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Isolierung und Charakterisierung potentieller Kontrollelemente
der MEK Ste7p
von Saccharomyces cerevisiae
Dissertation
zur Erlangung des Grades
eines Doktors der Naturwissenschaften
der Fakultät für Biologie
der Ruhr-Universität Bochum
angefertigt im Institut für Physiologische Chemie,
Arbeitsgruppe für Biochemie der Differenzierung
der Fakultät für Medizin
vorgelegt von
Markus Neugebauer
aus Dinslaken
Bochum 1999
Erstgutachter: Prof. Dr. W. Duntze
Zweitgutachter: Prof. Dr. W. E. Weiler
Abgabe der Arbeit: 30. Juni 1999
Tag der mündlichen Prüfung: 6. September 1999
Inhaltsverzeichnis
I
Seite
Abkürzungen IV
1. Einleitung 1
2. Material und Methoden 10
2.1. Fein- und Biochemikalien 10
2.2. Saccharomyces cerevisiae-Stämme 11
2.3. Escherichia coli-Stämme 12
2.4. Plasmide 12
2.5. Genbibliothek 12
2.6. Antikörper 13
2.7. Synthetische Oligonucleotide 13
2.8. Methoden zur Kultivierung von Mikroorganismen 15
2.8.1. Kultivierung von Saccharomyces cerevisiae 15
2.8.2. Zelldichtebestimmung von S.cerevisiae-Flüssigkulturen 16
2.8.3. Kultivierung von Escherichia coli 16
2.8.4. Glycerindauerkulturen 17
2.9. Molekularbiologische Methoden 18
2.9.1. Präparation und Transformation CaCl2-kompetenter E. coli-Zellen 18
2.9.2. Amplifikation und Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli-Zellen 18
2.9.3. Amplifikation der verwendeten Genbibliothek 18
2.9.4. Präparation und Transformation LiAc-kompetenter S. cerevisiae-
Zellen
19
2.9.5. Isolierung von Plasmid-DNA aus S. cerevisiae-Zellen 20
2.9.6. Isolierung genomischer DNA aus S. cerevisiae-Zellen 20
2.9.7. PCR-Amplifikation von DNA-Fragmenten 21
2.9.8. Gendeletion durch homologe Rekombination 22
2.9.9. Sequenzierung von DNA 23
Inhaltsverzeichnis
II
2.9.10. Trennung von DNA in Agarosegelen 23
2.9.11. Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen 23
2.9.12. Reinigung und Konzentrierung von DNA-Fragmenten 24
2.9.13. Quantifizierung von DNA 24
2.9.14. Restriktion von DNA-Molekülen 24
2.9.15. Ligation von DNA-Fragmenten 24
2.9.16. Phosphorylierung von 5’-DNA-Enden 25
2.10. Biochemische und immunologische Methoden 26
2.10.1. Herstellung von Proteinextrakten aus Hefezellen 26
2.10.2. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 27
2.10.3. Westernblotting und Immundetektion 27
2.10.4. β-Galaktosidase-Enzymtest mit flüssigen Hefekulturen (quantitativ) 28
2.10.5. β-Galaktosidase-Enzymtest membrangebundener Hefezellen
(qualitativ)
29
2.11. Hefegenetische Methoden 30
2.11.1. Konjugation (qualitativ) 30
2.11.2. Sporulation 30
2.11.3. Separation der Ascosporen 31
2.11.4. Quantitative Konjugation 31
2.12. Methoden des 2-Hybrid-Systems 32
2.12.1. Detektion von Proteininteraktionen in vivo mit dem 2-Hybrid-System 32
2.12.2. Segregation von pAS2-1-Plasmiden aus Hefezellen 33
3. Ergebnisse 35
3.1. Isolierung Ste7p-bindender Proteine durch das 2-Hybrid-Screening
einer Genbank
35
3.1.1. Systemvoraussetzungen des 2-Hybrid-Screenings 36
3.1.1.1. far1∆-Modifikation des 2-Hybrid-Stamms Y190 36
3.1.1.2. Konstruktion des ‘Bait’-Plasmids pAS2-1-STE7 38
3.1.1.3. Konstruktion eines FUS1P-lacZ-Reportersystems 41
3.1.2. Überprüfung der Systemvoraussetzungen 44
3.1.2.1. Kontrolle der Vitalität 44
Inhaltsverzeichnis
III
3.1.2.2. Kontrolle unspezifischer Reportergen-Aktivierung 45
3.1.2.3. Expressions- und Modifikationsüberprüfung des Ste7p-
Fusionsproteins
46
3.1.2.4. Überprüfung der funktionalen Integrität des Ste7p-Fusionsproteins 48
3.1.3. Isolierung potentieller Ste7p-Bindungspartner aus der pACT2-FRYL-
Genbank durch ein 2-Hybrid-Screening
52
3.1.4. Verifizierung der Protein-Interaktionen 53
3.2. Identifizierung der selektierten Ste7p-Bindungspartner 63
3.3. Charakterisierung Ste7p-bindender Proteine mit unbekannter
Zellfunktion
68
3.3.1. Voraussetzungen der phänotypischen Analysen 69
3.3.1.1. Deletionsmutationen der korrespondierenden Gene 69
3.3.1.2. Konstruktion eines Überexpressionsvektors für das Gen YLR033w 71
3.3.1.3. Kontrolle der Zytotoxizität und der Expression des Myc-Ylr033Wp-
Fusionsproteins
73
3.3.2. Phänotypische Untersuchungen zur Charakterisierung der Proteine mit
unbekannter Zellfunktion
76
3.3.2.1. Konfrontation mit dem Pheromon α-Faktor 76
3.3.2.2. Quantitative Konjugation 78
4. Diskussion 80
5. Zusammenfassung 93
6. Literatur 95
Abkürzungen
IV
Abkürzungen
Abb. Abbildung
AD Aktivierungsdomäne
Ade Adenin
Amp Ampicillin
As Aminosäuren
3-AT 3-Amino-1,2,4-triazol
ATP Adenosintriphosphat
BD Bindedomäne
bp Basenpaare
dNTP Desoxyribonucleosidtriphosphat
E. coli Escherichia coli
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonucleinsäure
g Erdbeschleunigung
His Histidin
KAc Kaliumacetat
kb Kilobasenpaare
kDa Kilodalton
LiAc Lithiumacetat
Leu Leucin
MAT Paarungstyp
MCS multiple Klonierungsstelle
min. Minuten
NaAc Natriumacetat
NaF Natriumfluorid
NH4Ac Ammoniumacetat
nm Nanometer
OD optische Dichte
ONPG ortho-Nitrophenyl-β-D-galaktopyranosid
ORF offener Leserahmen
PCR Polymerase Kettenreaktion
Abkürzungen
V
PEG Polyethylenglykol
PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid
PPi Pyrophosphat
Pwo Pyrococcus woesei
RT Raumtemperatur
SDS Natriumdodecylsulfat
sec. Sekunden
Taq Thermus aquaticus
TCA Trichloressigsäure
Tris Tris-(hydroxymethyl-)aminomethan
Trp Tryptophan
Ura Uracil
v/v Volumen pro Volumen
w/v Gewicht pro Volumen
X-Gal 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galaktopyranosid
1. Einleitung
1
1. Einleitung
Die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae ist der am besten charakterisierte, niedere
Eukaryont und bietet sich hinsichtlich vieler Stoffwechsel- und Regulationsvorgänge als
Modellorganismus für höher organisierte Metazoen an.
Um auf extrazelluläre Einflüsse bzw. Umweltveränderungen physiologisch reagieren zu
können, besitzt dieser Einzeller verschiedene Signalübertragungswege, die in der
Evolution stark konserviert bis zu den Mammaliern als MAPK (mitogen aktivierte
Proteinkinase) bzw. ERK (extrazellulär regulierte Kinase) -Aktivierungswege wiederzu-
finden sind.
Dabei werden Signale an der Zelloberfläche von Rezeptoren detektiert und
zytoplasmatisch über sequentielle Proteinkinasereaktionen zu multiplen Effektoren im
Zellkern und zu anderen Zielorten übertragen.
Das zentrale Modul dieser Signaltransduktionskaskaden besteht aus der MAPK bzw.
ERK, die durch eine vorgeschaltete MAPK/ERK-Kinase (MEK) phosphoryliert und
aktiviert wird. Diese MEK wird vorher selbst von einer übergeordneten MAPK/ERK-
Kinase-Kinase (MEKK) durch Phosphorylierung aktiviert (Blumer und Johnson, 1994).
Von S. cerevisiae sind bisher sechs Signalwege mit einer derartigen Strukturver-
wandtschaft zur Einleitung unterschiedlichster Zellprozesse bekannt. Diese steuern
einfache Differenzierungsprozesse und die Übergänge im Lebenszyklus, wie die
Konjugation und das invasive Wachstum bei haploiden Zellen sowie die Pseudo-
hyphenentwicklung und die Sporulation bei diploiden Zellen. Zwei weitere Signalwege
steuern die Zellwandbiosynthese und die Adaptation an hyperosmotische Bedingungen
(Herskowitz, 1995).
Hinsichtlich der einzelnen Komponenten, deren Wechselwirkungen und Rangfolge
zueinander ist unter diesen Signaltransduktionswegen der sogenannte Pheromonsignal-
weg bisher am besten charakterisiert.
1. Einleitung
2
Im Lebenszyklus von S. cerevisiae werden durch ihn alle relevanten Prozesse zur Vorbe-
reitung und Durchführung der Konjugation gesteuert. Dabei fusionieren jeweils zwei
haploide Zellen der entgegengesetzten Paarungstypen a und α zu einer diploiden Zelle
a/α. Die drei wesentlichen Reaktionen, die durch eine Signalwegaktivierung ausgelöst
werden, beinhalten die Synchronisation des Zellstadiums beider Konjuganten durch eine
Blockade des Zellteilungszyklus in der späten G1-Phase, die morphologische
Differenzierung (Ausbildung von Konjugationsfortsätzen) sowie die Expression
konjugationsrelevanter Gene, deren Produkte für die Agglutination, die darauf folgende
Plasmogamie und für die abschließende Karyogamie erforderlich sind (Konopka und
Fields, 1992)
Die Aktivierung dieses Signalwegs wird durch paarungstypspezifische, extrazelluläre
Signalpeptide, sogenannte Pheromone, initiiert. Das Pheromon des Paarungstyps α, das
als α-Faktor bezeichnet wird, ist ein unmodifiziertes Tridecapeptid (Kurjan und
Herskowitz, 1982). Dagegen ist das Pheromon des Paarungstyps a (a-Faktor) ein
carboxyterminal methyliertes und farnesyliertes Dodecapeptid (Anderegg et al., 1988).
Frühe genetische Analysen führten zu einer Sammlung von Mutanten, die gegenüber
dem proliferationshemmenden Effekt dieser Pheromone resistent waren und die als ste-
Mutanten (steril) bezeichnet wurden. Die meisten Produkte der daraus abgeleiteten STE-
Gene sind im Pheromonsignalweg integriert (Hartwell, 1980), für den in der
Zwischenzeit noch weitere Komponenten gefunden und charakterisiert werden konnten.
Ein Modell des Pheromonsignalwegs, das die derzeitigen Kenntnisse der Signaltrans-
duktion von der Zellmembran bis zu den Zielorten vereinfacht zusammenfaßt, ist in
Abbildung 1 dargestellt.
1. Einleitung
3
Abb. 1: Modell des Pheromonsignalwegs von Saccharomyces cerevisiae (verändert nach Edwards et al., 1997)
Die Signaltransduktion wird durch die Bindung der Pheromone an die nur in haploiden
Zellen paarungstypspezifisch exprimierten Zelloberflächenrezeptoren initiiert. Deren
Stimulation aktiviert daraufhin in beiden Zelltypen den gleichen Signalweg. Der
α-Faktor-Rezeptor wird im Paarungstyp a durch das Gen STE2 (Burkholder und
Hartwell, 1985) und der a-Faktor-Rezeptor im Paarungstyp α durch das Gen STE3
(Hagen et al., 1986) codiert. Beide Rezeptoren besitzen durch ihre sieben
transmembranen Domänen eine strukturelle Homologie zu verschiedenen
Hormonrezeptoren in höheren Eukaryonten, die gewöhnlich mit einem heterotrimeren
G-Protein gekoppelt sind (Dohlman et al., 1991).
1. Einleitung
4
Auch in S. cerevisiae interagieren die Pheromonrezeptoren mit einem derartigen Gαβγ-
Proteinkomplex, dessen Untereinheiten durch die Gene GPA1 (Gα), STE4 (Gβ) und
STE18 (Gγ) codiert werden (Dietzel und Kurjan, 1987b; Whiteway et al., 1989). Bei
Stimulation des Rezeptors durch das Pheromon kommt es an der katalytischen Gα-
Untereinheit des Komplexes zu einem Guanin-Nucleotidaustausch (GDP => GTP),
wodurch ihre Affinität zu den anderen Untereinheiten reduziert wird. Der trimere
Komplex dissoziiert in das GTP-Gα-Protein und das die nachgeschalteten
Signalwegkomponenten aktivierende Gβγ-Dimer (Whiteway et al., 1989). Die
intrinsische GTPase-Aktivität der Gα-Untereinheit wird durch ein GTPase-aktivierendes
Protein (GAP) stimuliert, das durch das Gen SST2 codiert wird (Chan und Otte, 1982;
Apanovitch et al., 1998). Nach GTP-Hydrolyse kommt es durch eine Reassoziation der
drei Untereinheiten zu keiner weiteren Aktivierung des Signalwegs.
Auf welche Weise das Signal von dem Gβγ-Dimer an die sich anschließende
Proteinkinase-Kaskade übermittelt wird, ist noch nicht eindeutig aufgeklärt. Jedoch
konnte die Rangfolge der an der weiteren Signaltransduktion beteiligten Komponenten
durch epistatische Analysen ermittelt werden. Demzufolge ist die Signalübermittlung an
die nachfolgende MAPK-Kaskade von der Proteinkinase Ste20p abhängig (Leberer et
al., 1992; Ramer und Davis, 1993) .
Diese Kaskade setzt sich aus den Proteinkinase-Komponenten Ste11p (Chaleff und
Tatchell, 1985; Rhodes et al., 1990), Ste7p (Chaleff und Tatchell, 1985; Teague et al.,
1986), Fus3p (Elion et al., 1990) und Kss1p (Courchesne et al., 1989) zusammen, die
alle mit unterschiedlichen Domänen des Ste5p (Perlman et al., 1993) unabhängig
voneinander assoziieren. Dieses Protein scheint als Gerüst zu dienen, um die
Proteinkinasen zusammenzuführen und mit ihnen einen Signalübertragungskomplex zu
bilden (Marcus et al., 1994; Choi et al., 1994).
Durch in vitro Analysen konnte eine selektive Serin/Threonin-spezifische
Phosphorylierung des Ste11p durch Ste20p nachgewiesen werden (Wu et al., 1995).
