plagiat merupakan tindakan tidak terpuji - core.ac.uk · dari awal penelitian hingga laporan akhir...
Post on 02-Mar-2019
225 Views
Preview:
TRANSCRIPT
VALIDASI METODE KOLORIMETRI DENGAN PEREAKSI ALUMINIUM
KLORIDA UNTUK PENETAPAN KADAR FLAVONOID TOTAL DALAM
SEDIAAN GEL BASIS NATRIUM CARBOXYMETHYLCELLULOSE
LSKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)
Program Studi Ilmu Farmasi
Oleh:
Laurentius Dian Ardiyanto
NIM : 048114013
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2008
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ii
VALIDASI METODE KOLORIMETRI DENGAN PEREAKSI ALUMINIUM
KLORIDA UNTUK PENETAPAN KADAR FLAVONOID TOTAL DALAM
SEDIAAN GEL BASIS NATRIUM CARBOXYMETHYLCELLULOSE
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)
Program Studi Ilmu Farmasi
Oleh:
Laurentius Dian Ardiyanto
NIM : 048114013
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2008
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iii
Skripsi
VALIDASI METODE KOLORIMETRI DENGAN PEREAKSI ALUMINIUM
KLORIDA UNTUK PENETAPAN KADAR FLAVONOID TOTAL DALAM
SEDIAAN GEL BASIS NATRIUM CARBOXYMETHYLCELLULOSE
Yang diajukan oleh:
Laurentius Dian Ardiyanto
NIM : 048114013
telah disetujui oleh
Pembimbing Jeffry Julianus, M.Si Tanggal : ........................................
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iv
Pengesahan Skripsi Berjudul
VALIDASI METODE KOLORIMETRI DENGAN PEREAKSI ALUMINIUM
KLORIDA UNTUK PENETAPAN KADAR FLAVONOID TOTAL DALAM
SEDIAAN GEL BASIS NATRIUM CARBOXYMETHYLCELLULOSE
Oleh :
Laurentius Dian Ardiyanto NIM : 048114013
Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma pada tanggal : 22 Mei 2008
Mengetahui Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma
Dekan
(Rita Suhadi, M.Si., Apt) Pembimbing : (Jeffry Julianus, M.Si) Panitia Penguji : Tanda Tangan
1. Jeffry Julianus, M.Si .......................
2. Christine Patramurti, M.Si, Apt. .......................
3. Yohanes Dwiatmaka, M.Si. .......................
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Untukk para e
Wit
v
emanue
th hope.
elku terc
.....
cinta
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vi
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN
PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS
Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma :
Nama : Laurentius Dian Ardiyanto
Nomor Mahasiswa : 048114013
Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan
Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul :
VALIDASI METODE KOLORIMETRI DENGAN PEREAKSI ALUMINIUM
KLORIDA UNTUK PENETAPAN KADAR FLAVONOID TOTAL DALAM
SEDIAAN GEL BASIS NATRIUM CARBOXYMETHYLCELLULOSE beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada
Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, me-ngalihkan dalam
bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara
terbatas, dan mempublikasikannya di Internet atau media lain untuk kepentingan
akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya
selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis.
Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya.
Dibuat di Yogyakarta
Pada tanggal : 27 Mei 2008
Yang menyatakan
( Laurentius Dian Ardiyanto )
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vii
PRAKATA
Alleluia…Alleluia…Alleluia...
Puji syukur kepada Allah Bapa, Putra dan Roh kudus atas penyertaannya
dari awal penelitian hingga laporan akhir ini selesai. Laporan akhir penelitian ini
disusun untuk memenuhi salah satu persyaratan untuk memperoleh gelar Sarjana
Strata Satu Program Studi Ilmu Farmasi (S.Farm).
Berbagai kesulitan telah berhasil dilewati dan akhirnya ucapan
terimakasih yang setulus-tulusnya dihaturkan kepada pihak-pihak yang telah
memberikan bantuan hingga akhir penelitian.
Penulis mengucapkan terimakasih kepada :
1. Papa, Mama, dan Ayu atas kasih sayang dan doanya yang menguatkan
2. Rita Suhadi, M.Si., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata
Dharma
3. Jeffry Julianus, M.Si selaku pembimbing skripsi atas segala bimbingan dan
arahannya selama penelitian berlangsung
4. Christine Patramurti, M.Si., Apt. dan Yohanes Dwiatmaka, M.Si.selaku dosen
penguji atas kritik, saran, dan bantuannya hingga laporan ini selesai
5. Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt. atas diskusinya yang banyak
membantu penulis selama penelitian
6. Rini Dwiastuti, S. Farm., Apt. selaku ketua Tea Project atas kesempatan yang
diberikan kepada penulis untuk berpartisipasi dalam penelitian
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
viii
7. Romo Drs. P. Sunu Hardijanto, S.J., S.Si, M.Sc. atas diskusi-diskusinya
tentang statistik dan etika penelitian
8. Enade Perdana Istyastono, S.F., Apt. dan A. Nora Iska Harnita M.Si, Apt. atas
bantuannya untuk memperoleh literatur untuk penelitian ini
9. Teman-teman Tea Project Agung ‘Simbah’, Resty ‘Simak’, Yoyo, Dona
‘Donce’, Ika ‘Monyi’, Tere, Rinta, Selvi, dan Fhery atas kerjasamanya.
Terutama untuk Resty atas bantuannya menyediakan sampel untuk penelitian
dan Selvi partner penelitian hingga akhir.
10. Mas Kunto, Pak Parlan, Pak Prapto, dan Mas Sarwanto atas segala bantuan
selama penulis bekerja di laboratorium.
11. Pipit, Ayu, Rudy, Desy, Silvia ‘Cipi’ atas kebersamaan selama studi di
Fakultas Farmasi USD
12. Rohkaters 04, gereja kecilku atas suka duka dan pengalaman iman yang
mendewasakan
13. Teman-teman di Fakultas Farmasi terutama FST 04 dan kelas A 04
14. Semua pihak yang membantu selama penulis menyelesaikan penelitian ini
yang tidak dapat disebutkan satu-persatu.
Tak ada gading yang tak retak, untuk itu segala kritik dan saran terhadap
penelitian ini amat diharapkan. Semoga penelitian ini bermanfaat bagi para
pembaca.
Penulis
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ix
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA
Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini
tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan
dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.
Yogyakarta, 27 Mei 2008
Penulis
Laurentius Dian Ardiyanto
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
x
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL .......................................................................................... ii
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................................. iii
HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................ iv
HALAMAN PERSEMBAHAN ......................................................................... v
HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ...................................................... vi
PRAKATA .......................................................................................................... vii
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ............................................................. ix
DAFTAR ISI ....................................................................................................... x
DAFTAR TABEL ............................................................................................... xiv
DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... xv
DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xvi
INTISARI ........................................................................................................... xvii
ABSTRACT ......................................................................................................... xviii
BAB I. PENDAHULUAN .................................................................................. 1
A. Latar Belakang ...................................................................................... 1
B. Permasalahan ......................................................................................... 3
C. Tujuan Penelitian ................................................................................... 3
D. Manfaat Penelitian ................................................................................ 3
E. Keaslian Karya ...................................................................................... 3
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA ....................................................................... 5
A. Flavonoid .............................................................................................. 5
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xi
1. Sifat-sifat fisika-kimia flavonoid ....................................................... 5
2. Reaksi kimia flavonoid ...................................................................... 6
3. Flavonoid teh hijau ............................................................................ 7
B. Kuersetin ............................................................................................... 7
C. Analisis Sediaan Gel ............................................................................. 8
D. Deskripsi Senyawa Eksipien Penyusun Formula Gel ........................... 9
1. Natrium carboxymethylcellulose ....................................................... 9
2. Asam sitrat ......................................................................................... 10
3. Propilen glikol ................................................................................... 10
4. Metil paraben ..................................................................................... 11
5. Etanol ................................................................................................. 11
E. Spektrofotometer UV-Vis ..................................................................... 11
F. Kolorimetri ............................................................................................ 14
1. Penetapan kadar flavonoid secara kolorimetri .................................. 15
2. Absorpsi radiasi elektromagnetik oleh senyawa kompleks ............... 16
G. Parameter Validitas Metode Analisis .................................................... 16
1. Akurasi .............................................................................................. 17
2. Presisi ................................................................................................ 17
3. Spesifisitas ......................................................................................... 17
4. Batas deteksi ...................................................................................... 18
5. Batas kuantitasi .................................................................................. 18
6. Linearitas ........................................................................................... 18
7. Range ................................................................................................. 18
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xii
H. Keterangan Empiris ............................................................................... 19
BAB III. METODOLOGI PENELITIAN .......................................................... 21
A. Jenis dan rancangan penelitian .............................................................. 21
B. Variabel penelitian ................................................................................ 21
C. Definisi Operasional .............................................................................. 21
D. Bahan Penelitian ................................................................................... 22
E. Alat Penelitian ....................................................................................... 22
F. Tatacara Penelitian ................................................................................. 22
1. Pembuatan pelarut dan pereaksi ........................................................ 22
2. Pembuatan sampel ............................................................................. 23
3. Pembuatan blangko ........................................................................... 23
4. Pembuatan larutan baku .................................................................... 23
5. Penentuan operating time (OT) ......................................................... 24
6. Penetapan panjang gelombang maksimum ....................................... 24
7. Pembuatan kurva baku ...................................................................... 24
8. Preparasi sampel ................................................................................ 25
9. Penetapan kadar flavonoid dalam sampel ......................................... 26
G. Analisis Hasil ........................................................................................ 26
BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................... 27
A. Optimasi Kondisi Pengukuran .............................................................. 27
1. Penentuan operating time (OT) ......................................................... 27
2. Penentuan panjang gelombang maksimum ....................................... 28
B. Pembuatan Kurva baku ......................................................................... 30
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiii
C. Preparasi Sampel ................................................................................... 31
1. Isolasi analit dari sampel ................................................................... 32
2. Tahap hidrólisis ................................................................................. 34
3. Ekstraksi cair-cair .............................................................................. 35
D. Penetapan Kadar Flavonoid dalam Sampel........................................... 36
E. Analisis Validitas Metode ..................................................................... 38
1. Spesifisitas ......................................................................................... 38
2. Akurasi .............................................................................................. 38
3. Presisi ................................................................................................ 39
4. Linearitas ........................................................................................... 39
BAB V. KESIMPULAN, SARAN DAN KETERBATASAN ........................... 41
A. Kesimpulan ........................................................................................... 41
B. Saran ...................................................................................................... 41
C. Keterbatasan .......................................................................................... 41
DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................... 42
LAMPIRAN ........................................................................................................ 45
BIOGRAFI PENULIS ........................................................................................ 52
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiv
DAFTAR TABEL
Tabel I. Daftar beberapa reagen untuk flavonoid ........................................... 6
Tabel II. Formula gel untuk penelitian ............................................................ 9
Tabel III. Kategori metode analisis dan persyaratan validasi ........................... 19
Tabel IV. Hubungan kadar kuersetin dengan absorbansi .................................. 30
Tabel V. Data % recovery dan koefisien variansi metode ............................... 38
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xv
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Rangka dasar flavonoid ................................................................... 5
Gambar 2. Sistem penomoran pada cincin flavonoid ........................................ 5
Gambar 3. Sruktur kimia kuersetin ................................................................... 8
Gambar 4. Struktur kimia natrium carboxymethylcellulose .............................. 10
Gambar 5. Struktur kimia asam sitrat ................................................................ 10
Gambar 6. Struktur kimia propilen glikol ......................................................... 10
Gambar 7. Struktur kimia metil paraben ........................................................... 11
Gambar 8. Diagram transisi elektron ................................................................ 14
Gambar 9. Reaksi pembentukan kompleks antara kuersetin dengan
aluminium klorida dalam suasana asam .......................................... 15
Gambar 10. Spektrum operating time kompleks kuersetin-AlCl3 ................................... 28
Gambar 11. Spektrum panjang gelombang maksimum kompleks
kuersetin-AlCl3 ................................................................................ 29
Gambar 12. Kurva baku kuersetin ....................................................................... 31
Gambar 13. Ikatan hidrogen natrium carboxymethylcellulose
membentuk cross link ...................................................................... 32
Gambar 14. Endapan CMC-Na yang terbentuk pada akhir proses isolasi .......... 34
Gambar 15. Reaksi hidrolisis flavonoid .............................................................. 35
Gambar 16. Alur pengerjaan sampel gel ............................................................. 37
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xvi
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Penimbangan dan contoh perhitungan kadar larutan baku ........... 45
Lampiran 2. Penimbangan dan contoh perhitungan kadar teoritis sampel ......... 47
Lampiran 3. Data dan contoh perhitungan % recovery ..................................... 48
Lampiran 4. Perhitungan koefisien variansi (CV) .............................................. 50
Lampiran 5. Gambar endapan CMC-Na yang terbentuk .................................... 51
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xvii
INTISARI
Untuk melengkapi penelitian optimasi formula sediaan gel sunscreen teh hijau dengan gelling agent natrium carboxymethylcellulose (CMC-Na) dikembangkan suatu metode analisis kuantitatif yang dapat digunakan dalam kontrol kualitas. Metode kolorimetri dengan pereaksi Aluminium klorida yang digunakan untuk menetapkan kadar flavonoid total diadaptasi untuk maksud ini. Adaptasi suatu metode analisis dengan sampel yang berbeda membutuhkan proses validasi kembali untuk menjaga validitas metode. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui akurasi dan presisi metode kolorimetri dengan pereaksi aluminium klorida untuk penetapan kadar flavonoid dalam bentuk sediaan gel.
