predavanje 8-hromatografija 2

H R O M A T O G R A F I J A- Gasna hromatografija- HPLC

ZATVORENE KOLONE

�Gasna hromatografija (GC)

U zavisnosti od stacionarne faze:� gasno-čvrsta (GSC) - stacionarna faza u obliku

aktivnog čvrstog adsorbenta: aktivni ugalj, teflon, silikagel, zeoliti ili aluminijum-oksid.

Osnovni proces: adsorpcija

� gasno tečna (GLC)- stacionarna faza je teškoisparljiva tečnost koja je u vidu tečnog slojaravnomerno nanešena preko površine inertnogčvrstog nosača.

Osnovni proces: raspodela

Mobilna fazaGas nosač: inertni gas, vrhunske čistoće�Azot ????�Helijum�ArgonRegulisati pritisak i brzinu protoka gasa nosača

A carrier gas should have the following properties:

1. Highly pure (> 99.9%)2. Inert so that no reaction with stationary phase or

instrumental components can take place, especially at high temperatures.

3. A higher density (larger viscosity) carrier gas is preferred.

4. Compatible with the detector since some detectors require the use of a specific carrier gas.

5. A cheap and available carrier gas is an advantage.

Koja jedinjenja se analiziraju GC?

� Isparljiva i termostabilna jedinjenja

� Uglavnom organska jedinjenjado 800 Da u neutralnom (molekulskom) obliku

� Ako nisu dovoljno isparljiva -prevesti ih u isparljiviji oblik derivatizacijom (hemijskom reakcijom: acetiliranjem, esterifikacijom, alkiliranjem…)

Razdvajanje u GC zavisi od:

� Isparljivosti komponente (isparljivije brže)� Rastvorljivosti komponente(rastvorljivije

sporije)� Polarnosti komponente i kolone (polarnije

sporije)� Temperature kolone(veća temperatura-brže)

� Brzine gasa(optimalna brzina)� Dužine kolone(duža kolona-duže putovanje)

constTR

HK +∆=

303,2log

Osnovni delovi GC� Izvor gasa nosača sa regulatorom

pritiska i protoka

� Injektor (sistem za unošenje uzorka)

� Hromatografska kolona u termostatu

� Detektor

� Sistem za registraciju signala iz detektora (računar i pisač)

Shema GC

Injektori

MIKROLITARSKI ŠPRICEVI

Kolone: pakovane (punjene) i kapilarne

1-5 m 10-150 m

GC Columns

Capillary columnsPacked columns

•Typically a glass or stainless steel coil. •1-5 total length and 5 mm inner diameter.• Filled with the st. ph. or a packing coated with the st.ph.

•Thin fused-silica.•Typically 10-150 m in length and 250µm inner diameter.•St. ph. coated on the inner surface.•Provide much higher separation eff.•But more easily overloaded by too much sample.

Detektor na bazi toplotne provodljivosti Thermal conductivity detector (TC)Shema

NEDESTRUKTIVAN

Plameno jonizacioni detektor (FID)

Ne mogu voda, CO, CO2 i većina

neorganskih jedinjenja

DESTRUKTIVAN

Detektor na bazi zahvata elektronaElectron capture detector (ECD)

HalogeniElectrons from a beta-source (Ni-63) ionize the carrier gas (nitrogen). Organic molecules containing electronegative atoms capture electrons and decrease current

Detektor: maseni spektrometar (GC-MS)

Maseni spektrometar je detektor

Uskladiti pritiske i osloboditi se gasa nosača

Koji detektor se nekoristi kod gasne hromatografije?

� katarometar

� maseni spektrometar

� atomski apsorpcioni spektrofotometar

� plameno-jonizacioni detektor

Koji gas nemože biti gas nosač kod gasne hromatografije?

� azot

� kiseonik

� helijum

� argon

Koji detektor ima radioaktivni izvor?

� katarometar

� maseni spektrometar

� detektor na bazi zahvata elektrona

� plameno-jonizacioni detektor

Detektor na bazi zahvata elektrona ima radioaktivni izvor:

� Alfa

� Beta

� Gama zraka

Injektor je deo koji služi za� Unos analize

� Razdvajanje analize

� Detekciju analize

Injektor se zagreva na temperaturu koja je

� Niža

� Ista

� Viša od temperature ključanja komponente

Objasniti sliku

Objasniti sliku

HPLC� High performance liquid

chromatographyTečna hromatografja visoke

efikasnosti ili Visoko efikasna tečna hromatografija

� High pressure liquid chromatography

Tečna hromatografija pod visokim pritiskomSamo TEČNA

HROMATOGRAFIJA

Najviše korišćena separaciona tehnika

HPLC ApplicationsChemical

Environmental

Pharmaceuticals

Consumer Products

Clinical

polystyrenesdyesphthalates

tetracyclinescorticosteroidsantidepressantsbarbiturates

amino acidsvitaminshomocysteine

Bioscienceproteinspeptidesnucleotides

lipidsantioxidantssugars

polyaromatic hydrocarbonsInorganic ionsherbicides

Hromatografija normalnih faza/reverznih fazaHromatografija normalnih faza/reverznih faza

Stacionarna faza Mobilna faza

Normalnefaze

manje od10%

PolarnaSilikagel

NepolarnaHeksan, heptan..

