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Nathalie Parthuisot2006 - 2009
Caractérisation et quantification des populations de Légionelles
naturellement présentes dans la rivière « Le Tech »
École Doctorale de Biochimie et Biologie Moléculaire B2M
Université Paris Diderot-Paris 7Université Pierre et Marie Curie-Paris 6
Maladie infectieuse bactérienne, connue depuis l’épidémie de 1976 .
La Légionellose
Les Légionelles
Les épidémies en constante progression
Deux manifestations cliniques : fièvre de Pontiac / infection
pulmonaire grave
Ces infections sont graves
C’est un bacille Gram-, aérobie, flagelle monopolaire, mesure 0.5µm
(largeur) et 2µm (longueur )
49 espèces décrites. Legionella pneumophila est la plus virulente
pour l’homme (plus de 80% des cas déclarés)
Introduction
Légionelles : bactéries ubiquitaires de l’environnement, qui se développent dans :
La contamination à l’homme : inhalation d'aérosols contaminés
eaux douces : les rivières, torrents et
lacs eaux marines et des sols mouillés ou
humides. Les milieux aquatiques artificiels : réseaux d’eau chaude (hôpitaux, hôtels,
immeubles) les systèmes de climatisation, thermes, spa (…)
mauvais entretien du réseau d’eau
Cependant, on ne connait pas les sources et les réservoirs naturels environnementaux des Légionelles.
Sources et réservoirs
Les milieux aquatiques naturels
:
Paramètres physico
chimiques
Multiplication (Abu Kwaik 1998)Rescucitation (Garcia 2007)
Inhibition (Temmerman 2007)Multiplication (Yammoto 1992)
Protection, Nutrition (Murga 2001, Storey 2004)
Interactions facteurs environnementaux
Facteurs biotiques :
pH
Température
Protozoaires
Flore
associée
Biofilm
Etats physiologiques :
Quels facteurs permettent aux Légionelles de se multiplier ?
Devenir : Comment acquièrent-elles leur virulence ? Et comment évaluer le risque sanitaire ?
Interactions facteurs environnementaux
Quels facteurs induisent ces états et quelle est l’occurrence des
Légionelles VNC en milieu naturel ?
Les Légionelles sont elles capables d’évoluer vers des états Viables
Non Cultivables (VNC) ?
Quels facteurs de stress entrainent la survie des
Légionelles ?
Ecologie des légionelles
Rivières, torrents,
lacs
Interactions facteurs
environnementaux :
Ecologie complexe
Paramètres physico chimiques Flore associée
Sources / Réservoirs : Milieux aquatiques naturels, Milieux aquatiques artificiels
Etats
physiologiques : Multiplication Survie Viables Non Cultivables
Evolution dans réservoirs : Virulence Risque sanitaire
Caractériser les sources et réservoirs environnementaux
de légionelles
Thèse :
Présentation site d’étude : Le Tech Sources principales de contamination / stations
analysées
Dynamique des Légionelles, dans les eaux et sédiments de la rivière « Le Tech »
1. Identification des sources et des réservoirs
environnementaux
Fleuve côtier, extrémité sud des Pyrénées-
Orientales.
Ecoulement sur 85.7 km, bassin versant de
780 km2
Source : massif du Costabonne (2345 m)
Le Tech (1)
Réalisation de la carte : année 2000
Le Tech (2)
Suivis mensuels et saisonniers, des 9 stations :
2. Etude de la dynamique des légionelles, dans les
eaux et sédiments de la rivière « Le Tech »
Caractériser les sources et réservoirs environnementaux de légionelles
Influence des paramètres environnementaux
Analyse de la diversité spécifique des
Légionelles
Quantification des L. pneumophila totales, Quantification des L. pneumophila actives et Quantification des L. pneumophila cultivables
Occurrence in situ des formes VNC
Développements méthodologiques (eaux et sédiments) :
Caractériser les sources et réservoirs environnementaux de légionelles
Méthodes de détection : Culture (norme AFNOR) PCR Immunofluorescence
Optimisation double-marquage L. pneumophila actives : Couplage spécificité (anticorps monoclonal) et activité métabolique Cytométrie phase solide Sédiments : application au préalable d’un gradient de séparation
Méthode alternative de quantification des L. pneumophila actives
Marquages immunofluorescents de L. pneumophila actives
L. pneumophila cells immunostained
Active L. pneumophila cell
L. pneumophila cells immunostained
Active L. pneumophila cell
Validation protocole de double-marquage
Principe : Eau robinet, dopée de 2.103 à 2.107 Lp/litre
Paramètres mesurés : L. pneumophila totales, actives et cultivables
Résultats :
Lp actives vs Lp cultivables
y = 0,893x + 2,1895
R2 = 0,9098
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00
Log (Lp cultivables /litre)
Lo
g (
Lp
act
ives
/lit
re)
Suivis mensuels : premiers résultatsLa Preste Céret
L. pneumophila totales
L. pneumophila actives
Céret Lp totales (NF) /litre
1,00E+00
1,00E+01
1,00E+02
1,00E+03
1,00E+04
1,00E+05
1,00E+06
1,00E+07
17/6/07 6/8/07 25/9/07 14/11/07 3/1/08 22/2/08
Aval Amont
La Preste Lp otales (NF) /litre
1,00E+00
1,00E+01
1,00E+02
1,00E+03
1,00E+04
1,00E+05
1,00E+06
1,00E+07
17/6/07 6/8/07 25/9/07 14/11/07 3/1/08 22/2/08
Aval Amont
Céret : % Lp actives/Lp totales
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
17/6/07 6/8/07 25/9/07 14/11/07 3/1/08 22/2/08
Aval Amont
Résultats préliminaires
La Preste : % Lpactives/ Lptotales
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
17/6/07 6/8/07 25/9/07 14/11/07 3/1/08 22/2/08
Aval Amont
Développements méthodologiques (eaux et sédiments) :
Caractériser les sources et réservoirs environnementaux de légionelles
Analyses des dynamiques des espèces de Légionelles : Méthodes de détection classique : L. pneumophila et quelques
Legionella spp Manque d’information sur dynamique intra-spécifique Optimisation outil d’empreintes moléculaires : CE-SSCP
variations spatio-temporelles des espèces variations des espèces en fonction des stations
Outil de quantification moléculaire (PCRq en temps réel) : Suivre variations Legionella spp et L. pneumophila
Conclusion
Résultats préliminaires : Concentrations L. pneumophila totales (vivantes et mortes) non
négligeables Concentrations faibles en L. pneumophila actives : 0.02 à 1% L.
pneumophila totales Quantifications de L. pneumophila viables non cultivables
Outils pertinants pour étudier dynamique des Légionelles
Etude de la dynamique des légionelles, dans les eaux et
sédiments de la rivière « Le Tech »
Perspectives : Dynamiques saisonnières et stations-dépendantes Influence des facteurs environnementaux
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