Penelitian ini difokuskan pada proses preparasi sampel yang terdiri dari tiga tahap, isolasi analit dari basis gel menggunakan aseton, hidrolisis untuk memecah ikatan glikosida dengan HCl 25%, dan ekstraksi cair – cair untuk memisahkan aglikon dengan glikon. Proses ini diharapkan mampu mempertahankan validitas metode.
Hasil penelitian menunjukkan metode ini memiliki akurasi dan presisi yang dapat diterima. Akurasi ditunjukkan dengan nilai % recovery sebesar 91,09%. Presisi ditunjukkan dengan nilai CV sebesar 5,25%. Hasil ini membuktikan bahwa metode kolorimetri dengan pereaksi aluminium klorida memiliki validitas yang baik ketika digunakan pada sediaan gel. Kata kunci : gel, natrium carboxymethylcellulose, kolorimetri, aluminium klorida,
akurasi, presisi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xviii
ABSTRACT
To complete research of optimization formula of green tea gel dosage forms as sunscreen, a quantitative analysis method which can be used in quality kontrol had been developed. Colorimetry method with aluminium chloride as reagent for total flavonoid assay had been adapted for this purpose. Adaptation some analytical method with different sample require revalidation process to maintain method validity. The aim of this research is to find out accuration and precision of colorimetry method with aluminium chloride reagents for quantitative analysis of flavonoids in gel dosage forms.
This research had focused in sample preparation included three steps, analite isolation from gel base using acetone, hydrolysis to brake glycosidic bonds with HCl 25%, and liquid – liquid extraction to separate aglicon and glicon. This process had expected to maintain method validity.
Result of this research show that this methods has acceptable accuration and precision. Accuration showed by 90,53% for % recovery value. Precision showed by 5,378% for coefficient of variance value. This result proved that colorimetry method with aluminium chloride as reagent has good validity when it used in gel dosage forms.
Keywords : gel, carboxymethylcellulose sodium, colorimetry, aluminium
chloride, accuration, precision
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
1
BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Svobodova et al. (2003) dalam artikelnya memberikan penjelasan tentang
sejumlah senyawa fenolik alam dengan struktur yang digambarkan sebagai suatu
fenol (cincin aromatik yang berikatan dengan gugus hidroksil) seperti asam
kafeat, asam ferulat, kuersetin, apigenin, genistein, resveratrol, asam
nordihidroguaiaretat, asam karnosat, silimarin, polifenol teh, dan tanin. Senyawa-
senyawa fenolik tersebut terbukti mempunyai efek protektif terhadap kerusakan
kulit yang diinduksi radiasi UV. Untuk mempermudah penggunaan senyawa-
senyawa fenolik alam tersebut, Wijayanti (2008) telah melakukan penelitian
optimasi formula sediaan gel teh hijau sebagai dengan basis natrium
carboxymethylcellulose.
Dengan adanya perkembangan, terutama berkaitan dengan GMP (Good
Manufacturing Practice), formulasi sediaan yang baik hendaknya juga didukung
dengan kontrol kualitas yang baik pula. Bidang analisis kuantitatif terutama,
memainkan peranan yang penting dalam kontrol kualitas. Dalam kaitannya
dengan penelitian Wijayanti (2008), untuk melengkapi hasil penelitian tersebut,
maka perlu disusun suatu metode analisis kuantitatif yang dapat digunakan dalam
kontrol kualitas sediaan gel yang telah dikembangkan.
Polifenol teh hijau yang bertanggungjawab terhadap efek sunscreen
dalam sediaan gel hasil optimasi Wijayanti (2008), merupakan senyawa alam
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2
yang digolongkan dalam kelas flavonoid. Syah (2006) menyebutkan empat
polifenol utama dalam teh hijau yaitu katekin, epikatekin, epigallokatekin, dan
epigallokatekingalat. Ditinjau dari struktur kimianya keempat polifenol tersebut
merupakan flavonoid (Robinson, 1991). Oleh karenanya metode analisis
kuantitatif flavonoid dapat menjadi metode analisis yang rasional dalam kontrol
kualitas sediaan gel teh hijau.
Aluminium klorida (AlCl3) diketahui dapat membentuk kompleks
berwarna dengan gugus hidroksi fenolik yang bertetangga dengan gugus karbonil
dan dengan gugus orto dihidroksi fenolik dalam senyawa flavonoid (Markham,
1982). Gugus ini dimiliki oleh senyawa-senyawa flavonoid yang ditemukan dalam
teh (Anonim, 1999).
Penelitian Pertiwi (2006), telah membuktikan validitas analisis kuantitatif
flavonoid secara kolorimetri dengan pereaksi AlCl3. Selain itu peneliti yang
bersangkutan juga telah menggunakannya pada penetapan kadar flavonoid total
dalam beberapa fraksi teh. Penggunaan metode tersebut untuk analisis kuantitatif
sampel sediaan bentuk gel membutuhkan beberapa penyesuaian untuk menjamin
validitas metode. Akurasi dan presisi yang dipengaruhi oleh proses preparasi
sampel menjadi parameter utama untuk menunjukkan validitas metode ketika
diterapkan dalam analisis dalam sampel gel. Untuk mengetahui validitas metode
kolorimetri dengan pereaksi AlCl3 pada penetapan kadar flavonoid total dalam
sediaan gel teh hijau, maka perlu dilakukan penelitian ini.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
3
B. Permasalahan
Apakah penetapan kadar flavonoid total dalam sediaan gel teh hijau
secara kolorimetri dengan pereaksi aluminium klorida mempunyai akurasi dan
presisi yang baik?
C. Tujuan Penelitian
Mengetahui akurasi dan presisi penetapan kadar flavonoid total dalam
sediaan gel teh hijau secara kolorimetri dengan pereaksi aluminium klorida.
D. Manfaat Penelitian
Manfaat yang diharapkan dari penelitian ini adalah:
a. Manfaat teoritis
Memberikan pengetahuan akan metode penetapan kadar flavonoid dalam
sediaan gel
b. Manfaat praktis
Menyediakan metode untuk kontrol kualitas sediaan gel dengan basis natrium
carboxymethylcellulose terutama dengan kandungan flavonoid
E. Keaslian Karya
Pertiwi (2006) telah melakukan penelitian penetapan kadar flavonoid
total terhitung sebagai kuersetin dengan menggunakan metode kolorimetri dalam
teh hijau dan teh hitam [merkX].
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
4
Perbedaan penelitian ini dengan penelitian sebelumnya adalah pada
sampel yang digunakan. Penelitian Pertiwi (2006) menggunakan produk teh hijau
dan teh hitam sebagai sampel. Penelitian ini menggunakan sampel berupa sediaan
gel. Sejauh pengetahuan penulis penelitian validasi metode kolorimetri dengan
pereaksi aluminium klorida untuk penetapan kadar flavonoid total dalam sediaan
gel basis natrium carboxymethylcellulose belum pernah dilakukan.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
5
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
A. Flavonoid
Flavonoid ditemukan pada berbagai macam tumbuhan dengan berbagai
struktur yang semuanya memiliki rangka dasar 15 atom karbon dan tersusun
dalam konfigurasi C6–C3–C6. Konfigurasi tersebut menggambarkan dua gugus
benzena yang dihubungkan tiga atom karbon, dapat berupa rantai alifatik atau
rantai siklik yang membentuk cincin piran sebagai cincin ketiga. Sistem
penomoran cincin A dan C menggunakan angka biasa, sedangkan cincin B
menggunakan angka aksen. Flavonoid banyak ditemukan terikat sebagai glikosida
dengan struktur flavonoid-O-glikosida atau flavonoid-C-glikosida (Riyanto,
1990).
