práctica 02 - m. por homología (ccorahua santo, robert)
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“AÑO DE LA INVERSIÓN PARA EL DESARROLLO RURAL Y LA SEGURIDAD ALIMENTARIA”
UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE GENÉTICA Y BIOTECNOLOGÍA
MODELIZACIÓN DE BIOMOLÉCULAS
PRÁCTICA 02: Modelamiento por Homologí a
PROFESORES ENCARGADOS
Gustavo Sandoval P.
Dan Vivas R.
ALUMNO RESPONSABLE CÓDIGO CICLO
CCORAHUA SANTO, Robert 09100107 X
2013 - II
INFORME 02 UNMSM
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MODELAMIENTO POR HOMOLOGÍA
INTRODUCCIÓN
La calidad de las predicciones mejora sustancialmente cuando consideramos las secuencias de otras proteínas
homólogas, puesto que los patrones de sustitución de aminoácidos proporcionan información valiosa. Si
queremos modelar un dominio o una proteína compuesta de varios dominios nuestra mejor fuente de
información serán sin duda otras proteínas de estructura conocida, que se depositan y anotan en el Protein Data
Bank (PDB), el repositorio mundial de estructuras tridimensionales de biomacromoléculas (Rose et al., 2011). El
PDB se actualiza semanalmente y contiene estructuras obtenidas sobre todo por cristalografía de rayos X y por
NMR.
La búsqueda de proteínas por similaridad de secuencia de aminoácidos se realiza utilizando la herramienta
BLASTp, este sistema de búsqueda utiliza un algoritmo simple y robusto de alineamiento local. El puntaje o
“score” que se asigna a la búsqueda, luego es calculada por medio de las matrices PAM y BLOSUM, las cuales
tienen un fuerte sustento teórico (Henikoff, S. and J.G. Henikoff, 1992).
Además de predicción de estructura por homología, se utilizan otros parámetros de evaluación. Software de
análisis que está disponible a través del servidor Web de ExPASy (Gasteiger, E. et al., 2003) permite las
herramientas para análisis que incluyen Compute pI / MW, una herramienta para predecir el punto isoeléctrico
de la proteína (pI) y peso molecular (Mw); ProtParam, para calcular diversos parámetros físico-químicos
(Gasteiger, E. et al., 2005).
Otras herramientas nos permiten hacer predicciones mayor escala tales como el PHD, que es un método de
predicción de estructuras secundarias disponible de forma “online” (Rost, B. et al., 1993). Este método, cuando
apareció, tiene una precisión de más del 70 %. Un aspecto clave es el uso de la información evolutiva en forma
de múltiples alineamientos de secuencias que se utilizan como entrada en lugar de las secuencias individuales.
La inclusión de información de la familia de proteínas de esta forma aumenta la precisión de la predicción.
Una de las herramientas ampiamente usadas es Cn3D, una herramienta de visualización para estructuras
biomoleculares, secuencias y alineamientos de secuencias. Lo que diferencia a Cn3D de otro software es su
capacidad para correlacionar la estructura y la secuencia de información: por ejemplo, un científico puede
encontrar rápidamente los residuos en una estructura cristalina que corresponden a mutaciones de
enfermedades conocidas, o residuos conservados del sitio activo de una familia de homólogos de secuencias.
Cn3D muestra la estructura-alineacion de la estructura, junto con la secuencia basada en la estructura en las
alineaciones, para enfatizar qué regiones de un grupo de proteínas relacionadas son las más conservadas en
estructura y secuencia (Wang, Y. et al., 2000).
Con las herramientas descritas, el objetivo del trabajo es realizar una predicción de estructura tridimensional
por homología de secuencias de aminoácidos usando el programa Cn3D.
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RESULTADOS
Búsqueda de secuencia y marcos de lectura abiertos
Se extrajo una secuencia de aminoácidos de una proteína de la base de datos del GenBank. La proteína
Rusticianina (tabla 01) tiene el tamaño de 189 aa, considerando el péptido señal que abarcan los 35 primeros aa.
TABLA 01. Proteína escogida para realizar el modelamiento por homología
Organismo
Número de acceso Proteína Tamaño Péptido señal
Acidithionacillus ferrivorans
DNA CP002985.1|:1711936-1712505
- 570 nt* -
Aa AEM47850.1 Rusticianina* 189 aa* 35 aa*
*Datos obtenidos directamente del GenBank
FIGURA 01. Resumen del alineamiento por homología de la secuencia traducida de rusticianina en la base de datos de
proteínas, utilizando la herramienta BLASTx.