1. Einleitung
5
Aktiviertes Ste11p wiederum phosphoryliert und aktiviert die Threonin/Tyrosin-
spezifische Proteinkinase Ste7p (Neiman und Herskowitz, 1994). Dazu sind die
Aminosäurereste Serin-359 und Threonin-363 essentiell (Yashar et al., 1995; Zheng und
Guan, 1994). Mittels der aktivierten Ste7p-Kinase werden die zwei partiell redundanten
Kinasen Fus3p und Kss1p durch die Phosphorylierung an den Threonin- und
Tyrosinresten eines TPEYP-Motivs aktiviert (Gartner et al., 1992; Ma et al., 1995).
Diese Mechanismen und die daran beteiligten Komponenten weisen eine große Überein-
stimmung zu den zentralen Modulen der MAPK-Regulationswege in höheren
Eukaryonten auf. Der davon am besten untersuchte Signalweg, dessen Aktivierung
durch Wachstumsfaktoren und Differenzierungsagonisten erfolgt, setzt sich aus den
homologen Kinasen Raf (MEKK), MEK1/2 (MEK) und ERK1/2 = p42/p44 (MAPK)
zusammen. Die außerordentliche Homologie der Einzelkomponenten beruht sowohl auf
strukturelle Übereinstimmungen (40 - 55 % Sequenzidentität der katalytischen Domäne)
als auch auf funktionale Übereinstimmungen durch die Phosphorylierungsmotive des
Substrats (TPXYP-Konsensus bei MEK’s und PX(TP/SP)-Konsensus bei MAPK’s). In
Folge der Signalwegaktivierung wird eine Zellproliferation oder Zelldifferenzierung
ausgelöst (Brunet und Pouyssegur, 1997; Errede et al., 1995).
Bei S. cerevisiae werden in Abhängigkeit von der pheromoninduzierten Fus3p/Kss1p-
Aktivierung zwei wichtige Folgereaktionen eingeleitet.
Beide Enzyme sind unabhängig voneinander in der Lage, den Transcriptionsfaktor
Ste12p zu aktivieren (Elion et al., 1991). Die Signifikanz der damit korrelierten
Phosphorylierungen ist noch nicht eindeutig geklärt (Hung et al., 1997; Song et al.,
1991). Aktiviertes Ste12p initiiert die Transcription vieler konjugationsrelevanter Gene
(u.a. FUS1 und FAR1) durch die Bindung an spezifische Promotorbereiche, die als
‘Pheromon response elements’ (PRE’s) bezeichnet werden (Sprague, 1991).
1. Einleitung
6
Der zur Konjugation erforderliche G1-Arrest des Zellteilungszyklus wird durch das
FAR1-Genprodukt herbeigeführt. far1-mutierte Zellen können durch eine Pheromon-
induktion nicht mehr in der G1-Phase des Zellzyklus arretiert werden, zeigen aber noch
eine normale Transcriptionsaktivierung (Chang und Herskowitz, 1990). Far1p, auch als
CKI (cyclin-dependent kinase inhibitor) bezeichnet, wird in der frühen G1-Phase
akkumuliert (Oehlen et al., 1996) und ausschließlich durch aktiviertes Fus3p
phosphoryliert (Peter et al., 1993). Als Folge dieser Modifikation wird die Assoziation
mit einem für die Zellzyklusprogression essentiellen Komplex, bestehend aus der CDK
(cyclin-dependent kinase) Cdc28p und einem der drei redundanten, G1-spezifischen
Cycline Cln1p, Cln2p oder Cln3p, ermöglicht. Durch die damit einhergehende
Kinaseinhibierung ist die Progression von der G1- zur S-Phase im Zellzyklus nicht mehr
gewährleistet, und die Zellen verharren in der späten G1-Phase an einem Kontrollpunkt,
der als ‘Start’ bezeichnet wird (Tyers und Futcher, 1993; Peter und Herskowitz, 1994).
Dieser ist analog zu dem von höheren Eukaryontenzellen bekannten ‘Restriktionspunkt’.
Neben der pheromoninduzierten Genexpression und dem G1-Arrest ist die
morphologische Differenzierung eine weitere wichtige Voraussetzung zur Erlangung
einer Paarungskompetenz. Das polarisierte Zellwachstum wird in Form eines Aktin-
Cytoskelettumbaus bei der Ausbildung von Konjugationsfortsätzen, ebenso wie bei der
Knospenbildung im vegetativen Lebenszyklus, u.a. durch einen Proteinkomplex
vermittelt. Daran sind die Proteine Cdc42p, eine essentielle Rho-homologe GTPase
(Johnson und Pringle, 1990), Cdc24p, ein essentieller Guanin-Nucleotid-
Austauschfaktor des Cdc42p und Bem1p, ein nichtessentielles Protein mit zwei SH3-
Domänen (Src homology 3) beteiligt (Chenevert et al., 1994; Lyons et al., 1996;
Peterson et al., 1994). Bem1p interagiert ebenfalls mit Ste5p, Ste20p und Aktin, und
wird deshalb als vermittelnde Komponente zwischen dem Pheromonsignalweg und dem
Cytoskelettumbau an der Plasmamembran angesehen (Leeuw et al., 1995).
1. Einleitung
7
Weitere zu diesem Zweck am Konjugationsfortsatz lokalisierte Proteine sind das Spa2p
(spindle pole antigen) und das Sph1p (Spa2p homolog), die mehrere strukturhomologe
Bereiche besitzen. Diese Domänen bestimmen teilweise die richtige Lokalisierung dieser
für die morphologische Differenzierung essentiellen Proteine (Arkowitz und Lowe,
1997; Roemer et al., 1998).
Problemstellung
Nach einer Aktivierung dieses Signalwegs durch Pheromoninduktion werden die Zellen
eines erfolglosen Konjugationsversuchs durch einen Inaktivierungsprozeß in den
vegetativen Lebenszyklus zurückgeführt (‘Recovery’) und mögliche Zellschäden eines
durch Daueraktivierung anhaltenden G1-Arrests vermieden.
Diese Adaptation haploider Zellen äußert sich offensichtlich bereits kurze Zeit nach
einer Pheromoninduktion durch den Wiedereintritt in die Proliferation.
Eine aktive Beendigung der Induktion erfolgt dabei sowohl durch die extrazelluläre
Proteolyse des Pheromons (MacKay et al., 1988) als auch durch die Internalisierung des
Pheromon-Rezeptorkomplexes (Jenness und Spatrick, 1986). Des weiteren ist zu einer
Desensibilisierung ebenfalls die Rückführung des aktivierten Signalwegs in den Grund-
zustand erforderlich. Im Gegensatz zu den gut charakterisierten Mechanismen der
Aktivierung, sind die antagonistischen Prozesse der Signalweginaktivierung noch nicht
so detailliert aufgeklärt.
Die meisten der bekannten Prozesse beschränken sich auf die Modulation der Fus3p-
MAPK, an deren Dephosphorylierung und damit verbundener Inaktivierung die
Threonin/Tyrosin-spezifische Phosphatase Msg5p beteiligt ist, die in Abhängigkeit von
einer Signalwegaktivierung exprimiert wird (Doi et al., 1994).
Eine zusätzliche Gegenregulation dieser MAP-Kinase erfolgt durch die Tyrosin-
spezifischen Phosphatasen Ptp3p und Ptp2p. Im Gegensatz zu Msg5p, dessen Aufgabe in
der Adaptation nach einer erfolgten Signalwegaktivierung liegt, werden diese
1. Einleitung
8
coregulierenden Phosphatasen unabhängig von der Signalwegaktivierung exprimiert und
erfüllen demnach eher die Aufgabe einer Determinierung der Basisaktivität (Zhan et al.,
1997).
Darüber hinaus sind die beiden MAP-Kinasen Fus3p und Kss1p auch durch eine
Retrophosphorylierung ihrer übergeordneten MEK Ste7p an den antagonistischen
Prozessen beteiligt. Diese aminoterminale Modifikation geht mit einer partiellen MEK-
Inaktivierung einher und wird deshalb als Rückkopplungsmechanismus zu einer
Begrenzung der Signalstärke (Attenuierung) verstanden (Errede und Ge, 1996; Zhou et
al., 1993).
Vergleichbare molekulare Mechanismen der Signalweginaktivierung sind bei
Säugerzellen wiederzufinden. So existieren für die extrazellulär regulierten Kinasen
(ERK) äquivalente Mechanismen der Dephosphorylierung und damit verbundener
Inaktivierung durch Threonin/Tyrosin- (Alessi et al., 1993; Shin et al., 1997; Sun et al.,
1993), Serin/Threonin- und Tyrosin-spezifische Proteinphosphatasen (Alessi et al.,
1995; Gopalbhai und Meloche, 1998), wobei die Identität der letztgenannten noch nicht
festgestellt werden konnte. Neben der auch hier bekannten MEK-Retrophosphorylierung
mit einer daraus resultierenden Attenuierung durch eine ERK (Brunet et al., 1994),
weisen in vitro- und in vivo-Experimente auf eine zusätzliche negative Regulation durch
die Serin/Threonin-spezifische Proteinphosphatase PP2A hin (Dudley et al., 1995;
Sontag et al., 1993).
Für S. cerevisiae ist eine derartige Inaktivierung der MEK Ste7p durch spezifische
Dephosphorylierung in vivo nicht bekannt, jedoch legt die Analogie der Mechanismen
und die Homologie der beteiligten Komponenten nahe, daß auch in diesen Zellen die
Retrophosphorylierung der Ste7p-Kinase nicht den einzigen Inaktivierungsmechanismus
darstellt und eine andere spezifische Inaktivierung durch eine Dephosphorylierung
möglich ist.
1. Einleitung
9
Einen Hinweis darauf geben die Untersuchungen von Errede und Ge (1996) die zeigten,
daß das Ste7p in vitro ein Substrat der PP2A ist und durch diese Proteinphosphatase
inaktiviert werden kann.
Diese Hinweise wurden zum Anlaß genommen, um der Frage nachzugehen, durch
welche Komponenten ein derartiger Ste7p-Inaktivierungsprozeß in vivo erfolgen könnte.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte ihre Identität durch einen zielgerichteten
Methodenansatz festgestellt werden.
Dazu wurde die Isolierung entsprechender Komponenten (‘negative Kontrollelemente’)
aus einer Genbibliothek vorgesehen. Im Gegensatz zu den bisherigen methodischen
Ansätzen, durch die wichtige Komponenten der Desensibilisierung isoliert werden
konnten (4.), die aber nicht zu einer Identifizierung der hier angesprochenen
Kontrollelemente führten, sollte diese Isolierung nicht auf der Basis einer Protein-
funktionalität sondern ausschließlich durch das Protein-Protein-Bindungsverhalten in
vivo erfolgen.
Hierzu wurde das 2-Hybrid-System unter der Verwendung des Ste7p als Zielprotein
vorgesehen. Von den so isolierten Bindungspartnern sollten im Anschluß daran die
Proteine mit einer potentiellen Aufgabe als MEK-Kontrollelement in ihrer relevanten
Funktion überprüft werden.
2. Material und Methoden
10
2. Material und Methoden
2.1. Fein- und Biochemikalien
Amersham Buchler GmbH & Co KG, Braunschweig, BRDECL Westernblot-Detektionsreagens
Bachem, Heidelberg, BRDα-Faktor
Bio-Rad Laboratories GmbH, München, BRD30 % Acrylamid-/Bisacrylamid-Lösung, APS, Molekulargewichts-Proteinmarker
Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, BRDPwo DNA-Polymerase, Proteaseinhibitoren-Cocktail
Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, California, USAMatchmaker Two-Hybrid System 2
Difco Laboratories GmbH, Augsburg, BRDBacto-Agar, Bacto-Pepton, Bacto-Trypton, Hefe-Extrakt, Hefe-Stickstoffbasis
Eurogentec, Seraing, BelgienRestriktionsendonucleasen, Oligonucleotidsynthesen
Genomed GmbH, Bad Oeynhausen, BRDJetsorb Gelextraktions-Kit
Gibco BRL, Eggenstein, BRDLachssperm DNA-Lösung, T4-DNA-Ligase, Geneticin® (G418 Sulfat)
MBI Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, BRDTaq DNA-Polymerase, dNTP-Mix, 1kb DNA-Leitermarker
Medac GmbH, Hamburg, BRDZymolyase 100T
Perkin-Elmer Corporation, Norwalk, Connecticut, USAABI PRISM™ Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequenzierungs-Kit
Pharmacia-LKB GmbH, Freiburg, BRDT4-Polynucleotid-Kinase, pUC18 SmaI/BAP
Qiagen GmbH, Hilden, BRDQIAprep Spin Miniprep-Kit, QIAGEN-tip 100, QIAGEN-tip 500
Schleicher & Schuell GmbH, Dassel, BRDNYTRAN® 0,45 µm neutrale Nylontransfermembran, Einmal-Sterilfilter 0,2 µm,Nitrocellulosemembran 0,45 µm
Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, BRD3-Amino-1,2,4-triazol, Cycloheximid, Ampicillin, Aminosäuren, Adenin, Uracil,Polyethylenglykol (P3640), Röntgenfilm Kodak BioMax MR, Orange G,pBR322 DNA-Marker
Nicht aufgeführte Chemikalien wurden in p.A.-Qualität von unterschiedlichenHerstellern aus der BRD bezogen.
