metode de purificare-2
Post on 16-Jun-2015
384 Views
Preview:
TRANSCRIPT
Gel-cromatografia(sitare moleculară )
Metoda se bazează pe diferenţele de mărime ale proteinelor:•perlele de răşină prezintă mici pori, în care pot difuza moleculele de proteină ce sunt suficient de mici. •cele cu dimensiuni mai mari vor rămâne în faza mobilă
şi vor fi eluate din coloană
Proteina mare Proteina mica
Traseu scurt Traseu lung
Structura Sephadex
Cromatografia de schimb ionic
Enzimele posedă o anumită sarcină electrică în soluţie, în funcţie de : structura lor pH izoelectric. valoarea de pH, •În soluţii cu valori de pH:• sub valoarea punctului izoelectric, enzimele vor avea încărcare pozitivă şi se vor lega de schimbători cationici, •în soluţii cu pH mai mare de punctul izoelectric vor fi încărcate negativ şi se vor lega de schimbători anionici.
•Valoarea de pH trebuie să fie astfel aleasă încât să menţină încărcarea electrică opusă a proteinei/enzimei şi a schimbătorului de ioni.
•Tăria ionică trebuie să fie suficientă pentru a asigura solubilitatea proteinei, fără ca sarcinile să competiţioneze cu proteina pentru situsurile schimbătorului de ioni.
+
_Sar
cina
net
a de
la s
upra
fata
pro
tein
ei
4 5 6 7 8 9 pH
Legare la schimbatori cationici
Legare la schimbatori anionici
Domeniu de stabilitate de pH
++
++
+ ++
+
-
- -++
+
+
+
++
+ +-
- -+
Matrice schimbatoare de ioni cu
sarcini pozitive (anionica)
Proteina cu sarcina negativa
la valoare de pH selectataProteina legata de matrice
Schimbătorii de ioni sunt, în general polimeri insolubili în apă, ce conţin grupări cationice sau anionice.
- schimbătorii cationici conţin grupări anionice: SO3-, -OPO3-, COO-;- schimbătorii anionici conţin grupări cationice: grupări terţiare şi
cuaternare de amoniu, cu formula generală –NHR2+ şi +NR3+.
Principalele tipuri de schimbători de ioni
Tip de schimbător
Grupare funcţională Contra-ion
Denumire
Schimbător cationic slab
carboximetil-O-CH2-COO-
Na+ CM(celuloză, sephadex)
Schimbător cationic puternic
sulfopropil-O-CH2- CH2- CH2-SO3
-
Na+ SP(sephadex)
Schimbător anionic slab
dietilaminoetil Cl- DEAE(celuloză, sephadex)
Schimbător anionic puternic
amină cuaternară(dietil-(2-hidroxipropil) amino etil)
QAE(sephadex)
Pentru un amestec de proteină, care la pH 7,0 au următoarele sarcini electrice :poteina 1 +4proteina 2 +2proteina 3 0proteina 4 -2proteina 5 -4
Etapele procesului de schimb ionic sunt:a) se alege faza staţionară (răşina) cu încărcare pozitivă, şi se utilizează un tampon de tărie ionică mică ce conţine grupări
negativeb) – când se adaugă amestecul de proteine, proteinele încărcate negativ (4 şi 5) vor înlocui ionii negativi ai tamponului şi se
vor lega de răşinăc) – proteine încărcate pozitiv şi neutre nu vor interacţiona cu faza staţionară şi vor trece în volumul de lichid V0 prin eluţie;d) – după legarea proteinelor, se adaugă un tampon (faza mobilă) ce are tărie ionică mare (se foloseşte de obicei NaCl);e) – ionii negativi din acest tampon mai concentrat vor competiţiona cu proteina pentru sarcinile electrice pozitive ale răşinii;f) – când tăria ionică este suficient de mare pentru a dislocui proteina, aceasta va fi eliberată, putând fi eluată din coloană;g) – cu cât sarcina electrică negativă a proteinei este mai mare, cu atât concentraţia ionică a tamponului de eluţie este mai
mare.
++++
-
-
-
-
Incarcarea coloanei-initial
Incarcarea coloanei-finalSpalarea coloanei cu solutie
cu tarie ionica mica
Proteine nelegate
Gradient saruri
0
1M
Gradient saruri-initial
Gradient saruri-final
IIIII
I
Adsorbtia proteinelor
Echilibrare
Aplicarea probei si spalare
ElutieRegenertare
Test rapid
Cromatografie de schimb ionicElutie prin gradient de tarie ionica (concentratie de saruri)
Cromatografia de afinitate
Metode de purificare a enzimelor ce au în comun faptul că se stabilesc interacţii mai mult sau mai puţin specifice între enzimă şi un ligand imobilizat.
Proba Tip de ligand
Enzima Substrat, inhibitor, cofactor
Antigen Anticorp, virus, celula
Lectina Polizaharide, glicoproteine, receptor de celula
Acid nucleic Secventa complementara de baza, histone, acizi nucleici, polimeraze, proteine de legare
Hormoni Receptori, proteine de transport
Matrice de cromatografie de afinitate in prezenta proteinei-tinta
A-suport de imobilizareB- spacer armC- ligandulD-proteina-tinta
Matrice de cromatografie de afinitate cu metal imobilizat
Suport de imobilizare pe care este atasat un agent de chelare ce leaga coordinativ un ion metalic
top related