Gambar 1. Rangka dasar flavonoid
Gambar 2. Sistem penomoran pada
cincin flavonoid
1. Sifat-sifat fisika-kimia flavonoid
Glikosida mudah larut dalam air dan alkohol, Sebaliknya sebagian besar
aglikon flavonoid larut dalam pelarut organik nonpolar (Bruneton, 1993). Ikatan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
6
dengan gula (glikon) dapat meningkatkan kelarutan dari aglikon flavonoid dalam
pelarut polar namun menjadikannya kurang reaktif (Markham, 1982).
Flavonoid, seperti senyawa fenol lainnya, mudah mengalami reaksi
oksidasi pada suasana netral dan basa. Stabilitas flavonoid diperoleh pada suasana
asam, tetapi dalam suasana asam baik panas atau dingin dalam waktu yang lama,
glikosida dapat terhidrolisis (Robinson, 1991).
Flavonoid dapat mengalami perubahan kimia karena panas, enzim,
keberadaan air dan pH. Untuk mencegahnya, bahan baku yang masih segar
biasanya dipanaskan hingga suhu 100oC dengan oven untuk menghentikan reaksi
enzimatik dan menghilangkan air (Riyanto, 1990).
2. Reaksi kimia flavonoid
Flavonoid dapat bereaksi dengan beberapa reagen untuk keperluan
analisis kualitatif maupun kuantitatif. Oleh karena flavonoid biasa ditemukan
dalam bentuk glikosida, maka terlebih dahulu perlu dilakukan hidrolisis yang
akan memisahkan glikon dengan aglikon flavonoid. Hidrolisis dapat dilakukan
dengan tiga macam cara, yaitu dengan katalis asam, enzim, atau basa (Riyanto,
1990).
Tabel 1. Daftar beberapa reagen untuk flavonoid Nama Reagen Sasaran
Natrium metoksida gugus yang peka terhadap basa
Natrium asetat anhidrat identifikasi gugus hidroksil paling basa
Aluminium klorida gugus hidroksi dan keton yang
bertetangga, gugus orto dihidroksi
Asam borat anhidrat dua gugus hidroksi pada posisi orto
(Markham, 1982; Riyanto, 1990)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
7
Kondisi hidrolisis flavonoid berbeda untuk jenis flavonoid-O-glikosida
dan flavonoid-C-glikosida. Flavonoid-O-glikosida lebih mudah dihidrolisis
dibandingkan flavonoid-C-glikosida. Jenis glikon dan tempat glikon itu terikat
pada inti flavonoid juga menentukan kondisi untuk hidrolisis (Markham, 1982).
3. Flavonoid teh hijau
Teh (Camellia sinensis (L.) O. Kuntze) mengandung sejumlah flavonoid
golongan flavanol terutama katekin dan senyawa turunannya seperti epikatekin,
epigallokatekin, dan epigallokatekingalat (Syah, 2006). Selain itu terdapat pula
flavonoid golongan flavonol seperti kuersetin, kaempferol, mirisetin, dan
kuercitrin serta beberapa golongan flavonoid yang lain (Anonim, 1999). Katekin,
yang merupakan flavonoid utama dalam teh, ditemukan lebih banyak dalam teh
hijau dibandingkan dalam teh hitam. Hal ini disebabkan enzim polifenol oksidase
yang mengoksidasi katekin diinaktivasi pada proses pembuatan teh hijau,
sedangkan pada pembuatan teh hitam, katekin dibiarkan teroksidasi membentuk
senyawa baru yang memiliki warna merah kecoklatan (Syah, 2006).
B. Kuersetin
Kuersetin termasuk dalam flavonoid golongan flavonol (Bruneton, 1993).
Senyawa ini larut dalam aseton, asam asetat dan pirimidin; sangat sukar larut
dalam air panas dan dietil eter; tidak larut dalam air dingin (Anonim, 2005)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
8
OH
OOH
HO O
OH
OH
Gambar 3. Struktur kimia kuersetin
C. Analisis Sediaan Gel
Gel tersusun atas sejumlah kecil komponen padatan yang terdispersi
dalam sejumlah besar cairan. Komponen padat dari gel membentuk jaringan tiga
dimensi yang membentuk rigiditas gel. Oleh karena itu, meskipun sebagian besar
komponennya berupa cairan, gel memiliki kemampuan untuk mempertahankan
bentuknya dengan pemberian sedikit tekanan. Padatan yang lazim digunakan
dalam gel adalah polimer meskipun beberapa gel tersusun atas padatan inorganik.
Contoh polimer yang biasa digunakan sebagai gelling agent antara lain carbomer,
poloxamer, CMC-Na, Hidroxy Propyl Methyl Cellulose (HPMC), dan karaginan
(Swarbick and Boylan, 1992)
Untuk memperoleh analit, yang merupakan komponen gel, sistem
dispersi dari gel perlu dipisahkan terlebih dahulu. Penggunaan ekstraksi padat –
cair atau elektrolit, mampu memisahkan zat terdispersi dan medium dispers gel.
Pelarut-pelarut yang digunakan dalam ekstraksi padat - cair menyesuaikan dengan
sifat kelarutan dari zat terdispersi gel. Untuk keperluan memecah sediaan gel ini
digunakan pelarut yang tidak melarutkan zat terdispersi agar diperoleh endapan
(Gillard et.al, 1985; Rohman, 2007).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
9
Elektrolit dapat digunakan untuk mengendapkan zat terdispersi yang
memiliki sifat terionkan. Elektrolit yang digunakan adalah elektrolit dengan sifat
yang berlawanan dengan sifat ion zat terdispersi. Polimer kationik dapat
diendapkan dengan penambahan senyawa anionik begitu pula sebaliknya (Gillard
et.al, 1985).
D. Deskripsi Senyawa Eksipien Penyusun Formula Gel
Tabel 2. Formula gel untuk penelitian Natrium Carboxymethylcellulose (CMC-Na) 4 Asam sitrat 0,5 Propilen Glikol 10 Metil paraben 0,3 Etanol 11,7 Fraksi teh hijau 0,03 Aquades 72,5
(Wijayanti, 2008)
1. Natrium carboxymethylcellulose
Natrium carboxymethylcellulose (CMC-Na) yang juga sering disebut
sebagai carboxymethylcellulose (CMC) atau cellulose gum merupakan gelling
agent turunan selulosa (Zatz and Kushla, 1996). CMC-Na terdispersi dalam air
pada berbagai temperatur membentuk larutan koloidal yang jernih. Materi ini
praktis tidak larut dalam aseton, etanol (95%), eter dan toluen (Parsons, 2005).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
10
Gambar 4. Struktur kimia natrium carboxymethylcellulose
2. Asam sitrat
Asam sitrat digunakan secara luas sebagai pemberi suasana asam,
antioksidan, atau buffer dalam berbagai sediaan farmasi. Senyawa ini larut 1
dalam 1,5 bagian ethanol (95%) dan 1 dalam kurang dari 1 bagian air; agak sukar
larut dalam eter (Amidon, 2005).
Gambar 5. Struktur kimia asam sitrat
3. Propilen glikol
Propilen glikol digunakan sebagai antimikroba, humectant, plasticizer,
atau co-solvent. Senyawa ini dapat bercampur dengan aseton, kloroform, etanol
(95%), gliserin dan air; larut 1 dalam 6 bagian eter ( Owen and Weller, 2005).
Gambar 6. Struktur kimia propilen glikol
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
11
4. Metil paraben
Metil paraben digunakan sebagai antimikroba dalam produk makanan,
dan sediaan farmasi. Senyawa ini dapat digunakan sendiri atau dikombinasikan
dengan paraben yang lain.
Metil paraben mudah larut dalam etanol (95%), dan eter; agak sukar larut
dalam gliserin. Kelarutan dalam air meningkat dengan kenaikan suhu. Pada suhu
kamar 1 bagian metil paraben larut dalam 400 bagian air (Johnson and Steer,
2005).
O
OH
O Gambar 7. Struktur kimia metil paraben
5. Etanol
Etanol biasa digunakan sebagai pelarut dalam berbagai sediaan farmasi.
Senyawa ini dapat bercampur dengan kloroform, eter, gliserin dan air (Owen,
2005).
F. Spektrofotometer UV-Vis
Spektrofotometer memiliki kemampuan menentukan jumlah analit dalam
suatu sampel berdasarkan berapa banyak cahaya yang diabsorpsi oleh analit
tersebut. Cahaya, yang merupakan radiasi elektromagnetik, diabsorpsi oleh
molekul analit dalam sampel dan menyebabkan terjadinya eksitasi elektron ke
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
12
tingkat energi yang lebih tinggi. Peristiwa absorpsi ini terjadi melalui satu atau
lebih dari beberapa cara di bawah ini :
1. Transisi elektronik (electronic transition)
Energi dari radiasi elektromagnetik mempromosikan elektron pada orbital
ikatan (bonding orbital) menuju orbital anti-ikatan (antibonding orbital) yang
memiliki energi lebih tinggi.
2. Transisi vibrasional (vibrational transition)
Energi radiasi elektromagnetik bekerja meningkatkan vibrasi atau osilasi dari
atom yang membentuk ikatan kimia.
3. Transisi rotasional (rotational transition)
Energi radiasi elektromagnetik meningkatkan rotasi dari atom yang
membentuk ikatan kimia.
Dari ketiga cara tersebut, transisi elektronik adalah yang paling berperan dalam
analisis pada daerah UV-Vis (Cairns, 2003).
Oleh karena elektron pada kondisi tereksitasi kurang stabil, maka elektron
akan kembali pada kondisi dasar (ground state) yang memiliki tingkat energi
lebih rendah. Pada saat itu elektron melepaskan energi dalam bentuk panas.
Peristiwa inilah yang bertanggungjawab pada proses pembentukan warna
(Christian, 2004).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
13
Elektron dalam molekul diklasifikasikan menjadi empat tipe :
1. Elektron pada kulit yang tertutup (closed-shell electrons)
Elektron tipe ini tidak berperan dalam pembentukan ikatan dan memiliki
energi eksitasi yang sangat tinggi sehingga tidak berperan dalam absorpsi pada
area UV-Vis.
2. Elektron ikatan kovalen tunggal (covalent single-bond electrons)
Elektron tipe ini disebut juga elektron sigma (σ). Elektron σ ini memiliki
energi eksitasi yang tinggi sehingga tidak berperan dalam absorpsi pada area
UV-Vis.
3. Pasangan elektron bebas (n)
Elektron tipe ini memiliki energi eksitasi yang lebih rendah dari elektron σ dan
dapat berperan dalam absorpsi pada area UV-Vis. Contohnya adalah pasangan
elektron bebas pada atom N, O, S dan halogen.
4. Elektron pada orbital phi (π)
Elektron tipe ini adalah yang paling mudah tereksitasi dan berperan penting
dalam pembentukan spektrum pada daerah UV-Vis.
