polyamines - accueil - philippe fié · pdf file4 1)#historique! mises en...

Dr. Philippe FIEVET

Les Polyamines Revue de littérature

Hommages et remerciements !

Cette monographie représente à ce jour (mine de rien) 3 mois de travail à temps (beaucoup trop) plein que j'ai commencé en décembre 2007, afin de divulguer au plus grand nombre les résultats d'une équipe française de recherche clinique : l'équipe du Pr. Jacques-Philippe Moulinoux et de Véronique Quemener, que j'avais personnellement rencontrée au cours du congrès conjoint SFC-SFI (société française du cancer – société française d'immunologie) en décembre 1993 à Marseille.

Fortement impressionné par la qualité et la rigueur de son

intervention, par la pertinence des travaux présentés - d'autant plus que dans l'assistance, personne ne prêtait attention à sa communication tout en bavardant - pour moi, elle avait fait l'effet d'une bombe. J'ai voulu en savoir davantage, moi qui travaillais d'arrache-pied en nutrition sur les problèmes de maladies auto-immunes. Ce qui fut dit à la pause du congrès fut fait, madame Quemener m'envoya tous les articles de son équipe sur le sujet dans le mois qui suivit. Boum, j'étais tombé dans la marmite à polyamines et j'ai encore une bosse.

Qu'elle en soit remerciée, j'ai passé de longs et délicieux

moments d'apprentissage, de lectures, et de réflexions sur les polyamines. D'autant que quelques temps plus tard, le Pr. Moulinoux me confiait son rapport à l'académie de médecine ! Le nirvana en quelque sorte. Quel bonheur ! Merci, je suis un peu moins idiot grâce à vous.

Il est donc tout à fait normal que je renvoie l'ascenseur : je

continuerai à faire des conférences sur le sujet, ici et là. Les avancées importantes dans les cancers méritent à coup sûr d'être connues du grand public, malgré les grandes réticences de ceux qui en sont encore à croire qu'hormis eux point de salut. En somme, un Dieudonné des polyamines !

Puisque la grande majorité des médecins méconnait ces travaux,

ses incidences pratiques, et que le public n'est pas informé non plus, au moins, on ne pourra plus dire qu'on ne savait pas : vous avez libre accès à l'information que je publie.

C'est une synthèse, non exhaustive ni complète encore, car le

travail est énorme de recueillir de par le monde tous les travaux effectués sur les polyamines, de les traduire, de les mettre à jour, de les mettre en forme pertinente tant pour le professionnel de santé que pour le public. Je continue, je fais au mieux, et au fil du temps, cela s'enrichira encore !

Table des matières

1) Historique ......................................................................................................................................... 4 2) Structure des Polyamines ........................................................................................................... 5 3) Synthèse des polyamines ............................................................................................................ 7 4) Métabolisme intra-‐cellulaire des Polyamines ..................................................................... 8 5) Rétroconversion des Polyamines ............................................................................................. 9 6) Transport des Polyamines ....................................................................................................... 11 7) ODC et SAMDC .............................................................................................................................. 13 8) Intérêt diagnostique en cancérologie .................................................................................. 18 9) Fonctions des PA ......................................................................................................................... 20 10) Polyamines et système nerveux central ........................................................................... 26 11) Effet antalgique ......................................................................................................................... 30 12) Position du problème en cancérologie ............................................................................. 32 13) Carence en polyamines et croissance tumorale ............................................................ 33 14) Carence en polyamines et immunité ................................................................................. 36 15) Approche nutritionnelle ........................................................................................................ 38

1) Historique

Mises en évidence pour la première fois au 17ème siècle dans le liquide séminal

humain, ces polyamines (PA) sont des ingrédients universels de toute cellule eucaryote.

Les polyamines sont de petites molécules dont le rôle biologique est INCONTESTABLE, il s’agit de :

• la spermine (ou neuridine), • la spermidine, • la putrescine, • la cadavérine.

Ø Van Leeuwenhoeck en 1678 découvre des cristaux de spermine

phosphate dans le liquide séminal humain.

Ø Vauquelin en 1791 décrit une structure solide à 4 pans terminée par des pyramides très allongées à 4 faces...

Ø Böttcher en 1865 décrit ces cristaux et confirme la structure de cristal

décrite par Vauquelin.

Ø En 1878, Schreiner montre que les cristaux présents dans le liquide séminal humain sont composés d’un sel de phosphate d’une base organique.

Ø La putrescine et la cadavérine sont isolées pour la première fois en

1887 par L. Brieger à partir de cultures de Vibrio cholerae.

Ø Le nom de spermine est donné la première fois par Ladenburg et Abel en 1888.

Ø Harrison en 1931 décrit que divers tissus animaux contiennent

principalement de la spermine et de la spermidine comme polyamines.

Ces molécules basiques sont conservées au cours de la phylogenèse et la

spermine existe chez les archéobactéries (4 milliards d’années).

Il existe de nombreuses polyamines répandues dans le règne végétal et animal.

2) Structure des Polyamines

La structure des polyamines (PA) a été établie entre 1924 et 1927 par Rosenheim, mais il a fallu attendre une cinquantaine d’années supplémentaires pour que les PA ne soient plus considérées comme des produits de simple dégradation. Il s’agit de petites molécules hydrosolubles d’étude difficile in situ, car elles n’ont pas de caractéristiques optiques, et nous ne possédons pas de sondes spécifiques. Cependant, la mise au point d’outils immunologiques, notamment les anticorps anti-polyamines, a fait progresser les connaissances sur la localisation et la distribution cellulaires et tissulaires des polyamines.

STRUCTURE DES PRINCIPALES POLYAMINES

dénomination structure

Putrescine NH2-(CH2)4-NH2

1,4 butane diamine

Spermidine NH2-(CH2)3-NH-(CH2)4-NH2

N-[3 aminopropyl]-1,4 butane diamine

Spermine NH2-(CH2)3-NH-(CH2)4-NH-(CH2)3-NH2

N,N’-bis[3-aminopropyl]-1,4 butane diamine

Cadavérine NH2-(CH2)5-NH2

(1,5 pentane diamine)

Chez les mammifères, la PUTRESCINE, la SPERMIDINE et la SPERMINE sont présentes dans la majorité des liquides biologiques et dans toutes les cellules de l’organisme. La CADAVERINE, obtenue par décarboxylation de la lysine, provient principalement du microbiote intestinal, et se retrouve parfois dans le corps.

H2N NH2

putrescine

spermidine

spermine

H2N H2N

CO2H ornithine

Les fonctions NH2 sont protonées au pH physiologique de l’organisme (NH3+).

Elles ont donc une affinité pour les structures négativement chargées de l’organisme. Elles sont ainsi poly-cationiques, et peuvent donc engager des liaisons amides avec les protéines, ce qui modifiera alors leurs propriétés.

3) Synthèse des polyamines

Chez les humains les PA sont synthétisées par voie endogène à partir de l’ornithine. L’ornithine est un acide aminé non essentiel, jamais engagé dans une liaison peptidique, et provenant du cycle de l’urée.

Elles sont inter-convertibles (passage de l’une à l’autre). De plus, il existe un apport exogène de polyamines, assuré par l’alimentation, et majoré par la flore intestinale qui participe à leur formation au cours du métabolisme bactérien.

4 enzymes sont nécessaires à la fabrication des PA (page suivante):

1. L’ornithine décarboxylase (ODC) 2. La S-adénosine méthyl décarboxylase (SAMDC) 3. La spermidine synthétase (SPDS) 4. La spermine synthétase (SPMS)

L’ODC décarboxyle l’ornithine en putrescine. Son cofacteur est la vitamine B6.

La SAMDC décarboxyle la S-adénosyl-méthionine (forme active de la méthionine). Ces 2 enzymes ont une demi vie de moins d’une heure.

La SAMDC permet ainsi l’entrée de la méthionine dans le cycle des PA. La méthionine (AA essentiel) est indispensable à la synthèse protéique.

Ces 2 enzymes ODC et SAMDC sont régulés par le pool des différentes polyamines.

La spermidine synthétase joue un rôle mineur sur la teneur intracellulaire en PA. C’est une enzyme constitutive et stable, régulée par la biodisponibilité en S-adénosyl-méthionine décarboxylée (SAM décarboxylée). Mais son activité peut être augmentée s’il existe un stimulus de promotion et de croissance, et dans ce cas il y a augmentation de la transcription de son ARNm (et de sa traduction.

La spermine synthétase joue également un rôle mineur sur la teneur en PA intracellulaire. Exprimée seulement chez les eucaryotes, son taux est constitutif et stable. Elle est régulée par la biodisponibilité en SAM décarboxylée.

4) Métabolisme intra-‐cellulaire des Polyamines Les enzymes sont représentées comme suit :

L’ornithine ordinairement engagée dans le cycle de l’urée est en partie

détournée pour être transformée en putrescine lors de la prolifération cellulaire.

La putrescine est convertie en spermidine par la SPDS puis en spermine par la SPMS. Ces 2 enzymes utilisent la SAM décarboxylée comme donneur de propylamine.

La méthyl-thio-adénosine (MTA) sera scindée en adénosine et en 5’ méthyl-thio-ribose-1-phosphate par l’enzyme 5’ méthyl-thio-ribose-phosphatase, dont l’activité est diminuée ou absente dans les cellules malignes. Le 5’ méthyl-thio-ribose-1-P permet de sauvegarder le pool de méthionine.

Remarquons donc que dans le cas d’une cancérisation, le pool cellulaire de méthionine s’effondre dans les cellules malignes, ce qui est néfaste à la bonne régulation de lecture du génome.

spermidine

arginine

ornithine

putrescine

Acétyl putrescine

N8-acétyl spermidine

spermine

SAM décarboxylée SAM

méthionine

adénine

MTA 5' Méthylthioribose-1-P

SAM décarboxylée SAM

méthionine

5' Méthylthioribose-1-P

adénine

5) Rétroconversion des Polyamines Les enzymes sont représentées comme suit :

Il existe une rétroconversion des PA effectuée par une autre enzyme, la

polyamine oxydase (PAO). Cette PAO est constitutive. C’est une enzyme FAD dépendante. Son activité est intense. L’inter-conversion est initiée par acétylation de la spermine et de la spermidine. L’acétyle vient du coenzyme A et l’enzyme responsable est la spermine/spermidine N1-acétyl-transférase (SSAT).

La N1 acétyl spermine/spermidine est ensuite oxydée par la PAO. Fait intéressant, l’activité de la PAO produit du peroxyde d’hydrogène H2O2 et fournit donc des radicaux libres oxygénés à la cellule.

Ainsi, de la putrescine pourra être redonnée à partir de l'oxydation de la spermidine, et de la spermidine pourra être redonnée à partir de l’oxydation de la spermine.

La diamine oxydase (à cuivre), agit sur les PA et leurs dérivés acétylés et

spermidine

putrescine

spermine

β alanine

Acétyl Co A

3-acétamido propanal

Acétyl Co A

3-acétamido propanal

N1-acétyl spermidine

N1-acétyl spermine

fournit du GABA, du 3 acétamido-propanal, H2O2 et de l’ammoniac.

La SSAT acétyle la spermidine en N1, mais chez les mammifères il existe une acétylation en N8; N1 et N8 diacétyl spermine et spermidine se retrouvent dans les urines.

L’activité de la SSAT ainsi que son taux sont faibles dans la plupart des cellules. Ainsi, la SSAT régule le taux de dégradation des PA. Mais la présence d’agents toxiques, de certaines hormones, de facteurs de transcription, de polyamines ou analogues induisent efficacement sa production.

Les PA induisent également la synthèse de PMF1 (Polyamine Modulated Factor 1), qui est un facteur de transcription liant le PRE (Polyamine Response Element) sur le promoteur de la SSAT.

Les analogues de polyamines accroissent grandement la demi-vie de la SSAT, en prévenant son ubiquitinylation et son adressage protéosomal.

La surexpression de la SSAT est étudiée sur modèles transgéniques et montre une distorsion du pool des PA.

On voit alors:

• L’apparition de N1 spermidine acétylée, • L’accumulation massive de putrescine, • Une forte diminution du pool de spermine et de spermidine.

Le signe phénotypique le plus marquant est une perte de poils chez

l’animal (trop de putrescine).

Les résultats montrent sans équivoque que le catabolisme et non l’inhibition

de synthèse des PA représente le mécanisme directeur dans le métabolisme des polyamines.

Le but majeur étant de prévenir une hyper accumulation de PA

intracellulaire.

