ocupaÇÃo cientifica nas fÉrias 12 - 23 julho 2010 influência dos mirnas na activação da...

OCUPAÇÃO CIENTIFICA NAS FÉRIAS12 - 23 JULHO 2010

Influência dos miRNAs na activação da microgliaCoordenação : Doutora Ana Luísa Cardoso

Juliana Simões

Beatriz Corte Real Martins

ÍNDICE

Introdução Actividades laboratoriais realizadas:

Plaqueamento de células Transfecção Western Blot Alamar Blue: Viabilidade Teste de Griess qRT-PCR: Extracção de RNA e Transcrição

Conclusão

INTRODUÇÃO

Durante estas duas semanas, realizámos experiências no âmbito do estudo da microglia. Este tipo de células, juntamente com os astrócitos e os neurónios, constituem os tipos celulares presentes no cérebro. A microglia é o conjunto celular responsável pela protecção do cérebro e desempenha funções de suporte, protecção e eliminação de possíveis ameaças.

Leg.1: Activação da Microglia

☺PLAQUEAMENTO DE CÉLULAS☺

Leg.2. Observação do hemocitómetro ao microscópio

Leg.3. Visualização de células ao microscópio

☺TRANSFECÇÃO ☺

* Objectivo: Introduzir um plasmídeo para expressar algo ( no nosso caso, proteína GFP)

* Procedimento:

1º Preparar os complexos de lipossomas+folatos+DNA

2º Distribuir os complexos pelos poços e aguardar 4 horas

3º Mudar o meio celular para o mesmo não se tornar tóxico

Leg.4: Introdução de lipossomas nas células

Leg.5: Troca de meio às células

☺ ALAMAR BLUE ☺

* Objectivo: Determinar a viabilidade celular e averiguar se a transfecção foi tóxica para as células.

* Procedimento: 1º: Preparar a mistura de resazurina com o meio das células

2º: Pôr um 1ml de meio nas células

3º: Ir avaliando a mudança de cor do meio

4º: Retirar uma amostra e ler a absorvância

5º: Calcular a percentagem de viabilidade em função do controlo

Leg.6:Mudança de cor do meio celular

☺ TESTE DE GRIESS☺

* Objectivo: Determinar a produção de óxido nítrico e nitratos pelas células

* Procedimento: 1º Tirar uma amostra de meio após o estímulo com LPS

2º Adicionar sulfanamide e posteriormente NED

3º Ler a absorvância do meio

4º Comparar a absorvância com uma curva de calibração

5ª Determinar a concentração de nitritos na amostra

Leg.7: Obtenção de resultados do Teste de Griess

☺ WESTERN BLOT ☺

* Objectivo: Determinar a presença e a quantidade de uma dada proteína em amostras de células ou tecido.

Leg.8: Proteínas a correr no gel

Leg.9: Western Blot

☺QRT-PCR ☺

* Objectivo: Quantificar o RNA mensageiro de um determinado gene.

* Procedimento: 1º Fazer a extracção do RNA a partir das células

2º Quantificar o RNA

3ºFazer a transcrição com o Transcriptazer Reverser

4º Quantificar o cDNA com uma sonda fluorescente

Leg.10: Termociclador

Leg.11: Procedimento do qRT-PCR

CONCLUSÃONo final deste estágio, compreendemos um pouco

mais acerca do objecto e método de estudo da bioquímica. Foi deveras aliciante e enriquecedor uma vez que, além de aprendermos mais e vivenciarmos uma experiência universitária também convivemos e estabelecemos relações com outras pessoas.

Leg. : Grupo “O papel dos miRNAs na activação da microglia