(Christian, 2004)
Peristiwa transisi elektron dalam molekul menuju tingkat energi yang
lebih tinggi digolongkan menjadi 4 macam yaitu transisi σ- σ*, transisi n- σ*,
transisi n- π*, dan transisi π- π*. Dari keempat transisi tersebut transisi n- π* dan
π- π* merupakan jenis transisi yang berperan dalam analisis pada daerah UV-Vis
(Rohman, 2007)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
14
Gambar 8. Diagram transisi elektron
Aspek kuantitatif spektrofotometer dinyatakan dalam hukum Lambert-
Beer yang secara matematis ditulis menurut persamaan berikut :
A ‐log T log 1T abc
Dimana :
A : absorbansi T : transmitan a : konstanta absorptivitas b : jarak (tebal kuvet) c : konsentrasi (Christian, 2004)
G. Kolorimetri
Suatu senyawa yang menyerap pada panjang gelombang UV yang ingin
ditetapkan kadarnya pada panjang gelombang visibel, perlu diubah terlebih dahulu
menjadi senyawa berwarna (Rohman, 2007). Pengubahan senyawa ini mampu
meningkatkan selektivitas dan sensitivitas metode (Fell, 1986). Penggunaan
reagen tertentu mampu merubah analit menjadi senyawa baru yang mengabsorpsi
pada panjang gelombang visibel. Syarat dari reagen ini adalah :
a. Reaksinya selektif dan sensitif
b. Reaksi berlangsung cepat, bersifat kuantitatif, dan reprodusibel
π
σ*
π*
σ
n
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
15
c. Produk berwarna yang dihasilkan stabil selama proses analisis berlangsung
(Rohman, 2007)
1. Penetapan kadar flavonoid secara kolorimetri
Senyawa flavonoid memberikan absorpsi pada panjang gelombang UV.
Ketika flavonoid akan ditetapkan kadarnya pada panjang gelombang visibel, maka
reagen tertentu perlu ditambahkan untuk mengubahnya menjadi senyawa
berwarna. Salah satu reagen yang lazim digunakan adalah aluminium klorida
(AlCl3). Senyawa flavonoid yang memiliki gugus hidroksi fenolik yang
bertetangga dengan gugus karbonil dan gugus dihidroksi fenolik mampu bereaksi
membentuk kompleks dengan AlCl3. Gugus hidroksi fenolik yang bertetangga
dengan gugus karbonil membentuk kompleks tahan asam sedangkan gugus
dihidroksi fenolik membentuk kompleks tidak tahan asam (Markham, 1982).
OH
OOH
HO O
OH
OH
quercetin
O
OOH
HO O
O
O
Al2+
Al+
O
OOH
HO O
OH
OH
Al2+
AlCl3 HCl
Gambar 9. Reaksi pembentukan kompleks antara kuersetin dengan Aluminium klorida dalam suasana asam (Markham, 1982)
Kompleks yang terbentuk antara AlCl3 dengan flavonoid merupakan
senyawa koordinasi. Senyawa ini terbentuk oleh ikatan antara ion logam sebagai
atom pusat dengan suatu ion atau molekul netral sebagai ligan (Brady, 1998).
Reaksi pembentukan kompleks ini sering diklasifikasikan sebagai reaksi asam-
basa Lewis. Dalam hal ini, ligan berfungsi sebagai basa Lewis yang mendonorkan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
16
pasangan elektron kepada ion logam sebagai asam Lewis dan membentuk
kompleks (Amiji, 2003).
2. Absorpsi radiasi elektromagnetik oleh senyawa kompleks
Absorpsi radiasi elektromagnetik senyawa kompleks pada daerah UV-Vis
terjadi melalui salah satu atau lebih peristiwa transisi, yaitu eksitasi ion logam,
eksitasi molekul ligan, dan transfer muatan. Dua proses yang pertama tidak
memberikan peran yang signifikan dalam analisis kuantitatif senyawa kompleks.
Untuk kepentingan analisis kuantitatif, transfer muatan memegang peranan
penting dalam absorpsi radiasi sinar UV-Vis. Ketika senyawa kompleks menyerap
radiasi, elektron dari ligan berpindah ke ion logam atau sebaliknya. Transisi ini
meliputi promosi elektron dari level π dalam ligan atau dari orbital ikatan σ
menuju orbital kosong (unoccupied orbital) dari ion logam, atau promosi elektron
ikatan σ menuju orbital π yang kosong dari ligan (Christian, 2004).
H. Parameter Validitas Metode Analisis
Validasi metode analisis diperlukan untuk menjamin bahwa prosedur
yang dilakukan dengan cara yang benar memberikan hasil yang sesuai dengan
tujuan analisis (Anonim, 2004a). Parameter yang harus dipenuhi suatu metode
agar dinyatakan valid adalah akurasi, presisi, spesifisitas, batas deteksi, batas
kuantitasi, linearitas dan range (Anonim, 2004b).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
17
1. Akurasi
Akurasi merupakan kedekatan nilai terukur dengan nilai sebenarnya.
Akurasi metode analisis ditetapkan dalam range metode tersebut (Anonim,
2004b). Akurasi dihitung sebagai persen perolehan kembali (% recovery) .
Ada tiga metode penentuan akurasi :
a. Menganalisa sampel yang telah diketahui konsentrasinya dan membandingkan
nilai terukur dengan nilai sebenarnya.
b. Spiked – placebo recovery method. Sejumlah zat aktif murni ditambahkan
pada blanko formulasi (formula tanpa zat aktif) dan hasil analisis
dibandingkan dengan nilai teoritis.
c. Metode standar adisi. Pada metode ini, suatu sampel dianalisis, sejumlah zat
aktif murni ditambahkan lalu dianalisis kembali. Perbedaan dua hasil analisis
tersebut dibandingkan dengan hasil teoritis.
(Anonim, 2004a)
2. Presisi
Presisi menyatakan kedekatan hasil analisis satu dengan yang lain ketika
dilakukan pada sampel yang sama dan homogen. Standar deviasi atau standar
deviasi relatif (RSD), disebut juga koefisien variansi (CV), digunakan untuk
menyatakan presisi (Anonim, 2004b).
3. Spesifisitas
Spesifisitas didefinisikan sebagai kemampuan untuk membedakan dan
mengukur suatu analit dari komponen-komponen lain yang ada dalam sampel
(Anonim, 2004b). Spesifisitas harus dibuktikan dengan data yang menyatakan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
18
ketiadaan senyawa pengganggu yang mengacaukan hasil analisis seperti senyawa
pengotor (impurities), degradasi produk atau komponen lain dalam sampel
(Anonim, 2004a).
4. Batas deteksi
Batas deteksi merupakan jumlah analit terendah yang masih dapat
dideteksi namun tidak dapat dikuantifikasi dengan nilai yang tepat. (Anonim,
2004b).
5. Batas kuantitasi
Batas kuantitasi merupakan kadar terendah suatu analit yang masih dapat
dihitung dan memberikan akurasi dan presisi yang dapat diterima (Anonim,
2004b).
6. Linearitas
Linearitas merupakan kemampuan suatu metode analisis untuk
mendapatkan hasil uji yang secara langsung proporsional dengan jumlah analit
dalam sampel (Mulya dan Hanwar, 2003). Linearitas ditentukan dengan membuat
plot hubungan antara kadar dengan respon analisis lalu ditentukan koefisien
korelasi antar keduanya (Anonim, 2004a).
7. Range
Range merupakan rentang kadar terendah dan tertinggi suatu analit yang
masih dapat dihitung dan memberikan akurasi dan presisi yang baik. Range
memiliki satuan yang sama dengan satuan yang digunakan pada hasil analisis
(Anonim, 2004b).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
19
Tabel III. Kategori metode analisis dan persyaratan validasi Kategori I II III IV Kuantitatif Limit test Akurasi Ya Ya * * Tidak Presisi Ya Ya Tidak Ya Tidak
Spesifisitas Ya Ya Ya * Ya Batas deteksi Tidak Tidak Ya * Tidak
Batas kuantitasi Tidak Ya Tidak * Tidak Linearitas Ya Ya Ya * Tidak
Range Ya Ya * * Tidak * Mungkin dibutuhkan tergantung sifat dari metode analisis
United States Pharmacopeia (USP) 28 membedakan metode analisis
menjadi 4 kategori dan masing-masing kategori memiliki persyaratan parameter
validasi yang berbeda.
a. Kategori I merupakan metode analisis kuantitatif untuk senyawa murni obat
dan zat aktif termasuk pengawet dalam sediaan farmasi
b. Kategori II mencakup metode analisis kualitatif dan kuantitatif untuk
menganalisis senyawa pengotor dan produk hasil degradasi dalam sediaan
farmasi
c. Kategori III meliputi metode analisis untuk menentukan karakteristik suatu
sediaan farmasi, seperti kecepatan disolusi dan kecepatan pelepasan obat.
d. Kategori IV mencakup uji identifikasi
Tabel III menunjukkan keempat kategori tersebut beserta kebutuhan
parameter validitasnya.
I. Keterangan Empiris
Senyawa flavonoid dapat membentuk kompleks berwarna dengan
aluminium klorida dalam suasana asam yang intensitas warnanya sebanding
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
20
dengan kadar flavonoid. Teh hijau mengandung polifenol yang merupakan
senyawa golongan flavonoid. Maka analisis kuantitatif dengan pereaksi
aluminium klorida dapat digunakan pada sampel sediaan gel teh hijau.
Gel tersusun atas padatan berupa polimer yang terdispersi dalam medium
pendispers. Penggunaan pelarut yang tidak melarutkan padatan terdispersi namun
melarutkan medium terdispersi mampu memisahkan kedua komponen gel
tersebut.
Keterangan empiris yang ingin diperoleh dari penelitian ini adalah akurasi
dan presisi metode kolorimetri dengan pereaksi aluminium klorida untuk
penetapan kadar flavonoid total dalam sediaan gel teh hijau.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
21
BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini termasuk penelitian non-eksperimental rancangan deskriptif
karena tidak ada manipulasi yang dilakukan terhadap subyek uji.
B. Variabel Penelitian
Variabel dalam penelitian ini adalah kadar kuersetin yang diukur dengan
metode kolorimetri dengan pereaksi aluminium klorida.
C. Definisi Operasional
1. Flavonoid total yang dimaksud dalam penelitian ini adalah semua flavonoid
dalam sediaan gel teh hijau yang dapat membentuk kompleks dengan
aluminium klorida
2. Sediaan gel teh hijau yang digunakan dalam penelitian ini adalah formula hasil
penelitian Wijayanti (2008) dengan komponen CMC-Na, propilen glikol,
metil paraben, asam sitrat, fraksi teh hijau dan aquades
3. Kadar flavonoid total dalam sediaan gel teh hijau dinyatakan sebagai kadar
flavonoid ekuivalen dengan kuersetin.
