestrikciRestrikcióós ems eméésztsztéés (s (SmaISmaI): 18 ): 18 óórara

••ElektroforElektrofor ééziszis: 21 : 21 óórara

VVáálasztlasztáási lehetsi lehetııssééggAz idAz idııppéénznz

A jA j óómunkmunkáához hoz

ididıı kellkell

Sejtfal feltSejtfal feltáárr ááss�� PlugPlug kkéészszííttéés s

BaktBaktéérium szuszpenzirium szuszpenzióó

LysostaphinLysostaphin oldat (40 oldat (40 µµg/ml)g/ml)

LizozimLizozim (550 (550 µµg/ml)g/ml)�� ( ( 3 / 18 3 / 18 óóra,ra, EC EC ll ííziszis pufferben), 37 pufferben), 37 ooCC

MembrMembr áán fehn fehéérje emrje eméésztsztééssProteinProteináázz K (67 K (67 µµg/ml), 3 / 18 g/ml), 3 / 18 óóra, 50 ra, 50 ooCC

(ESTN pufferben)(ESTN pufferben)

MosMosááss3* TE pufferben3* TE pufferben

KromoszKromoszóómmáálislis DNS restrikciDNS restrikcióós ems eméésztsztééseseSmaISmaI enzimmel enzimmel

(20 (20 U/plugU/plug, , 3 / 18 3 / 18 óórara , 25 , 25 ooCC))

PFGE PFGE éés a DNS fragmentumok detekts a DNS fragmentumok detektáálláásasaEtidium-bromiddal

ÖÖsszefoglalsszefoglaláássOptimOptim áális metodikai paramlis metodikai paramééterekterek

KK ööszszöönnööm a figyelmet!m a figyelmet!