6) Transport des Polyamines

La plupart des cellules possèdent la capacité plus ou moins forte à synthétiser des PA. Il est clair que la synthèse de novo n’est pas la plus importante. Des polyamines additionnelles sont nécessaires pour les cellules en demande élevée en PA (cellules tumorales ou à renouvellement rapide). Les cellules cancéreuses ont un transport amplifié.

Des polyamines exogènes sont ainsi transportées quand la synthèse est perturbée ou si le tissu ne peut en produire. Leur provenance est variée: alimentaire, bactérienne, ou par relargage issu d’autres cellules. Les cellules de mammifères ont un mécanisme de transport actif, nécessitant un transporteur et de l’ATP, modulé par un potentiel membranaire. Un transport par endocytose peut exister.

Le transport de spermidine et de putrescine est sensible (mais non dépendant) au sodium, et dépend du calcium, du manganèse et du magnésium. L’extraction de la spermine n’est pas sensible au sodium extracellulaire

Beaucoup de cellules ont un transporteur unique par polyamine mais il existe aussi un transporteur commun. La spécificité du transporteur n’est pas très forte: des molécules structurellement peu proches des PA (comme l’herbicide paraquat ou des dérivés alkylés sur le groupe amine primaire, ou encore le MGBG inhibiteur de la SAMDC) peuvent être extraites du milieu extra cellulaire.

Les protéines et la composition du système transporteur sont inconnues chez les mammifères. La déplétion en polyamines et les facteurs de croissance augmentent le transport.

En fait, la règle est que l’augmentation de la formation des PA élève aussi leur capture, mais de forts taux intracellulaires inhibent la captation; cet effet est en partie régulé par l’antizyme, une protéine multifonctionnelle inhibitrice de l’ODC.

La muqueuse intestinale a une grande importance dans le transport. Les entérocytes captent les polyamines depuis la lumière intestinale (captation identique à celle d’autres types cellulaires) mais les entérocytes sont innombrables. De plus, il existe une diffusion passive à ce niveau. Ces polyamines intestinales jouent un rôle important dans la régénération et dans la croissance épithéliale et contribuent à la croissance des tumeurs. Si des rats sont nourris avec un aliment contenant de la putrescine radiomarquée, 24 h après ingestion, 6 % de la radioactivité ingérée est retrouvée au niveau de la tumeur.

La tumeur utilise donc les polyamines EXOGENES pour entretenir son état prolifératif.

L’excrétion des PA chez les mammifères est beaucoup moins étudiée; en général, les PA et leurs dérivés acétylés se retrouvent dans les urines chez les sujets sains ou malades, animaux ou humains. Il semble exister un système d’excrétion différent de celui de l’extraction. L’antizyme jouerait aussi un rôle de régulateur d’excrétion.

Dans le milieu extracellulaire, les PA peuvent être liées de manière covalente à des protéines de transport comme :

• la fibronectine, • l’alpha 2 macroglobuline, • l’alpha 1 antitrypsine, • l’alpha 1 antichymotrypsine, • l’antithrombine III.

Les hématies transportent également les PA : la quasi-totalité de la

spermine et de la spermidine circulante est présente dans les globules rouges, et une rigidification membranaire de ceux-ci a pu être mise en évidence corrélativement à l’augmentation des concentrations érythrocytaires. Ces modifications participent à l’installation d’une anémie hémolytique chez les animaux cancéreux.

La putrescine est activement accumulée dans les plaquettes, où il existe un système de transport membranaire spécifique.

Les lymphocytes B produisent normalement des anticorps anti polyamines susceptibles de former des immuns-complexes en cas de cancer.

7) ODC et SAMDC

Les tissus cancéreux et cellulaires ont des niveaux de PA et une biosynthèse de PA très élevée (Scalabrino & Feriolo 1982, Pegg 1988, Marton & Pegg 1995). Parallèlement la synthèse de l’ODC est forte, celle de la SAMDC un peu moindre.

L’ODC devient active après traitement aux carcinogènes chimiques et promoteurs de tumeurs, comme d’ailleurs dans les cellules transformées par divers oncogènes tels v-src, neu, ras (Hölttä et al 1988, Pegg 1988, Sistonen et al 1989b, Auvinen et al 1992).

L’hyperexpression ODC induit une transformation maligne, une capacité à croître en colonies en milieu semi solide et à former rapidement des tumeurs évolutives chez les souris nude (Auvinen et al 1992, Moshier et al 1993, Auvinen et al 1997).

Dans une autre étude, l’hyperexpression ODC semble incapable de transformer les cellules NIH3T3 en l’absence de l’oncogène c-Ha-ras (Hibshoosh et al 1991).

La SAMDC hyperexprimée peut également conduire à une transformation celllulaire maligne des cellules NIH3T3 (Paasinen-Sohns et al 2000).

La SAMDC semblerait être un inducteur potentiel de transformation maligne plus puissant que l’ODC.

Alors que les cellules transformées par l’hyperexpression de SAMDC ou ODC peuvent former des tumeurs chez la souris nude, les animaux transgéniques hyper exprimant l’ODC ne montrent pas de tumorigénèse spontanée accrue pendant leur durée de vie (Alhonen et al. 1995) et maintiennent normal leur taux de PA dans les tissus (Halmekytö et al 1991a, Halmekytö et al 1993).

Cependant ces cellules montrent une grande capacité à réagir à de faibles doses de carcinogènes chimiques cutanés ou bien à l’exposition des UVB : formation de papilloma (Halmekytö et al 1992). Des observations similaires ont été faites avec des souris transgéniques K6/ODC hyperexprimant l’ODC dans les kératinocytes de follicules pileux (O’brien et al 1997), et ces souris montrent une sensibilité fortement accrue à former des tumeurs spontanées (Megosh et al 1995). Une faible dose unique de carcinogène est généralement suffisante pour initier une tumorigénèse chez les souris K6/ODC.

Ces cellules montrent souvent des mutations du gène c-Ha-ras après administration de doses d’initiation de carcinogènes (Megosh et al 1998).

Quand les souris transgéniques K6/ODC sont croisées avec les souris transgéniques TG.AC v-Ha-ras, les souris double-transgéniques produisent spontanément des carcinomes cutanées (Smith et al 1998).

Cet effet est réversible en présence de DFMO (inhibiteur de l’ODC) (Lan et al 2000). Des résultats similaires sont obtenus quand les cellules infectées avec ras ou ODC ou les 2 sont transférées aux souris nude (Cliford et al 1995).

Seules les cellules infectées à hyperproduire à la fois ODC et l’oncoprotéine c-Ha-ras sont capables de former des tumeurs. Les souris K6/ODC –actuellement dénommées K5/ODC—ont récemment montré leur très grande sensibilité à

l’exposition de radiations UVB (Ahmad et al 2001). Après 30 semaines d’exposition répétée aux UVB, 40% des souris K5/ODC développent des tumeurs épidermiques, tandis que les souris glabres SKH-1—modèle le plus commun et le plus sensible de la photocarcinogénèse (Bickers et Athar 2001) - ne développent pas de tumeurs après une exposition de plus de 50 semaines aux UVB.

Le rôle central de l’ODC dans la carcinogénèse épidermique a été conforté par le fait que l’antizyme (l’inhibiteur naturel de l’ODC) ciblé dans les kératinocytes de souris transgéniques diminue la sensibilité aux carcinogènes chimiques (Feith et al 2001).

Les cellules tumorales pourraient avoir une isoforme d’ODC spécifique, ou une modification post-transcriptionnelle de l’ARNm de l’ODC, ou encore une modification de sa régulation, car l’activité ODC dans quelques tumeurs dépend du GTP (O’Brien et al 1986, O’Brien et al 1987, Hietala et al 1988), normalement une propriété de quelques ODC bactériennes.

On ne sait pas bien comment l’hyper expression de l’ODC et de la SAMDC conduit à une transformation maligne mais on a démontré que quelques composants des voies de transmission du signal cellulaire sont impliqués. La transformation cellulaire par hyperexpression de l’ODC aboutit à la phosphorylation du facteur d’échange nucléotidique Sos-1, de Raf-1 kinase, et c-Jun—formant avec c-fos le facteur de transcription AP1 hétérodimérique régulant la transcription des gènes cibles - (Paasinen-Sohns & Hölttä 1997).

Les kinases Erk1 et Erk2—de la famille MAP—ne sont pas nécessaires pour médier le signal. Similairement c-Jun est le médiateur « intégral » de la signalisation dans la transformation induite par l’hyperexpression de la SAMDC (Paasinen-Sohns et al 2000).

Les transformants montrent une activation constitutive de la voie c-Jun N Hacetyl spermidine terminal kinase (JNK). L’expression de mutants négatifs dominants JNK1 et SEK1 – 2 kinases upstream de c-Jun reversent le phénotype des transformants SAMDC.

Au niveau de la régulation cellulaire, l’effet largement habituel de l’ODC et de la SAMDC dans les cellules transformées est une down-regulation de l’inhibiteur de cycline kinase p27 kip1 et la perte de celui-ci dans les complexes cyclineE/cycline dépendante kinase 2 (Ravanko et al 2000).

De plus, les niveaux de cycline D1 et de cycline D1 dépendante kinase de même que l’activité totale cycline dépendante kinase 4 sont élevés.

Ceci suggère que l’expression de l’ODC ou de la SAMDC peut affecter le cycle cellulaire par différentes voies. Il est évident que les taux de PA, si fortement associés à une prolifération rapide et à une croissance tumorale, ont motivé un grand effort de recherche sur les inhibiteurs de PA ainsi que sur les analogues de PA pour tester leur capacité à réduire la croissance des cellules et des tumeurs cancéreuses.

• Les inhibiteurs de l’ODC

Le plus étudié, le plus ancien, est le DFMO (alpha difluoro méthyl ornithine), c’est un inhibiteur irréversible de l’ODC (Bey et al, 1978, reviewed in Meyskens & Gerner 1999).

Le traitement de cellules de mammifères (rongeurs et humains) avec le DFMO

aboutit généralement à une suppression du contenu cellulaire en putrescine et en spermidine dans les tissus et dans les cellules où le pool de PA dépend de l’ODC, sans affecter la teneur en spermine (Gerner et Mamont 1986, Pegg 1988, Meyskens et al 1998).

L’inhibition de l’ODC supprime la formation de tumeurs dans les modèles expérimentaux de cancer de la vésicule biliaire (Nowels et al 1986), du sein (Thompson et al 1986), de l’intestin (Nigro et al 1986), et de la peau (Peralta Soler et al 1998, Arbeit et al 1999).

Cependant les premiers essais cliniques avec le DFMO sont décevants, et à

haute dose des effets secondaires apparaissent—diarrhées, douleurs abdominales, anémie modérée et perte de l’audition temporaire (Abeloff et al 1984, Abeloff et al 1986, Talpaz et al 1986, Harari et al 1990).

Le DFMO affecte aussi considérablement les gliomes (Levin et al 1992), mais lors d’essais de phase III, aucun bénéfice n’est obtenu en supplément lorsque l’on adjoint une radiothérapie (Prados et al 2001).

De ce fait, le DFMO est actuellement étudié et testé comme comme agent de prévention à dose faible sur le long terme il y a peu d’effets secondaires. (Love et al 1993, Meyskens et al 1994,Mitchell et al 1998, Carbone et al 2001, Simoneau et al 2001). A faible dose et sur le long terme, on n’observe par d’effets secondaires.

D’autres essais cliniques sont effectués avec l’inhibiteur de synthèse de la SAMDC, le MGBG (methyl glioxal bis guanyl hydrazone), et le SAM 486 A.

Le MGBG est toxique à forte dose, le SAM 486 A développe une activité antiproliférative prometteuse dans les cellules en culture et dans les premiers essais sur des animaux.

IL EST MAINTENANT CLAIREMENT ETABLI QUE L’INCAPACITE DU DFMO A REDUIRE IN VIVO LA PROLIFERATION CELLULAIRE MALIGNE PROVIENT EN GRANDE PARTIE DU FAIT QUE LES CELLULES CANCEREUSES RESTAURENT LEUR POOL INTRACELLULAIRE DE PUTRESCINE ET DE SPERMIDINE EN CAPTANT LES PA DEPUIS LE MILIEU EXTERIEUR.