4. Akurasi dinyatakan sebagai % recovery
5. Presisi dinyatakan sebagai koefisien variansi (CV)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
22
D. Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan meliputi baku kuersetin p.a (Sigma), etil asetat p.a
(J.T. Bakker), aseton p.a (Merck), HCl p.a (J.T. Bakker), AlCl3.6H2O p.a (Merck),
etanol farmasetis (Brataco), heksamin farmasetis (MKR), natrium sitrat farmasetis
(MKR), aquadest. Sampel yang digunakan adalah gel teh hijau hasil penelitian
Wijayanti (2008).
E. Alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi alat-alat gelas (Pyrex-
Germany), spektrofotometer Uv-Vis (Perkin-Elmer Lambda 20), waterbath (Abo-
Tech), alat ultrasonik (Retsch tipe T 460 No. V935922013 EY), micropipet 0,5 –
5,0ml (Socorec), neraca analitik BP 160P, neraca analitik Scaltec SBC 22
readibility 0,01 mg.
F. Tata Cara Penelitian
1. Pembuatan pelarut dan pereaksi
a. Larutan asam klorida 25% dalam aquadest. Akuades sebanyak 10 ml
ditambahkan asam klorida sebanyak 66,7 ml dalam labu takar 100,0 ml. Larutan
tersebut ditambahkan akuades hingga tanda.
b. Larutan heksamin 0,5% dalam aquadest. Heksamin sebanyak 0,5
gram dilarutkan dengan akuades dalam labu takar 100,0 ml sampai tanda.
c. Larutan natrium sitrat 0,5% dalam aquadest. Natrium sitrat sebanyak
0,5 gram dilarutkan dengan akuades dalam labu takar 100,0 ml sampai tanda.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
23
d. Larutan asam asetat 5% dalam metanol. Asam asetat glasial sebanyak
25,0 ml ditambahkan metanol p.a dalam labu takar 500,0 ml sampai tanda.
e. Larutan aluminium klorida dalam asam asetat 5% dalam metanol.
Serbuk aluminium klorida sebanyak 2 gram ditambahkan 25 ml asam asetat 5%
dalam metanol dalam labu takar 100,0 ml, lalu dilakukan degassing selama 5
menit untuk membantu melarutkan aluminium klorida. Larutan tersebut
ditambahkan asam asetat 5% dalam metanol sampai tanda. Larutan ini dibuat
sehari sebelumnya dan disimpan dalam botol coklat dan ditutup rapat (Mabry,
1970).
2. Pembuatan sampel
Sampel berupa basis gel teh hijau (tanpa fraksi teh hijau) dibuat sesuai
dengan formula hasil penelitian Wijayanti (2008).
3. Pembuatan blangko
Etil asetat sebanyak 5,0 ml dimasukkan ke dalam labu takar 25,0 ml lalu
ditambahkan 1,0 ml larutan AlCl3 2% (dalam asam asetat dalam metanol) dan 0,5
ml natrium sitrat 0,5%. Larutan tersebut ditambahkan asam asetat 5% dalam
metanol sampai tanda.
4. Pembuatan larutan baku
a. Larutan stok kuersetin 500 ppm. Baku kuersetin sebanyak 25,0 mg
yang ditimbang seksama ditambahkan 15 ml etil asetat dalam labu takar 50,0 ml,
lalu dilakukan degassing selama 5 menit untuk membantu melarutkan kuersetin.
Larutan tersebut ditambahkan etil asetat sampai tanda.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
24
b. Larutan intermediet kuersetin 50 ppm. Larutan stok kuersetin 500
ppm sebanyak 2,50 ml diencerkan dengan etil asetat dalam labu takar 25,0 ml
sampai tanda.
5. Penentuan Operating Time (OT)
Larutan intermediet kuersetin 50 ppm sebanyak 2,0 ml ditambahkan 1,0
ml larutan AlCl3 2% (dalam asam asetat dalam metanol) dan 0,5 ml natrium sitrat
0,5% dalam labu takar 25,0 ml,. Larutan tersebut ditambahkan asam asetat 5%
dalam metanol sampai tanda. Absorbansi diukur tiap 2 menit pada panjang
gelombang maksimum teoritis (428nm) selama 60 menit
6. Penetapan panjang gelombang maksimum
Larutan intermediet kuersetin 50 ppm masing-masing sebanyak 1,5; 3,0;
dan 4,0 ml dimasukkan ke dalam labu takar 25,0 ml. Masing-masing labu
ditambahkan 1,0 ml larutan AlCl3 2% (dalam asam asetat dalam metanol) dan 0,5
ml natrium sitrat 0,5%. Larutan tersebut ditambahkan asam asetat 5% dalam
metanol sampai tanda. Serapan diukur pada operating time pada rentang panjang
gelombang 400 – 500nm. Panjang gelombang maksimum ditentukan dari
spektrum yang dihasilkan.
7. Pembuatan kurva baku
Larutan intermediet kuersetin 50 ppm masing-masing sebanyak 1,5; 2,0;
2,5; 3,0; 3,5; dan 4,0 ml dimasukkan ke dalam labu takar 25,0 ml. Masing-masing
labu ditambahkan 1,0 ml larutan AlCl3 2% (dalam asam asetat dalam metanol)
dan 0,5 ml natrium sitrat 0,5%. Larutan tersebut diencerkan dengan asam asetat
5% dalam metanol sampai tanda. Serapan diukur setelah operating time pada
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
25
panjang gelombang maksimum. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali. Data yang
diperoleh dihitung menggunakan program regresi linear sehingga diperoleh
persamaan yang dapat digunakan untuk menghitung kadar kuersetin dalam
sampel.
8. Preparasi sampel
a. Pembuatan kuersetin 30 ppm dalam aseton. Baku kuersetin sebanyak
25,0 mg yang ditimbang seksama dilarutkan dengan 15 ml aseton dalam labu
takar 50,0 ml, lalu dilakukan degassing selama 5 menit untuk membantu
melarutkan kuersetin. Larutan tersebut sebanyak 1,5 ml ditambahkan aseton
dalam labu takar 25,0 ml sampai tanda.
b. Isolasi kuersetin. Basis gel teh hijau sebanyak 20 gram dimasukkan ke
dalam beker glass. Basis gel tersebut ditambah dengan 20,0 ml kuersetin 30 ppm
dalam aseton lalu dipindahkan ke dalam mortir. Basis gel digerus dengan stamper
hingga terbentuk endapan berwarna putih, kemudian fase cair dimasukkan
kedalam labu didih 250 ml. Aseton sebanyak 20 ml ditambahkan lagi ke dalam
ampas dan dilakukan penggerusan. Proses ini diulangi 2 kali lagi sehingga
digunakan 80 ml aseton. Proses isolasi telah selesai ketika terbentuk endapan
CMC yang berwarna putih dan tidak nampak lagi ada air yang terjebak dalam
matriks gel. Cairan yang ada di dalam labu didih 250 ml ditambahkan 2,0 ml HCl
25% dan 1,0 ml heksamin 0,5%. Dilakukan refluks pada suhu 60oC selama 30
menit dilanjutkan dengan penguapan seluruh aseton pada suhu 80oC. Waktu yang
dibutuhkan hingga semua aseton menguap kurang lebih 45 menit. Akuades
sebanyak 10 ml dan etil asetat sebanyak 15 ml ditambahkan ke dalam sisa
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
26
penguapan lalu dimasukkan ke dalam corong pisah. Setelah dilakukan
penggojogan kuat selama 15 detik, fase etil asetat ditampung dalam labu takar
25,0 ml. Fase air diekstraksi sekali lagi menggunakan 10 ml etil asetat. Fase etil
asetat dikumpulkan sebagai larutan sampel. Replikasi dilakukan sebanyak tujuh
kali.
9. Penetapan kadar flavonoid dalam sampel
Larutan sampel dalam etil asetat sebanyak 5,0 ml ditambahkan 1,0 ml
larutan AlCl3 2% (dalam asam asetat dalam metanol) dan 0,5 ml natrium sitrat
0,5% dalam labu takar 25,0 ml lalu. Larutan tersebut ditambahkan asam asetat 5%
dalam metanol hingga tanda.
Larutan didiamkan sampai masuk rentang operating time, lalu diukur
serapannya pada panjang gelombang maksimum. Prosedur yang sama dilakukan
pada replikasi yang lain.
G. Analisis Hasil
Validitas metode dianalisis menggunakan parameter-parameter berikut :
a. Akurasi
Akurasi dinyatakan dengan parameter % recovery dengan rumus :
% recovery kadar terukurkadar teoritis
×100%
b. Presisi
Presisi dinyatakan dengan parameter koefisien variansi (CV) dengan rumus :
CV = SDx
100%
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
27
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Optimasi Kondisi Pengukuran
Optimasi kondisi pengukuran dilakukan untuk memperoleh kondisi
pengukuran yang optimal. Kondisi yang optimal merupakan bagian tak
terpisahkan dari suatu metode analisis yang mampu memperkecil kesalahan
pengukuran. Dalam konteks penelitian ini, dilakukan optimasi pada dua kondisi
yaitu operating time dan panjang gelombang maksimum.
1. Penentuan operating time (OT)
Pembentukan warna hasil reaksi antara kuersetin dengan aluminium
klorida membutuhkan waktu tertentu agar diperoleh absorbansi optimum. Untuk
itu dilakukan penentuan operating time, yaitu suatu rentang waktu tertentu dimana
spektrum menunjukkan kurva absorbansi yang stabil (datar) sebagai tanda reaksi
pembentukan kompleks telah optimum.
Penentuan operating time ini penting untuk meminimalkan kesalahan.
Sebelum operating time reaksi pembentukan kompleks belum sempurna,
sedangkan setelah operating time dimungkinkan kompleks yang terbentuk sudah
rusak sehingga pengukuran di luar operating time dapat memberikan kesalahan
akibat absorbansi yang terbaca tidak menunjukkan nilai optimum.
Operating time ditentukan menggunakan larutan baku dengan kadar 4
ppm dan dilakukan pada panjang gelombang teoritis yaitu 428 nm (Mabry, 1970).
Pengukuran operating time dilakukan selama 60 menit sejak pereaksi Aluminium
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
28
klorida ditambahkan. Berdasarkan hasil pengukuran diperoleh operating time
pada rentang 30 – 45 menit. Spektrum operating time dapat dilihat pada gambar 7.
