CCM – 23/04/2015
Nathalie Cella
Métodos e estudo em
biologia celular e tecidual
PERGUNTASFERRAMENTAS
Perguntas de Biologia Celular
como as células formam um tecido?
como os tecidos formam órgãos?
Do que a célula é composta?
Por que/Como as células “adoecem”?
como as células se comunicam?
como as células interagem com o meio externo?
como as célula respondem a agressões?
como as células se diferenciam?
como as células se movimentam?
como o ovo (zigoto) se torna um organismo multicelular?
como as células proliferam?como as células crescem?
Qual é o aspecto de uma célula?
Theodor Schwann
Matthias Schleiden
Rudolf Virchow
https://www.youtube.com/watch?v=4OpBylwH9DU
História da Teoria Celular
ferramentas
• Imagem
• bioquímica
• Biologia molecular
• computacional
Microscopia óptica
Bright filed Phase contrast
Differencial-interference-contrast Dark field
Processamento de imagem
microscopia
óptica confocal
microscopia
óptica convencional
deconvolução
e imagem
Divisão de uma célula animal
https://www.youtube.com/watch?v=DD3IQknCEdc
Microscopia eletrônica (ME)
de transmissão
e
de varredura
Microcscopia eletrônica
Microscopia
óptica
ME
de
transmissãoME
de
varredura
Estereocílios de uma célula
do ouvido interno de um sapo
Flor de trigo
Alvéolo mamário
Célula de levedura
Como detectar diferentes
proteínas e mRNAs na célula?
ANTICORPOS
Imunização de animais
Figure 9-18 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
imunocitoquímica/imunohistoquímica
detecção de moléculas in situ
DAB
fluoresceína
diferentes marcadores
detecção de moléculas
na célula
Verde – proteína“V”
Vermelho – células proliferando
https://www.youtube.com/watch?v=-k2xmEUSKYk
localização da expressão
de genes diferentes
Detecção de mRNA
Dinâmica de proteínas por
microscopia óptica
https://www.youtube.com/watch?v=w0-7c8Ui84U
FRAPfluorescence recovery after photobleaching
https://www.youtube.com/watch?v=FbCHqk37yQ4
Estudo da estrutura e função da
proteína SHAKIRA
Como estudar esta proteína?
Shakira
Schlafen
“evidência correlativa”
supressão da
expressão de
Shakira
aumento da migração
aumento da proliferação
“Perda de função”
(exemplo)
Super-expressão
de Shakira
aumento da adesão
diminuição da proliferação
“ganho de função”
Pele
cérebro
Intestino
Pâncreas
glândula mamária
glândulas salivares
Expressão de Shakira
Reduzir para entender..
Cultura celular in vitro
Cultura celular (in vitro)
S
um determinado tecido
tem vários tipos celulares
SS
S
S
Anti-shakira
fluoróforo
Isolamento das células que
expressam Shakira
FACS
fluorescence activated cell sortercélulas que expressão
Shakira isoladas
Isolamento das células que expressam
Shakira
supressão da
expressão de
Shakira
Interferência de RNA (RNAi)
shakira
tubulina
Shakira tem alguma função na
proliferação celular?
Ensaio de incorporação de BrdU
Shakira tem alguma função na
proliferação celular?
Imunofluorescência
com anti-BrdU
Shakira tem alguma função na
migração celular?
time-lapse video-microscopy
https://www.youtube.com/watch?v=iFOus8ehxUc
Shakira tem alguma função na
migração celular?
Ensaio de “fechamento de ferida”
Shakira -controle
não é importante
na migração
Shakira -controle
é importante
na migração
Shakira -controle
células sem Shakira
“morrem”
E se as células isoladas não
expressarem Shakira?
Super-expressão
do gene que
codifica
Shakira
COMO ?
Clonagem de fragmentos de DNA
Propagação dos plasmídeos
Introdução de DNA em uma célula
Outras perguntas
• Há alteração da expressão gênica na
ausência de Shakira?
• Há alterações no ciclo celular?
• Há alterações na morfologia?
• Há alterações na função celular ?
• Como é animal sem Shakira (knockout)?
• Como é o animal com Shakira mutada?
• Que moléculas interagem com Shakira?