• Antizyme

L’antizyme (identifié pour la première fois dans des cultures de cellules d’hépatome de rat) inhibe l’activité ODC et est induit après addition de putrescine (Fong et al 1976). On a montré très vite que l’antizyme était présent dans d’autres lignées cellulaires et qu’il pouvait être induit par la spermine et la spermidine (Heller et al 1976) qui sont les inducteurs les plus efficaces (Matsufuji et al 1995). L’antizyme est présent chez différentes espèces, champignons, levures, nématodes, insectes et vertébrés. Sa présence dans les bactéries est discutée.

En plus de sa fonction inhibitrice sur l’ODC, l’antizyme cible sa dégradation (Murakami et al 1992) régule le captage cellulaire des PA (He et al 1994, Mitchell et al 1994) et l’excrétion extra cellulaire des polyamines (Sakata et al 2000).

Chez les vertébrés l’antizyme existe sous plusieurs isoformes. L’isoforme antizyme 1 est la plus anciennement connue, la plus ubiquitaire et la plus étudiée. Son poids moléculaire est de 21 kDa, il est constitué de 221 acides aminés chez la souris et le rat et de 228 chez l’homme. Il a une très grande affinité pour le

monomère ODC. La moitié carboxyterminale de la molécule (121-227) est suffisante pour lier l’ODC et est essentielle pour inhiber le transport des PA. La partie 69-112 est nécessaire pour déstabiliser l’ODC et suffisante pour accélérer sa dégradation en protéines hétérologues quand elle se lie de façon covalente.

L’antizyme joue un rôle important dans la régulation des taux de PA intracellulaires. L’expression de l’antizyme dans le cancer peut être diminuée (Tsuji et al 1998), ou accrue (Saverio et al 2000). Cette dernière représente sans doute la réponse normale à une élévation de concentration de PA et peut, avec l’accroissement d’activité de la SSAT, prévenir l’accumulation de PA à des niveaux toxiques. Par contre, de fortes concentrations en PA dans des cultures primaires de carcinome prostatique suppriment la croissance de cellules faiblement métastatiques capables d’exprimer l’antizyme, mais pas la croissance de cellules fortement métastatiques incapables d’exprimer l’antizyme (Koike et al 1999).

De plus, l’hyperexpression forcée de l’antizyme dans des lignées de kératinocytes malins de hamster aboutit à une réversion du phénotype cancéreux et induit une différenciation épithéliale ainsi qu’une déméthylation de l’ADN (Tsuji et al 2001), tandis que l’expression ciblée de l’antizyme dans la peau de souris transgéniques diminue l’induction de l’ODC promue par la tumeur et diminue la sensibilité aux carcinogènes chimiques (Feith et al 2001). Lorsque l’antizyme est hyperexprimé dans les cellules épithéliales prostatiques humaines immortalisées, les taux de spermidine et de spermine diminuent légèrement mais les taux de putrescine sont divisés par 3 (Scorcioni et al 2001). Ceci aboutit à l’accumulation des cellules en phase S, tout comme on l’observe similairement lorsque les cellules souffrent de déficit en polyamines.

Toutefois, l’expression de l’antizyme 1 n’est pas nécessaire pour la viabilité cellulaire: les souris knock-out pour l’antizyme sont viables, morphologiquement normales, fertiles, mais ont une forte mortalité périnatale—environ 1/3 dans les quelques jours précédant ou suivant le terme normal.

L’antizyme 1 ciblerait les cyclines et les kinases cycline-dépendantes en vue de leur dégradation. Il est possible que les antizymes soient non seulement impliqués dans la régulation du métabolisme des PA, mais beaucoup plus largement dans la régulation de différents processus de croissance ou de processus en relation avec le cycle cellulaire. Ceci est conforté par le fait de l’observation que la protéine Smad 1 se lie à l’antizyme 1 pour être dégradée. Les protéines Smad médient la signalisation induite par les membres de la superfamille des TGFβ impliqués dans la prolifération cellulaire, la différenciation et l’apoptose (Itoh et al 2000).

Ainsi, il reste beaucoup de questions sans réponse sur les fonctions des antizymes.

Les antizymes forment une famille génique ancestrale. Chez les vertébrés, on trouve de multiples isoformes; chez les humains existent au moins 4 antizymes codés chacun par un gène différent (Coffino 2001). Ces antizymes présentent 3 traits communs. Ils ont une homologie structurale, surtout dans la moitié carboxyterminale requise pour la liaison à l’ODC. Ils peuvent se lier à l’ODC, réduire son activité et, selon l’isoforme, amorcer sa dégradation. Enfin, leur synthèse est stimulée par les PA via « frameshifting » ribosomal ce qui nécessite des motifs conservés dans l’ARNm à proximité du site de « frameshifting ».

L’antizyme 1 est largement distribué dans les tissus, l’antizyme 2 aussi mais son expression est moins abondante. L’antizyme 3 est exprimé seulement dans les cellules germinales mâles à un stade post-méiotique de leur transformation en spermatozoïdes (Tosaka et al 2000, Ivanov et al 2000). L’antizyme 4 est

uniquement connu comme « EST ». Les antizymes 1 et 2 humains sont identiques à 54 %. Ils lient et inhibent tous 2 l’ODC, et sont globalement aussi efficaces pour inhiber l’extraction es PA.

• Les analogues des polyamines

Les analogues de PA peuvent mimer l’action des PA, induire une diminution de leur synthèse et une élévation de leur catabolisme; ils sont transportés part les mêmes systèmes membranaires, mais ne peuvent se substituer aux PA en termes de différenciation et de croissance cellulaires (Casero & Woster 2001).

Les analogues de PA sont en général des dérivés symétriques ou non de dérivés alkylés de PA. Les groupes alkyl sont généralement ajoutés au groupe amine primaire terminal.

Plusieurs analogues des polyamines ont montré une activité anti tumorale dans des lignées de cellules cancéreuses (Porter et al 1987, Porter et al 1991, Chang et al 1992, Davidson et al 1993) et dans les xénogreffes de tumeurs humaines (Benacki et al 1995, Sharma et al 1997).

Les meilleurs succès sont obtenus avec la N1-N11-diéthylnorspermine (DENSPM). Testée en essais de phase I (Creaven et al 1997, Straff et Bender 2001), elle est testée actuellement en phase II (Casero et Woster 2001). Le DENSPM induit une forte activité SSAT qui induit une décroissance des teneurs intracellulaires en PA (Gabrielson et al 1999).

8) Intérêt diagnostique en cancérologie

Seulement 2 % des polyamines libres se retrouvent dans le plasma, en partie liées aux lipoprotéines. Les hématies captent les PA synthétisées par les cellules en prolifération et les concentrations érythrocytaires reflètent l’importance de cette prolifération. L’index de prolifération cellulaire présente un réel intérêt surtout en cas de tumeurs à taux de doublement rapide.

Les animaux porteurs de tumeurs spontanées, greffées ou chimio-induites montrent que les taux de spermidine et de de spermine sont en règle générale corrélés aux concentrations tumorales de polyamines et à l'importance de la prolifération maligne (utilisation de putrescine marquée au 14C).

Par exemple, chez des enfants atteints de leucémie aigue lymphoblastique, chez des patients atteints de tumeur cérébrale, ou chez des patients atteints de cancer de prostate, la concentration érythrocytaire de PA est non seulement corrélée au stade de la maladie dès le moment du diagnostic, mais encore se révèle être un critère de réponse aux thérapeutiques ainsi qu’un moyen de surveillance de récidive.

Pour illustrer ce sujet, parmi les études effectuées, citons l'abstract paru dans Prog. Urol en 1992 :

"La spermidine et la spermine sont des polyamines ubiquitaires dont le métabolisme est important au niveau de la glande prostatique. Les polyamines interviennent dans les processus de prolifération et de différenciation cellulaires normaux ou tumoraux. Leurs taux érythrocytaires étant corrélés aux taux intra-tumoraux, nous avons dosé les PAE chez 45 témoins, 66 patients ayant une hyperplasie bénigne de la prostate et 100 patients ayant un adénocarcinome de prostate. Les polyamines érythrocytaires sont des marqueurs de prolifération et de métastases prostatiques et peuvent différencier les patients hormonorésistants des patients hormonosensibles. Bien que non spécifiques les polyamines sont des marqueurs circulants de l'état de prolifération tumorale d'un patient donné et ont très certainement un intérêt pronostique qu'il conviendra d'évaluer ultérieurement"

Et cet autre abstract de 1994 paru dans J. Urol.:

"Chez 43 patients porteurs de cancers prostatiques de stade D2, récemment diagnostiqués et non traités, les auteurs ont étudié la corrélation entre la progression d'une part, et l'indice de performance initial, l'hémoglobinémie initiale, le résultat du dosage de l'antigène spécifique prostatique, le grade de Gleason, l'étendue de la maladie sur la scintigraphie osseuse et les niveaux érythrocytaires de spermine et de spermidine d'autre part. Après le début de l'hormonothérapie, trois patients sont décédés d'autres causes et ont été exclus de l'étude, 16 sont restés en rémission avec un suivi moyen de 28±11 mois et 24 ont eu une progression (dont 18, soit 75% sont morts du cancer) avec un suivi moyen de 12±9 mois (p<0,05 pour le suivi). L'indice de performance initial, l'hémoglobinémie initiale et les niveaux érythrocytaires de spermine et de spermidine étaient corrélés à la progression, l'hémoglobinémie et le niveau érythrocytaire de spermine étant les variables indépendantes les plus significatives (p=0,006 et p=0,001, respectivement). En ce qui concerne la survie spécifique, seuls l'hémoglobinémie et le niveau érythrocytaire de spermine étaient des variables significatives (p=0,02 et p=0,0025, respectivement). Si ces données sont confirmées, le niveau érythrocytaire de polyamines, obtenu par simple prise de sang, pourrait permettre

de distinguer dès le diagnostic les patients à risque d'échappement hormonal rapide, qui pourraient bénéficier d'un traitement de première intention plus agressif"

On observe une rigidification membranaire des hématies d'animaux cancéreux (les PA s'associant aux phospholipides membranaires). Les hématies devenues anormales sont captées par les macrophages spléniques et induisent l'anémie retrouvée chez les patients cancéreux.

La rate contient chez un sujet cancéreux jusque 8 fois plus de PA et la splénectomie normalise la numération globulaire tout en réduisant significativement la prolifération tumorale. Ces résultats sont obtenus chez des patients atteints de cancer de la prostate M1, en normalisant de plus la formule blanche.

Il apparaît cependant que dans le cancer du sein et le mélanome malin on ne retrouve pas de taux de PA élevés dans le plasma et dans les hématies.

En cas de gliome malin, les taux érythrocytaires de PA avant traitement sont proportionnels au grade histologique de la tumeur.

En cas de cancer de la prostate, les taux de spermidine constituent un index de la prolifération tumorale, ceux de la spermine renseignent sur la progression métastatique et l'échappement hormonal. On peut ainsi prédire une évolution défavorable, quel que soit le traitement ultérieur.

Dans la leucémie aigüe lymphoblastique (LAL) les enfants possèdent des taux érythrocytaires proportionnels à la gravité de leur maladie.

Il existe une méthode d'analyse des PA sensible, spécifique et rapide. Dosage des polyamines érythrocytaires

Le dosage est effectué par HPLC à partir d’un prélèvement sanguin de 5 ml

recueilli sur citrate de sodium (vacutainer). Le prélèvement sanguin effectué par le laboratoire de biologie médicale du patient peut être transféré par « chronopost » du lundi au jeudi à l’adresse suivante :

Service du Professeur Moulinoux CHU Hôpital Pontchaillou 2 rue Henri Le Guilloux 35033 Rennes Cedex

Téléphone : 02.99.28.43.89 Télécopie : 02.99.28.43.90

Le prélèvement ne doit jamais être congelé. Il peut être conservé à +4°C

jusqu’à l’envoi postal. Le prélèvement doit parvenir au Service de Cytogénétique dans les 24h. Il n’est pas nécessaire de prévoir un envoi postal réfrigéré. Le prélèvement sanguin doit être accompagné d’une ordonnance émanant du médecin traitant. Le dosage (B60, code 990 de la nomenclature) est remboursé à 100% par la SS, les frais postaux sont à la charge du patient.

9) Fonctions des PA

Les polyamines sont essentielles à la vie et à la division de la cellule.

La complexité de leur métabolisme ainsi que leur homéostasie étroitement contrôlée renforce l’idée qu’elles sont essentielles à la survie cellulaire.

La spermine joue un rôle spécifique dans l’organisation structurale et la régulation d'activité de la chromatine. In vitro, la spermine permet de condenser l’ADN en particules sphéroïdes.