Gambar 10. Spektrum operating time kompleks kuersetin-AlCl3
2. Penentuan panjang gelombang maksimum
Hasil analisis dengan spektrofotometer dipengaruhi salah satunya oleh
panjang gelombang pengukuran. Pengukuran absorbansi pada panjang gelombang
maksimum dapat meningkatkan sensitivitas dan mengurangi kesalahan analisis.
Hal ini disebabkan pada panjang gelombang maksimum perbedaan konsentrasi
sedikit saja akan menimbulkan absorbansi yang berbeda (Rohman, 2007).
Pada penelitian ini, panjang gelombang maksimum ditentukan sebagai
verifikasi terhadap panjang gelombang maksimum teoritis (428 nm). Verifikasi ini
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
29
dibutuhkan karena ada kemungkinan hasil yang diperoleh akan berbeda karena
perbedaan waktu, alat, lingkungan, dan personalia penelitian. Farmakope
Indonesia IV (1995) memberikan batasan bahwa panjang gelombang maksimum
terukur tidak boleh berbeda lebih dari 2 nm terhadap panjang gelombang
maksimum teoritis.
Gambar 11. Spektrum panjang gelombang maksimum kompleks kuersetin-
AlCl3
Penentuan panjang gelombang serapan maksimum dilakukan pada tiga
konsentrasi larutan baku yaitu 3, 6, dan 8 ppm. Pengulangan pengukuran dengan
tiga konsentrasi berbeda ini bertujuan agar penarikan kesimpulan lebih
meyakinkan. Pengukuran dilaksanakan pada rentang 400 – 500 nm. Spektrum
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
30
pengukuran panjang gelombang maksimum (gambar 8) menunjukkan bahwa
panjang gelombang maksimum berada pada 427,4 nm. Perbedaan hasil dengan
panjang gelombang maksimum teoritis masih diterima sebab tidak melebihi 2 nm.
B. Pembuatan Kurva Baku
Kurva baku dibuat agar diperoleh persamaan yang dapat digunakan untuk
menghitung kadar kuersetin di dalam sampel. Kurva baku dibuat pada rentang
kadar 3 – 8 ppm. Menurut Anonim (2004a), untuk keperluan validasi metode
dibutuhkan sedikitnya kurva baku yang dibuat pada 6 konsentrasi.
Tabel IV menunjukkan tiga replikasi kurva baku yang diperoleh.
Koefisien korelasi ketiga kurva baku (r) menunjukkan nilai yang lebih besar
dibandingkan dengan harga r tabel dengan taraf kepercayaan 99%, yaitu 0,875
(De Muth, 1999). Untuk keperluan analisis kuantitatif dipilih kurva baku dengan
linearitas terbaik yaitu replikasi 2.
Tabel IV. Hubungan kadar kuersetin dengan absorbansi Replikasi I Replikasi II Replikasi III
Kadar (ppm) Absorbansi Kadar
(ppm) Absorbansi Kadar (ppm) Absorbansi
3,13 0,162 3,06 0,172 3,15 0,183 4,18 0,236 4,09 0,243 4,21 0,241 5,22 0,279 5,11 0,290 5,26 0,315 6,27 0,324 6,13 0,349 6,31 0,346 7,31 0,402 7,15 0,404 7,36 0,405 8,36 0,486 8,17 0,486 8,41 0,476
A -0,0248 A -0,0079 A 0,0152B 0,05912 B 0,05908 B 0,05402R 0,9926 R 0,9971 R 0,9960
Harga koefisien korelasi, atau sering disebut sebagai linearitas, yang
mendekati ±1 menunjukkan adanya hubungan yang proporsional antara
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
31
peningkatan kadar dengan absorbansi. Ini merupakan persyaratan berlakunya
hukum Lambert-Beer (Christian, 2004). Dengan demikian persamaan kurva baku
yang diperoleh dapat digunakan untuk menghitung kadar kuersetin dalam sampel.
Gambar 9 menunjukkan titik-titik pada kurva baku yang hampir membentuk garis
lurus, ini menunjukkan koefisien korelasi yang mendekati ±1.
Gambar 12. Kurva baku kuersetin
C. Preparasi Sampel
Preparasi sampel, dalam penelitian ini, merupakan aspek terpenting yang
akan mempengaruhi akurasi dan presisi hasil pengukuran kadar analit. Preparasi
sampel gel meliputi tiga bagian yaitu isolasi analit kuersetin dari dalam sampel
gel, dilanjutkan dengan hidrolisis dan isolasi aglikon yang telah terpisah dengan
gula dengan ekstraksi cair – cair.
0.000
0.100
0.200
0.300
0.400
0.500
0.600
0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00
Absorba
nsi
Kadar kuersetin (ppm)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
32
1. Isolasi analit dari sampel
Kekhasan dari bentuk sediaan gel adalah kemampuan zat terdispersinya
untuk memerangkap medium dispersinya. Kemampuan ini terutama disebabkan
kemampuan zat terdispersi yang berupa polimer untuk membentuk cross link yang
menghasilkan suatu matriks (Zatz and Kushla, 1996).
Ikatan hidrogen dalam natrium carboxymethylcellulose bertanggung
jawab dalam pembentukan cross link. Cross link yang disebabkan oleh ikatan
hidrogen dikenal sebagai physical cross link atau non-kovalen cross link. Natrium
carboxymethylcellulose membentuk tipe cross link yang sering disebut random
coil. Cross link dalam natrium carboxymethylcellulose dapat dilihat pada gambar
13.
Gambar 13. Ikatan hidrogen natrium carboxymethylcellulose membentuk
cross link
Zat aktif merupakan komponen gel yang larut atau bercampur dalam
medium dispersi. Untuk menarik zat aktif keluar dari sistem gel maka medium
dispersi perlu dibebaskan dari matriks zat terdispersi.
Natrium carboxymethylcellulose (CMC-Na) adalah zat terdispersi dalam
formula gel teh hijau yang digunakan sebagai sampel. Untuk menarik medium
dispersi (air) dari matriks CMC-Na, digunakan aseton. Alasan digunakan aseton
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
33
adalah air dapat bercampur dengan aseton dan flavonoid sendiri mempunyai
kelarutan yang baik di dalam aseton (Drużyńska et al., 2007; Chebil et al., 2007),
sedangkan CMC-Na sendiri praktis tidak larut dalam aseton. Mekanisme isolasi
ini berbeda dengan peristiwa syneresis, yaitu keluarnya medium dispersi dari
matriks gel, yang secara alami terjadi pada gel yang tidak stabil. Keluarnya
medium dispersi pada peristiwa syneresis disebabkan gaya tarik matriks gel
mendorong medium dispersi keluar dari sistem gel, pada proses isolasi ini
keluarnya medium dispersi karena ditarik oleh aseton.
Untuk menarik medium dispersi dari sampel seberat 20 gram dibutuhkan
80 ml aseton yang dilakukan dalam empat tahap masing-masing 20 ml. Perubahan
bobot sampel akan mengubah volume aseton yang diperlukan. Ini berkaitan
dengan kejenuhan campuran air dan aseton, makin banyak air yang harus ditarik
makin banyak aseton yang diperlukan untuk menarik.
Penggunaan kekuatan mekanik juga dibutuhkan pada proses ini. Kontak
antara aseton dengan permukaan gel menyebabkan matriks CMC-Na di
permukaan menyusut dan menghalangi penetrasi aseton ke bagian dalam gel.
Untuk mempermudah penetrasi aseton, digunakan tenaga mekanik yang dalam
penelitian ini berupa penggerusan dengan mortir dan stamper.
Akhir dari proses isolasi ini ditunjukkan secara subyektif dengan tidak
adanya air yang terjebak dalam matriks gel dan terbentuknya endapan CMC-Na.
Hal ini dapat dilihat pada gambar 14.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
34
Keterbatasan dari proses isolasi ini terletak pada subyektivitasnya yang
tinggi. Subyektivitas ditemui dalam proses penggerusan dengan mortir, hasil yang
berbeda mungkin dapat ditemui pada peneliti yang berbeda.
Gambar 14. Endapan CMC-Na yang terbentuk pada akhir proses isolasi
2. Tahap hidrolisis
Hidrolisis dibutuhkan untuk memecah glikosida sehingga dihasilkan
aglikon flavonoid. Penggunaan baku berbentuk aglikon kuersetin sebenarnya tidak
membutuhkan tahap hidrolisis. Tahap ini dikerjakan pada baku untuk
menyamakan perlakuan dengan sampel gel yang mengandung fraksi teh hijau. Hal
ini dikarenakan sebagian besar flavonoid yang ditemukan dalam teh hijau terikat
sebagai glikosida terutama pada atom C3 dan C4’ yang merupakan gugus
potensial untuk reaksi dengan aluminium klorida (Anonim, 1999).
Kandungan flavonoid dalam teh merupakan golongan flavonoid-O-
glikosida yang dapat terhidrolisis dengan waktu yang relatif singkat. Menurut
Anonim (1999), glikon yang terikat pada flavonoid dalam teh adalah jenis
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
35
glukosida, galaktosida dan rhamnosida. Ketiga jenis glikon tersebut terhidrolisis
dalam waktu kurang dari 30 menit pada suasana asam (Markham, 1982).
O OH
OH
OH
O
O
OH
OHHO
O
O
OOH
HO
OH
OH
HO OH
OH
OH
O
O
OH
OHHO
O
O
OOH
HO
OH
OH
OH
HCl+ H2O +
rutin
kuersetin
rutinosida
C3
Gambar 15. Reaksi hidrolisis flavonoid
Prosedur hidrolisis yang digunakan dalam penelitian ini mengacu pada
penelitian Pertiwi (2006). Prosedur hidrolisis tersebut menggunakan asam klorida
untuk menghidrolisis flavonoid dalam medium aseton. Heksamin yang juga
ditambahkan dalam sistem hidrolisis digunakan untuk menangkap kelebihan ion
H+. Reaksi hidrolisis ditunjukkan pada gambar 15.
3. Ekstraksi cair – cair
Sampel yang telah dihidrolisis merupakan campuran senyawa flavonoid
yang larut dalam aseton dan glikon yang larut air. Campuran dua macam senyawa
yang berbeda sifat kelarutannya ini dikhawatirkan menimbulkan masalah ketika
dilakukan pengukuran dengan spektrofotometer, yaitu adanya endapan glikon di
dalam larutan sampel sehingga mengganggu pembacaan absorbansi.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
36
Ekstraksi cair – cair dengan corong pisah dipilih sebagai metode untuk
memisahkan kedua senyawa yang berbeda sifat kelarutan tersebut. Sistem Etil
asetat - air digunakan karena keduanya tidak bercampur, dan flavonoid sendiri
larut dalam etil asetat.