La secuencia de nucleótidos, desde la posición 1711936 hasta 1712505 del genoma de Acidithionacillus
ferrivorans, de dicha proteína fue sometida a una búsqueda por homología BLASTx en la base de datos del NCBI.
Los resultados se muestran en la figura 01. Se observa un resumen de la búsqueda por homología de la
secuencia query (rusticianina) realizada en blast. Además de los tres primeros alineamiento, que son proteínas
rusticianina del mismo genoma de Acidithiobacillus ferrivorans, se encontró una identidad del 94% con
proteínas de A. ferrooxidans (3 alinemientos siguientes) que cubrieron un 94 % (en la primera) y un 92 % (en las
dos siguientes) de la secuencia query. Otras secuencias protéicas, más abajo, correspondieron a rusticianina tipo
A y B de A. ferrooxidans. Todos los resultados descritos fueron encontrados mediante una búsqueda aleatoria
(Evalue<1e-90).
Resultados (figura 02) obtenidos por la herramienta ORF Finder (Open Reading Frame Finder), ofrecida por el
GenBank, mostraron coherencia con la proteína que ya se había anotado (rusticianina, 189 aa) y que es ofrecida
en el genbank. Un ORF que desde la posición 1 (Met) va hasta el aminoácido 189 (Lys) y termina en STOP.
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FIGURA 02. Marcos de lectura abiertos obtenidos de la secuencia nucleotídica perteneciente a la proteína rusticianina.
FIGURA 03. Marco de lectura abierto de la secuencia nucleotídica de proteína rusticianina, obtenido por la herramienta
“translate tool”.
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Los resultados de marco de lectura abierto, obtenidos por otra herramienta (translate tool, Expasy), se
muestran en la figura 03. Un codón inicial que codifica el aminoácido metionina y un codón final precedido por
un aminoácido de lisina (K). Dicho marco de lectura abierto es idéntico al que se encontraba en la base de datos
del GenBank.
FIGURA 04. Dominios putativos conservados de la proteína Rusticianina (query), según la herramienta BLAST
La secuencia protéica inferida por translate tool, de Expasy, fue sometida a una búsqueda por homología
utilizando la herramienta BLASTp, los resultados se muestra en figura 04. Rusticianina mostró pertenecer a la
superfamilia “cupredoxin” consta de una beta-sandwich con 7 cadenas en lámina 2 beta, que está dispuesto en
un barril beta Greek-key. Además, la secuencia sugiere que la proteína tiene un multidominio PetE
(plastocianina, producción de energía y conversión).
FIGURA 05. Dominios putativos conservados de la proteína Rusticianina (query), según la herramienta BLAST
Los resultados de alineamiento de la secuencia fueron muy similares al obtenido en la figura 02, después de
alinear el traducido de la secuencia nucleotídica cuando se utilizó BLASTx.
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Parámetros bioquímicos y estructura secundaria
Los parámetros bioquímicos predecidos por la herramienta ProtParam se muestran en la tabla 02. La proteína
tiene un peso molecular mediano con un punto isoeléctrico de 9.52, lo que hace pensar de una proteína que en
una solución de pH menor a 7.0, se cargaría negativamente. Tiene mayor cantidad de aminoácidos cargados
negativamente. Una vida media de 10 horas in vivo en un organismo como E. coli. Presenta un índice alifático
que hace pensar de una proteína estable, además el promedio de hidropaticidad resultó 0.180, resultado de una
proteína hidrofobica (Kyte, J. et al, 1982).
TABLA 02. Parámetros bioquímicos de la proteína query (rusticianina).
PARÁMETRO Resultado CLASIFICACIÓN
Número de aminoácidos 189 aa
Peso molecular 19785.0Da Mediano peso molecular
Punto isoeléctrico teórico 9.52
Número de residuos negativamente cargados (Asp + Glu) 8 Proteína Cargada negativamente Número de residuos positivamente cargados (Arg + Lys) 15
Fórmula C906H1410N228O252S8
Número total de átomos 2804
Vida media estimada >10 horas en m.o. Alto
Índice alifático 31.79 Estable
Grand average of hydropathicity 0.180 Hidrofóbico
La predicción de estructuras secundarias obtenida por la herramienta PHD (secondary structure prediction) se
observa en la figura 06.
FIGURA 06. Estructuras secundarias en la secuencia de aminoácidos de rusticianina, obtenida por PHD.