La spermine permet aussi l’association des sous unités ribosomiques et intervient à différentes étapes de la synthèse protéique. La spermine protège l’ADN des endonucléases induites lors de l’apoptose.

Les polyamines sont capables d’interagir avec diverses structures protéiques (comme l’actine, permettant alors sa polymérisation).

En bref, l’action essentielle des polyamines se situe au niveau :

• de la croissance cellulaire, • de la prolifération, • de la stabilisation des charges négatives de l’ADN, • de la transcription ARN, • de la synthèse protéique, • de l’apoptose, • de la régulation de la réponse immune.

Une fois présentes dans l’organisme, les polyamines sont métabolisées dans

différents tissus.

Ces polyamines sont présentes dans le lait maternel, et jouent très certainement un rôle majeur dans la maturation néo-natale (à côté de la flore intestinale incontournable); ainsi l’idée d’une supplémentation en polyamines dans les formulations alimentaires infantiles est à l’étude.

• Liaisons à l’ADN

C’est certainement la propriété la plus singulière et la plus importante des PA: leur capacité à se lier aux acides nucléiques et tout spécialement à l’ADN. Les PA neutralisent les charges des groupes phosphate, interagissent avec les bases et entrent à l’intérieur des boucles mineures de la double hélice (Feuerstein et al 1990, Feuerstein et al 1991, Tippin & Sundaralingam 1997, Deng et al, 2000). La spermine neutralise 40% des charges négatives de l’ADN, contre 10% pour les histones. Les polyamines peuvent élever la température de fusion Tm de l’ADN de façon dose-dépendante (Thomas et Bloomfield 1984). L’accroissement est de l’ordre de 10 à 20 fois pour une dose physiologique de spermine suggérant que les PA peuvent avoir un rôle significatif dans la stabilisation de la structure de l’ADN in vivo.

Les PA se lient avec l’ADN nu (Gosule & Schellman 1976, Pelta et al 1995) et la chromatine (Marquet et al, 1986, Sen et Crothers 1986) Les études immuno-cyto-chimiques sur la spermidine et de la spermine ont montré que les PA sont associées lors de la mitose à des chromosomes hautement compactés (Hougaard et

al 1987, Sauve et al 1999), de sorte qu’elles peuvent avoir un effet plus stabilisant que régulateur sur la structure de la chromatine pendant le cycle cellulaire (Laitinen et al 1998).

Les PA ont aussi la capacité à induire des changements conformationnels de l’ADN. On a montré que leur liaison promouvait la conversion dextre du B-ADN en Z-ADN senestre (Thomas et al 1991, Bancroft et al 1994, Hasan et al 1995), ou en une forme alternative A-ADN à hélice droite (Jain et al 1989). Cependant les PA peuvent aussi lier le B-ADN dextre de sorte qu’il n’y a pas de changement de structure secondaire détectable en spectroscopie Raman (Deng et al 2000). La forme Z-ADN senestre est induite principalement par blocage de séquences alternatives purine-pyrimidine et joue un rôle dans le contrôle transcriptionnel (Herbert et Rich 1999).

L’autre voie suggérant que les PA régulent la transcription est qu’elles induisent les boucles mineures de l’ADN après liaison aux boucles majeures (Feuerstein et al 1986, Feuerstein et al 1989, Rouzina et Bloomfield 1998). Les polyamines promeuvent les boucles ADN en neutralisant les charges négatives du phosphate, réduisant l’énergie requise pour former les boucles et ainsi facilitant l'augmentation des interactions protéines-ADN. Le bouclage ADN lui-même est une voie majeure de régulation transcriptionnelle de l’expression génique (Kerppola 1998, Coulombe 1999).

Plusieurs protéines de liaison exercent leur action via leur capacité à boucler l’ADN, et dans les organismes supérieurs, coopérent avec le bouclage produit par de multiples facteurs de transcription afin d'induire la réponse requise transcriptionnelle. Les PA effectuent la liaison de plusieurs facteurs de transcription sur l’ADN (Thomas et Thomas 1993, Panagiotidis et al 1995, Desiderio et al 1999). Dans le cas du récepteur estrogénique, les PA ont montré qu’elles pouvaient agir directement sur la conformation de l’élément de réponse dans l’ADN (Thomas et al 1997, Lewis et al 2000).

Les PA semblent aussi impliquées dans les voies de signalisation qui régulent la synthèse des facteurs de transcription ou modulent leur capacité de liaison via la phosphorylation (Wang et al 1993, Wang et al 1999, Pfeffer et al 2000, Wang et al 2001).

• Synthèse protéique

Lorsque les cellules sont carencées en PA, les premiers effets détectables sont observés sur la synthèse de l’ADN et des protéines. La réplication de l’ADN peut être altérée dès le premier cycle cellulaire :

• après ensemencement en présence d’inhibiteurs de synthèse des PA (Fredlund et Oredsson 1996)

• ou chez les cellules en culture déficientes en synthèse de PA sans apport exogène de PA (Laitinen et al 1998).

Les noyaux isolés de cellules carencées en PA synthétisent 70-80% moins

d’ADN que les cellules témoins (Koza et Herbst 1992). Ces cellules peuvent accumuler de petits fragments d’ADN correspondant en taille aux fragments Okazaki (Pohjanpelto et Hölttä 1996). La chromatine des cellules carencées de manière prolongée en PA sont plus sensibles à la digestion par les nucléases (Synder 1989, Basu et al 1992, Laitinen et al 1998).

Les cellules carencées en polyamines montrent une anomalie de la formation des polysomes (Hölttä et Hovi 1985), qui pourrait résulter d’un défaut d’initiation

et/ou d’élongation protéique (Takemoto et al 1983). Ces effets peuvent être expliqués par la capacité des polyamines à se lier et à influencer la structure secondaire des mARN, tARN et rARN (Kusama-Eguchi et al 1991, Yoshida et al 1999, Igarashi et Kashiwagi 2000).

• Croissance cellulaire

La déplétion en polyamines altère l’expression de nombreux gènes de croissance. Cependant, les mécanismes moléculaires par lesquels l’expression génétique est régulée sont inconnus et les voies de régulation impliquées sont à peine découvertes. L’arrêt du cycle cellulaire après déplétion en PA est médié par l’induction d’inhibiteurs de cycline dépendante kinase p21WAF1/CIP1 et p27KIP1 via des mécanismes p53 dépendants (Kramer et al 1999, Ray et al 1999, Ray et al 2001), alors qu’une voie indépendante p53 peut exister (Nemoto et al 2001, Ray et al 2001).

La carence en PA stabilise la protéine p53 ainsi que son mARN (Li et al 2001). Dans les cellules transformées par l’hyperexpression d’enzymes de synthèse de PA, l’expression de p27KIP1 est fortement diminuée, confirmant ainsi le rôle de p27KIP1 dans le contrôle du cycle cellulaire par les polyamines (Ravanko et al 2000). En plus de p21WAF1/CIP1, p27KIP1 et p53, la carence en polyamines affecte l’expression de cyclines variées.

Des modifications d’expression de la cycline A, B1 et D1 ont été observées (Thomas et Thomas 1994, Thomas et al 1997, Marty et al 2000); la variation de D1 est la plus importante. Les altérations de l’expression génétique peuvent être médiées par le NF-kb qui est rapidement activé dans les cellules privées de polyamines (Pfeffer et al 2001).

• Apoptose

La mort cellulaire programmée et la croissance cellulaire sont les deux côtés d’une même pièce. Leurs voies de régulation se recouvrent partiellement et un signal induisant une prolifération dans un certain type cellulaire ou état physiologique, peut dans d’autres types cellulaires ou circonstances conduire à l’apoptose. Ainsi, il n’est pas surprenant que les polyamines soient impliquées dans la régulation de l’apoptose.

Paradoxalement, il apparaît qu’elles peuvent agir en tant que promoteurs, modulateurs et protecteurs de l’apoptose (Schipper et al 2000). On sait depuis plusieurs années que sous certaines conditions les PA ont des effets toxiques sur les cellules (Allen et al 1979, Gahl et Pitot 1979). De fortes concentrations anormales en polyamines sont délétères sur la croissance cellulaire et peuvent conduire à la mort de la cellule (He et al 1993, Poulin et al 1993) qui souvent est de nature apoptotique (Tome et al 1994, Tobias et Kahana 1995, Poulin et al 1995, Xie et al 1997).

L’oxydation de la spermidine et de la spermine par l’amine oxydase sérique ou par la PAO intracellulaire produit du H2O2—peroxyde d’hydrogène radicalaire— et des aminoaldéhydes qui sont de puissants inducteurs de l’apoptose (Parchment et Pierce 1989, Ha et al 1997). Cependant les PA sont capables d’induire une apoptose sans oxydation (Brunton et al 1991, Mitchell et al 1992, Alhonen et al 2000); ainsi il n’est pas simple de savoir quel mécanisme joue un rôle majeur dans la cellule.

Diverses études utilisant des types cellulaires variés ont montré que l’activité ODC est rapidement et remarquablement accrue après induction de l’apoptose (Donato et al 1991, Grasilli et al 1991, Manchester et al 1993, Desiderio et al 1995,

Penning et al 1998, Lindsay et Wallace 1999). Ceci conduit dans quelques cas, comme on pouvait s’y attendre, à accroître le taux de PA intracellulaires, mais également aussi souvent les concentrations en PA sont diminuées. Le DFMO inhibe l’apoptose dans presque tous les systèmes cellulaires où il a été testé (Piacentini et al 1991, Manchester et al 1993, Monti et al 1998, Penning et al 1998, Ray et al 2000). Cependant le traitement au DFMO uprégule la SAMDC -l’autre enzyme clé de la biosynthèse de polyamines - et alors que les taux de putrescine et spermidine sont diminués par le DFMO, les niveaux de spermine sont souvent accrus.

Curieusement, les inhibiteurs de la SAMDC (Kaneko et al 1998, Pening et al 1998, Satoh et al 1999, Ray 2000) et les analogues de la spermidine et de la spermine (McCloskey et al 1996, Kramer et al 1997, Shah et al 2001) induisent généralement ou accentuent l’apoptose. L’activité ODC agit le plus sur les taux de putrescine tandis que la SAMDC fournit de la S-adénosyl méthionine pour la synthèse de spermine et de spermidine, suggérant que la putrescine et les polyamines « les plus hautes » pourraient avoir des rôles différents dans l’apoptose.

L’ODC, dans certains cas, peut avoir une rôle très actif dans la régulation de l’apoptose. On l'a suspecté d’être un médiateur direct de l’apoptose induite par l’hyperexpression du proto-oncogène c-myc (Packham et Cleveland 1994). Cette suggestion est basée sur le fait que l’expression forcée de l’ODC, comme celle de c-myc, est suffisante pour induire l’accélération de la mort cellulaire après avoir retiré l'IL3 de cellules myéloïdes murines. Dans ce contexte, l’ODC est un médiateur de l’apoptose induite par c-myc puisque c-myc régule l’expression de l’ODC au niveau de la transcription (Bello-Fernandez et al 1993).

Alors que l’accumulation de polyamines apparaît capable de déclencher l’apoptose, la diminution des taux de PA, spécialement spermidine et spermine, semble être l’occurrence la plus répandue dans l’apoptose (Manchester et al 1993, Tome et al 1997, Penning et al 1998, Moffatt et al 2000, Nitta et al 2001). Il est hautement concevable que des taux très faibles de PA peuvent promouvoir réellement l’apoptose.

Premièrement, la déplétion en PA peut conduire à l’arrêt du cycle cellulaire ou à l’apoptose en affectant la voie de régulation du cycle cellulaire p53/p21/p27 (Kramer et al 1999, Ray et al 1999, Li et al 1999).

Deuxièmement, les PA sont importantes dans la régulation des transports d’ions et dans la stabilisation d’importants composants cellulaires comme la structure membranaire et celle de la chromatine. Par conséquent la déplétion en PA pourrait induire la déstabilisation d’importantes structures cellulaires, conduisant à la perte de l’intégrité cellulaire et finalement induisant l’apoptose (Schipper et al 2000).