Aseton yang terdapat dalam sistem hidrolisis, mampu bercampur baik
dengan air maupun dengan etil asetat. Pada tahap orientasi diketahui bahwa
keberadaan aseton menyebabkan pemisahan kedua fase tidak optimal dan tidak
reprodusibel. Fenomena ini dapat disebabkan karena indeks polaritas aseton dan
etil asetat yang tidak terlalu berbeda, sehingga dapat bercampur pada saat
dilakukan ekstraksi cair – cair. Aseton memiliki indeks polaritas 5,1 sedangkan
etil asetat 4,4. Karena itu sebelum dilakukan ekstraksi cair – cair seluruh aseton
diuapkan.
D. Penetapan Kadar Flavonoid dalam Sampel
Hingga akhir proses preparasi sampel, belum diperoleh senyawa
flavonoid yang murni. Metil paraben yang lebih larut dalam pelarut organik masih
ditemukan dalam fase etil asetat yang digunakan sebagai larutan sampel (gambar
16). Kedua senyawa ini, aglikon flavonoid dan metil paraben, memberikan
serapan pada daerah UV, sehingga penetapan kadar pada daerah UV tidak
dimungkinkan.
Reaksi aluminium klorida dengan aglikon flavonoid menyebabkan
pergeseran panjang gelombang serapan dari aglikon flavonoid, sehingga senyawa
kompleks yang terbentuk memberikan serapan pada daerah visibel. Pada panjang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
37
gelombang visibel, metil paraben sudah tidak memberikan serapan lagi, sehingga
penetapan kadar dapat dilakukan tanpa adanya senyawa pengganggu.
Gambar 16. Alur pengerjaan sampel gel
Pada penelitian ini, reaksi pembentukan kompleks berlangsung dalam
suasana asam yang berasal dari pelarut asam asetat dalam metanol. Untuk
mempertahankan pH asam dalam sistem, maka digunakan natrium sitrat yang
ditambahkan sesaat setelah penambahan aluminium klorida sebagai buffer.
Senyawa berwarna yang terukur dalam penelitian ini merupakan
kompleks aluminium dengan gugus hidroksi fenolik yang bertetangga dengan
gugus karbonil dan gugus orto dihidroksi fenolik. Kompleks aluminium dengan
gugus orto dihidroksi fenolik masih terbentuk pada kondisi ini, meskipun gugus
tersebut tidak tahan asam. Hal ini dikarenakan asam yang digunakan adalah asam
Hidrolisis, dan ekstraksi cair - cair
Fase padat : endapan CMC-Na
Gel
Isolasi dengan aseton
Fase cair : - air - etanol - propilenglikol - asam Sitrat - metilparaben - flavonoid
Fase etil asetat : - metilparaben - flavonoid
Fase air : - asam Sitrat - glikon
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
38
lemah dengan konsentrasi yang rendah. Markham (1982) menerangkan
penggunaan asam klorida pekat untuk memutus kompleks aluminium dengan
gugus orto dihidroksi fenolik.
E. Analisis Validitas Metode
Penetapan kadar flavonoid total dalam sediaan gel termasuk dalam
metode analisis kategori I (Anonim, 2004b). Kategori I mensyaratkan parameter
validasi metode spesifisitas, akurasi, presisi, linearitas, dan range. Parameter-
parameter yang dapat diperoleh melalui penelitian ini adalah sebagai berikut :
1. Spesifisitas
Informasi mengenai spesifisitas metode diperoleh melalui studi pustaka
mengenai kemungkinan reaksi aluminium klorida dengan komponen-komponen
gel yang lain. Komponen-komponen gel yang lain tidak memiliki gugus-gugus
yang dapat bereaksi dengan aluminium klorida sehingga dapat dikatakan bahwa
metode ini spesifik hanya akan menetapkan kadar flavonoid dalam sediaan gel.
Tabel V. Data % recovery dan koefisien variansi metode
Replikasi Kadar Terukur (%)
Kadar Teoritis (%) % recovery
1 0.002753 0.002925 94,13 2 0.002568 0.002893 88,77 3 0.002789 0.003024 92,22 4 0.002553 0.002956 86,36 5 0.002872 0.003044 94,35 6 0.002982 0.003057 97,54 7 0.002382 0.002828 84,25
rata-rata 91,09 SD 4,78 CV 5,25
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
39
2. Akurasi
Akurasi metode ditentukan berdasarkan nilai % recovery. Metode
penentuan recovery yang digunakan pada penelitian ini adalah spiked – placebo
recovery method. Anonim (2004a) memberikan batasan % recovery yang diterima
untuk sampel di bawah 0,1% adalah 75 – 125%. Tabel V menunjukkan %
recovery dari metode sebesar 91,09 ± 4,78%. Hasil ini menunjukkan bahwa
metode penetapan kadar masih memenuhi rentang % recovery yang
dipersyaratkan.
3. Presisi
Level presisi yang berlaku dalam penelitian ini adalah repeatability.
Level presisi ini meliputi kesalahan yang mungkin terjadi pada tahap preparasi
sampel seperti penimbangan, pengenceran, dan ekstraksi pada kondisi penelitian
yang sama (personalia, alat, waktu, dan laboratorium yang sama). Untuk
penentuan repeatability setidaknya dibutuhkan enam sampel (Ermer, 2005).
Repeatability dinyatakan sebagai koefisien variansi (CV). CV dari
metode dapat dilihat pada tabel V. Menurut Anonim (2004a) CV yang masih
diterima untuk sampel dengan kadar dibawah 0,1% adalah 20%, sedangkan
metode ini memberikan CV sebesar 5,25 %. Dengan demikian, CV dari metode
yang diteliti masih dapat diterima.
4. Linearitas
Parameter linearitas diperoleh melalui informasi tentang koefisien
korelasi yang diperoleh dalam pembuatan kurva baku. Anonim (2004a)
memberikan batasan koefisien korelasi yang dapat diterima untuk analisis
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
40
kuantitatif adalah sebesar 0,99. Kurva baku yang dibuat pada konsentrasi antara 3
– 8 ppm menghasilkan koefisiean korelasi sebesar 0,9971 menunjukkan bahwa
metode ini memberikan linearitas yang baik.
Akurasi dan presisi, yang menjadi parameter utama dalam penelitian ini,
terutama dipengaruhi oleh preparasi sampel. Tahap preparasi sampel yang
semakin panjang berpotensi menurunkan kualitas akurasi dan presisi metode
karena kemungkinan terjadinya kesalahan juga meningkat.
Validasi metode yang dilakukan Pertiwi (2006) menghasilkan akurasi
yang lebih baik dibandingkan penelitian ini, tetapi presisi yang dihasilkan sama.
Rentang % recovery pada penelitian tersebut antara 98, 51 – 101, 99 %,
sedangkan penelitian ini menghasilkan % recovery pada rentang 84,25 – 97,54 %.
Penurunan akurasi ini dipengaruhi oleh preparasi sampel yang lebih panjang dan
penggunaan sediaan farmasi (gel). Pertiwi (2006) melakukan validasi metode
penetapan kadar dengan sampel berupa baku kuersetin. Validasi metode yang
dilakukan Pertiwi (2006) menghasilkan CV pada rentang 4,11 – 8, 28 %,
sedangkan pada penelitian ini dihasilkan CV 5,25%.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
41
BAB V
KESIMPULAN, SARAN DAN KETERBATASAN
A. Kesimpulan
Metode kolorimetri dengan pereaksi aluminium klorida memberikan
akurasi dan presisi yang baik untuk penetapan kadar flavonoid total terhitung
kuersetin pada sediaan gel teh hijau.
B. Saran
Penelitian ini perlu dilanjutkan dengan penelitian penetapan kadar
flavonoid total dalam sediaan gel teh hijau.
