ms. romeu moreira dos santos - câmpus de jaboticabal · • sds-page = eletroforese em gel de...

2015

Ms. Romeu Moreira dos Santos

2017

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INTRODUÇÃO

SDS-PAGE

• SDS-PAGE = Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) com dodecil-sulfato de sódio (SDS).

• O SDS-PAGE consiste em um tipo de eletroforese realizada em condições

desnaturantes p/ a separação de proteínas.

• Presença de reagentes desnaturantes

• (beta-mercaptoetanol) que destrói as pontes dissulfeto

• SDS para conferir cargas negativas as proteínas

• separação eletroforética das cadeias polipeptídicas isoladas com base em

seu P.M. / tamanho

• Migração das proteínas é inversamente proporcional aos seus P.Ms

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INTRODUÇÃO

SDS-PAGE

• Essa técnica foi descrita por Laemmli (Laemmli (1970), Nature,

277, p. 680) quando a utilizou com a finalidade de determinar a

mobilidade das proteínas em gel de poliacrilamida submetido à

corrente elétrica.

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INTRODUÇÃO

SDS-PAGE

• Gel

• O gel (matriz) de poliacrilamida

• Composto por acrilamida e bis-acrilamida formando um

polímero reticulado.

• Possuem poros menores do que agarose, portanto, maior poder de

resolução.

• Pode separar bio-moléculas de DNA, RNA e Proteínas

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INTRODUÇÃO

SDS-PAGE

• SDS - dodecil-sulfato de sódio

• É um detergente que pode dissolver moléculas hidrofóbicas,

mas também possui uma carga negativa (sulfato) a ele

associada.

• Moléculas proteicas sob a ação do SDS são:

• Solubilizadas pelo detergente (estrutura primária)

• Adsorvidas com carga negativas

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INTRODUÇÃO

SDS-PAGE

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INTRODUÇÃO

SDS-PAGE

• Eletroforese de proteínas em SDS-PAGE - objetivo

• Caracterizar

• Quantificar

• Determinar a pureza da amostra

• Comparar proteínas de diferentes fontes

• O primeiro passo na técnica de Western blot

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Estudar as frações:

- gama-globulina precipitada- isotipo IgG purificado

Utilizando a técnica de SDS-PAGE

Objetivo da aula

SDS-PAGE

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SDS-PAGE

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O que fazer:

- Aplicar as amostras preparadas em cada poço;

- Deixar correr em uma voltagem de 100V por 40 min.;

- Retirar o gel do suporte com cuidado;

- Colocar no corante comassie blue por 5 min

- Colocar no descorante por 2 horas

- Analisar o gel

SDS-PAGE

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Gamaglobulina

IgG

SDS-PAGE

Soro

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SDS-PAGE

Estrutura das proteínas

IgG

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SDS-PAGE

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SDS-PAGE

B-mercaptoetanol para desnaturação: quebra das pontes dissulfeto

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SDS-PAGE

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SDS-PAGE

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SDS-PAGE

Eletroforese SDS-PAGE

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Soro total Gama

globulina

IgG

SDS-PAGE

Cadeia H de

IgG

50 kDa

Cadeia L de

IgG

25 kDa

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Obrigado!

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