2. Material und Methoden
11
2.2. Saccharomyces cerevisiae-Stämme
Stamm-bezeichnung MAT Genotyp
Referenz/Herkunft
Y190 a ura3-52 his3-200 lys2-801 ade2-101 trp1-901 leu2-3,112 gal4∆ gal80∆ cyhr2 LYS2::GAL1UAS-HIS3TATA-HIS3 URA3::GAL1UAS-GAL1TATA-lacZ
(Harper et al.,1993) /Clontech1
Y190∆ a ura3-52 his3-200 lys2-801 ade2-101 trp1-901 leu2-3,112 gal4∆ gal80∆ cyhr2 LYS2::GAL1UAS-HIS3TATA-HIS3 URA3::GAL1UAS-GAL1TATA-lacZ far1::kanMX4
diese Arbeit
381G-43A a SUP4-3(t.s.amber) cry1-1 his4-580amber trp1amber ade2-1tyr1 lys2 gal1 ste7amber
(Hartwell,1980)
FY1679 a/α ura3-52/ura3-52 trp1∆63/TRP1 his3∆200/HIS3leu2∆1/LEU2
(Winston etal., 1995)
X2180-1A a SUC2 mal mel gal2 CUP1 YGSC2
UTL-7A a ura3-52 trp1 leu2-3,112 FKZ3
ycl024w∆ a ura3-52 trp1 leu2-3,112 ycl024w::loxP-kanMX4-loxP diese Arbeit
yhl023c∆ a ura3-52 trp1 leu2-3,112 yhl023c::loxP-kanMX4-loxP diese Arbeit
ykr038c∆ a ura3-52 trp1 leu2-3,112 ykr038c::loxP-kanMX4-loxP diese Arbeit
yol078w∆ a ura3-52 trp1 leu2-3,112 yol078w::loxP-kanMX4-loxP diese Arbeit
FY1679-1A α ura3-52 trp1∆63 leu2∆1 diese Arbeit
FYα-ycl024w∆ α ura3-52 trp1∆63 leu2∆1 ycl024w::loxP-kanMX4-loxP diese Arbeit
FYα-yhl023c∆ α ura3-52 trp1∆63 leu2∆1 yhl023c::loxP-kanMX4-loxP diese Arbeit
FYα-ykr038c∆ α ura3-52 trp1∆63 leu2∆1 ykr038c::loxP-kanMX4-loxP diese Arbeit
FYα-yol078w∆ α ura3-52 trp1∆63 leu2∆1 yol078w::loxP-kanMX4-loxP
diese Arbeit
FYα-yol087c∆ α ura3-52 his3∆200 leu2∆1 yol087c::loxP-kanMX4-loxP EUROSCARF4
FY1679-7C a ura3-52 his3∆200 diese Arbeit
FYa-ycl024w∆ a ura3-52 his3∆200 ycl024w::loxP-kanMX4-loxP diese Arbeit
FYa-yhl023c∆ a ura3-52 his3∆200 yhl023c::loxP-kanMX4-loxP diese Arbeit
FYa-ykr038c∆ a ura3-52 his3∆200 ykr038c::loxP-kanMX4-loxP diese Arbeit
FYa-yol078w∆ a ura3-52 his3∆200 yol078w::loxP-kanMX4-loxP diese Arbeit
FYa-yol087c∆ a ura3-52 trp1∆63 yol087c:: loxP-kanMX4-loxP EUROSCARF4
1 Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, California, USA2 Yeast Genetic Stock Center, University of California, Berkeley, USA3 F. K. Zimmermann, Technische Hochschule Darmstadt, BRD4 EUROPEAN SACCHAROMYCES CEREVISIAE ARCHIVE FOR FUNCTIONAL ANALYSIS, Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt, BRD
2. Material und Methoden
12
2.3. Escherichia coli-Stämme
Stamm-bezeichnung Genotyp
Referenz/Herkunft
TG1 supE hsd∆5 thi ∆(lac-proAB) F’[traD36proAB+ lacIq lacZ∆M15]
(Gibson, 1984)
DH5α supE44 ∆lacU169 (φ80 lacZ∆M15) hsdR17recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1
(Hanahan, 1983)
2.4. Plasmide
Plasmidbezeichnung Referenz/HerkunftYEp13 (Broach et al., 1979)pAS2-1 (Harper et al., 1993) / Clontech1
pAS2-1-STE7 diese ArbeitpACT2 (Durfee et al., 1993) / Clontech1
pVA3-1 (murine p53(72-390) in pAS2-1) (Iwabuchi et al., 1993) / Clontech1
pLAM5’-1 (human lamin C(66-230) in pAS2-1) (Bartel et al., 1993) / Clontech1
pTD1-1 (SV40 large T-antigen(84-708) in pACT2) (Li und Fields, 1993) / Clontech1
pCL1 (Wildtyp GAL4 in YCp50-Derivat) (Fields und Song, 1989) / Clontech1
YEp357R (Myers et al., 1986)YEp357R-LEU2-FUS1P diese ArbeitpRS6myc (Erdmann und Blobel, 1996)pRS6myc-YLR033w diese ArbeitpFA6-kanMX4 (Wach et al., 1994)pUG6 (Güldener et al., 1996)pUC18 (Yanisch-Perron et al., 1985)
1 Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, California, USA
2.5. Genbibliothek
Bezeichnung pACT2-FRYL-GenbibliothekVektor pACT2Insertierte DNA ~ 0,8 - 2,5 kb-Fragmente genomischer DNA des Stamms
Ym955: (MATa ura3-52 his3-200 ade2-101 lys2-801leu2-3,112 trp1-901 tyr1-501 gal4-542 gal80-538)
Genregulation konstitutiver ADH1-FremdpromotorE. coli-Wirt MR32Zahl unabhängiger Klone ~ 5 x 106
Referenz/Herkunft (Fromont-Racine et al., 1997)
2. Material und Methoden
13
2.6. Antikörper
Bezeichnung Referenz/HerkunftMaus α-Human Myc-Epitop, monoklonal, 9E10 (Evan et al., 1985)
Kaninchen α-S. cerevisiae Gal4p(BD), polyklonal Santa Cruz Biotechnology, Inc.,Santa Cruz, California, USA
Ziege α-Maus IgG - Peroxidase(Zweitantikörper-Konjugat), polyklonal
Sigma-Aldrich Chemie GmbH,Deisenhofen, BRD
Ziege α-Kaninchen IgG - Peroxidase(Zweitantikörper-Konjugat), polyklonal
Sigma-Aldrich Chemie GmbH,Deisenhofen, BRD
2.7. Synthetische Oligonucleotide
Genomische Substitutionen
Bezeichnung Basensequenz1 (5’ →→ 3’)FARKAN(FW) ATCCACTGGAAAGCTTCGTGGGCGTAAGAAGGCAATA-
TATTAATGcgtacgctgcaggtcgacFARKAN(RE) AAAAGCAAAAGCCTCGAAATACGGGCCTCGATTCCCG-
AACTACTAatcgatgaattcgagctcgYCLKAN(FW) CTTGATAATAGTGCTGACGTAAATTACCAGAACTACT-
GCAGTATGcagctgaagcttcgtacgcYCLKAN(RE) CAAGAGTACGCTGTTAGGTGGCTTTTTTACTGTAGTA-
GGGCATTCataggccactagtggatctgYHLKAN(FW) GGGAACAGAGTCATCTTTTGGGTAGAAACTAAGCTTC-
AATGGATGcagctgaagcttcgtacgcYHLKAN(RE) GTTACAATAGAGAGATTTACCAATGGTGTATCTCGAT-
TAAATACTataggccactagtggatctgYKRKAN(FW) CCTGTAATATCGCTTTATACGGAAAAACTGAATTCTT-
TCATTATGcagctgaagcttcgtacgcYKRKAN(RE) ATTCGTAGTGTGAACATTAGGCTAACTGTAACAAAAA-
TCGTTAATataggccactagtggatctgYOLKAN(FW) ACAGTGTTTGTAAAACCCCCACCACACCATAATAAGA-
CGATAATGagctgaagcttcgtacgcYOLKAN(RE) ACCAAAATTAATGCTGGTAAGATGCAGTATAATGGG-
TTTTACTTAataggccactagtggatctg
1 Die zur Amplifikation des kanMX4-Moduls erforderliche Sequenz der Primerhybriden sind in kleinen Lettern notiert.
2. Material und Methoden
14
Genomische Substitutionsanalysen
Bezeichnung Basensequenz (5’ →→ 3’)kan(RE) ACCCATATAAATCAGCATCCFAR1(FW) CAGCGATGCAATTTTCAACAFAR1(RE) CAGCGTCACGATCTCCACTTYCL(FW) ATGCACACCTTCGTAAGAAGYHL(FW) AATGCCATCTCCTAGAATCGYKR(FW) GTAGAGGTACCAATTCGACGYOL78(FW) CATATTGGGTTGTACTACTGYOL87(FW) CTTGAAGAACGACTACATCG
Genomische Amplifikationen zur Klonierung von Genen
Bezeichnung Basensequenz1 (5’ →→ 3’) SchnittstellenSTE7(FW) GGTTGTTGCATATGTTTCAACGAAAGACT NdeISTE7(RE) CGCGGATCCTCAATGGGTTGATCTTTC BamHIFUS1P(FW) GGCAACCAGAACCGCTACT FUS1P(RE) GCCGAAATAACCGTGAGAAC YLR(FW) AATCGAAAGTTTTGATCATGACAGAAAGTG BclIYLR(RE) CTACCGCTGACTCGAGTTATTTCTTGTG XhoI
1 Substituierte, nicht homologe Basenpositionen sind in fetten Lettern notiert.
Amplifikation und Sequenzierung plasmidinsertierter DNA
Bezeichnung Basensequenz (5’ →→ 3’)pACT(FW) ACTATCTATTCGATGATGAAGATACCpACT(RE) AATTGAGATGGTGCACGATGCACApAS(FW) TCATCGGAAGAGAGTAGpRS(FW) CATATAGAAGTCATCG
2. Material und Methoden
15
2.8. Methoden zur Kultivierung von Mikroorganismen
2.8.1. Kultivierung von Saccharomyces cerevisiae
Die Kultivierung der Hefestämme erfolgte mit Ausnahme des Stamms 381G-43A bei
30°C in YEPD-Vollmedium oder unter Selektivbedingungen in synthetischen SD- bzw.
MV-Mangelmedien. Zur Anzucht adeninauxotropher Mutanten wurden die Medien bei
entsprechender Erfordernis mit 80 mg/l Adenin-Hemisulfat supplementiert.
Flüssigkulturen wurden in einem 5-fachen Gefäßvolumen aerob auf einem Schüttler bis
zum Erreichen der gewünschten Zelldichte inkubiert.
Zur Anzucht auf festen Nährböden wurde den Medien 2 % (w/v) Bacto-Agar zugesetzt.
Die aus Dauerkulturen in einem Verdünnungsausstrich beimpften Agarplatten wurden
bis zur Kolonienbildung 2 - 3 Tage inkubiert und nach Überprüfung der relevanten
Genmarker als Stammplatten bei 4°C gelagert. Diese wurden im Turnus von zwei
Wochen erneuert.
Alle Medien wurden durch Autoklavieren (20 min. 121°C) sterilisiert.
YEPD-Medium MV-Medium1 % (w/v) Hefe-Extrakt 0,67 % (w/v) Hefe-Stickstoffbasis ohne2 % (w/v) Bacto-Pepton Aminosäuren2 % (w/v) Glucose 2 % (w/v) Glucose
SD-MediumMV-Medium + 10 % (v/v) Aminosäuren/Basen-Stammlösung(pH 5,8) 0,3 g/l L-Isoleucin
1,5 g/l L-Valin0,2 g/l L-Arginin HCl0,2 g/l L-Histidin HCl Monohydrat1,0 g/l L-Leucin0,3 g/l L-Lysin HCl0,2 g/l L-Methionin0,5 g/l L-Phenylalanin2,0 g/l L-Threonin0,2 g/l L-Tryptophan0,3 g/l L-Tyrosin0,2 g/l Uracil0,2 g/l Adenin-Hemisulfat
In Abhängigkeit von den notwendigen Selektivbedingungen wurdendie entsprechenden Aminosäuren und Basen ausgelassen.
2. Material und Methoden
16
Weiterhin wurden die verwendeten Hefemedien je nach Erfordernis mit folgenden
Komponenten supplementiert:
Stammlösung Medienkonzentrationα-Faktor 1 mg/ml in EtOH (= 0,59 mM) 10 nM - 3 µM3-Amino-1,2,4-triazol 1 M in H2O (sterilfiltriert) 25 mMCycloheximid 1 mg/ml in H2O (sterilfiltriert) 10 µg/mlCuSO4 2,5 mg/ml in H2O (sterilfiltriert) 25 µg/mlGeneticin 10 mg/ml in H2O (sterilfiltriert) 0,2 mg/ml
2.8.2. Zelldichtebestimmung von S. cerevisiae-Flüssigkulturen
Bei der Erfordernis genauer Zelldichtebestimmungen erfolgten diese mit dem Coulter
Counter (Modell Industrial D, Coulter Electronics, Ltd., Luton, Bedfordshire, England).
Dazu wurde ein 0,5 ml Kulturaliquot zunächst zur Auflösung von Zellaggregaten 10 sec.
bei einer Leistung von 50 Watt mit einem Ultraschallgerät (Labsonic 2000, Braun
Melsungen AG, Melsungen, BRD) behandelt und anschließend mit einer
Elektrolytlösung (ISOTON II, Coulter Electronics) 1:50 verdünnt. Aus dem Zählwert
ergab sich mit Hilfe einer Koinzidenz-Korrekturtabelle die Zelldichte.
Alternativ dazu wurden die Zelldichten anhand der optischen Dichte mit dem Spektral-
photometer V-530 (Jasco GmbH, Groß-Umstadt, BRD) bei einer Wellenlänge von
600 nm bestimmt. Dabei entspricht eine OD600 von 1 der Zelldichte von ~ 3 x 107/ml
(Ausubel et al., 1994).
2.8.3. Kultivierung von Escherichia coli
Die Kultivierung von E. coli-Stämmen erfolgte bei 37°C in LB-Medium. Für Stämme
mit einem plasmidlokalisierten β-Lactamase-Gen wurde dem Medium 100 µg/ml
Ampicillin aus einer Stammlösung (10 mg/ml, sterilfiltriert) zugesetzt. Flüssigkulturen
wurden in einem 5-fachen Gefäßvolumen aerob auf einem Schüttler bis zum Erreichen
2. Material und Methoden
17
der gewünschten Zelldichte inkubiert. Die Zelldichtebestimmung erfolgte mit dem
Spektral-photometer V-530 (Jasco GmbH, Groß-Umstadt, BRD) bei einer Wellenlänge
von 600 nm. Eine OD600 von 1 entspricht der Zelldichte von 0,66 - 1,0 x 109/ml in
Abhängigkeit von dem verwendeten E. coli-Stamm.
Zur Anzucht auf festen Nährböden wurde den Medien 1,5 % (w/v) Bacto-Agar
zugesetzt. Die aus Dauerkulturen in einem Verdünnungsausstrich beimpften Agarplatten
wurden über Nacht inkubiert und als Stammplatten bei 4°C gelagert. Die Stammplatten
wurden im Turnus von zwei Wochen erneuert.
Die verwendeten Medien wurden durch Autoklavieren (20 min. 121°C) sterilisiert und
bis zum Gebrauch bei 4°C aufbewahrt.
LB-Medium1,0 % (w/v) Bacto-Trypton0,5 % (w/v) Hefe-Extrakt1,0 % (w/v) NaClpH 7,5 (NaOH)
2.8.4. Glycerindauerkulturen
Die Stämme von S. cerevisiae und E. coli wurden in 50 % (v/v) Glycerin bei -70°C
aufbewahrt und jährlich überprüft.
2. Material und Methoden
18
2.9. Molekularbiologische Methoden
2.9.1. Präparation und Transformation CaCl2-kompetenter E. coli-Zellen
Die Präparation von CaCl2-kompetenten E. coli-Zellen und deren Transformation mit
Plasmid-DNA erfolgte nach den Angaben der bei Sambrook et al. (1989) beschriebenen
Methoden. Die Selektion der Transformanten erfolgte auf LB-Amp-Agarplatten.
2.9.2. Amplifikation und Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli-Zellen
Aus den nach 2.8.3. in einem Kulturvolumen von 4 ml, 25 ml oder 100 ml gezüchteten
Zellen wurden die Plasmide im Mini-, Midi- oder Maxi-Präparationsmaßstab mittels des
QIAprep Spin Miniprep-Kit, QIAGEN-tip 100 oder QIAGEN-tip 500 der Firma Qiagen
durch eine Adsorption an Silicagel-Membranen bzw. Anionenaustauscher nach den
Angaben des Herstellers isoliert. Die DNA-Konzentrationen der Plasmideluate wurden
nach 2.9.13. bestimmt. Die Ausbeuten betrugen dabei maximal 20 µg, 100 µg bzw.
