luciferaze - bio.bg.ac.rs · bioluminescencija – hemijska reakcija mora da bude egzotermna da...

LUCIFERAZE

“THE SWISS ARMY KNIFE OF MOLECULAR BIOLOGY”

Da se upoznamo sa glavnim terminima

LUMINESCENCIJA je hladno zračenje svetlosti, ali ne kao posledica pretvaranja toplotne E u svetlosnu nego drugih izvora

energije. U zavisnosti od izvora E razlikujemo različite tipove

luminescencije.

BIOLUMINESCENCIJA je proces u kome živi organizam

emituje svetlost kao posledica enzimske reakcije koju

katalizuje enzim LUCIFERAZA.

LUCIFERIN + O2

PEROKSIDNI INTERMEDIJER

[OXILUCIFERIN]*

OXILUCIFERIN + SVETLOST

Bioluminescencija – hemijska reakcija mora da bude egzotermna da sintetiše energijom bogato jedinjenje koje će osloboditi foton prilikom prelaska u stabilno nepobuđeno stanje.

Fluorescencija ili fosforescencija je suprotan proces u kome je potrebno da dođe do apsorpcije energije koja

će kao rezultat dati emisiju svetlosti.

SUPSTRAT

Luciferini - klasa malih molekula koji pri oksidaciji oslobađaju svetlost

Vibrio, Photobacterium Dinoflagellata Koelenterazin – Ctenophora,

Radiollaria , Cnidaria

Latia Vargulin – Ostracodes, Poricthys Lampyridae

Widder, 2017, Science

KOJI ORGANIZMI IMAJU SPOSOBNOST BIOLUMINESCENCIJE

• Više od 2500 vrsta, a od toga 80% su morski organizmi

• Bakterije – Gammaproteobacteria rodovi Vibrio, Aliivibrio, Photobacterium

• Kopneni zglavkari i insekti: Myriapoda, Geophila, Hexapoda, Collembola, Diptera, Colepotera

• Dva od tri najčešće korišćena reporter sistema koji se zasnivaju na mehanizmu bioluminescencije u molekularnoj biologiji su izolovana iz kopnenih organizama (Photinus pyralis – svitac, Photorhabdus luminescens – crevni patogen, nematoda), a najnovija okarakterisana koja je ušla u primenu je luciferaza izolovana i Gaussia princeps, morska kopepoda

• 2008. godine – Nobelova nagrada za hemiju Osamu Shimomura za otkriće i razvoj GFP sa još dva američka naučnika

Widder, 2017, Science

NEPOŽELJAN PLEN – PHOTOBACTERIUM LEIOGNATHI

BAKTERIJSKE LUCIFERAZE

Heterodimeri, α -subjedinica (35 kDa) i β-subjedinica (40 kDa)

MEHANIZAM DEJSTVA VIBRIO FISCHERI

FMNH2 + O2 + RCHO → FMN + RCOOH + H2O + SVETLOST

LUX SISTEM

Organizacija LUX operona različitih bakterijskih vrsta.

Jezgro operona čine luxCDABE geni, dok se prisustvo ostalih gena

razlikuje od vrste do vrste.

LUX SISTEM

luxA i luxB – heterodimer luciferaze, luxC, luxD i luxE – multienzimski

kompleks reduktaza masnih kiselina, luxF – flavoprotein homolog

subjedinici luciferaze, luxG – flavin reduktaza, luxH – protein

najverovatnije uključen u sintezu FMN.

QUORUM SENSING...

• Komunikacija i koordinisano “ponašanje” populacije zavisno od koncetracije signalnog molekula (primer na slici kod Vibrio fischeri)

INSEKTI I BIOLUMINESCENCIJA

Najbogatija i najraznovrnija grupa organizama

Do sada je opisano 2500 vrsta koje imaju ovu osobinu

Od identifikacije luciferina svica 60 i 70-tih godina prošlog

veka do danas je okarakterisano još šest luciferina iz različitih

grupa organizama

• Razlike u emisiji nastaju kao posledica različitih supstrata i

rekcije koju katalizuje luciferaza

INSEKTI I BIOLUMINESCENCIJA

A.Photinus pyralis, Mg2+ za hirdrolizu ATP

B. Renilla reniformis, Ca2+

PHOTINUS PYRALIS – SVITAC

Najbolje proučena luciferaza, izolovana i okarakterisana 1976. god.