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Los resultados de la predicción de estructuras secundarias mostraron un alto contenido de cadenas beta
extendidas (35.98 %) y una reducida cantidad de aminoácidos que conforman una estructura alfa hélice (10.58
% de los aa.). La mayor parte de la secuencia son secciones al azar (ramdom coil, 53.44%); esto indica que la
proteína posiblemente sea muy dinámica.
Comparación por homología de estructura terciaria
Para la comparación de estructuras terciarias se extrajo una estructura 3D de la proteína rusticianina obtenida
por método de difracción de rayos X (Zhao, D. y Shoham, 1998). La resolución de la estructura, según el método
experimental usado, es de 1.9 Aº, figura 06. En la imagen se puede observar el lugar donde se une al átomo de
cobre (esfera negra) y también se indica los extremos amino (N(A)) y carboxilo (C(A)).
FIGURA 07. Estructura terciara de la proteína rusticianina de Acidithiobacillus ferrooxidans obtenida del GenBank .
La comparación de la secuencia traducida del gen de rusticianina de Acidithiobacillus ferrivorans con la proteína
de rusticianina de Acidithiobacillus ferrooxidans, utilizando el software Cn3D 4.3, se muestra en la figura 09. El
alineamiento de las secuencias se muestra también en la figura 08, este va desde la posición 6 hasta la 155, si se
considera la estructura de A. ferrooxidans como referencia. Se encontró que 16 de los aminoácidos de los 150 aa
alineados diferían en entre sí (representados en azul, figura 8 y 9).
FIGURA 08. Alineamiento de secuencias de rusticianina de A. ferrooxidans (filas 1 y 3) con la secuencia de rusticianina de A.
ferrivorans (fila 2 y 4). La primera sección va desde el aminoácido 6 (Thr) hasta el aa 86 (Ser), en la segunda sección se
muestra de la posición 86 (Ser) hasta el aa 155 (Lys). Alineamiento realizado en Cn3D.
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FIGURA 09. Alineamiento de la secuencia query de A ferrivorans en la estructura tridimensional de rusticianina de A
ferrooxidans (A-F). Se muestran diferentes planos de la estructura (B-D). En E y F se muestra la estructura con los residuos
de aa. En rojo aa de identidad, en azul, aquellos que diferían en alineamiento.
A B
C
F E
D
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En la figura 09 (F) se observa que tres aminoácidos interaccionan con el átomo de cobre (en negro); His85,
Ala144 y Cys138. Se observa además, hay una mayor proporción de cadena beta extendida y solo una pequeña
porción para establecer una estrucutra secundaria de alfa hélice. Adicionalmente, hay una gran parte que no
forma estructura secundaria, incluso en la estructura de A. ferrooxidans (figura 07) sin alinear. Se observa que la
estructura tiene un motivo como barril formado por láminas beta extendida. Tan solo 16 aminoácidos se
encontraron diferentes en el alineamiento; la mayor parte de los aminoácidos que difieren forman parte de las
hojas beta, esto haría perder la estrucura secundaria. Dos de los aminoácidos que diferían se encuentran dentro
de la estructura de hélice. Lo cual probablemente haría perder la estructura secundaría.
DISCUSIÓN
El mecanismo de la oxidación de hierro ferroso por proteobacterias ha sido ampliamente estudiado,
principalmente con A. ferrooxidans. Los genes que codifican los componentes principales implicados en la
transferencia de electrones a partir de hierro ferroso a oxígeno comprenden de un operón que codifica una
proteína de la membrana externa de función desconocida, dos citocromos c, rusticyanin y una citocromo
oxidasa Aa3 (Appia-Ayme et al., 1999) . Rusticyanin, una pequeña proteína periplásmica de cobre, también ha
sido el foco de mucho trabajo sobre la base estructural de su estabilidad a los ácidos y alto punto medio de
potencial redox (Kanbi et al., 2002). Los datos sobre la ubicación de la proteína rusticianina en A. ferrooxidans
no concuerdan con lo precicho para la proteína de A. ferrivorans, los parámetros bioquímicos predichos por la
herramienta ProtParam nos ofrece una idea de una proteína soluble en solución hidrofóbica. Es posible que la
proteína rusticianina no se encuentre en el periplasma, a diferencia de la proteína A. ferrooxidans.