C. Keterbatasan
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini merupakan aglikon
flavonoid sedangkan di alam flavonoid ditemukan sebagai glikosida.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
42
DAFTAR PUSTAKA
Amidon, G.E., 2005, Citric Acid Monohydrate, http://www.medicinescomplete.com/mc/excipients/current/ 1000293169.htm, diakses tanggal 24 Agustus 2007
Amiji, M. M., 2003, Complexation and Protein Binding, in Brown M., and Sheinis, L. A., Applied Physical Pharmacy, 200-201, The McGraw-Hill Companies, Inc., USA
Anonim, 1995, Farmakope Indonesia, edisi IV, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta
Anonim, 1999, Assay Camellia Sinensis #1, http://ukcrop.net/perl/ace/enh_tree/PhytochemDB?name=Camellia%20sinensis%20%231&class=Assay&expand=Result#Result, diakses tanggal 23 Oktober 2007
Anonim, 2004a, Guidelines For the Validation of Analytical Methods For Active Constituent, Agricultural and Veterinary Chemical Products, Australian Pesticides & Veterinary Medicines Authority, Australia
Anonim, 2004b, The United States Pharmacopeia 28, the United States Pharmacopeial Convention, Inc
Anonim, 2005, Material Safety Datasheet Quercetin Dihydrate MSDS, http://www.sciencelab.com/xMSDS-Quercetin_Dihydrate-9924781, diakses tanggal 27 Oktober 2007
Brady, J. E., 1998, General Chemistry Princples & Structure, 5th Ed., Jilid 1, diterjemahkan oleh Sukmariah Maun, Kamianti Anas, dan Tilda S. Sally, 455, Binarupa Aksara, Jakarta
Bruneton, J., 1993, Pharmacognosy Phytochemistry Medicinal Plants, 2nd Ed., translated by Caroline K. Hatton, 1076-1077, Intercept Ltd., Londress, Lavoisier Publishing, Paris
Cairns, D., 2003, Essential of Pharmaceutical Chemistry, 2nd edition, 151; 154, Pharmaceutical Press, Great Britain
Chebil, L., Humeau, C., Anthoni, J., Dehez, F., Engasser, J., and Ghoul M., 2007, Solubility of Flavonoids in Organic Solvents, J. Chem. Eng. Data , 52, 1552-155
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
43
Christian, G. D., 2004, Analytical Chemistry, 6th Ed., 468, John Wiley & Sons, Inc., USA
De Muth, J.E., 1999, Basic Statistics and Pharmaceutical Statistical Applications, 585, Marcel Dekker, Inc., USA
Drużyńska, D., Stepniewska, A., Wołosiak, R., 2007, The Influence of Yime and Type of Solvent on Efficiency of the Extraction of Polyphenols from Green Tea and Antioxidant Properties Obtained Extracts, Acta Sci. Pol., Technol. Aliment. 6(1), 27-36
Ermer, J. and Miller, J. H. McB., 2005, Method Validation in Pharmaceutical Analysis, 32, Wiley - VCH Verlag GmbH & Co. KGaA
Fell, A.F., 1986, UV and Visible Fluorescence Spectrophotometric, in Wade (Ed), Clarke’s Isolation and Identification of Drug, 2nd Ed., 222-225, The Pharmaceutical Press, London
Gillard, P., Pope, C., and Bore, P., 1985, Applications of Spectral Analysis of Polymers in Cosmetics, dalam Bore, P., Cosmetic Analysis: Selective Methods and Techniques, 16-27, Marcell-Dekker, Inc., United States of America
Johnsons. R., and Steer, R., 2005, Methylparaben, http://www.medicinescomplete.com/mc/excipients/current/ 1000293170.htm, diakses tanggal 24 Agustus 2007
Mabry, T. J., Markham, K. R., and Thomas, M. B., 1970, The Systematic Identification of Flavonoids, 35, Springer-Verlag, Berlin
Markham, K.R., 1982, Techniques of Flavonoid Identification, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, 5, 25, 47, Penerbit ITB, Bandung
Mulya, M. dan Hanwar, D., 2003, Prinsip-prinsip Cara Berlaboratorium yang Baik (Good Laboratory Practice), Majalah Farmasi Airlangga, Vol. III No.2, 71-76
Owen, S.C., 2005, Alcohol, http://www.medicinescomplete.com/mc/excipients/current/ 1000293170.htm, diakses tanggal 24 Agustus 2007
Owen, S.C., and Weller, P.J., 2005, Propylene Glycol, http://www.medicinescomplete.com/mc/excipients/current/ 1000303976.htm, diakses tanggal 24 Agustus 2007
Parsons, D., 2005, Carboxymethylcellulose Sodium, http://www.medicinescomplete.com/mc/excipients/current/1000295789.htm, diakses tanggal 24 Agustus 2007
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
44
Pertiwi, M.V., 2006, Penetapan Kadar Flavonoid Total Terhitung Sebagai Kuersetin dengan Menggunakan Metode Kolorimetri dalam Teh Hijau dan Teh Hitam [merkX], Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta
Riyanto, S., 1990, Flavonoid, dalam Mursyidi, A. (Ed), Analisis Metabolit Sekunder, 172; 175, Pusat Antar Universitas Bioteknologi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta
Robinson, T., 1991, Kandungan Organik Tumbuhan tinggi, 6th Ed., 208, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, Penerbit ITB, Bandung
Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, 251-252, Pustaka Pelajar, Yogyakarta
Svobodova, A., Psotova, J., and Walterova, D., 2003, Natural phenolics in prevention of UV-Induced Skin Damage (A review), Biomed. Papers, 147(2), 137-145
Swarbick, J., and Boylan, J.C., 1992, Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, jilid 15, 415, Marcel Dekker Inc., Nem York
Syah, A.N.A., 2006, Taklukkan Penyakit dengan Teh Hijau, 46, AgroMedia Pustaka, Jakarta
Wijayanti, L.R., 2008, Optimasi Formula Gel Sunscreen Ekstrak Kering Polifenol Teh Hijau (Camellia sinensis (L.)) dengan CMC (Carboxymethylcellulose) Sebagai Gelling Agent dan Propilen Glikol Sebagai Humektan dengan Metode Desain Faktorial, Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta
Zatz, J.L., and Kushla, G.P., 1996, Gels, in Lieberman, H.A., Rieger, M.M., and Banker, G.S., Pharmaceutical Dosage Forms Disperse Systems, Volume 2, 2nd edition, Marcel Dekker, Inc., USA
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
45
Lampiran 1. Penimbangan dan contoh perhitungan kadar larutan baku
I II III Kertas 0,2029 0,1996 0,1963 Kertas + zat 0,22943 0,22506 0,22226 Kertas + sisa 0,20331 0,19952 0,19665 Zat 0,02612 0,02554 0,02561
Contoh perhitungan kadar larutan baku (replikasi II)
Kuersetin dilarutkan dalam etil asetat hingga volume 50,0 ml (larutan stok)
25,54 mg50,0 ml
= 51,08 mg100 ml
= 510,8 mg1000 ml
= 510,8 ppm
Diambil 2,5 ml larutan stok diencerkan dengan etil asetat hingga volume 25,0 ml
(larutan intermediet)
510,8 ppm × 2,5 ml = X ppm × 25,0 ppm
X = 510,8 ppm × 2,5 ml
25,0 ml
= 51,08 ppm
Dipipet 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; dan 4,0 ml, ditambahkan pereaksi dan
diencerkan dengan pelarut hingga volume 25,0 ml
Kadar I = 51,08 ppm × 1,0 ml
25,0 ml
= 2,04 ppm
Kadar II = 51,08 ppm × 1,5 ml
25,0 ml
= 3,06 ppm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
46
Kadar III = 51,08 ppm × 2,0 ml
25,0 ml
= 4,09 ppm
Kadar IV = 51,08 ppm × 2,5 ml
25,0 ml
= 5,11 ppm
Kadar V = 51,08 ppm × 3,0 ml
25,0 ml
= 6,13 ppm
Kadar VI = 51,08 ppm × 3,5 ml
25,0 ml
= 7,15 ppm
Kadar VII = 51,08 ppm × 4,0 ml
25,0 ml
= 8,17 ppm
Dua replikasi yang lain dihitung dengan cara yang sama
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
47
Lampiran 2. Penimbangan dan contoh perhitungan kadar teoritis sampel
1 2 3 4 5 6 7 Kertas 0,1936 0,1986 0,1963 0,1960 0,1972 0,1955 0,1974 Kertas + zat 0,21895 0,22348 0,22226 0,22167 0,22278 0,22114 0,22280Kertas + sisa 0,19358 0,19886 0,19665 0,19616 0,19728 0,19639 0,19822Zat 0,02537 0,02462 0,02561 0,02551 0,02550 0,02575 0,02458Basis gel 20,818 20,424 20,324 20,709 20,103 20,217 20,863
Contoh perhitungan kadar kuersetin dalam sampel (replikasi 1)
Kuersetin dilarutkan dalam aseton hingga volume 50,0 ml
25,37 mg50,0 ml
50,74 mg100 ml
507,4 mg1000 ml
507,4 ppm
Diambil 1,5 ml diencerkan hingga volume 25,0 ml
507,4 ppm x 1,5 ml = X ppm x 25,0 ml
X = 507,4 ppm × 1,5 ml
25,0 ml
= 30,444 ppm
Diambil 20,0 ml lalu dicampurkan dalam basis gel, sehingga jumlah kuersetin
yang ditambahkan kedalam basis gel adalah :
30,444 mg1000,0 ml
0,609 mg20,0 ml
Jadi di dalam basis gel terdapat 0,609 mg kuersetin. Kadarnya adalah:
0,609 mg20,818 g
0,002925 g100 g
0,002925%
Enam replikasi yang lain dihitung dengan cara yang sama.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
48
Lampiran 3. Data dan contoh perhitungan % recovery
Replikasi Absorbansi Nilai X Kadar terukur (%)
Kadar teoritis (%) % recovery
1 0,263 4,5853 0.002753 0.002925 94,13 2 0,240 4,1960 0.002568 0.002893 88,77 3 0,260 4,5345 0.002789 0.003024 92,22 4 0,242 4,2299 0.002553 0.002956 86,36 5 0,265 4,6192 0.002872 0.003044 94,35 6 0,277 4,8223 0.002982 0.003057 97,54 7 0,227 3,9760 0.002382 0.002828 84,25 Rata-rata 91,09 SD 4,784
Contoh perhitungan % recovery (replikasi 1)
Nilai X dihitung dari persamaan kurva baku Y = 0,05908X - 0,0079
0,263 = 0,05908X – 0,0079
X = 0,263 + 0,0079
0,05908
= 4,5853 ppm
Nilai X merupakan kadar kuersetin hasil pengenceran 5 ml larutan sampel dengan
pereaksi AlCl3, Na sitrat, dan pelarut asam asetat dalam metanol hingga volume
25,0 ml. Maka kadar kuersetin dalam larutan sampel adalah :
4,5853 ppm × 255
= 22,9265 ppm = 22,93 ppm
Jumlah kuersetin terukur dalam basis gel:
22,93 mg1000,0 ml
0,573 mg25,0 ml
Kuersetin terukur dalam basis gel sebanyak 0,573 mg. Kadarnya adalah :
0,573 mg20,818 g
=0,002753 g
100 g= 0,002753%
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
49
Perhitungan % recovery :
% recovery = ,,
× 100%
= 94,13 %
Enam replikasi yang lain dihitung dengan cara yang sama.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
50
Lampiran 4. Perhitungan koefisien variansi (CV)
Replikasi x x2 1 94,13 8860,46 2 88,77 7880,11 3 92,22 8504,53 4 86,36 7458,05 5 94,35 8901,92 6 97,54 9514,05 7 84,25 7098,06 ∑ 637,62 58217,18
Perhitungan Rata-rata (x)
x = ∑
= 637,62
7 = 91,09
Perhitungan Standar Deviasi (SD)
SD = ∑ ∑
= 7(58217,18 ,
7(7-1) = 4,784
Perhitungan Koefisien Variansi (CV)
CV = SD
= 4,78491,09
×100% = 5,25%
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
51
Lampiran 5. Gambar endapan CMC-Na yang terbentuk
(a) Endapan yang terbentuk pada waktu isolasi dengan 40 ml aseton
(b) Endapan yang terbentuk pada waktu isolasi dengan 80 ml aseton
Proses isolasi yang telah selesai ditunjukkan dengan tidak adanya air yang terjebak dalam matriks gel seperti gambar (b)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
52
BIODATA PENULIS
Penulis skripsi berjudul VALIDASI METODE
KOLORIMETRI DENGAN PEREAKSI
ALUMINIUM KLORIDA UNTUK PENETAPAN
KADAR FLAVONOID TOTAL DALAM SEDIAAN
GEL BASIS NATRIUM
CARBOXYMETHYLCELLULOSE ini bernama
lengkap Laurentius Dian Ardiyanto. Penulis dilahirkan
di Yogyakarta pada tanggal 3 Februari 1986 sebagai
anak pertama dari pasangan Robertus Rudy Suselo dan Maria Magdalena Gani
Linarti.
Pendidikan formal yang pernah ditempuh penulis adalah SD Pangudi
Luhur Yogyakarta (tahun 1992 hingga tahun 1998), SLTP Negeri 5 Yogyakarta
(tahun 1998 hingga tahun 2001), SMU Negeri 1 Yogyakarta (tahun 2001 hingga
tahun 2004). Pada tahun 2004 penulis melanjutkan studi di Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma. Selama kuliah, penulis pernah mengikuti beberapa
kepanitiaan. Penulis juga aktif menjadi asisten beberapa mata praktikum.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
top related