500 µg Plasmid-DNA. Eine Lagerung erfolgte bei -20°C.
2.9.3. Amplifikation der verwendeten Genbibliothek
Um die durch den Vermehrungsprozeß bedingten Quantitätsasymmetrien zwischen den
einzelnen Plasmidspezies zu reduzieren, wurde die Kultivierung der E. coli-Zellen zur
Amplifikation der darin enthaltenen Genbankplasmide auf festen Nährböden in großen
Petrischalen (φ 15 cm) durchgeführt. Dazu wurde der Glycerin-Dauerkultur zunächst
ein Aliquot entnommen, mehrere sukzessive Verdünnungen auf LB-Amp-Medium
ausplattiert und der Zelltiter anhand der Kolonienanzahl nach einer Inkubation über
Nacht (37°C) bestimmt.
2. Material und Methoden
19
Mit einer daraus resultierenden Verdünnung wurde ein Mehrfaches der als ‘Anzahl
unabhängige Klone’ angegebenen Zellen auf LB-Amp-Nährböden ausplattiert. Die
Zelldichte wurde dabei auf ~ 80.000/Platte begrenzt, um ein konfluierendes Kolonien-
wachstum zu vermeiden. Nach einer Inkubation über Nacht bei 37°C wurden die Zell-
kolonien durch zweimaliges Spülen der Nährböden mit Medium abgewaschen und die
Zelldichte der Suspension nach 2.8.3. bestimmt. Diese wurde daraufhin in die für Maxi-
Plasmidpräparationen erforderlichen Zellmengen aliquotiert, die Zellen sedimentiert
(15 min. 6.000 x g 4°C) und jedes Pellet in 10 ml Puffer P1 (50 mM Tris-HCl pH 8,0
10 mM EDTA) resuspendiert. Die weitere Maxipräparation der Plasmide erfolgte
unmittelbar nach 2.9.2. oder zu einem späteren Zeitpunkt mit den bei -20°C gelagerten
Zellaliquots.
Die Konzentrationen und Ausbeuten dieser Präparationen wurden nach 2.9.13. bestimmt
und die Isolate bei -20°C gelagert, bis sie zur Transformation von Hefezellen verwendet
wurden.
2.9.4. Präparation und Transformation LiAc-kompetenter S. cerevisiae-Zellen
Zur einfachen Routinetransfomation von Hefezellen mit Plasmid-DNA wurden Zell-
kolonien von Agarplatten entnommen und damit das ‘Quick and Easy’-Transformations-
protokoll nach Gietz und Woods (1994) durchgeführt.
Bei der Notwendigkeit einer höheren Transformationseffizienz wurde die Anzucht und
die Transformation der Hefezellen nach der Methode von Gietz et al. (1992) mit einer
10 % (v/v) DMSO-Supplementierung vor dem Hitzeschock nach Hill et al. (1991)
durchgeführt. Dieses Protokoll wurde zur Transformation von Hefezellen mit der
Plasmid-Genbibliothek und mit den Gen-Deletionskassetten verwendet.
Die Ausplattierungen der Transformanten erfolgten auf entsprechenden Selektivagar-
platten.
2. Material und Methoden
20
2.9.5. Isolierung von Plasmid-DNA aus S. cerevisiae-Zellen
Von einer stationären S. cerevisiae-Kultur in Selektivmedium wurden 1,5 ml 5 Minuten
bei 2.000 x g sedimentiert, der Überstand abgenommen und zu dem Zellpellet 200 µl
Aufschlußpuffer, 200 µl Glasperlen (φ = 0,5 mm) und 200 µl Phenol/Chloroform/
Isoamylalkohol (25:24:1 v/v/v) gegeben. Nach 2 min. Schütteln auf einem Vortex und
5 min. Zentrifugation (16.000 x g) wurde der wässrige Überstand mit 1/10 Vol. 10 M
NH4Ac-Lösung und 2,5 Vol. Ethanol versetzt und die enthaltene DNA 10 min. auf Eis
gefällt. Nach einer Sedimentation (10 min. 16.000 x g) wurde das Pellet mit 70 % (v/v)
Ethanol gewaschen, getrocknet und in TE-Puffer resuspendiert. Diese Plasmidlösung
konnte zur Transformation von E. coli-Zellen eingesetzt werden.
Aufschlußpuffer2 % (v/v) Triton X-1001 % (w/v) SDS100 mM NaCl1 mM EDTA10 mM Tris-HCl pH 8,0
2.9.6. Isolierung genomischer DNA aus S. cerevisiae-Zellen
Diese Präparation erfolgte nach einer Standardmethode. Einer Sphäroplastierung mit
Zymolyase folgte eine SDS-Lyse der Zellen mit anschließender KAc-Fällung der
Proteine und Ethanolpräzipitation der DNA nach Struhl et al. (1979).
2. Material und Methoden
21
2.9.7. PCR-Amplifikation von DNA-Fragmenten
Als Vorlage-DNA (Template) wurden bei der Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
isolierte Plasmide (10 - 100 ng), genomische DNA (0,1 - 0,2 µg) oder Plasmide bzw.
genomische DNA microwellenlysierter Hefezellen verwendet. Zur Herstellung von
Microwellen-lysaten wurde eine mittelgroße Zellkolonie eine Minute bei max. Energie
in der Microwelle lysiert.
Die PCR-Ansätze enthielten weiterhin 1x PCR-Puffer, 0,2 mM dNTP’s, 1 µM Primer,
2,5 mM MgCl2 und 2,5 U DNA-Polymerase bei 50 µl Gesamtvolumen in besonders
dünnwandigen 0,5 ml PCR-Reaktionsgefäßen (Molecular Bio-Products, San Diego,
California, USA). Die Reaktionen wurden im Biometra TRIO-Thermoblock (Biometra
GmbH, Göttingen, BRD) mit Heizdeckel folgenden Bedingungen unterworfen:
2,0 min. 94°C Denaturierung0,5 min. 94°C Denaturierung0,5 min. 45 - 60°C Hybridisierung 25 - 30 Zyklen1,5 min. 72°C DNA-Synthese4,0 min. 72°C DNA-Restsynthese
Zu analytischen Routinezwecken wurden die Reaktionen mit Taq-DNA-Polymerase
durchgeführt und anschließend auf einem Agarosegel getrennt. Bei vorgesehener
Klonierung der Syntheseprodukte wurden die Reaktionen mit Pwo-Proofreading-DNA-
Polymerase und einer reduzierten Anzahl der Zyklen (≤ 25), oder im Fall der Ampli-
fikation von Gen-Deletionskassetten mit einem Taq/Pwo-Gemisch (5:1) bei ≤ 28 Zyklen
durchgeführt.
Bei der Notwendigkeit einer Konzentrierung und Reinigung wurden die
Syntheseprodukte anschließend durch die Zugabe von 1/10 Vol. 3 M NaAc-Lösung und
2,5 Vol. Ethanol 10 min. auf Eis gefällt. Nach einer Sedimentation (20 min. 16.000 x g
4°C) wurde das Pellet mit 70 % (v/v) Ethanol gewaschen, getrocknet, in TE-Puffer
resuspendiert und ein Aliquot zur Analyse in einem Agarosegel getrennt.
TE-Puffer10 mM Tris-HCl pH 7,5 1 mM EDTA
2. Material und Methoden
22
2.9.8. Gendeletion durch homologe Rekombination
Die chromosomalen Deletionen von Genloci in S. cerevisiae erfolgten durch die
homologe Rekombination mit linearen Rekombinationskassetten. Diese bestanden aus
dem Modul des heterologen Resistenzmarkers kanMX4 (kanr-Strukturgen mit
regulatorischen Bereichen), das von kurzen, homologen Zielsequenzen des Genoms
flankiert war. Im Gegensatz zu auxotrophen Komplementationsmarkern wie HIS3 oder
LEU2 bleiben hierbei vorhandene Auxotrophien in den Zellen für andere
Selektionszwecke erhalten und die Rekombinationsorte beschränken sich im
Wesentlichen auf den Ziellocus.
Die zur Rekombination erforderlichen Kassetten wurden durch PCR-Amplifikationen
nach 2.9.7. erzeugt (Baudin et al., 1993; Wach et al., 1994). Die dazu verwendeten
Hybrid-Primer bestanden an den 5’-Enden aus 45 bp einer Sequenz, die zu den nicht-
codierenden Bereichen des Ziellocus homolog waren und an den 3’-Enden aus 19 - 20
bp einer Sequenz, die zu den Anfangs- und Endsequenzen des Resistenzmarkers
homolog waren. Als Template dieser Reaktionen dienten die Vektoren pFA6 (Wach et
al., 1994) oder pUG6 mit dem darin integrierten kanMX4-Markermodul. Das Konstrukt
pUG6 besitzt zusätzlich flankierende loxP-Rekombinationssequenzen zum Verlust des
Resistenzmarkers aus dem Genom (Güldener et al., 1996). Durch dieses System sind
Mehrfachdeletionen mit einem einzigen Selektionsmarker möglich, was jedoch im
Rahmen dieser Arbeit keine Anwendung fand.
Nach einer Transformation von S. cerevisiae (2.9.4.) mit diesen Deletionskassetten
ließen sich die Zellen mit stabilen Genomrekombinationen auf YEPD-Medium plus 200
µg/ml Geneticin (G418) als G418r-Mutanten selektieren. Die Überprüfung einer
korrekten Substitution am vorgesehenen Locus erfolgte durch PCR mit
Microwellenlysaten der selektierten Mutanten als Template (2.9.7.). Die dazu
verwendeten Primerpaare waren jeweils zu einer genomischen Sequenz außerhalb des
Ziellocus (sense) und zu einer Sequenz im kanr-Strukturgen (antisense) homolog. Eine
Analyse der Produkte erfolgte durch die Trennung in Agarosegelen (2.9.10.).
2. Material und Methoden
23
2.9.9. Sequenzierung von DNA
Die Sequenzierungsreaktionen wurden mit dem ‘ABI PRISM™ Taq DyeDeoxy
Terminator Cycle Sequenzierungs-Kit’ (Perkin-Elmer Corporation, Norwalk,
Connecticut, USA) nach Herstellerangaben im Biometra TRIO-Thermoblock (Biometra
GmbH, Göttingen, BRD) mit Heizdeckel durchgeführt. Als Vorlage-DNA (Template)
wurden 0,5 µg Plasmid-DNA oder 50 ng isolierte PCR-Fragmente in die 25 Zyklen
umfassende PCR-Reaktion eingesetzt. Die Auswertung erfolgte mit dem ABI 373 DNA-
Sequencer (Perkin-Elmer).
2.9.10. Trennung von DNA in Agarosegelen
Die elektrophoretische Trennung von DNA-Fragmenten erfolgte bei einer Feldstärke
von 5 V/cm durch 0,8 - 2,0 % (w/v) Agarosegele in TBE-Puffer. Durch das in der
Agarose-lösung enthaltene Ethidiumbromid (1 µg/ml) konnte die DNA mit einer UV-
Lichtquelle (254 nm) durch Fluoreszenz visualisiert werden.
Als Größenstandard diente der ‘1kb DNA-Leitermarker’ (MBI Fermentas GmbH) mit
den Fragmentgrößen 10/8/6/5/4/3,5/3/2,5/2/1,5/1/0,75/0,5/0,25 kb. Soweit keine anderen
Angaben erfolgen, wurden davon 0,3 µg zur elektrophoretischen Trennung eingesetzt.
TBE-Puffer (10x) Probenauftragungspuffer (6x)900 mM Tris-Base 40 % (w/v) Saccharose in H2O900 mM Borat 0,4 % (w/v) Orange G 20 mM EDTA (pH 8,0)
2.9.11. Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen
Die Rückgewinnung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen erfolgte mit dem Jetsorb
Gelextraktions-Kit (Genomed GmbH, Bad Oeynhausen, BRD) unter der Verwendung
von DNA-bindenden Silica-Gelpartikeln nach den Angaben des Herstellers.
2. Material und Methoden
24
2.9.12. Reinigung und Konzentrierung von DNA-Fragmenten
Alternativ zu einer Phenolextraktion mit anschließender Ethanol-Präzipitation wurden
die DNA-Fragmente durch die Verwendung von DNA-bindenden Silica-Gelpartikeln
des Jetsorb Gelextraktions-Kit sowohl von Salzen und Enzymen befreit, als auch in ihrer
Konzentration gesteigert. Das Protokoll ist entsprechend einer Isolierung aus Agarose-
gelen, wobei das Gelvolumen durch die DNA-Lösung und H2O ersetzt wird.
2.9.13. Quantifizierung von DNA
Die Konzentrationen von DNA in Lösungen wurden mit Quarzglasküvetten im
Spektralphotometer V-530 (Jasco GmbH, Groß-Umstadt, BRD) bei einer Wellenlänge
von 260 nm bestimmt. Eine OD260 von 1 entspricht dabei ~ 50 µg doppelsträngiger DNA
oder ~ 20 µg einzelsträngiger Oligonucleotide. Verunreinigungen wurden durch den
Quotienten OD260/OD280 erfaßt, der optimal zwischen 1,8 und 2 liegen sollte.
2.9.14. Restriktion von DNA-Molekülen
Die Restriktion von DNA-Molekülen (0,1 - 0,5 µg / 10 µl Ansatz) erfolgte unter den
individuellen Puffer- und Temperaturbedingungen für die jeweilige Endonuclease nach
Herstellerangaben bei einer Inkubationsdauer von 1 Stunde.
2.9.15. Ligation von DNA-Fragmenten
Zur Ligation wurden 50 - 200 ng linearisierte Plasmid-DNA mit der 1 - 2 fachen
molaren Menge Insert-DNA und 1 U T4-DNA-Ligase vereinigt. Die Reaktionen
erfolgten in einem Endvolumen von 10 - 20 µl mit dem Puffer des Herstellers über
2. Material und Methoden
25
Nacht bei 16°C. Um ungewollte Falschhybridisierungen von kohäsiven Fragmentenden
untereinander zu reduzieren, wurden die Ansätze vor der Enzymzugabe 5 min. auf 45°C
erhitzt und dann sofort in Eis überführt.
2.9.16. Phosphorylierung von 5’-DNA-Enden
In Vorbereitung auf die Einklonierung von stumpfen PCR-Fragment-Enden (aus Ampli-
fikationen mit Pwo-DNA-Polymerase) in einen stumpfendigen, dephosphorylierten
Vektor, wurde ~ 0,3 pmol dieser Fragmente zur 5’-Phosphorylierung in einem Volumen
von 20 µl mit 10 U T4-Polynucleotid-Kinase und 1 µM ATP im dazugehörigen Puffer
für 30 min. bei 37°C inkubiert. Das Enzym wurde durch eine Inkubation von 10 min. bei
68°C inaktiviert und die Produkte anschließend nach 2.9.12. gereinigt.