D’un autre côté, la déplétion en PA même après l’arrêt du cycle cellulaire peut ne pas être suffisante seule pour induire l’apoptose (Li et al 1999, Li et al 2001), mais peut sensibiliser la cellule à d’autres facteurs induisant l’apoptose. La déplétion en PA semble être un inducteur spécifique impliquant que les polyamines sont impliquées dans la régulation de quelques voies apoptotiques, mais pas toutes (Stefanelli et al 2001, Li et al 2001). Sans surprise, la spermine et/ou la spermidine ont des effets protecteurs contre l’apoptose dans plusieurs types de cellules neuronales (Harada et Sugimoto 1997), de l’ascite tumorale de Ehrlich (Moffatt et al 2000), de cellules de lymphomes B (Nitta et al 2001), de cellules de parasite Trypanosoma cruzi (Piacenza et al 2001). À nouveau l’effet protecteur peut être spécifique de la voie induisant l’apoptose (Hegardt et al 2000) et peut être médié par l’activation de la transcription des gènes requis pour la prolifération et la survie

cellulaires (Shah et al 2001).

Bien que les mécanismes mis en œuvre par les PA dans l’apoptose ne permettent pas de conclure, il est clair que des niveaux excessifs, tout comme des taux très bas de PA, interfèrent sur leurs interactions spécifiques et agissent sur leurs activités.

On a pu suggérer que la signification physiologique réelle de la synthèse des PA réside dans le contrôle du cycle et de la survie cellulaires (Schipper et al 2000). De ce fait, l’induction précoce de l’ODC souvent observée au cours de l’apoptose peut être reliée à la progression de la cellule dans une phase du cycle jusqu’à ce qu’un point de non retour soit atteint, à partir duquel l’apoptose est déclenchée comme résultante de signaux induisant l’apoptose. Mais dans des conditions où l’apoptose est inhibée et/ou les cellules ont des lésions génétiques, l'expression constitutive de l'ODC peut conduire à la transformation cellulaire et des cellules à croissance déréglée peuvent être observées (Auvinen et al, 1992, Moshier et al 1993, Auvinen et al 1997). Après le point de non retour du cycle cellulaire (le taux de polyamines), le taux de celles-ci décroît pendant le processus apoptotique.

• Synthèse d’hypusine

Pendant longtemps la seule fonction hautement spécifique et sans équivoque des polyamines était de fournir un acide aminé inhabituel, l'hypusine (Park et al 1981, Park et al 1982). Le groupe aminobutyl est transféré de la spermidine sur une lysine hautement conservée du facteur d'initiation de transcription eucaryote elf-5A, qui est avec le variant elf-5A2 la seule protéine connue contenant de l'hypusine (Park et al 1993, Jenkins et al 2001).

L'hypusine est formée en deux temps; d'abord la déoxyhypusine synthase catalyse le transfert d'un aminobutyl sur une lysine pour former la déoxyhypusine, qui est ensuite convertie en hypusine au cours d'une réaction catalysée par la déoxyhypusine hydroxylase. L'hypusination est nécessaire pour l'activité biologique de elf-5A (Park 1989, Smith-Mc Bride et al 1989).

La formation d'hypusine est étroitement couplée à la prolifération cellulaire, sa formation s'accroît 30 fois après un stimulus de croissance, et est essentielle à la survie cellulaire (Chen et Chen 1997, Park et al 1997). L'interruption du gène de la déoxyhypusine synthase comme celui de elf-5A chez la levure conduit à un phénotype léthal (Schnier et al 1991, Sasaki et al 1996, Park et al 1998). L'inhibition de la déoxyhypusine synthase chez les mammifères entraîne l'arrêt de croissance cellulaire (Park et al 1994, Chen et al 1996, Shi et al 1996), la mort cellulaire (Tome et Gerner 1997) ou encore une différenciation tumorale (Chen et al 1996).

Cependant, elf-5A contenant de l'hypusine n'est pas nécessaire pour la synthèse globale de protéines. Chez des levures conditionnellement déficientes en elf-5A, la synthèse de protéines est inhibée seulement de 30 % en condition non permissive, et ceci est accompagné d'une légère modification dans le profil du polysome (Kang et Hershey 1994). Plus précisément, l'activation de elf-5A apparaît faciliter la transcription de sous séquences spécifiques d'ARNm; peut être ces sous séquences sont requises pour la division cellulaire, et ainsi la nécessité de elf-5A pour la division pourrait être expliquée (Park et al 1997).

La signification de elf-5A dans la prolifération cellulaire est mieux mise en lumière par le fait que le variant récemment trouvé elf-5A2 tissu-spécifique est fortement exprimé dans les lignées cellulaires d'adénocarcinomes colorectaux, en plus des testicules et du cerveau (Jenkins et al 2001), et par le fait qu'il a été isolé

comme oncogène candidat dans le développement de cancers ovariens et dans d'autres tumeurs solides (Guan et al 2001). L'accumulation de putrescine dans les lignées de cellules résistantes au DFMO après retrait de celui-ci des cultures, induit l'apoptose (Tome et al 1997). Ce fait a été imputé à l'inhibition de la formation de l'hypusine. La généralisation de ce phénomène à d'autres types cellulaires reste à démontrer. Fait intéressant, dans la tomate, elf-5A peut faciliter la transcription d'ARNm requis pour l'apoptose (Wang et al 2001).

Tandis qu'il paraît clair qu'elf-5A contenant l'hypusine est nécessaire à la synthèse protéique, on ne sait pas complètement par quelle voie cela s'effectue. La protéine a été initialement identifiée comme un facteur d'initiation de transcription putatif, fondé sur sa capacité à stimuler la synthèse de méthionyl puromycine in vitro (Kemper et al 1976).

Des faits plus récents suggèrent que elf-5A facilite la synthèse protéique en promouvant le transport nucléaire spécifique d'ARNm (Rhul et al 1993, Katahira et al 1994). On a proposé aussi que elf-5A pourrait être impliqué dans le turn over des ARNm, agissant en diminuant le décapping (Zuk et Jacobson 1998). Une séquence ARNm consensus liant elf-5A a été identifiée (Xu et Chen 2001). Le consensus est présent chez plus de 400 "EST" humains, mais on ne sait pas s'ils représentent les substrats physiologiques de elf-5A.

• Autres rôles

Durant les 10 dernières années, les PA ont montré leur fonction d’activateurs endogènes et/ou de bloqueurs de plusieurs classes de canaux cationiques. Elles sont capables d’activer, d’inhiber ou de bloquer les récepteurs NMDA (Ransom et Stec 1988, Williams et al 1989, Williams 1997) et de bloquer les récepteurs AMPA et kainate (Donevan et Rogawski 1995, Kamboj et al 1995). Ces 3 groupes de récepteurs appartiennent à la classe des récepteurs canaux activés par le glutamate.

D’autres canaux cationiques sont bloqués par les PA :

• les canaux potassiques Kir « inwardly rectifying » (Fakler et al 1994, Ficker et al 1994, Lopatin et al 1994),

• les récepteurs canaux nicotiniques à l’acétylcholine (Haghighi et Cooper 1998, Haghighi et Cooper 2000),

• les canaux « gated » à nucléotides cycliques (Luet Ding 1999), • les canaux voltage « gated » calciques (Scott et al 1993) et sodiques (Huang

et Moczydlowski 2001).

Les récepteurs NMDA contiennent au moins 2 sites de liaison spécifiques aux PA.

De nouvelles fonctions des PA sont régulièrement. Une des plus étranges suggère que les polyamines pourraient moduler la synthèse de NO (Southan et al 1994, Szabo et al 1994, Baydoun et Morgan 1998). Cette modulation pourrait être médiée en partie par la down-régulation du transport de la L-arginine (Mössner et al 2000). À l’inverse, le NO s’est montré capable d’agir sur la synthèse des PA en inhibant l’ODC (Bauer et al 2001, Ignarro et al 2001). Ainsi, la régulation de ces petites molécules « versatile » modulatrices de fonctions cellulaires peut être partiellement interconnectée.

Les PA sont aussi impliquées dans la thermorégulation...

10) Polyamines et système nerveux central

Le rôle essentiel des polyamines dans le développement et la différentiation du système nerveux central (SNC) est bien documenté malgré que leur rôle exact dans la neurogénèse soit mal connu. Elles joueraient un rôle dans la division neuronale et leur différenciation, l’axonogenèse, la synaptogenèse et la plasticité neuronale. Ainsi, de nombreux efforts de recherche se sont tournés vers l’implication des PA dans les maladies du SNC.

Les stress chimiques, thermiques, physiques ou métaboliques dans le cerveau provoquent une réponse commune d’induction d’activité de l’ODC (Kauppinen et Alhonen 1995, Johnson 1998, Bernstein et Müller 1999, Seiler 2000).

L’ODC et la SAMDC sont régulées de manière caractéristique dans le cerveau durant le développement. Chez les mammifères l’activité ODC est maximale aux alentours du jour de naissance (Anderson et Schanberg 1972, Laitinen et al 1982, Onoue et al 1988, Morrison et al 1998). Pendant les premières semaines ou mois l’activité cérébrale de l’ODC diminue pour atteindre un niveau bas à l’âge adulte. L’activité ODC dans le cerveau adulte de souris est environ 70 fois plus faible qu’au moment de la naissance (Suorsa et al 1992). L’activité SAMDC est très faible à la naissance et s’accroît au fur et à mesure de la maturation du cerveau (Suorsa et al 1992, Morrison et al 1993), 6 fois chez les humains et 8 fois chez la souris.

Les PA extracellulaires sont connues pour réguler les récepteurs canaux NMDA au glutamate dans le SNC (Ransom et Stec 1988, Williams et al 1989), récepteurs ayant des rôles majeurs dans l’induction de la LTP—long term potentiation—et dans la régulation du développement neuronal embryonnaire (Bliss et Collingridge 1993, Schlaggar et al 1993). La LTP sous tend certains types de mémoire et d’apprentissage. Les souris transgéniques surexprimant l’ODC montrent une élévation significative « seizure treshold » aux stimuli chimiques et électriques, et « impaired » les performances dans l’apprentissage spatial et les tests de mémoire (Alhonen et al 1993). D’autres analyses in vitro utilisant des « slice » hippocampiques révèlent que l’excitation de la transmission synaptique est altérée, mais sans altérations sur la LTP, « although » il est possible que les taux extracellulaires de putrescine dans les « slice » ne soient pas comparables à ceux existants in vivo (Pussinen et al 1998).

Les PA intracellulaires du SNC sont responsables pour la rectification et le « gating » de forts canaux « inward rectifier » au potassium (Kir canaux) (Fakler et al 1994, Ficker et al 1984, Lopatin et al 1994) et les récepteurs ioniques nicotiniques à l’acétylcholine (Haghighi et Cooper 1998, Haghighi et Cooper 2000, Bixel et al 2001). Les canaux KIR stabilisent le potentiel membranaire de repos dans les cellules excitables et non excitables et contrôlent l’excitabilité « treshold » neuronale et des cellules musculaires (Reimann et Ashcroft 1999, Oliver et al 2000). Les récepteurs canaux ioniques nicotiniques sont « widespread » dans le SNC où ils fonctionnent comme récepteurs post-synaptiques ecxitateurs ou comme récepteurs pré-synaptiques modulant le relargage de neurotransmetteurs (Sargent 1993, Role et Berg 1996). Ils ont été impliqués dans un large éventail de fonctions cognitives, dont les processus visuels et auditifs, la nociception, la mémoire et l’attention (Picciotto et al 1995, Bannon et al 1998, Xiang et al 1998, Marubio el al 1999, Vetter et al 1999). Les lieux des sites de liaison aux PA sur le récepteur ont été cartographiés (« mappés » (Bixel et al 2001), mais on en connaît peu sur les mécanismes et la signification physiologique exercée par les polyamines.

Ainsi l’accroissement de l’activité ODC est la réponse commune à différents stimuli pathologiques dans le cerveau. L’activité de la SAMDC diminue après traumatisme (Henley et al 1997), ischémie cérébrale (Rohn et al 1992), s’élève

dans l’épilepsie (Rohn et al 1992, Morrison et al 1994), dans la maladie d’Alzheimer (Morrison et al 1993), mais demeure inchangée après « restrained » stress (Gilad et Gilad 1996). L’induction de l’activité ODC est plus forte dans les stress métaboliques sévères comme ceux de l’ischémie cérébrale (Paschen et al 1993). L’élévation de l’activité ODC concomitante de la diminution de l’activité SAMDC aboutit à une élévation forte des taux de putrescine. Il existe un « single » cas rapporté d’élévation des taux de N1-acétylspermidine chez la gerbille et le rat après « injury » du SNC (Rao et al 2000), ce qui suggère que l’activité SSAT s’accroît aussi et qu’elle peut contribuer aux taux de putrescine.