Gerando todo um organismo
geneticamente modificado (OGM)
Células-tronco embrionárias
DNA exógeno
células embrionárias com
uma cópia do DNA exógeno
Fêmea prenhe
embrião
injeção
das células
alteradas
embrião híbrido
transplante no útero
de fêmeas pseudo-prenhes
gene alterado nas gônadas
(ou seja, na linhagem germinativa)
X
F Manimais transgênicas
com 1 cópia do gene alterado
AT AT
X
AA AT AT TTanimal homozigoto
para o gene alterado
Caracterização do fenótipo resultante da
alteração de determinado gene
E se a alteração resultar em letalidade?
Mutações e deleções “tecido-específicas”
controle
knockout
Análise das células e tecidos por
microscopia
normal (“selvagem”)
alterados (mutantes
ou knockouts)
Alteração/ausência
de Shakira
resulta em letalidade
na embriogênese
Que proteínas interagem com
Shakira?
PCRpolymerase chain reaction
Biblioteca de cDNA
mRNA
Transcrição reversa
separação das fitas e
adição do segundo primer
Clonagem de fragmentos de DNA
Sistema duplo-híbrido em levedura
shakira
“isca”“presa”
proteína expressa
por um dos clones
genes recombinantes são
introduzidos em células de levedura
“isca”“presa” capturada
sítio de ativação
de trasncrição
transcrição de
gene reporter
Estudo da estrutura e função da
proteína SHAKIRA
Shakira altera a expressão de
outros genes?
Shakira + Shakira -
Genes sobre uma lâmina (DNA)
mRNA de células
Shakira -
mRNA de células
Shakira +
Microarrays de DNA
Análise dos genes alterados em
consequência da ausência de Shakira
ChIP - chromatin immunoprecipitation
Shakira atua diretamente na transcriçãod e genes?
Extração proteica
Fracionamento
celular
Figure 8-12 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
SDS-PAGESDS-polyacrylamide gel electrophresis
Detecção de proteínas no gel de
eletroforese
gel corado pelo
Coomassie blue
Western blot
Transferências das
proteínas do gel
para uma membrana
shakira
Imunodetecção (immunoblot)
2D-SDS-PAGE corado pelo Coommassie blue
Imunodetecção após 2D-SDS-PAGE
Há 4 tipos de Shakira!!!
Espectrometria de massa (MS)
• Ferramenta analítica para midir a massa de
uma molécula
• Determina a sequência de aminoácidos de
uma proteína
• Detecta alterações pós-traducionais
cristalografia de raio-Xdeterminação da estrutura tridimensional
MDALQLANSAFAVDLFKQLCEKEPLGNVLFSPICLSTSLSLAQVGAKGDTANEI
GQVLHFENVKDIPFGFQTVTSDVNKLSSFYSLKLIKRLYVDKSLNLSTEFISST
KRPYAKELETVDFKDKLEETKGQINNSIKDLTDGHFENILADNSVNDQTKILVV
NAAYFVGKWMKKFPESETKECPFRLNKTDTKPVQMMNMEATFCMGNIDSINCKI
IELPFQNKHLSMFILLPKDVEDESTGLEKIEKQLNSESLSQWTNPSTMANAKVK
LSIPKFKVEKMIDPKACLENLGLKHIFSEDTSDFSGMSETKGVALSNVIHKVCL
EITEDGGDSIEVPGARILQHKDELNADHPFIYIIRHNKTRNIIFFGKFCSP
Sequência de aa da Shakira
Três sítios de fosforilação em resíduos de tirosina (Y)
BLAST: Basic Local Alignment Search
NCBI - National Center for Biotechnology Information
Perguntas que o BLAST responde
• Que espécies de batérias têm uma proteína relacionada a uma certa
proteína cuja sequência de aminoácidos é conhecida?
• Que outros genes codificam proteínas com estrutura semelhante a uma
determinada estrutura de interesse?
• Que genes no homem se parecem com um determinado gene de
camundongo?
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1734/
Blast quickstart
Predição de sítios de fosforilação e
possíveis enzimas envolvidas
Predição de sinal de localização nuclear
Predição de outras alterações
pós-traducionais
MODELO de estudo
x
OBJETO de estudo
Modelos de estudo
vantagens e desvantagens
www.ibioseminars.org