2. Material und Methoden
26
2.10. Biochemische und immunologische Methoden
2.10.1. Herstellung von Proteinextrakten aus Hefezellen
Die mit 5 ml einer Übernachtkultur angeimpfte Hauptkultur von 50 ml wurde bis zu
einer Zelldichte von OD600 ≅ 0,6 nach 2.8.1. kultiviert. CuSO4-Induktionen erfolgten
unmittelbar beim Ansetzen der Kultur, während Induktionen mit α-Faktor erst ~ 1,5
Stunden vor der Zellernte erfolgten. Die anschließende Präparation von Proteinextrakten
erfolgte nach einer sogenannten TCA-Methode (Clontech, Yeast Protocols Handbook).
Alle folgenden Schritte wurden auf Eis oder bei 4°C durchgeführt. Pro 7,5 OD600-
Einheiten des 5 min. bei 1.500 x g sedimentierten Zellmaterials wurden 100 µl TCA-
Puffer zur Resuspendierung des Zellpellets sowie 100 µl Glasperlen (φ = 0,5 mm) und
100 µl einer eiskalten 20 % (w/v) TCA-Lösung zum Zellaufschluß zugesetzt. Dieser
erfolgte 4 x 60 sec. auf einem Vortex mit zwischenzeitlichen Kühlpausen (30 sec. Eis).
Nach der Sedimentation der Glasperlen (1 min. Eis) wurde der Überstand in ein neues
Gefäß überführt und die Glasperlen mit 0,5 ml einer 1:1-Mischung aus 20 % (w/v) TCA-
Lösung und TCA-Puffer 2 x 60 sec. auf einem Vortex gewaschen und abermals
sedimentiert (1 min. Eis). Die beiden Überstände wurden vereinigt und 10 min. bei
16.000 x g zentrifugiert. Das sedimentierte Präzipitat wurde in 10 µl modifizierten SDS-
Probenpuffer pro 1 OD600-Einheit des eingesetzten Zellmaterials resuspendiert und der
pH-Wert gegebenenfalls mit 1 M Tris-Lösung nachgestellt. Vor der Gelauftragung
wurden die Proben 5 min. in kochendem Wasser inkubiert und unlösliche Bestandteile
durch Zentrifugation (5 min. 16.000 x g) sedimentiert.
TCA-Puffer SDS-Probenpuffer (modifiziert)20 mM Tris-HCl pH 8,0 62,5 mM Tris-HCl pH 6,850 mM Ammoniumacetat 2 % (w/v) SDS0,2 mM EDTA 10 % (v/v) GlycerinProtease-/Phosphataseinhibitoren: 5 % (v/v) β-Mercaptoethanol1 µl/ml Proteaseinhibitoren-Cocktail 0,001 % (w/v) Bromphenolblau1 mM PMSF Protease-/Phosphataseinhibitoren:10 mM PPi 1 µl/ml Proteaseinhibitoren-Cocktail10 mM NaF 1 mM PMSF
10 mM PPi
10 mM NaF
2. Material und Methoden
27
2.10.2. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Die Elektrophorese zur Trennung von Proteinen erfolgte nach der Methode von
Laemmli (1970) in einem diskontinuierlichen Gelsystem. Das Trenngel wurde für die
Mini-Protean II-Elektrophoresekammer (Bio-Rad Laboratories GmbH, München, BRD)
mit den Maßen 80 x 50 x 0,75 mm erstellt. Es besaß eine Acrylamid-/Bisacrylamid-
Konzentration von 10%T / 3%C, während die des darauf geschichteten Sammelgels
4%T / 3%C betrug. Die Elektrophorese der aufgetragenen Proben wurde bei einer
konstanten Spannung von 180 V durchgeführt, bis das Bromphenolblau das Gelende
erreichte.
Elektrodenpuffer (5x)0,124 M Tris0,96 M Glycin0,5 % (w/v) SDS
2.10.3. Westernblotting und Immundetektion
Der Transfer von Proteinen aus Polyacrylamid-Gelen an eine aufliegende Nitrocellulose-
membran erfolgte in einem Sandwich aus zwei Doppellagen Whatman-Papier mit einer
Semi-Dry Blotkammer (Bio-Rad Laboratories GmbH, München, BRD) nach den
Angaben des Herstellers unter Verwendung des Transferpuffers nach Bjerrum und
Schafer-Nielsen (1986). Die Transferdauer betrug 30 - 45 min. bei einer maximalen
Stromdichte von 5 mA/cm2 Filterfläche.
Transferpuffer Ponceau S-Färbelösung (10x)48 mM Tris 30 % (w/v) Sulfosalicylsäure39 mM Glycin 30 % (w/v) TCA0,0375 % (w/v) SDS 2 % (w/v) Ponceau S20 % (v/v) Methanol
2. Material und Methoden
28
Die Markerbanden wurden durch eine reversible Ponceau S-Färbung (Sambrook et al.,
1989) auf den Blot eingetragen. Nach einer Entfärbung mit TBS-Puffer erfolgte die
Absättigung unspezifischer Bindestellen mit Blocking-Puffer für 1 Stunde. Darauf folgte
eine einstündige Inkubation mit den Primär-Antikörpern (1 : 500 der polyklonalen und
1 : 5.000 der monoklonalen Antikörper in Blocking-Puffer), 3 x 5 min. Waschen mit
TBST-Puffer und eine 30 min. Inkubation mit den Peroxidase konjugierten Sekundär-
Antikörpern (1 : 2000 in Blocking-Puffer). Nach 3 x 5 min. Waschen mit TBST-Puffer
und einmaligem Waschen mit TBS-Puffer konnten unter Verwendung des ECL
Westernblot-Detektionsreagens (Amersham Buchler GmbH & Co KG, Braunschweig,
BRD) die chemilumineszenten Signale mit einem Röntgenfilm nach Expositionszeiten
von 10 - 300 sec. detektiert werden.
Die Färbung und alle Inkubations- und Waschschritte der Immundetektion erfolgten bei
Raumtemperatur auf einem Schüttler.
TBS-Puffer TBST-Puffer Blocking-Puffer10 mM Tris-HCl pH 8,0 TBS-Puffer TBST-Puffer150 mM NaCl 0,05 % (v/v) Tween-20 5 % (w/v) Magermilch-
pulver
2.10.4. ββ-Galaktosidase-Enzymtest mit flüssigen Hefekulturen (quantitativ)
Der aus Vorkulturen auf eine Zelldichte von OD600 = 0,2 angeimpften Hauptkulturen
wurden in den vorgesehenen Zeitabständen Aliquots von 1 ml zur Zelldichtebestimmung
nach 2.8.2. und von 1,5 ml für den β-Galaktosidase-Enzymtest entnommen. Für den
Enzymtest wurden die Zellen mit Z-Puffer gewaschen (Sedimentation: 30 sec.
16.000 x g), 5-fach konzentriert und die Zellen von 100 µl Suspension durch dreimaliges
Schockgefrieren (1 min. flüssiger Stickstoff) und Auftauen (1 min. 37°C-Wasserbad)
permeabilisiert. Diesem Ansatz wurden 0,7 ml Z-Puffer mit β-Mercaptoethanol und
160 µl ONPG-Lösung als Substrat zugegeben und bei 30°C inkubiert, bis durch das
Spaltprodukt Nitrophenol eine ausreichende Gelbfärbung erzeugt wurde. Die Reaktion
2. Material und Methoden
29
wurde durch die Zugabe von 0,4 ml 1 M Na2CO3-Lösung gestoppt, die Zelltrümmer
sedimentiert (10 min. 16.000 x g) und die Extinktionen der Überstände bei 420 nm in
einem Spektralphotometer V-530 (Jasco GmbH, Groß-Umstadt, BRD) gemessen.
Die Aktivität in Units ergab sich aus dem Quotienten 1.000 x OD420/Reaktionszeit (min.)
x 0,5 ml Kulturvolumen x OD600 nach Miller (1972).
Z-Puffer ONPG-Lösung60 mM Na2HPO4∗7H20 0,4 % (w/v) ONPG in Z-Puffer pH 7,040 mM NaH2PO4∗H2010 mM KCl1 mM MgSO4∗7H20pH 7,0(+/- 2,7 µl/ml (v/v) β-Mercaptoethanol)
2.10.5. ββ-Galaktosidase-Enzymtest membrangebundener Hefezellen (qualitativ)
Von den auf Agarnährböden kultivierten Hefezellen (Kolonien oder Impfstriche) wurde
ein Replikationsabzug auf eine Nylontransfermembran erstellt. Die daran haftenden
Zellen wurden durch Schockgefrieren (10 sec. flüssiger Stickstoff) und Auftauen (2 min.
Raumtemperatur) permeabilisiert und die Membran anschließend auf ein mit Z-Puffer/
X-Gal-Lösung getränktes Whatman-Papier gelegt. Die Inkubation erfolgte bis zum
deutlichen Auftreten der Indol-Spaltprodukte bei 30°C für 1 - 10 Stunden.
X-Gal-Stammlösung4 % (w/v) X-Gal in N,N-Dimethylformamid
Z-Puffer/X-Gal-Lösung1,6 % (v/v) X-Gal-Stammlösung in Z-Puffer
2. Material und Methoden
30
2.11. Hefegenetische Methoden
2.11.1. Konjugation (qualitativ)
Frisch angezüchtete Zellen der zu konjugierenden Stämme wurden auf einer YEPD-
Platte miteinander vermengt und für 6 Stunden bei 30°C inkubiert. Die Isolierung der
gebildeten Zygoten erfolgte anhand der charakteristischen Morphologie mit der Hilfe
eines Mikromanipulators (Singer MSM System, Singer Instrument Co. Ltd., Somerset,
England) oder über die Komplementation von auxotrophen Selektionsmarkern auf
Minimalmedien.
2.11.2. Sporulation
Die Sporulationen wurden auf festen Nährböden durchgeführt. Dazu wurden die
diploiden Zellen zunächst über Nacht auf GNA-Präsporulationsmedium nach Miller et
al. (1955) bei 30°C kultiviert, auf Fogel’s Sporulationsmedium nach Fowell (1952)
überstempelt und bis zu einer Woche bei 30°C inkubiert.
GNA-Präsporulationsmedium Fogel’s Sporulationsmedium5,0 % (w/v) Glucose 0,89 % (w/v) Kaliumacetat1,0 % (w/v) Hefe-Extrakt 0,10 % (w/v) Glucose0,8 % (w/v) Nutrient Broth 0,25 % (w/v) Hefe-Extrakt
Die Ausbildung von Ascosporen wurde durch eine Sporenanfärbung überprüft. Diese
erfolgte mit Malachitgrün nach McClung (1943). Zur Gegenfärbung des Ascus wurde
dabei Safranin O verwendet.
2. Material und Methoden
31
2.11.3. Separation der Ascosporen
Die Asci der Sporulationsplatten wurden als Suspension zum partiellen Zellwandverdau
mit 100 µg/ml Zymolyase in 1 M Sorbitol bei 30°C für 10 min. inkubiert. Dieser Prozeß
wurde durch das Waschen der Zellen mit 1 M Sorbitol beendet. Die Asci wurden als
Impfstrich auf eine nivellierte YEPD-Platte übertragen und die Sporen jeder Tetrade mit
dem Mikromanipulator (Singer MSM System, Singer Instrument Co. Ltd., Somerset,
England) entsprechend der Vorschrift nach Sherman und Hicks (1991) systematisch
separiert. Zur Keimung und Kolonienbildung wurden die Platten 7 Tage bei 30°C inku-
biert. Im Anschluß daran wurden die Genmarker der Klone durch Replikaplattierungen
analysiert.
2.11.4. Quantitative Konjugation
Die quantitative Bestimmung des Konjugationsverhaltens von Hefestämmen erfolgte
nach einer Methode von Hartwell (1980). Die zu testenden Stämme wurden bis zu einer
Zelldichte von < 2 x 107/ml in YEPD-Medium kultiviert. 2 x 106 Zellen jedes Paarungs-
typs wurden vermengt auf einen sterilen Millipore-Filter (HA, 0,45 µm Porengröße,
φ 2,5 cm) aufgetragen und für 6 Stunden auf einem YEPD-Nährboden bei 30°C
inkubiert. Der anschließenden Resuspendierung in 10 ml YNB (1,7 g/l Hefe-
Stickstoffbasis ohne Aminosäuren, ohne Ammoniunsulfat, pH 5,8) folgte zur Auflösung
von Zellaggregaten eine 10 sec. Ultraschallbadbehandlung.
200 µl der in YNB erstellten 10-3- und 10-4-fachen Verdünnungen wurden auf MV-
Medium (plus eventuell erforderlicher Supplementierung) plattiert und durch die
Komplementation von auxotrophen Markern nur die gebildeten Zygoten (MATa/α)
selektiv angezüchtet. Ein weiteres Aliquot wurde auf MV-Medium mit zusätzlicher
Basen- bzw. Aminosäurensupplementierung aufgetragen und dadurch die gebildeten
MATa/α-Zellen und zusätzlich die MATa-Ausgangszellen selektiv kultiviert. Aus der
Anzahl der nach 3 Tagen bei 30°C gebildeten Kolonien ergab sich die Paarungseffizienz
aus dem Quotienten der MATa/α-Zellen : MATa/α-Zellen + MATa-Zellen.
2. Material und Methoden
32
2.12. Methoden des 2-Hybrid-Systems
2.12.1. Detektion von Proteininteraktionen in vivo mit dem 2-Hybrid-System
Diese Methode bedient sich der genetischen Selektion von Genen in S. cerevisiae, deren
Proteine in vivo interagieren (Chien et al., 1991; Fields und Song, 1989). Die Selektion
begründet sich auf eine Aktivierung von Reportergenen auf der Transcriptionsebene.
Kommt es in den Zellen zur Bindung zweier Proteine, deren codierende Sequenzen in
zwei unterschiedlichen Plasmidspezies (BD- und AD-Plasmid) vorliegen, so assoziieren
auch die daran fusionierten DNA-Binde- und Aktivierungsdomänen des Gal4p-
Transcriptionsfaktors. Diese Rekonstitution zu einer funktionalen Einheit bewirkt die
spezifische DNA-Bindung an einer genomischen GAL1-Enhancersequenz und
Aktivierung der dadurch regulierten, voneinander unabhängigen und mit
unterschiedlichen Promotoren versehenen Reportergene HIS3 und lacZ des verwendeten
S. cerevisiae-Stamms Y190 (Harper et al., 1993) bzw. Y190∆ (diese Arbeit). Während
das HIS3-Gen der Wachstumsselektion dient, kann durch das lacZ-Gen eine
kolorimetrische Signaldetektion erfolgen.
Im Rahmen des 2-Hybrid-Screenings wurde aufgrund der höheren Effizienz eine
sequentielle Cotransformation gegenüber einer simultanen Cotransformation bevorzugt.