Les taux de spermidine et de spermine ne se modifient pas significativement ou diminuent temporairement (Paschen et al 1993). Le rôle de l’accroissement du taux de putrescine n’est pas clair. Dans quelques études, les taux excessifs de polyamines ont été impliqués dans la dégénérescence neuronale après « injury » cérébrale (Paschen et al 1993, Schmitz et al 1993, Kindy et al 1994, Baskaya et al 1997, Dogan et al 1999). D’un autre côté, on a suggéré que l’activation du métabolisme des PA post-ischémique est nécessaire à la régénération des neurones stressés, car le prétraitement aux polyamines réduit la nécrose neuronale post ischémique (Gilad et Gilad 1991). Ceci est conforté par l’observation qu’après ischémie cérébrale l’ODC est up-régulée également dans des régions où les dégâts cellulaires n’apparaissent pas habituellement (Keinänen et al 1997) et des études sur rats transgéniques hyper-exprimant l’ODC démontrent que l’induction de l’ODC a un rôle neuroprotecteur dans ce modèle d’ischémie focale cérébrale (Lukkarinen et al 1997, 1998).

Quelques études histochimiques sur le pattern d’expression de l’ODC et de

l’antizyme dans le SNC ont été publiées. Les études sur l’ODC se sont focalisées principalement sur le développement du pattern d’expression ou sur l’effet des stimuli pathologiques sur l’expression. Les polyamines elles-mêmes ont aussi été localisées en employant des méthodes immuno-cyto-chimiques. Une expression décelable de l’ODC apparaît restreinte aux neurones (Müller al 1991, 1993, Bernstein et Müller 1995, Ichikawa et al 1997, 1998, Gritli-Linde et al 2001), l’expression gliale de l’ODC étant rapportée dans quelques cas seulement (Bernstein et Müller 1999). Ces études ont clairement montré que l’ODC est une protéine cytoplasmique.

L’expression de l’antizyme est également confinée aux neurones comme démontré par immunocytochimie et hybridation in situ (Juntilla et al 1995, Gritli-Linde et al 2001). L’antizyme est principalement localisé dans le cytoplasme. Alors que les cellules gliales ne contiennent pas de quantité détectable d’ODC, les études immunocytochimiques utilisant des anticorps antispermidine et antispermine ont montré que dans ces cellules les taux de polyamines sont comparables à ceux des neurones, parfois même supérieurs (Laube et Veh 1997, Biedermann et al 1998, Skatchkov et al 2000). On a suggéré que les celulles gliales servaient de lieu de stockage des PA (Laube et Veh 1997) mais on ne sait pas comment est formée et maintenue leur haute teneur en polyamines.

• Polyamines et régulation des canaux Kir

Les canaux Kir ont 2 rôles physiologiques principaux :

• Stabilisation du potentiel de repos aux alentours du potentiel d’équilibre du K+,

• Médiation du transport du K+ à travers les membranes

(Williams 1997, Reimann et Aschroft 1999, Oliver et al 2000).

Les canaux Kir conduisent mieux « more current » quand la membrane est hyperpolarisée que quand celle-ci est dépolarisée. Les Kir favorisent le flux entrant de K+. Cette propriété aboutit principalement à un bloc voltage-dépendant de courants de sortie du Mg++ cytoplasmique et de polyamines qui entrent dans le pore sous influence d’un champ voltage membranaire et « impede » l’efflux du K+.

Il y a 7 sous classes de canaux Kir parmi lesquels les canaux Kir 2 –Kir2.1-Kir2.4— représentent typiquement de forts rectifieurs. Le terme fort se réfère à la rectification dépendante d’un fort voltage. Les polyamines, principalement la spermine, sont responsables du « gating » et de la rectification intrinsèque des Kir2 (Fakler et al 1994, Ficker et al 1994, Lopatin et al 1994, Fakler et al 1995) et des Kir3 (Yamada et Kurachi 1995). Ce dernier appartient à une sous famille de rectifieurs intermédiaires activés par les protéines G. Les polyamines rectifient aussi le canal Kir4 qui est ATP dépendant (Fakler et al 1994, 1996) et les faibles rectifieurs Kir6.2 en pH alcalin (Baukrowitz et al 1999). Les faibles canaux rectifieurs de la sous famille Kir1 sont relativement insensibles aux polyamines (Fakler et al 1994, Yamada et Kurachi 1995, Riochet et al 2001).

Les membres de la sous famille Kir2 sont typiquement exprimés dans le cœur, les muscles squelettiques et le SNC. La sous famille Kir3 est aussi exprimée dans le SNC, en plus des neurones centraux on la retrouve dans une variété de types cellulaires et de tissus, parmi lesquels les cardiomyocytes (Oliver et al 2000). Kir4.1 est exprimé dans les cellules gliales et peut être leur canal Kir prédominant (Takumi et al 1995, Hibino et al 1999, Kofuji et al 2000).

Rather les canaux ubiquitaires Kir6 sont exprimés aussi dans les neurones centraux (Liss et Roeper 2001). La pertinence des canaux Kir dans le fonctionnement cellulaire normal est confirmée par les observations que leurs gènes sont mutés dans 3 maladies humaines héréditaires et une maladie murine. La mutation de Kir.1 donne le syndrome de Bartter type III (Simon et al 1996). La mutation de Kir.2 est retrouvée dans le syndrome d’Andersen (Plaster et al 2001) et la mutation de Kir.6 se voit dans l’hypoglycémie hyperinsulinique persistante familiale de l’enfance (Thomas et al 1996). Tandis que les souris knock out pour Kir6.2 sont sujettes de « seizures » généralisées après une brève hypoxie (Yamada et al 2001). Des mutations dans la région du pore de Kir3.2 donne un phénotype murin « weaver » (Pattil et al 1995). Le syndrome de Bartter est une affection tubulaire rénale caractérisée par « salt wasting », hypokaliémie et acidose métabolique. Le rare syndrome d’Andersen est caractérisé par des paralysies périodiques, des arythmies cardiaques et des dysmorphies relativement sévères. Les souris « weaver » ont une perte sélective de neurones cérébraux et souffrent d’ataxie « gait ».

Les comparaisons de séquence entre les 2 chefs de file forts rectifieurs et faibles rectifieurs Kir2.1 et Kir1.1 ont identifié 3 résidus définissant le bloc voltage dépendant des polyamines : des résidus glutamate ou aspartate négativement chargés dans le second segment transmembranaire TM2 (Fakler et al 1994, Lu et MacKinnon 1994, Stanfield et al 1994, Wible et al 1994) et dans 2 sites de la partie C terminale cytoplasmique (Taglialatela et al 1995, Yang et al 1995, Kubo et Murata 2001). L’échange du site neutre TM2 dans le « weakly » Kir1.1 par un résidu négativement chargé transforme ce canal en fort canal « inward rectifier » (Wible et al 1994) tandis que la neutralisation du site TM2 et « any » site C-terminal de KIR2.1 réduit fortement la rectification médiée par la spermine (Tagliatela et al 1995, Kubo et Murata 2001). La nécessité d’acides aminés négativement chargés aux sites TM2 et C-terminaux pour une « forte » rectification suggère des interactions électrostatiques entre ces sites et les molécules bloqueuses positivement chargées (Oliver et al 2000). Ce fait est renforcé par la trouvaille que une cystéine « reporter » au site TM2 du segment transmembranaire peut être

« readily » modifiée avec des « reagent » cystéine réactifs indiquant l’exposition du site TM2 dans la lumière du pore (Lu et al 1999). Kir 6.2 montre une rectification polyamine responsive uniquement en pH alcalin. Cette dépendance au pH a été montrée être conférée par une histidine C-terminale. Aux environs de pH neutre, l’histidine est protonée et Kir 6.2 présente une rectification « weak » alors que l’alcalinisation déprotonne l’histidine donne une forte rectification (Baukrowitz et al 199). Cette rectification pH dépendante peut en cas de stress métabolique inhiber l’activité électrique et aider à protéger la cellule d’une déplétion énergétique.

On a montré en utilisant des inhibiteurs de synthèse des PA et des lignées de cellules CHO ODC-déficientes que des changements dans les taux cellulaires de PA pouvaient réellement altérer la rectification des canaux Kir et l’excitabilité des cellules (Bianchi et al 1996, Shing et al 1996). L’effet de taux élevés de PA sur les canaux Kir a été étudié sur des souris transgéniques hyperexprimant l’ODC dans le cœur sous contrôle du promoteur de la chaîne lourde de l’α-myosine (Lopatin 2000). Dans les coeurs transgéniques les taux de putrescine étaient multipiés par 35, la spermidine de 3 à 6 fois, mais la spermine était quasiment inchangée. En dépit de ces changements, les altérations des canaux Kir transgéniques étaient relativement faibles. L’ »inward rectification » ainsi que la voltage dépendance de la rectification étaient essentiellement inchangées « although » la densité du courant était réduite. Dans les cardiomyocytes isolés de souris Gyro, qui sont déficientes en spermine synthase et totalement dépourvues de spermine mais possédant des taux de spermidine accrus 4 à 5 fois dans le coeur,la rectification « inward » était « slightly » réduite (Lopatin 2000) mais la densité des « currents » Kir était inchangée. La manipulation directe des taux polyamines à la pipette dialyse dans les myocytes indiquent que spermidine et spécialement spermine sont des régulateurs majeurs de la rectification dans les cellules intactes. La putrescine joue relativement un rôle assez mineur de contrôle, mais peut causer un bloc voltage dépendant « weakly » significatif. Les souris transgéniques ODC et Gyro sont apparemment normales, et seulement des effets relativement mineurs sur les caractéristiques des potentiels d’action et « rates » du cœur peuvent être attendus. L’hypertrophie cardiaque et l’épilepsie sont chacune associée à des taux accrus de polyamines et à une hyperexcitabilité, mais on ne sait pas si ces 2 faits sont reliés entre eux.

11) Effet antalgique

Les expériences montrent que la carence en PA élève de 65% le seuil douloureux chez les animaux. Les récepteurs NMDA sont impliqués dans la perception douloureuse et dans les phénomènes de sensibilisation à la douleur responsables d’hyperalgie au long cours. Ces récepteurs sont synaptiques et leur stimulation peut conduire à la mort neuronale.

La carence en PA empêche la phosphorylation de la tyrosine de la sous unité NR2B des récepteurs NMDA, et altère le processus de LTP (long term potentiation) Dans tous les modèles animaux testés, l’alimentation carencée en PA démontre son effet antalgique, tant préventif que curatif, alors que ce type d’alimentation n’a pas du tout d’action anti-inflammatoire. En essai clinique humain, cet effet antalgique n’est pas modifié quelle que soit la thérapeutique utilisée. Une alimentation pauvre en polyamines inhibe la mise en mémoire de la douleur et restaure la sensibilité aux opioïdes. La carence en PA alimentaires constitue le paramètre déterminant pour obtenir cet effet car l’utilisation du DFMO ne modifie pas l’effet obtenu.

Il est important de différencier la douleur et la mémorisation de celle-ci, qui accentue la sensibilité à une douleur ultérieure (l'hypersensibilité à la douleur).

L'alimentation carencée en PA donne les effets suivants :

• empêche une douleur aigüe de passer à la chronicité, • empêche l'hypersensibilité à la douleur à long terme malgré une

expérience douloureuse antérieure, • restaure l'efficacité antalgique des opioïdes, • diminue fortement l'hypersensibilité douloureuse induite avec le temps

par les morphiniques, • réduit la douleur neurologique et inflammatoire.

Intensité du stimulus

Sensation douloureuse

Allodynie

Sensibilisation à la douleur

Hyperalgie

Analgésie

Stimulus non nociceptif

Stimulus nociceptif

Sensibilité normale

à la douleur

Anti hyperalgie

C’est en cancérologie que l’effet antalgique est démontré. Des études sur d’autres types de douleurs sont en cours.

12) Position du problème en cancérologie

Les polyamines (PA) à la fois produites par les cellules cancéreuses et apportées par l’alimentation sont des facteurs de croissance cellulaire entretenant des relations métaboliques réciproques et complexes avec certains de leurs compartiments extracellulaires (sanguins particulièrement) de même qu’avec différents systèmes (digestif, immunitaire, nerveux). Tout signal mitogène induit une synthèse de PA et toute synthèse de PA s'accompagne d'un effet mitogène.