Reverzne faze

više od 90%

NepolarnaModifikovani

silikagel: C8, C18

PolarnaMetanol,

acetonitril, voda/pufer…

Eluiranje može biti� IzokratskoUvek ista mobilna faza, npr. 50% metanol

� GradijentnoSastav mobilne faze se menja za vreme eluiranja

Npr. prvih 5 minuta teče 50% metanol, drugih 5 minuta 60% metanol, trećih 5 minuta 70% metanol.......

Osnovni delovi HPLC

� Izvor protoka mobilne faze: rezervoar, pumpa i filter

� Deo za separaciju: injektor, hromatografska kolona i termostat

� Detektor ili sistem detektora

Shema HPLC

Injektor

Injektor sa petljom

Kolone

Detektori

� UV-Vis spektrofotometri� (Photo)Diode Array Detector (PDA ili

DAD)� Fluorimetri� Refraktometri� Hemiluminiscentni detektori� Elektrohemijski detektori� Maseni spektrometar HPLC/MS

Nove tehnologije: UHPLC ili UPLC � Ultra High Performance Liquid Chromatography Where standard HPLC typically uses column particles with sizes

from 3 to 5µm and pressures of around 400 bar, uHPLC use specially designed columns with particles down to 1.7µm in size, at pressures in excess of 1000 bar. The main advantage of an uHPLC is speed. These systems are faster, more sensitive, and rely on smaller volumes of organic solvents than standard HPLC, resulting in the ability to run more samples in less time. However, if the systems are run at typical pressures greater than 800 bar, the columns age, or degrade quicker. Newer technology is being developed for uHPLC units to use column particles with 1µm size, and pressure potentials up to 6,800 bar.

Injector

Detector

Column

Solvents

Mixer

Pumps

High Performance Liquid Chromatograph

Waste

HROMATOGRAM� Zapis hromatografskog razdvajanja

� Apscisa: vreme provedeno u koloni ili zapremina mobilne faze

� Ordinata: Jačina signala detektora (srazmerno koncentraciji uzorka)

KA>KB>KC

FtV RR =

Retenciono vreme- vreme koje je komponenta provela u koloni od momenta injiciranja do njene pojave u detektoru

KORIGOVANO t ,R i NEKORIGOVANO t R

Retenciona zapremina-zapremina mobilne faze potrebnada komponentu spere (eluira) sa kolone

Retencija

� - Faktor kapaciteta (faktor zadržavanja, retencioni faktor)

tR

t0

Str

engt

h of

det

ecto

r si

gnal

Time

tR – retenciono vreme komponente koja je zadržana na koloni;t0 – retenciono vreme komponente koja se ne zadržava na koloni –pik mobilne faze

0

0,

t

ttk R −=

fazemob

uzorkaRF.υ

υ=Retencija

Rezolucija- koliko su dobro pikovi razdvojeni

2121

12 2

2WW

tWWtt

R RR

+∆=+

−=

DOBRO RAZDVAJANJE R>2.0

Broj teorijskih platoa

N

LH =

2)(16W

tN R=

L- dužina koloneN – broj teorijskih platoa

2

2/1

)(54.5W

tN R=

Kvalitativna i kvantitativna analiza

Kvantitativna analiza

Visina/površina pikasrazmerna je koncentraciji

46

Kalibraciona krivaKalibraciona kriva

C1

C4

C3

C2

ConcentrationArea

A1

A2

A3

A4C1 C2 C3 C4

A1

A2

A3

A4

Concentration

Pea

k ar

ea

Calibration curveCalibration curve

Kvalitativna analiza-poređenje sa standardom

standard

Chromatogram of Gasoline1. Isobutane2. n-Butane3. Isopentane4. n-Pentane5. 2,3-Dimethylbutane6. 2-Methylpentane7. 3-Methylpentane8. n-Hexane9. 2,4-Dimethylpentane10. Benzene11. 2-Methylhexane12. 3-Methylhexane13. 2,2,4-Trimethylpentane14. n-Heptane15. 2,5-Dimethylhexane16. 2,4-Dimethylhexane17. 2,3,4-Trimethylpentane18. Toluene19. 2,3-Dimethylhexane20. Ethylbenzene21. m-Xylene22. p-Xylene23. o-Xylene

HPLC hromatogramEkstraktGinko biloba-razdvojeni flavonoidiKolona C-18Mob. faza 60% CH3OH, brzina protoka 1 mL /min

50

Objasniti slikuObjasniti sliku

C18

CH3

StrongStrongWeakWeak

OH

51

Objasniti slikuObjasniti sliku

OH

HO

SiOH

SiOHStrongStrong

WeakWeak

Steric hindrance

Objasniti sliku

x

a

b

c

a b c

c b a

0

0

Time

Time

Normal Phase (SiO2)

Reverse Phase (C18)

Normal Phase (SiO2) TLC