Zunächst wurde das rekombinante BD-Plasmid (pAS2-1-Derivat) nach einer
Schnellmethode (2.9.4.) in die Zellen befördert, diese Trp+-Transformanten selektiv in
100 ml SD-Trp-Medium über Nacht angezüchtet und in 300 ml YEPD-Medium
verdünnt als Hauptkultur für 3 - 5 Stunden bis zur mittellogarithmischen
Wachstumsphase (OD600 ~ 0,6) kultiviert. Darauf folgte die zweite Transformation mit
der in AD-Plasmiden (pACT2) enthaltenen Genbibliothek nach dem zweiten der in
2.9.4. angeführten Protokolle. Pro großer Petrischale (φ 15 cm) mit einem SD-Trp,-
Leu,-His,+3-AT-Nährboden wurde 1/30 der Zellmenge einer Hauptkultur ausplattiert,
die mit 0,5 µg Plasmid-DNA der Genbibliothek transformiert wurde. Nach 4 - 7 Tagen
bei 30°C bildeten die Cotransformanten mit einer potentiellen Proteinwechselwirkung
His+-prototrophe Kolonien aus.
2. Material und Methoden
33
Parallel dazu wurde die Effizienz dieser sequentiellen Cotransformationen durch ver-
dünnte Ausplattierungen auf SD-Trp,-Leu-Nährböden überprüft und lag in der Regel bei
~ 1 x 105/µg Plasmid-DNA der Genbibliothek.
Zur Etablierung des jeweils essentiellen Genbankplasmids in der Zelle wurden die Klone
ein weiteres mal hinsichtlich ihrer His+-Prototrophie auf neuen Medien selektiert und
nicht essentiellen, cotransformierten Genbankplasmiden die Gelegenheit gegeben, aus
den Zellen zu segregieren.
Die in vivo-Interaktionen der etablierten, His+-prototrophen Klone wurden zur
Eliminierung falsch-positiver Klone durch eine anschließende Überprüfung der lacZ-
Reportergen-Aktivierung nach 2.10.5. verifiziert. Die daraus hervorgegangenen
His+/lacZ+-Klone wurden zu weiteren Analysen einer Segregation des BD-Plasmids
(2.12.2.) zugeführt.
2.12.2. Segregation von pAS2-1-Plasmiden aus Hefezellen
Diese Methode bezieht sich auf die Kombination von 2-Hybrid-Stämmen wie Y190 bzw.
dessen Derivat Y190∆, die ein mutiertes cyhr2-Allel des ribosomalen Proteins L29
besitzen, mit dem BD-Plasmid pAS2-1, das ein entsprechendes Wildtypallel CYHs2
enthält. Bei einer Plasmidsegregation kommt es zum Verlust der durch das dominante
CYHs2-Allele bestehenden Sensitivität gegenüber dem ribosomalen Elongationsinhibitor
Cycloheximid (Harper et al., 1993).
Eine nach dieser Methodik durchgeführte Segregation von BD-Plasmiden erspart die
sonst zu weiteren Analysen notwendige Isolierung und Retransformation von AD-
Plasmiden cotransformierter Zellen des 2-Hybrid-Stamms.
Zur Herbeiführung dieser Segregation wurden die cotransformierten Zellen einer
Kolonie in geringer Zelldichte (1:10 und 1:100 in H2O verdünnt) auf den Nährboden
SD-Leu,+Cycloheximid (10 µg/ml) plattiert. Durch die Tryptophansupplementierung
entfiel der Selektionsdruck zum Erhalt des BD-Plasmids und entsprechende Cyhr, Trp-,
Leu+-Segreganten konnten bei 30°C in 4-7 Tagen unter der Selektion des Cycloheximids
2. Material und Methoden
34
zu Kolonien heranwachsen. Zur Verifizierung des Plasmidverlustes wurden diese Klone
durch Replikaplattierung auf SD-Trp,-Leu-Nährböden hinsichtlich ihrer Tryptophan-
Auxotrophie überprüft und der lacZ-Phänotyp in einem β-Galaktosidase-Enzymtest mit
membranfixierten Zellen (2.10.5) ermittelt.
3. Ergebnisse
35
3. Ergebnisse
3.1. Isolierung Ste7p-bindender Proteine durch das 2-Hybrid-Screening einer Genbank
Die in 2.12.1. beschriebene Methodik des 2-Hybrid-Systems eignet sich, um in vivo-
Proteininteraktionen in einer großen Anzahl von Kombinationen durch ein Genbank-
Screening auf der Ebene einer genetischen Selektion zu erfassen. Die Selektion
beschränkt sich auf die Wechselwirkungen von Proteinen und stellt deren zelluläre
Funktionen in den Hintergrund. Anders als bei biochemischen Methoden behalten die
Proteine durch in vivo-Bedingungen ihre native Konformation, wodurch optimale
Voraussetzungen zur Interaktion existieren.
Zu der nach diesem Prinzip vorgesehenen Isolierung Ste7p-bindender Proteine und der
anschließenden Verifizierung dieser Interaktionen wurde das ‘Matchmaker Two-Hybrid
System 2’ (Clontech Laboratories) verwendet.
Die Detektion der Proteinwechselwirkungen erfolgt in diesem System durch den
2-Hybrid-Stamm Y190, der durch die TATA-Boxen des HIS3- und des GAL1-Promotors
gegenüber anderen Stämmen eine stärkere Reportergen-Aktivierung des HIS3-Gens zur
konditionalen Wachstumsselektion und des lacZ-Gens zur kolorimetrischen Detektion
entwickelt. Dadurch wird eine ausreichende Erfassung auch schwacher oder transienter
Interaktionen gewährleistet. Allerdings muß dieser Stamm zur Suppression des Hinter-
grundwachstums bei der Selektion mit dem kompetitiven Inhibitor 3-Amino-1,2,4-
triazol (3-AT) kultiviert werden.
Des weiteren beinhaltet dieses System noch den BD-Vektor pAS2-1, zur Einklonierung
des Zielprotein codierenden Gens (‘Bait’), den AD-Leervektor pACT2 zur Negativ-
kontrolle sowie die BD- und AD-Vektoren pVA3-1 und pTD1-1 zur positiven Inter-
aktionskontrolle des Systems. Das pCL1-Plasmid hingegen exprimiert das vollständige
Gal4-Protein zur kolorimetrischen Positivkontrolle und das pLAM5-1’-Plasmid dient zur
Detektion falsch positiver Interaktionspartner (2.4.).
3. Ergebnisse
36
Für die Bindung und Isolierung potentieller negativer Kontrollelemente der MEK Ste7p
mit dem 2-Hybrid-System aus einer Genbank müssen als wichtige Systemvoraussetzun-
gen der native Konformationszustand dieses Proteins mit einer daraus resultierenden
Funktionalität als Proteinkinase (MEK) und dessen Modifikationsstatus gewährleistet
sein.
Im Rahmen des geplanten Genbank-Screenings sollte dieses einerseits durch die in vivo-
Expression des vollständigen Ste7-Proteins mit dem BD-Vektor pAS2-1 und
andererseits durch die pheromoninduzierte Aktivierung des Pheromonsignalwegs mit der
daraus resultierenden Phosphorylierung dieser Kinase erzielt werden.
3.1.1. Systemvoraussetzungen des 2-Hybrid-Screenings
3.1.1.1. far1∆∆-Modifikation des 2-Hybrid-Stamms Y190
Da zu erwarten war, daß negative Kontrollelemente spezifisch mit der durch Aktivierung
modifizierten Ste7p-Kinase interagieren, war es sinnvoll, das 2-Hybrid-Screening unter
der Bedingung eines aktivierten Pheromonsignalwegs durchzuführen. Die dazu erforder-
liche Pheromoninduktion der Indikatorzellen hätte jedoch auch einen Arrest des Zell-
teilungszyklus in der G1-Phase zur Folge, wodurch Interaktionen nicht detektiert werden
könnten.
Dieses Problem konnte durch die Verwendung FAR1-gendeletierter Zellen umgangen
werden, denn far1∆-Mutanten besitzen einen intakten Signalweg mit einer vollständig
davon entkoppelten Zellzyklusprogression (Chang und Herskowitz, 1990).
Zur Deletion des FAR1-Gens erfolgte eine Transformation von Zellen des 2-Hybrid-
Stamms Y190 mit einer durch PCR erzeugten Substitutionskassette (2.9.8.), die aus
einem kanMX4-Resistenzmarker und kurzen Flankierungen der Zielsequenz zur
homologen Rekombination bestand. In dieser PCR diente das Plasmid pFA6-kanMX4 als
3. Ergebnisse
37
Template und die Oligonucleotide FARKAN(FW) und FARKAN(RE) als Hybrid-
Primer.
Die Überprüfung einer korrekten Substitution der auf YEPD+Geneticin selektierten
G418r-Mutanten erfolgte durch genomische PCR-Amplifikationen microwellenlysierter
Zellen. Die dazu in einem Ansatz vereinigten Primer FAR1(FW), FAR1(RE) und
kan(RE) waren homolog zum nichtcodierenden 5’-Genbereich von FAR1 (sense), zum
codierenden Genbereich von FAR1 (antisense) und zum codierenden Genbereich des
kanr-Strukturgens (antisense).
Wie in Abbildung 2 ersichtlich ist, erzeugten nur die Y190∆-Klone 1 bis 5 als Bestäti-
gung einer far1::kanMX4-Substitution durch die Primerkombination FAR1(FW)/
kan(RE) eine erwartete Produktbande von 776 bp, während der Wildtyplocus des
Stamms Y190 durch die Primerkombination FAR1(FW)/FAR1(RE) ausschließlich die
erwartete Produktbande von 366 bp bildete.
Abb. 2: Genomische PCR-Analyse des Wildtyplocus (WT) imAusgangsstamm Y190 und der far1::kanMX4-Substitution in denerzeugten Y190∆-Mutanten. Zur Analyse wurden jeweils 3 µl derReaktionsansätze in einem 2 % (w/v) Agarosegel elekrophoretischgetrennt.
3. Ergebnisse
38
Zur phänotypischen Überprüfung des veränderten Genotyps wurden die Zellen in einem
Hemmhoftest mit dem Pheromon α-Faktor konfrontiert.
Wie Abbildung 3 zeigt, reagierten die far1∆-Mutanten (Y190∆) gegenüber dem Wildtyp
Y190 nicht auf diese Pheromoninduktion und waren somit aufgrund der fehlenden
Zellzyklusinhibierung α-Faktor-resistent.
Y190∆∆ Y190
Abb. 3: Hemmhoftest (Halo-Assay) einer far1∆-Mutante (Y190∆) und des ent-sprechenden Wildtyps Y190 mit α-Faktor.Es wurden jeweils ~ 5 x 103 Zellen auf einen YEPD-Nährbodenplattiert und sterile, mit 1 nmol (rechte Filter) bzw. 10 nmol (linke Filter)α-Faktor versetzte Filterplättchen auf die Medienoberfläche plaziert.Die Inkubation erfolgte für 2 Tage bei 30°C.
3.1.1.2. Konstruktion des ‘Bait’-Plasmids pAS2-1-STE7
Zur Klonierung des ‘Bait’-Konstrukts wurde der gesamte proteincodierende Bereich des
Gens STE7 durch eine PCR (2.9.7.) mit einer Proofreading-DNA-Polymerase (Pwo) und
mit dem Primerpaar STE7(FW)/STE7(RE), die durch eine NdeI- und eine BamHI-
Schnittstelle modifiziert waren, aus der genomischen DNA des Wildtyp-Stamms
3. Ergebnisse
39
X2180-1A amplifiziert und das Produkt mit einer Länge von 1.568 bp nach einer
elektophoretischen Trennung aus dem Agarosegel isoliert (2.9.11.). Diese Fragmente
wurden nach einer Phosphorylierung der glatten 5'-Enden gereinigt (2.9.16., 2.9.12.) und
zur Zwischenklonierung mit den glatten Enden des SmaI-linearisierten und durch BAP
dephosphorylierten Vektors pUC18 ligiert.
Direkte Einklonierungsversuche in den pAS2-1-Vektor ließen sich zuvor nicht reali-
sieren, da die 5'-Endsequenz zur NdeI-Restriktion vermutlich keine ausreichende Länge
aufwies.
Nach Transformation und Amplifikation dieser Ligationsprodukte in E. coli DH5α
wurde die nach 2.9.2. aus Ampr-Einzelklonen isolierte Plasmid-DNA durch eine
NdeI/BamHI- und eine NdeI- Restriktion auf einem Agarosegel analysiert.
Abbildung 4a zeigt die erwartete Fragmentbildung von 2.444/1.550/246/(14) bp und
3.994/260 bp bei einer der zwei möglichen Insertorientierungen im Plasmid, was die
korrekte Klonierung bestätigte.
Abb. 4: Analyse der Kontrollrestriktionen nach elektrophoretischer Trennung in1 % (w/v) Agarosegelen.a) NdeI/BamHI-Restriktion, NdeI-Restriktion und unrestringierte Probe
(ko) der Zwischenklonierung pUC18-STE7b) EcoRI/NdeI- und EcoRI/BamHI-Restriktion des pAS2-1-STE7-
Konstrukts
3. Ergebnisse
40
Das aus dem Agarosegel präparierte NdeI/BamHI-Fragment (1.550 bp) dieses pUC18-
STE7-Konstrukts wurde mit dem durch eine NdeI/BamHI-Restriktion und
anschließender Fragmentisolierung aus einem Agarosegel vorbereiteten pAS2-1-Vektor
ligiert (2.9.15.). Der von den codierenden Basen 1 bis 441 der vektorintegrierten GAL4-
DNA-Bindedomäne vorgegebene Leserahmen wurde dabei stromabwärts der NdeI-
Schnittstelle durch das STE7-Gen fortgesetzt. Nach erfolgter Transformation von E. coli
DH5α wurde die aus Ampr-Einzelklonen isolierte Plasmid-DNA hinsichtlich der
Regenerierung dieser Schnittstellen voneinander unabhängig durch eine EcoRI/NdeI-
und eine EcoRI/BamHI-Restriktion überprüft. Die Restriktionsstelle EcoRI existiert
dabei singulär im einklonierten STE7-Genfragment.
Die Fragmentbildung von 9.514/402 bp und 8.768/1.148 bp dieses pAS2-1-STE7-
Konstrukts zeigte die Analyse einer elektrophoretischen Trennung (Abbildung 4b) und
bestätigte das korrekte Klonierungsprodukt.
Die richtige Fortsetzung des durch die GAL4-Bindedomäne vorgegebenen Leserahmens
konnte über den Fusionsbereich der NdeI-Ligationsstelle hinaus durch eine DNA-
Sequenzierung (2.9.9.) mit dem 63 bp stromaufwärts zur Fusionsstelle hybridisierenden
Primer pAS(FW) bestätigt werden.
.......ATC GTA TCG CCG GTA TTG CAA TAC CCA GCT TTG ACT CAT ATG TTT CAA.......
Abb. 5: Schematische Darstellung des GAL4(BD)-STE7-Fusionsbereichs ausdem Vektorkonstrukt pAS2-1-STE7.
STE7
GAL4(BD)
pAS2-1
BamHI
ATG
ADH1P GAL4(1-441)
TGA
ADH1T
441
STE7
EcoRINdeI
3. Ergebnisse
41
Nach erfolgter Transformation des Stamms Y190∆ mit diesem in Abbildung 5
schematisch dargestellten pAS2-1-STE7-Konstrukt, wurde das dadurch codierte Produkt,
das durch den konstitutiven ADH1-Promotor regulierte Gal4p(BD)-Ste7p-Fusions-
protein, weiteren Analysen (3.1.2.) unterzogen.