La croissance tumorale ayant besoin d’apport de polyamines exogènes (alimentation et flore intestinale), l’idée de priver l’organisme de PA a donc germé et les chercheurs ont entrepris d’observer in vivo les conséquences d’une telle approche volontiers holistique.

In vivo, l’inhibition significative de la croissance tumorale est obtenue par l’inhibition de la synthèse intracellulaire de PA associée à la réduction de l’absorption intestinale des PA car les cellules cancéreuses reconstituent alors leur pool de facteurs de croissance en puisant dans leur environnement immédiat les PA nécessaires à leur multiplication. L’effet antiprolifératif d’une privation en PA endogène n’est significatif qu’à ce prix. L’effet est évidemment renforcé par une antibiothérapie (néomycine).

La carence seule en PA exogènes, obtenue par une alimentation appauvrie et un traitement antibiotique, permet néanmoins d’obtenir in vivo une inhibition de croissance tumorale de l’ordre de 50% ainsi qu’une augmentation de survie des animaux traités de 20%. Contrairement à ce qui est observé en cas d’inhibition du métabolisme intracellulaire des PA, la carence en PA exogènes n’affecte pas le taux de polyamines dans la tumeur.

Par ailleurs, on observe :

• que la présence d’une tumeur dans l’organisme accroît l’absorption intestinale de polyamines,

• le fait de carencer en PA un organisme cancéreux normalise la sécrétion endogène d’IL-2 et son activité NK cytotoxique,

• que la carence en PA double en 4 jours les taux de lymphocytes circulants toutes populations confondues,

• que la carence en PA induit chez le patient cancéreux un effet antalgique certain

Polyamines

+ DFMO.+ Polyamines

+ DFMO

Nombre de cellules

+ DFMO

(traitées)

0 1 2 3 4

Nombre de jours de culture

La prolifération des cellules cancéreuses est «dépendante» des polyamines.

Témoins

DFMO Inhibition de la synthèse des polyamines

13) Carence en polyamines et croissance tumorale

L'idée thérapeutique originale a toujours brûlé ses défendeurs. Pourtant, à la lecture de ce qui précède, comment ne pas voir à travers cet univers passionnant de polyamines un horizon nouveau, holistique, porteur d'espoir car relié à l'organisme tout entier.

Il faut donc au nom de la vérité scientifique considérer la maladie cancéreuse comme globale, affectant tous les compartiments de l'individu, y compris dans sa sphère psychique. Les chercheurs ne s'y sont pas trompés et ont entrepris d'évaluer l'efficacité d'une carence en polyamine sur une tumeur maligne.

Plusieurs approches ont été considérées, de même que la carence alimentaire en polyamines. Ce qui est aussi sans doute l'approche la plus simple. En effet, puisque la tumeur reconstitue son pool vital de PA en puisant dans l'extérieur via l'intestin, quoi de plus logique de l'affamer sur ce point.

Mais si l'on combine les différentes stratégies entre elles chez un même patient cancéreux, l'effet sera synergique, notamment la toxicité médicamenteuse (soit en termes de chimiothérapie, ou d'inhibiteur de l'ODC- DFMO) sera moindre.

Pour résumer, la thérapeutique contiendrait au mieux :

• Un inhibiteur enzymatique de l'ODC et/ou de la SAMDC • Un inhibiteur enzymatique de la PAO • Un régime alimentaire très carencé en polyamines • Une antibiothérapie à visée intestinale (néomycine®) • Une chimiothérapie (cyclophosphamide)

L'antibiotique retenu est la néomycine® (à défaut le flagyl®). De plus il a été

démontré que la néomycine® était un inhibiteur de capture intestinal de PA. Les études expérimentales ont montré que l'aliment carencé 50 fois en PA potentialisait notablement l'effet du DFMO. Corrélativement à une réduction très importante des taux de putrescine et de spermidine dans les tissus des animaux traités, ce traitement permet une inhibition à 95 % de la progression tumorale dans plusieurs types de tumeurs greffées chez l'animal.

De plus, l'arrêt de l'inhibition de la croissance tumorale obtenue à l'arrêt du traitement conduit à y associer les produits habituels de chimiothérapie anticancéreuse.

Ainsi fait, on s'aperçoit que la carence alimentaire en polyamines

potentialise considérablement les effets de la chimiothérapie vis à vis de la croissance volumétrique tumorale et augmente la survie des animaux. Les études précliniques montrent le même type de résultats chez l'homme.

Mais si in vitro les cibles moléculaires sont bien connues, in vivo il n'en va pas de même. Il est donc tentant certes, mais prématuré, d'expliquer qu'un appauvrissement en PA dans l'organisme entraîne une inhibition de la progression tumorale par le simple fait "que les PA sont nécessaires à la progression tumorale".

En effet, une autre composante vient s'ajouter à ces connaissances, l'impact des PA sur le système immunitaire.

Inhibition du volume tumoral par un traitement de carence en polyamines associé à du cyclophosphamide (endoxan®) à faible dose. Rats greffés avec le carcinome prostatique Mat Lylu. La carence en polyamines est administrée 5 jours par semaine et

l'endoxan® est utilisé à la dose de 20 mg.kg-1.sem-1.

14) Carence en polyamines et immunité

L'immunité anti-tumorale est renforcée par une carence en polyamines.

On savait que la carence en polyamines rétablissait une NFS normale chez les animaux cancéreux, tout en potentialisant l'effet d'une chimiothérapie anticancéreuse sans en augmenter les effets toxiques.

On peut retenir des études animales que les organismes tumoraux présentent une splénomégalie et un effondrement progressif de l'activité NK. Un traitement par carence en PA inverse ces anomalies. De manière identique, le développement tumoral effondre les concentrations spléniques en IL-2 ainsi que les populations lymphocytaires CD8+ et CD4+.

Mais ce n'est pas tout: utilisée seule, la carence en PA stimule l'activité de

phagocytose des macrophages; en association avec l'endoxan®, il potentialise l'activité cytotoxique cellulaire en élevant la production macrophagique de NO et de TNF. Il s'ensuit évidemment une réduction considérable de la diffusion métastatique et un gain de survie chez les animaux ainsi traités.

L'effet observé anti tumoral est maximal lorsque l'on combine toutes les thérapies entre elles pour réduire le taux de PA, à savoir :

• DFMO • MDL 72527 • Alimentation carencée en PA • Néomycine® • Endoxan®

Paramètres mesurés dans la rate de souris porteuses de carcinomes de Lewis 3LL et traitées pendant 6 jours avec une

carence en PA.

Il ne faut cependant pas perdre de vue que le fait de carencer l'alimentation en PA (et agir sur la flore) entraîne à lui seul un effet anti tumoral significatif, et cela sans que le taux tumoral de PA soit affecté.

Avec une alimentation carencée de 500 fois en PA, la réduction volumétrique de la tumeur est de 70 %, l'activité NK remonte significativement, les taux d'IL-2 aussi,

tout ceci expliquant l'effet ANTITUMORAL.

Diverses études ont utilisé des chimiothérapies séquentielles :

Cyclophosphamide le premier jour, Méthotrexate le second jour, Vindésine le 3éme jour,

sur différents types de tumeurs avec des effets assez impressionnants, associés à de diverses combinaisons alimentaires, d’analogues de PA et d’inhibiteurs enzymatiques, d’antibiotiques.

15) Approche nutritionnelle

L'approche nutritionnelle centrée sur les polyamines représente donc un traitement majeur en cancérologie. L'idée est d'utiliser l'efficacité du DFMO (si peu toxique in vivo et administrable per os) couplée à une carence exogène en PA. Plusieurs possibilités ont été étudiées. La trithérapie, concept initial

Elle représente l'association de :

• Néomycine (ATB) • Aliment appauvri en PA (APP) • DFMO

La triple association néomycine (ATB) + DFMO + alimentation appauvrie en

polyamines (APP) réduit de manière très significative la croissance tumorale et la diffusion métastatique, avec effondrement des taux tumoraux de putrescine et de spermidine. Ceci objective un effet cytostatique.

Évolution du volume tumoral de souris BL6 porteuses de greffe de carcinome pulmonaire de Lewis (3LL) traité par trithérapie. As = aliment standard

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

(mm²)

jours après greffe tumorale

trithérapie carcinome de Lewis souris greffées

as + dfmo

app + dfmo

app + atb + dfmo

Début de traitement

Ces résultats précliniques sont vérifiés dans 2 espèces rat/souris ayant subi des greffes de lignées tumorales 3LL murines, adénocarcinome de prostate murin Mat Ly-Lu hormono-indépendant, carcinome mammaire humain et glioblastome humain.

L'APP est un aliment pour rongeurs appauvri 9000 fois en polyamines par rapport à l'aliment standard (AS). Les entérocytes ne sont pas affectés chez les animaux traités par trithérapie. La trithérapie n'agit pas sur une phase précise du cycle cellulaire tumoral et supprime totalement la splénomégalie: les macrophages seraient alors disponibles pour lutter contre la tumeur.

L'association de drogues cytotoxiques à une trithérapie était donc

logiquement l'étape suivante. Le cyclophosphamide a été utilisé avec succès dans le carcinome de Lewis et l'adénocarcinome prostatique hormono-indépendant Mat Ly-Lu.

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

jours après greffe tumorale

évolution comparée du volume tumoral

AS + Endoxan

trithérapie 5j/7

trithérapie 5j/7 + endoxan

Évolution du volume tumoral de rats Copenhague porteurs d'une greffe d'adénocarcinome de la prostate Dunning MAT-Ly-Lu, carencés en polyamines 5

jours sur 7, et traités par de l'endoxanT à dose inefficace vis à vis de la croissance tumorale lorsqu'administrée isolément.

Début de traitement

Le cyclophosphamide administré au 1/5ème de la dose efficace chez des animaux nourris en standard (AS) est sans effet sur la croissance tumorale, mais lorsque couplé à une carence en PA, la drogue est capable de:

• inhiber la croissance tumorale • inhiber la diffusion métastatique • doubler le temps de survie des animaux

La bithérapie

La réalité des faits d'expérience concernant la trithérapie se heurte chez les patients au fait que l'on ne peut envisager une carence prolongée en PA sans déclencher à terme des effets sérieux; on considère actuellement la trithérapie comme traitement d'attaque, puis le relai est pris par une bithérapie associant:

• APP • antibiothérapie intestinale (ATB)

Le seul fait d'administrer une APP avec de la néomycine déclenche une réduction de croissance tumorale de 40 % dans tous les modèles animaux testés. Monothérapie : aliment carencé à usage humain :

CASTASE

CASTASE est une spécialité alimentaire bien adaptée aux besoins nutritionnels de l'homme, composée de glucides, lipides, protéines, vitamines, électrolytes et minéraux, administrable par voie entérale ou par sonde gastrique. Elle est néanmoins très appauvrie en polyamines :

ü 60 fois moins de putrescine ü 200 fois moins de cadavérine ü 700 fois moins de spermidine et spermine

que l'alimentation naturelle la plus pauvre qui soit en teneur en PA. De 1993 à 1997, ce soluté a fait l'objet d'essais précliniques (carcinome pulmonaire de Lewis murin, adénocarcinome de prostate hormono-indépendant Dunning MAT-Ly-Lu du rat). Il fallait alors administrer aussi de la néomycine pour obtenir une réduction de 40 % de la croissance tumorale (bithérapie).

CASTASE a donc été optimisé de manière à supprimer l'antibiothérapie intestinale tout en lui conservant un effet anticancéreux comparable, sans DFMO ni néomycine.

Parallèlement l'approche nutritionnelle a conduit à analyser plus de 300 aliments de consommation courante, permettant ainsi de les classer selon leur teneur en polyamines. Ainsi, le traitement d'attaque par Castase peut être relayé par une alimentation spécifique chez les patients cancéreux.

IL EXISTE DONC DANS CE DOMAINE 2 CAS DE FIGURE TOTALEMENT

DIFFERENTS.

IL FAUT ABSOLUMENT INSISTER SUR LE FAIT

Ø QU'UNE ALIMENTATION OPTIMALE POUR UN SUJET INDEMNE DE MALADIE CANCEREUSE

Ø N'EST PAS VALABLE POUR UN SUJET CANCEREUX.