Gen je u jednoj kopiji, ima 7 egzona i 6 introna; protein 62 kDa

MEHANIZAM KOD PHOTINUS PYRALIS

Luciferin+ ATP → Luciferin adenilat + PPi

Luciferin adenilat + O2 → Oksiluciferin + AMP + SVETLOST + H2O + CO2

EVOLUCIJA LUCIFERAZA

• Na osnovu raznovrsnosti enzima, supstrata i mehaniama uključenih u bioluminescenciju pretpostavka je da je bioluminiscencija evoluirala nezavisno bar 40 puta u različitim organizmima.

• Većina napora da se objasni evolucija se svodi na dva osnovna koji su usemreni na selektivni pritisak na supstrat ili enzim.

• U prvom slučaju selektivni pritisak je mogao da bude zaštiti organizme od rastuće koncentracije toksičnog kiseonika. Dok je moguća i hipoteza da su nastale od oksigenaza sa mešovitom funkcijom koje su uključene u oksidaciju rastuće koncentarcije organiskih jedinjenja.

• Sve ovo može da se odnosi samo na bakterijske luciferaze.

• Trenutno stanovište je da je većina luciferaza nastala de novo.

• Nastale od predačkog kalmodulin vezujućeg proteina, acil-CoA sintetaze, aminoacil-tRNK sintetaze, itd.

EVOLUCIJA LUCIFERAZA INSEKATA

-Polipeptidi 545-550 AK - ~60 kDa - na C-kraju SKL tripeptid (SerLysLeu) - 66-99% identičnosti - od slabo luminescentnih ligaza, formiranje aktivnog mesta luciferaze, koevolucija sa fotocitama do današnjih luciferaza

• Različita zastupljenost i kod bakterija iste vrste.

• Sekvenca Lux operona konzervirana kod svih luminescentnih bakterijskih vrsta.

• Prvo je povezana sa reparacijom DNK, a zatim sa quorum sensing (QS) sistemom. Međutim, QS nije karakterističan samo za bioluminescenciju (BL) – Šta je nastalo prvo BL ili QS?

• Bakterijske luciferaze kod bakterija koje žive u simbiozi su koevoluirale sa domaćinom i/ili njegovim organom za proizvodnju svetlosti.

• Najnoviji okarakterisani luciferazni sistemi kod dinoflagelata govore o mogućem gubitku odnosno redukciji luminescentnog potencijala i konvergentnoj evoluciji.

EVOLUCIJA LUCIFERAZA BAKTERIJA

PRIMENA I ZNAČAJ

Reporter geni u bakterijskim i eukariotskim ćelijskim linijama

identifikacija promotora

detekcija bakterija u uzorku

in vivo praćenje bakterijske i virusne infekcije

in vivo praćenje ekpresije gena u eksperimentalnim životinjama

in vivo praćenje tumora

GFP vs. Luciferazni reporter geni

- drastično kraći poluživot luciferze

- nema posttranslacionih modifikacija

- ne zavise od egzogenih supstrata ili ekscitatora - više puta ponovljeno merenje

- talasna dužina emitovane svetlost je duža, a E veća

- brži, manje zahtevni i jeftiniji

• Autoindukujući reporter sistem – V. harveyi za praćenje interspecijske komunikacije kod bakterija

• Ekspresija bakterijskih gena

• Vizualizacija kontaminacije u uzorcima hrane i okolini

• Detekcija bakterija u ciljnim tumorima, a u sklopu antitumorskog tretmana

• Praćenje ekspresije eukariotskih gena primenom eukariotskih luc i ruc luciferaznih reporter gena

• in vivo praćenje interakcije mikroorganizam – domaćin

PRIMENA I ZNAČAJ

• in vivo praćenje interakcije mikroorganizam – domaćin

PRIMENA I ZNAČAJ

Guo et al., 2013, Anti. Agents Chem.

PRIMENA I ZNAČAJ

• in vivo praćenje interakcije mikroorganizam – domaćin

van Zyl et al., 2015, Gut Microbes

• Kontrolisani koncentracijom arsena u podlozi

...I BIOSENZORI

• "sequencing by synthesis "

• Ronaghi i Nyrén 1996.

PIROSEKVENCIRANJE

• Sve zavise od O2

• Veoma je važno kako se ovi reporter geni ubace u organizam koji se analiziran, ali i jedna hromozomska kopija je bolja od plazmidno lociranih gena

• Nezamenljive u molekularnoj biologiji

• Kombinuju sposobnost da mere aktivnost promotora i u isto vreme određuju lokaciju bakterija i kvantifikaciju bakterija u kulturi, u kulturi eukariotskih ćelija, tkivima ex vivo i in vivo

ZAKLJUČAK