3.1.1.3. Konstruktion eines FUS1P-lacZ-Reportersystems
Um Wechselwirkungen mit der nativen, phosphorylierten Form der extrachromosomal
codierten Ste7p-Signalwegkinase in dem geplanten 2-Hybrid-System erfassen zu
können, mußte sichergestellt sein, daß dieses Protein unter den vorgesehenen
experimentellen Bedingungen durch Modifizierung aktivierbar war und eine
Funktionalität als MEK besaß.
Die Aktivierung der plasmidcodierten Ste7p-Kinase und ihre funktionale Integrität im
Pheromonsignalweg kann in den Zellen mit Hilfe eines Reporterplasmids überprüft
werden, bei dem das lacZ-Gen aus E. coli an den Promotor des FUS1-Gens, einem
fusionsrelevanten Konjugationsgen aus S. cerevisiae (McCaffrey et al., 1987), fusioniert
ist. Im Gegensatz zu anderen Ste12p-regulierten Promotoren, enthält der FUS1-Promotor
drei Bindestellen für den Transcriptionsfaktor Ste12p, die als PRE’s (pheromone-
response elements) bezeichnet werden. Aufgrund einer kooperativen Bindung der durch
das Fus3p aktivierten Ste12-Proteine an diese Elemente, wird bei einer Aktivierung des
Pheromonsignalwegs das Reportergen lacZ bis zu 1.000-fach induziert. (Chang und
Herskowitz, 1990; Herskowitz, 1995). Dadurch ist eine ausreichende Detektions-
möglichkeit gewährleistet. Die vom lacZ-Gen codierte β-Galaktosidase wird dabei
proportional der Induktionsstärke exprimiert und läßt durch die Bestimmung der
katalytischen Aktivität eine differenzierbare Quantifizierung zu.
Zur Konstruktion eines derartigen Reporterplasmids wurde die erforderliche FUS1-
Promotorsequenz in einem Fragment von 455 bp vor dem Startcodon bis einschließlich
3. Ergebnisse
42
der ersten 390 bp der proteincodierenden FUS1-Gensequenz per PCR mit dem
Primerpaar FUSP(FW)/FUSP(RE) und der Proofreading-Polymerase Pwo aus der
genomischen DNA des Stamms X2180-1A amplifiziert (2.9.7.). Nach der
Fragmentisolierung aus einem präparativen Gel erfolgte eine Phosphorylierung der
5’-Produktenden (2.9.16.) und eine EcoRI-Restriktion an den 3’-Enden. Dieses 748 bp-
Fragment wurde im Anschluß einer weiteren Isolierung aus einem Agarosegel in die
Ligation (2.9.15.) mit dem Promotor-Testvektor YEp357R eingesetzt, der zuvor durch
eine SmaI/EcoRI-Restriktion und anschließender Isolierung aus einem Agarosegel
vorbereitet wurde. Der von den codierenden Basen 1 bis 293 des FUS1-Gens
vorgegebene Leserahmen wurde dabei stromabwärts der EcoRI-Schnittstelle durch das
vektorintegrierte lacZ-Gen fortgesetzt.
Nach Transformation und Amplifikation dieser Ligationsprodukte in E. coli DH5α
wurde die nach 2.9.2. aus Ampr-Einzelklonen isolierte Plasmid-DNA mit der
Endonuclease PstI restringiert. Ein Restriktionsort befindet sich jeweils in der
Klonierungsstelle (MCS) des Vektors und ein anderer am Anfang des Insertfragments.
Die korrekte Fragmentbildung dieses YEp357R-FUS1P-Konstrukts von 217 bp und
8.531 bp zeigte die Analyse einer elektrophoretischen Trennung (Abbildung 6a).
3. Ergebnisse
43
Abb. 6: Restriktionsanalysen zur Bestätigung korrekter Klonierungen.a) PstI-Restriktion und unrestringierte Probe (ko) des YEp357R-
FUS1P-Konstrukts. Die elektrophoretische Trennung erfolgte ineinem 2 % (w/v) Agarosegel.
b) EcoRI-Restriktion des YEp357R-LEU2-FUS1P-Konstrukts mitrichtiger Fragmentbildung (Klon 7) und falschen Fragmentbildungen(Klone 1 - 6 und 8) der Ligationsprodukte. Die elektrophoretischeTrennung erfolgte in einem 1 % (w/v) Agarosegel.
Zur Anwendung in Kombination mit dem 2-Hybrid-Stamm Y190∆ mußte dieses
Konstrukt noch um den auxotrophen Komplementationsmarker LEU2 erweitert
werden.
Dieses Gen konnte als Bestandteil eines 4.066 bp-Fragments aus dem Plasmid YEp13
durch eine PstI-Restriktion und Trennung in einem Agarosegel isoliert werden. Das
YEp357R-FUS1P-Konstrukt wurde mit dem gleichen Enzym linearisiert und ebenfalls
als Fragment aus einem Agarosegel isoliert. Nach anschließender Ligation und erfolgter
Transformation von E. coli DH5α konnte die korrekte Klonierung und die
Regenerierung der entscheidenden EcoRI-Fusionsstelle durch eine Restriktion der aus
Ampr-Einzelklonen isolierten Plasmid-DNA mit der Endonuclease EcoRI bestätigt
werden. Eine zweite Schnittstelle befindet sich dabei im LEU2-Gen.
3. Ergebnisse
44
Die Abbildung 6b zeigt die entsprechende Gelanalyse mit der erwarteten Fragment-
bildung von 2.420 bp und 10.200 bp des Ligationsprodukts bei Klon 7 als Bestätigung
einer korrekten Klonierung, während die übrigen Klone eine falsche Fragmentbildung
der Ligationsprodukte aufwiesen.
Die wesentlichen Bestandteile dieses Klonierungsprodukts zeigt Abbildung 7. Eine
Funktionalitätsüberprüfung dieses YEp357R-LEU2-FUS1P-Konstrukts erfolgte im
Rahmen der Untersuchung zur Signalwegintegrität der Gal4p(BD)-Ste7p-Fusion
(3.1.2.4.).
.......CTT AAA AGG AAT TCC CAG CTT GCT CCC.......
Abb. 7: Schematische Darstellung der wesentlichen Bestandteile des YEp357R-LEU2-FUS1P Reporterkonstrukts, das auf einer FUS1P-lacZ-Fusionbasiert.
3.1.2. Überprüfung der Systemvoraussetzungen
3.1.2.1. Kontrolle der Vitalität
Besonders bei regulatorischen Proteinen, wie den Fus3p/Kss1p-Kinasen und der Ste7p-
Kinase, die intrazellulär nur in einer geringer Anzahl von ~ 5.000 und < 2.000
Molekülen vorhanden sind (Bardwell et al., 1996), besteht bei einer starken
Überexpression wie durch den konstitutiven ADH1-Promotor des pAS2-1-Plasmids die
Gefahr, daß die Zellvitalität beeinträchtigt wird.
lacZFUS1-Promotor
FUS1
FUS1(1-293)LEU2
PRE PRE PRE
PstI EcoRIEcoRI
lacZ
3. Ergebnisse
45
Zur Überprüfung dieser Möglichkeit wurde der mit dem Konstrukt pAS2-1-STE7 und zur
positiven Kontrolle mit dem Leerplasmid pAS2-1 transformierte Stamm Y190∆ hinsicht-
lich des Wachstums auf SD-Trp Selektivmedium überprüft. Da hierbei zwischen den
beiden Transformanten keine Wachstumsunterschiede festgestellt wurden, konnte eine
Vitalitätsbeeinflussung durch das Gal4p(BD)-Ste7p-Produkt ausgeschlossen werden,
wobei von dessen vollständiger und stabiler Expression zunächst ausgegangen wurde.
3.1.2.2. Kontrolle unspezifischer Reportergen-Aktivierung
Die Aktivierung der im Stamm Y190∆ enthaltenen Reportergene HIS3 und lacZ sollte
im Rahmen des 2-Hybrid-Screenings ausschließlich auf eine spezifische Protein-Protein-
Wechselwirkung der Gal4p(BD)-Fusion mit einer Gal4p(AD)-Fusion zurückzuführen
sein. Deshalb mußte das Gal4p(BD)-Ste7p-Fusionsprotein zuvor darauf überprüft
werden, ob es eventuell unspezifische Aktivierungen der Reportergene in den Zellen
verursacht. Mögliche Ursachen dafür könnten eine unspezifische Bindung an die Gal4p-
Aktivierungsdomäne oder eine autonome Transcriptionsaktivierung durch die
unspezifische Bindung an die relevanten Promotorelemente sein.
Die zu diesem Nachweis erzeugten Cotransformanten des Stamms Y190∆ beinhalteten
jeweils ein GAL4(BD)-Plasmid und ein GAL4(AD)-Plasmid in den Kombinationen
pAS2-1-STE7/pACT2; pAS2-1/pACT2 (negative Kontrolle) und pVA3-1/pTD1-1
(positive Kontrolle). Die HIS3-Aktivierung wurde durch einen Vergleich des
konditionalen Wachstums auf SD-Trp,-Leu,-His,+3-AT-Medium und die lacZ-
Aktivierung durch einen β-Galaktosidase-Enzymtest mit dem Substrat X-Gal nach
2.10.5. überprüft.
Die mit dem STE7-Konstrukt cotransformierten Zellen wiesen ebenso wie die
Negativkontrolle den erwarteten His-/lacZ--Phänotyp auf, während die Positivkontrolle
den erwarteten His+/lacZ+-Phänotyp erkennen ließ. Somit war bestätigt, daß unter der
3. Ergebnisse
46
Voraussetzung einer vollständigen und stabilen Expression von dem Gal4p(BD)-Ste7p-
Fusionsprotein keine unspezifische Reportergen-Aktivierung ausging.
3.1.2.3. Expressions- und Modifikationsüberprüfung des Ste7p-Fusionsproteins
Die stabile und vollständige Expression der an die Gal4p-Bindedomäne fusionierten 515
Aminosäuren des Ste7-Proteins ist eine essentielle Voraussetzung, um potentielle
Bindungspartner mit dem 2-Hybrid-System erfassen zu können. Deshalb mußte dessen
Existenz in entsprechenden Zellysaten zunächst nachgewiesen werden.
Ein weiterer, nicht unwesentlicher Aspekt war die Tatsache, daß durch die Gal4p(BD)-
Fusionierung eine Konformationsänderung des Ste7p nicht ausgeschlossen werden
konnte, was unter Umständen die Modifikation dieses Proteins beeinträchtigen würde.
Daher sollte zusätzlich gezeigt werden, daß die entsprechenden Acceptordomänen des
Ste7p für eine Phosphorylierungsreaktion frei zugänglich sind.
Dieser Nachweis kann durch einen unmittelbaren Vergleich des Ste7p aus zwei
parallelen Kulturen mit und ohne α-Faktor-Induktion erfolgen. Da die multiple
Phosphorylierung des Ste7-Proteins in der Gelelektrophorese eine Bandenretardierung
verursacht, die einer Molekulargewichtsdifferenz von ~ 12,0 kDa entspricht (Yashar et
al., 1995), können entsprechende Isoformen leicht differenziert werden.
Um die Expression und Modifikation des Ste7p durch eine Immundetektion in einem
Westernblot überprüfen zu können, erfolgte zunächst eine elektrophoretische Trennung
der nach 2.10.1. von den Kulturen Y190∆ + pAS21-STE7 (ohne α-Faktor-Induktion),
Y190∆ + pAS21-STE7 (mit 2 µM α-Faktor-Induktion) und Y190∆ + pVA3-1
(Kontrolle) erstellten Proteinextrakte in einem Polyacrylamid-Gel.
In dem daraus angefertigten Westernblot konnten die Gal4p(BD)-Fusionsproteine nach
2.10.3. durch eine Bindung Gal4p(BD)-spezifischer Primär-Antikörper (Kaninchen α-
S. cerevisiae Gal4p(BD)) mit Peroxidase-konjugierten Sekundär-Antikörpern (Ziege α-
3. Ergebnisse
47
Kaninchen IgG - Peroxidase) und einem Luminol-Substrat (ECL Westernblot-Detek-
tionsreagens) als Signal auf einem Röntgenfilm detektiert werden (Abbildung 8).
Abb. 8: Immunoblot-Analyse des Gal4p(BD)-fusionierten Ste7-Proteins auseiner nicht induzierten und einer α-Faktor induzierten Kultur (pAS2-1-STE7), sowie des p53-Proteinfragments der Kontrollkultur (pVA3-1).Von jedem Proteinextrakt wurde das Zelläquivalent von 0,2 OD600-Einheiten zur Elektrophorese auf ein 10 % (w/v) Acrylamidgelaufgetragen. Die Positionen des Molekulargewichtsmarkers entsprechender elektrophoretischen Trennung in Nachbarspuren des gleichen Gels.Die Expositionsdauer des Röntgenfilms betrug 1 min.
Das von dem Lysat der Kontrollkultur (pVA3-1) erzeugte Primärsignal ( [ ) mit der
apparenten Masse von ~ 52 kDa entspricht dem erwarteten Molekulargewicht des
Gal4p(BD)-fusionierten p53-Fragments (318 Aminosäuren-Fragment: ~ 35,7 kDa +
Gal4p(BD): ~ 16,6 kDa).
Im Gegensatz dazu dominiert in dem Lysat der pAS2-1-STE7-transformierten Kultur
ohne α-Faktor ein Signal ( ) in Höhe der apparenten Masse von ~ 86 kDa, das
dem erwarteten Molekulargewicht des Gal4p(BD)-fusionierten Ste7p in seiner
3. Ergebnisse
48
hyperphosphorylierten Isoform (Ste7p: ~ 57,7 kDa + Phosphate: ~ 12,0 kDa
+ Gal4p(BD): ~ 16,6 kDa) entspricht. Das wesentlich schwächere Signal ( ) hingegen,
mit einer schnelleren Migration in Höhe von ~ 74 kDa, korrespondiert zu der
unphosphorylierten Isoform dieses Proteins, während die dazu retardierte Bande ( )
eine intermediäre Übergangsform darstellt. Diese beiden Isoformen konnten durch die
α-Faktor-Induktion der Parallelkultur offenbar vollständig in den hyperphosphorylierten
Zustand überführt werden.
Diese Analysen zeigten, daß das Gal4p(BD)-fusionierte Ste7p des pAS2-1-STE7-
Konstrukts vollständig und stabil in den Zellen exprimiert wurde, und daß die
Phosphorylierungsdomänen zu Modifikationen frei zugänglich waren.
3.1.2.4. Überprüfung der funktionalen Integrität des Ste7p-Fusionsproteins
Nachdem die vollständige Expression und Modifizierbarkeit des fusionierten Ste7p
nachgewiesen war, wurde mit zwei voneinander unabhängigen Versuchsansätzen die
funktionale Integrität der extrachromosomal codierten Ste7p-Proteinkinase im Pheromon-
signalweg als weitere Voraussetzung für eine optimale Interaktionskompetenz überprüft.