Protocole alimentaire (année 2000) Aliments permis Pain blanc, biscottes, pâtes, riz Champignons, radis, œufs, jambon blanc Steak (filet, haché), côte de bœuf, bœuf bourguignon Escalope de veau, dinde, poulet Colin frais Crêpes aux champignons, au jambon Gruyère, fromage blanc, fromage cernoix lait de chèvre, petit suisse, riz au lait Crème caramel, flan, crème au chocolat, Pommes (crues et cuites) poire, raisin, nectarine Gelée de groseilles galettes St Michel, boudoirs Biscuits alsacienne, crêpes dentelle, pâtes de fruits Aliments à consommer avec modération certains jours Pomme de terre épluchée (50 g) Confitures (30 g) Vin (100 ml) Lait de vache (100 ml) Ketchup, bombel, vache qui rit, yaourt Aliments interdits Jus de fruits (orange) Céréales Tomate, céleri, betterave, cornichon, concombre Frites, haricot vert, petit pois, épinard, carotte, artichaut Endive, salsifi, courgette, salade Raviolis, foie de veau, sauce tomate Camembert Pêche, prune, orange, pamplemousse, banane, melon

BIBLIOGRAPHIE

1 Biological signifiance of dietary polyamines. Larqué E., Sabatar-Molina N., Zamora S. Nutrition 2007 ; 23(1): 87-95. 2 Polyamines : metabolism and implication in human diseases. Moinard C., Cynober L., De Bandt J.P. Clin. Nut. 2005 ; 24(2) : 184-97. 3 Production, caractérisation et application d’anticorps antipolyamines. Bouille Nathalie, thèse de doctorat 1999 n° 99 REN10144, Rennes 1. 4 Effet anti tumoral d’une carence en polyamines sur le système de

défense de l’organisme cancéreux. Chamaillard Laura, Moulinoux J.P., thèse de doctorat, 1997 n° 97 REN1 0021 Rennes 1. 5 Polyamine metabolism and its importance in neoplasic growth and

as a target for chemotherapy. Pegg A.E. Cancer res 1988 ; 48 : 759-74. 6 Formation, catabolism and properties of the natural polyamines. Seiler N. In: Carter C., ed. the neuropharmacology of polyamines. London : Academic Press 1994 : 1-36. 7 Les polyamines : aspects chimiques, rôle biologique, applications

médica- les. Moulinoux J.P., Quemener V. Paris : Médecine-sciences Flammarion 1991 : 1-280. 8 Schreiner P. Liebigs Ann. Chem. 194 : 68, 1878. 9 Böttcher L. Arch. Path. Amat. 32 : 525, 1865. 10 Vauquelin L.N. Ann. Chem. 1791; 9 : 64-80. 11 Brieger L. August Hirschwald Berl. 1887. 12 Ladenberg A., Abel J. Ber. Dtsch. Chem. Ges. 21 : 758, 1888. 13 Van Leeuwenhoeck A. Phil Trans. Roy. Soc. Lond. 12 : 1042, 1678. 14 Rosenheim M.C., Rosenheim O., Dudley H.W. Biochem. J. 18 : 1263, 1924. 15 Rosenheim O., Dudley H.W. Biochem. J. 21 : 97, 1927. 16 Harrison G.A. Biochem. J. 25 : 1885, 1931. 17 Erythrocyte spermine levels: a prognostic parameter in childhood com mon acute lymphoblastic leukemia. Bergeron C., Bansard J.Y., Lemoine P. et al. Leukemia 1997 ; 11 : 31-6. 18 Polyamines as target fot therapeutic intervention.

Marton L.J., Pegg A.E. Annu. Res. Pharmacol. Toxicol. 1995 ; 35 : 55-91. 19 Alterations in intestinal uptake of putrescine and tissue polyamine concen tration in tumor-bearing rats. Brachet P., Quemener V., Havouis R., Tomé D., Moulinoux J.P. Biochim. Biophys. Acta 1994 ; 1227 : 161-70 20 Red blood cell polyamines, anemia and tumor growth in the rat.

Quemener V., Bansard J.Y., Delamaire M. et al. Eur. J. Cancer 1996 ; 32A : 316-21.

21 Intérêt diagnostique des polyamines érythrocytaires (PAS) dans l'adénocarci- nome prostatique (AP) : à propos de 100 patients. Cipolla B., Guillé F., Quemener V., Lévêque J.M., Moulinoux J.P., Lobel B. Prog Urol 1992 ; 2, 50 - 57. 22 Polyamines érythrocytaires et pronostic des cancers de prostate

stade D2. Cipolla B., Guillé F., Moulinoux J.P., Bansard J.Y., Roth S., Staerman F., Corbel L., Queme ner V., Lobel B. J Urol 1994 ; 151, 629. 23 Tumor growth inhibition by polyamine deprivation. Quemener V., Moulinoux J.P., Bergeron C. et al In : Dowling RH, Fölsch UR, Löser C, eds. Polyamines in the gastrointestinal tract. Lancaster UK : Kluwer Academic Press, 1992 : 375-85. 24 Neomycin inhibition of intestinal putrescine uptake. Hardy A., Quemener V. Anticancer Res. 1998 ; 18 : 4163-70 25 Polyamine deprivation enhances antitumoral efficacy of

chemotherapy. Quemener V., Moulinoux J.P., Havouis R., Seiler N. Anticancer Res. 1992 ; 12 : 1447-54. 26 Polyamine deprivation : a new tool in cancer treatment. Quemener V., blanchard Y., Chamaillard L., Havouis R., Cippola B., Moulinoux J.P. Anticancer Res. 1994 ; 14 : 443-8 27 Polyamine deprivation stimulates NK cell activity in cancerous mice. Chamaillard L., Quemener V., Havouis R., Moulinoux J.P. Anticancer Res. 1993 ; 13 : 1027-34. 28 Polyamine deprivation prevents the development of tumor-induced im mune- suppression. Chamaillard L., Catros-Quemener V., Delcros J.G. et al Br. J. Cancer 1997 ; 76 : 365-70. 29 Polyamine in gut inflammation and allergy. Peulen O., Deloyer P., Deville C., Dandrifosse G. Curr. Med. Chem. 2004 ; 3 : 1-8. 30 Pharmacology & therapeutics. J.M. Loftis et al 2003 ; 97 : 55-85

31 Les polyamines présentent-elles un intérêt dans le traitement du

cancer ? Moulinoux J.P., Seiler N. Médecine/Sciences 1996 ; 12 : 745-755 32 Les Polyamines. Behr J-P. Flammarion Médecine Sciences Quemener V., Moulinoux J.P. EDS ; 1991 : 11-20 33 Red blood free polyamine concentrations in patients on maintenance

hemodialysis. Moulinoux J.P., Le Pogamp P., Quemener V., Le Calve M., Joyeux V., Chevet D. Life Sci. 1981 ; 29 : 955-62 34 In vitro study on the entry of polyamines into normal red blood cells. Moulinoux J.P., Le Calve M., Quemener V., Quash G-A. Biochimie 1984 ; 66 : 385-93 35 le transport du potassium: aspects moléculaires et pathologiques. Lesage F., Barhanin J., Meneton P. Médecine/sciences 2000 ; 16 : 663-73 36 Bis(7-amino-4-azaheptyl)diméthylsilane and bis (7-ethylamino-4-

azaheptyl) dimethylsilane : inhibition of tumor growth in vitro and in vivo.

Seiler N., Delcros J.G., Vaultier M., Le Roch N., Havouis R., Moulinoux J.P. Cancer Res. 1996 ; 56 : 5624-30 37 Bis(7-amino-4-azaheptyldimethylsilane : a new tetramine with

polyamine-like fea tures. Effects on cell growth. Delcros J.G., Vaultier M., Le Roch N., Havouis R., Moulinoux J.P., Seiler N. Anticancer Drug design 1997 ; 12 : 35-48 38 Dimethylsilane polyamines : cytotoxic compounds with potentials as

anticancer drugs. Douaud F., Le Roch N., Renault J., Delcros J.G., Havouis R., Vaultier M., Moulinoux J.P. Anticancer Drug Design 1997 ; 12 : 621-23 39 Dimethylsilane polyamines, a new class of potential anticancer drugs

: effects on the growth of Lewis carcinoma in mice. Seiler N., Douaud F., Havouis R., Le Roch N., Vaultier M., Seiler N., Moulinoux J.P. Int. J. Oncol. 1997 ; 11 : 835-41 40 Dimethylsilane polyamines : cytotoxic compounds with potentials as

anticancer drugs II. Uptake and cytotoxic mechanisms. Le Roch N., Douaud F., Havouis R., Delcros J.G., Vaultier M., Moulinoux J.P., Seiler N. Anticancer Res. 2002 ; 22 : 3765-76 41 Role of protein kinase C activators and inhibitors, calmoduline

antagonists and membrane sialic acids in polyamine transport in murine leukelia cells.

Kahn N.A., Quemener V., Moulinoux J.P. Cell Mol. Biol. 1989 ; 35 : 215-24

42 Characterization of Na+dependent and system A-independent

polyamine transport in normal human erythrocytes. Kahn N.A., Quemener V., Moulinoux J.P. Biochem. Arch. 1989 ; 5 : 161-69 43 Spermidine binding sites at the cell surface of normal and desialited

human ery throcytes. Khan N.A., Quemener V., Moulinoux J.P. Biochem. Arch. 1989 ; 5 : 321-29 44 Polyamines and polyamino acids regulation of protein tyrosine kinase from human erythrocytes. Khan N.A., Masson I., Quemener V., Clari G., Moret V., Moulinoux J.P. Biochem. Int. 1989 ; 20 : 863-68 45 Mechanism of spermidine transport and its interference with

polyamine analogues in cultured mammalian cells. Khan N.A., Quemener V., Seiler N., Moulinoux J.P. Exp. Cell Biol. 1990 ; 58 : 172-78 46 Coupling of Na+ with spermidine transporter protein. Khan N.A., Masson I., Quemener V., Moulinoux J.P. Cell Biol. Mol. 1990 ; 36 : 345-48 47 Mechanism of polyamine spermidine uptake by Xenopus laevis oocytes. Khan N.A., Quemener V., Havouis R., Moulinoux J.P. Biochem. Int. 1990 ; 21 : 607-13 48 Phorbol esters augment spermidine transport without protein C

kinase activation. Khan N.A., Quemener V., Moulinoux J.P. Biochem. Pharmacol. 1990 ; 40 : 1-4 49 Review : Polyamine membrane transport regulation. Khan N.A., Quemener V., Moulinoux J.P. Cell Biol. Int. Rep. 1991 ; 15 : 9-24 50 Endogenous and exogenous polyamines in support of tumor growth. Seiler N., Sarhan S., Grauffel C., Jones R., Knödgen B., Moulinoux J.P. Cancer Res. 1990 ; 50 : 5077-83 51 In vivo synergistic inhibition of Mat Ly-Lu rat prostatic

adenocarcinoma growth by polyamine deprivation and low-dose cyclophosphamide.

Cipolla B., Blanchard Y., Chamaillard L., Quemener V., Guillé F., Havouis R., Mouli noux J.P. Urol. Res. 1996 ; 24 : 93-99 52 Polyamine deficient diet to relieve pain hypersensitivity. Rivat C. et al Pain 2007 53 Non nociceptive environmental stress induces hyperalgesia, not

analgesia, in pain and opioid-experienced rats. Rivat C., Laboureyras E., Laulin J.P., Le Roy C., Richebé P., Simonnet G. Pain 2007 ; 32 : 2217-28

54 Polyamine contents in current foods : a basis for polyamine reduced diet and a study of its long term observance and tolerance in prostate carcinoma patients.

Cipolla B., Havouis R., Moulinoux J.P. Amino acids 2007 ; 33 : 203-12

polyamines - accueil - philippe fié · pdf file4 1)#historique! mises en...

Documents

determination of underivatized polyamines: a review of...

inducing somatic embryogenesis by polyamines in ......

la musique du 17ème siÈcle le baroque

urinary and erythrocyte polyamines during the evaluation...

lipophilic polyamines providing enhanced intracellular

6th international conference on polyamines biochemical...

première partie approche historique depuis le 17ème...

programmation et animations 17ème festival chauffer dans la...

intracellular polyamines mediate inward rectification of ca...

a review: polyamines and photosynthesis -...

17ème festival "les jeunes parmis le jazz"

guide des aliments et leur teneur en polyamines - … ·...

atrium, la revue du forum ehtp-entreprises 17ème edition

17ème dimanche ordinaire année b

polyamines: molecules with regulatory functions in plant...

histoire de la littérature classique du 17ème siècleme...

polyamines, gelling agents in tissue culture ... ·...

branched polyamines cure prion-infected neuroblastoma...

17ème édition du baromètre expectra des salaires cadres...

polyamines and plant alkaloids -...