Comparando la predicción de estructura secundaria con la terciaria, se observa que hay concordancia en cuanto
a la proporción de láminas beta extendidas y ramdom coil; adicionalmente hay un bajo porcentaje de
aminoácidos predichos para formar estructura alfa hélice, tal como se muestra en la comparación con la
estructura 3D. Los aminoácidos Met18 y Glu20 en A ferrooxidans que cambian a leucina y alanina
respectivamente en A ferrivorans, se encuentran formando la estructura alfa hélice. El aminoácido alanina en la
posición 20 de A ferrivorans no cambiaría la formación de una estructura secundaria; Ala proporciona cierta
estabilización hidrófoba sin incurrir en el coste de la entropía asociada con la restricción conformacional dentro
la hélice alfa (Blaber M et al, 1993).
De los aminoácidos que difieren entre la estructura 3D de A. ferrooxidans y A ferrivorans, los más importantes
son aquellos involucrados en la interacción con el átomo de cobre, sitio activo y los implicados en la estabilidad
y plegamiento de la proteína, por lo tanto, el énfasis en los aminoácidos que van a determinar la formación de
esctructuras secundarias es también importante. Entre los aminoácidos formando las láminas beta extendidas,
las posiciones Val74 y Phe87 están incluidos, cada uno en el medio de una extensión beta; en el alineamiento, se
observa que estos aa. cambian a Ile74 y Leu87 respectivamente. En la figura 10 se puede observar que algunos
aminoácidos (según Fujiwara, K. et al., 2012) tienen menor tendencia a formar cadenas beta en una estructura
tridimensional tipo barril en donde los residuos de los aminoácidos se encuentran escondidos del solvente, es
decir de manera interior al barril. En A. ferrivorans los aminoácidos Ile74 y Leu87 tienen menor tendencia que
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valina y fenilananina para formar cadenas beta, sin embargo eso no impediría la formación de la estructura.
Posiblemente dichos aminoácidos le dan una característica más dinámica a la estructura proteínica de A
ferrivorans; esta especie es psicrotolerante, y crece a temperaturas menores a 10 grados centígrados, al
contrario de A ferrooxidans que habita temperaturas de 30 ºC, por lo cual dichos aminoácidos le conferirían
mayor libertar o flexibilidad a la proteína de la bacteria psicrotolerante.
FIGURA 10. Propensidad de los aminoácidos con residuos ocultos a formar cadenas beta. Se puede observar a
los aminoácidos isoleucina que tiene una menor tendencia que valina a formar cadenas beta, de la misma
manera, leucina tiene menor tendencia que fenilalanina a formar cadenas beta. (Fujiwara, K. et al., 2012).
Metaloproteínas, en general, y las proteínas de cobre, en particular, se estabilizan en gran medida por el grupo
prostético (es decir, el ión metálico). En principio, este efecto estabilizador se produce independientemente de
la función del ión metálico en la función de la macromolécula. Proteínas azules de cobre (BCP) son proteínas
relativamente pequeñas, solubles electrones de transferencia (Randall et al 2000; Vila y Fernández 2001).
Las metaloproteínas de cobre, en general, poseen una estructura de β-barril y están dispuestos en una llamada
topología de llave griega, lo cual es característico de la proteína query (rusticianina). La rigidez se debe a la gran
red de enlaces de hidrógeno que se extiende entre los lámina β de estas proteínas, que a su vez es necesario
para cumplir con su función (transporte de electrones). El sitio activo es particularmente rígido. El ión de cobre
está fuertemente unido a un átomo de azufre de un ligando cisteína y para los átomos de nitrógeno de imidazol
de dos residuos de histidina (Alcaraz, L. et al.,, 2005) (HisN y HisC, respectivamente, de acuerdo con su
proximidad en la secuencia de los extremos N-y C-terminales). Esto último concuerda con la proteína en estudio,
cuyo átomo de cobre se encuentra unido por una cisteína en la posición 138 (Cys138), de igual manera una
histidina se encuentra en la posición 85 (Hys85) interaccionando con el átomo de cobre.
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En la mayor parte de estas proteínas, un átomo de azufre axial de una metionina, débilmente unido al metal,
completa la coordinación pseudotetrahedral (Randall et al. 2000). Esta geometría, que permanece
esencialmente inalterada tras la oxidación o reducción de los iones de cobre, se impone por el andamio de
proteínas. Este no es el preferido para la coordinación de iones cobre (II) y por lo tanto, el metal se encuentra en
una conformación tensa (Malmström, 1994). Rusticianina de A. ferrivorans posee los aminoácidos, que
interaccionan con el cobre, conservados, sugiriendo que la estabilidad de la proteína es muy alta y posee las
mismas características de potencial redox que A. ferrooxidans. Esta característica permite un bajo consumo de
energía de re-organización, que se requiere para un proceso redox eficiente (Gray et al 2000).
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