Zunächst sollte untersucht werden, ob durch das Ste7p-Fusionsprotein nach einer
Aktivierung des Pheromonsignalwegs eine verstärkte, Ste12p-abhängige Transcriptions-
aktivierung des FUS1P-regulierten lacZ-Reportergens ermöglicht ist. Bei einer
funktionalen Integrität des extrachromosomal codierten Ste7p wurde gegenüber einem
nicht überexprimierenden Stamm ein amplifiziertes Aktivierungssignal erwartet.
Um dieses quantitativ erfassen zu können, wurden die Stämme Y190∆ + pAS2-1-STE7
und Y190∆ + pAS2-1 (Leervektor) mit dem in 3.1.1.3. erstellten FUS1P-lacZ-
Reporterkonstrukt YEp357R-LEU2-FUS1P cotransformiert. Die daraus in SD-Trp,-Leu
selektiv angezüchteten Flüssigkulturen wurden in ein YEPD-Vollmedium umgesetzt, um
3. Ergebnisse
49
während des Induktionszeitraums eine unlimitierte Nährstoffversorgung zu
gewährleisten. Dabei ist die Gefahr einer gravierenden Plasmidsegregation als Folge des
fehlenden Selektionsdrucks in der Zeitspanne von 6 Stunden zu vernachlässigen.
0
50
100
150
200
250
300
350
400
0 50 100 150 200 250 300 350 400
Zeit (min)
Akt
ivit
ät (
Uni
t)
Abb. 9: Grafische Darstellung der Pheromonsignalweg-Aktivierung in Abhän-gigkeit von der Zeit.Die Induktion der Zellen erfolgte mit 1 µM α-Faktor zum Zeitpunktt = 0 und wurde durch die Ste12p-abhängige Transcriptionsaktivierungeines FUS1P-lacZ-Reportersystems detektiert.oo Y190∆ + pAS2-1 + YEp357R-LEU2-FUS1P /− α-Faktorn Y190∆ + pAS2-1 + YEp357R-LEU2-FUS1P /+ α-Faktor∆∆ Y190∆ + pAS2-1-STE7 + YEp357R-LEU2-FUS1P /− α-Faktors Y190∆ + pAS2-1-STE7 + YEp357R-LEU2-FUS1P /+ α-Faktor
3. Ergebnisse
50
Diese Kulturen wurden nach einer Vorinkubation in der logarithmischen
Wachstumsphase bei einer Zelldichte von OD600 = 0,2 mit 1 µM α-Faktor induziert und
jeweils eine Parallelkultur zur Kontrolle nicht induziert. Mit den in 60 bzw. 90
minütigem Abstand entnommenen Zellaliquots wurde die β-Galaktosidase-
Enzymaktivität nach 2.10.4. kolorimetrisch bestimmt. Die Abbildung 9 zeigt eine
grafische Auswertung dieser Meßergebnisse.
Wie dieser Grafik zu entnehmen ist, konnte in der Ste7p-überexprimierenden Kultur
bereits ohne α-Faktor-Induktion eine moderate Erhöhung der Basisaktivität gegenüber
der mit dem Leerplasmid transformierten Kultur verzeichnet werden.
Durch die Induktion mit α-Faktor erfolgte in der überexprimierenden gegenüber der
nicht überexprimierenden Kultur eine signifikante Steigerung der Ste12p-vermittelten
FUS1P-Induktion.
Sowohl der Befund des amplifizierten Aktivierungssignals als auch der des amplifizierten
Basissignals lassen auf eine Integrität des plasmidcodierten Ste7p in diesem Signalweg
schließen, wodurch sich die Funktionsfähigkeit als aktivierbare MEK ableiten läßt.
Unabhängig von dieser Induktionsanalyse sollte die funktionale Integrität des
extrachromosomal codierten Ste7p auch durch die homologe Komplementation einer
ste7-Mutation in einem S. cerevisiae-Stamm, dessen Zellen einen sterilen Phänotyp
aufweisen, bestätigt werden. Für diese Analyse eignete sich der Stamm 381G-43A. Das
ste7- und das trp1-Allel dieser Zellen beinhalten Amber-Mutationen, die aufgrund eines
thermosensitiven Suppressors SUP4-3(t.s.amber) konditional nur bei restriktiver
Temperatur (34°C) phänotypisch ausgeprägt werden.
Nach einer Transformation dieses Stamms mit dem Konstrukt pAS2-1-STE7 bzw. mit
dem Leervektor pAS2-1 (negative Kontrolle) wurden die modifizierten Zellen bei 34°C
auf einem selektiven SD-Trp-Nährboden mit dem Pheromon α-Faktor konfrontiert.
3. Ergebnisse
51
381G-43A (ste7) + pAS2-1-STE7 381G-43A (ste7) + pAS2-1
Abb. 10: Überprüfung der Komplementation einer ste7-Zellmutation durchdas plasmidcodierte Ste7p-Fusionsprotein in einem Hemmhoftest(Halo-Assay) mit α-Faktor.Von den Kulturen 381G-43A (ste7) + pAS2-1-STE7 und 381G-43A(ste7) + pAS2-1 (negative Kontrolle) wurden jeweils ~ 5 x 103 Zellenauf einen SD-Trp-Nährboden plattiert und ein steriles, mit 10 nmolα-Faktor versetztes Filterplättchen auf die Medienoberfläche plaziert.Die Inkubation erfolgte für 2 Tage bei 34°C.
Wie der Abbildung 10 zu entnehmen ist, bildete die Kultur mit der plasmidcodierten
Überexpression der Ste7p-Fusion einen Hemmhof um den α-Faktor-Auftragungsort aus.
Der ste7-Defekt dieser Zellen wird demnach durch das Fusionsprotein komplementiert,
was einen fertilen Phänotyp zur Folge hat. Die Kontrollzellen mit dem Leerplasmid
hingegen wiesen erwartungsgemäß einen sterilen Phänotyp auf, der dem ste7-Genotyp
entspricht.
Dieses Ergebnis bestätigt, unabhängig von der vorherigen FUS1P-Induktionsanalyse, die
funktionale Integrität der als Fusionsprotein überexprimierten Ste7p-Proteinkinase in der
MEK-Position des Pheromonsignalwegs.
3. Ergebnisse
52
3.1.3.Isolierung potentieller Ste7p-Bindungspartner aus der pACT2-FRYL-Genbank durch ein 2-Hybrid-Screening
Nachdem für den 2-Hybrid-Stamm Y190∆ die far1∆-Modifikation und für das
Gal4p(BD)-fusionierte Zielprotein Ste7p das Ausbleiben einer Zytotoxizität und einer
unspezifischen Reportergen-Aktivierung, sowie die vollständige Expression und die
funktionale Integrität bestätigt waren, bestanden damit die erforderlichen Systemvoraus-
setzungen für das 2-Hybrid-Screening einer Genbank.
Aufgrund des vorgesehenen Konzepts und des dazu relevanten Untersuchungsergeb-
nisses (3.1.2.3., 3.1.2.4.), wonach nur mit einer Pheromoninduktion der Signalweg
aktiviert und das plasmidcodierte Ste7p vollständig in die vorgesehene Modifikations-
form überführt werden konnte, wurden die Interaktionspartner unter dem Einfluß einer
α-Faktor-Induktion isoliert.
Dazu wurden die Zellen des Stamms Y190∆ + pAS2-1-STE7 mit der nach 2.9.3.
amplifizierten Genbibliothek pACT2-FRYL transformiert und die Ausplattierung der
Cotransformanten auf den mit 1 µM α-Faktor supplementierten SD-Trp,-Leu,-His,
+3-AT-Nähragar entsprechend 2.12.1. durchgeführt. Eine Wachstumsselektion erfolgte
dabei durch das konditional in Folge von in vivo-Proteininteraktionen exprimierte HIS3-
Gen.
Die Anzahl der auf einer großen Selektionsplatte (φ 15 cm) aufgetragenen
Cotransformanten wurde auf durchschnittlich 60.000 begrenzt, da wegen des α-Faktor-
degradierenden ‘Barrier’-Faktors (= Bar1p-Protease) (MacKay et al., 1988), der von den
MATa-Zellen sezerniert wird, die biologische Wirksamkeit des zugefügten Pheromons
durch die Zelldichte limitiert ist.
Zur Wachstumskontrolle wurde der mit den Plasmiden pVA3-1/pTD1-1 (positive
Kontrolle) und pAS2-1-STE7/pACT2 (negative Kontrolle) cotransformierte, isogene
Stamm verdünnt auf dem gleichen Medium ausplattiert.
Insgesamt wurden durch sukzessive Transformationsetappen nach dieser Methodik
~ 15 x 106 Cotransformanten überprüft. Das entspricht dem 3-fachen der als ‘Anzahl
3. Ergebnisse
53
unabhängiger Klone’ angegebenen, ursprünglich erzeugten Genbank-Einzelklone und
korreliert mit den Vorgaben nach Fromont-Racine et al. (1997) und dem ‘Matchmaker
Two-Hybrid System 2’-Handbuch der Firma Clontech.
Aus diesem 2-Hybrid-Screening gingen insgesamt 527 His+-prototrophe Einzelklone mit
einer potentiellen Ste7p-Proteinwechselwirkung hervor, die durch weitere Analysen
bestätigt werden mußten.
3.1.4. Verifizierung der Protein-Interaktionen
Zur Überprüfung der unmittelbar aus dem 2-Hybrid-Screening isolierten His+-
prototrophen Klone wurden weitere Analysen nach einer Strategie durchgeführt, die in
der Abbildung 11 schematisch dargestellt ist. Das Ziel dieses Konzepts war eine
effiziente Differenzierung der potentiell positiven Bindungspartner in positive und falsch
positive Proteininteraktionen.
Falsch positive Befunde können aus unspezifischen Reportergen-Aktivierungen
resultieren, die nicht auf eine spezifische Wechselwirkung des Ste7p mit den
genbankcodierten Proteinen zurückzuführen sind. Die möglichen Ursachen werden im
Zusammenhang mit den jeweiligen Gegenmaßnahmen in den einzelnen Schritten dieser
Selektion dargestellt, die zu der Eliminierung falsch positiver Klone führen.
Des weiteren wurde im Rahmen dieser Selektion auch die Eliminierung von Klonen
berücksichtigt, die mehrfach mit identischen Genbankplasmiden durch dieses 2-Hybrid-
Screening isoliert wurden.
3. Ergebnisse
54
Y190∆ + pAS2-1-STE7 Transformation mit der pACT2-FRYL-Genbibliothek
His+, Trp+, Leu+
Segregation nichtessentieller Genbankplasmide
His+, Trp+, Leu+
β-Galaktosidase-Filtertest
His+, lacZ+, Trp+, Leu+
Gruppierung identischer Klone durch PCR/HaeIII-Restriktion
Gruppenrepräsentanten
BD-Plasmid-Segregation (pAS2-1-STE7)
Cyhr, lacZ-, Trp-, Leu+
Retransformation
+ pAS2-1 + pAS2-1-STE7 + pLAM5’-1
His-, lacZ-, Trp+, Leu+ His+, lacZ+, Trp+, Leu+ His-, lacZ-, Trp+, Leu+
Abb. 11: Schematischer Ablauf des 2-Hybrid-Screenings und der anschließen-den Überprüfung daraus isolierter, potentiell positiver Klone.Der für den jeweiligen Selektionsschritt relevante Phänotyp ist infetten Lettern notiert.
In Vorbereitung auf diese Analysen wurden die isolierten Klone zunächst auf dem zuvor
verwendeten Medium erneut ausgestrichen und nochmals angezüchtet. Zum einen sollte
durch diese Nachselektion die His+-Prototrophie der einzelnen Klone bestätigt werden,
zum anderen wurde dadurch auch die Segregation nichtessentieller Genbankplasmide
aus mehrfachtransformierten Zellen initiiert, deren Produkte keinen Bezug zu einer
Ste7p-Interaktion haben.
Sequenzierung
3. Ergebnisse
55
Die parallele Aufnahme multipler Plasmidspezies in eine Rezipientenzelle ist durch den
Transformationsprozeß unvermeidbar. Durch eine Begrenzung der dazu verwendeten
Plasmidmengen konnte die Häufigkeit mehrfachtransformierter Zellen jedoch schon im
Voraus reduziert werden. Für eine erfolgreiche Durchführung der anschließenden
Analysen war die ausschließliche Etablierung der zur Reportergen-Aktivierung
essentiellen Plasmidspezies unbedingte Voraussetzung.
Diese Anzuchten zur Nachselektion dienten auch gleichzeitig als ‘Masterkulturen’ zur
Bereitstellung des Zellmaterials für die anschließenden Versuche.
Um zu überprüfen, ob für die Protein-Interaktion eines dieser Klone die Notwendigkeit
der Signalwegaktivierung durch eine α-Faktor-Induktion bestand, wurden die Zellen
parallel auf identische Selektionsplatten ohne α-Faktor ausgestrichen und das
Wachstumsverhalten verglichen. Es ergab sich jedoch in keinem Fall ein Wachstums-
unterschied durch eine veränderte HIS3-Reportergen-Aktivierung zu den entsprechenden
Ausstrichen mit α-Faktor.
Eine häufige Ursache für das Auftreten falsch positiver, His+-prototropher Cotrans-
formanten des ersten Selektionsschrittes kann eine sequenzspezifische Affinität der
Gal4p(AD)-fusionierten Proteine zu dem HIS3-Promotor, der dieses Reportergen
reguliert, mit einer daraus resultierenden Transcriptionsaktivierung sein (Bartel et al.,
1993b). Deshalb ist es sinnvoll, die Proteininteraktionen dieser Klone zunächst mit Hilfe
eines zweiten, von HIS3 unabhängigen Reportersystems zu verifizieren. In dem hier
verwendeten Stamm Y190∆ wird dieses durch das lacZ-Gen unter der Kontrolle eines
GAL1-Promotors ermöglicht.
Die lacZ-Reportergen-Aktivierung der isolierten His+-Phänotypen wurde analog zur
HIS3-Aktivierung wiederum durch zwei Parallelansätze in Anwesenheit und
Abwesenheit von 1 µM α-Faktor analysiert.
Dazu wurden die Klone zu Impfstrichen auf SD-Trp,-Leu-Nährböden kultiviert, die
wegen der Ade--Auxotrophie dieses Stamms mit Adenin (60 mg/l) supplementiert waren.
3. Ergebnisse
56
Unter Adeninmangel würde dieser Stamm aufgrund der ade2-Mutation rote Pigmente
aus einem Stoffwechselintermediat (Aminoimidazol-Ribonucleotid-Derivat)
akkumulieren, das die blaufarbigen Spaltprodukte des folgenden Enzymtests überlagern
könnte.
Der β-Galaktosidase-Enzymtest wurde mit den auf Nylontransfermembranen erstellten
Replikationsabzügen nach 2.10.5. durchgeführt. Die fixierten Zellen wurden dazu durch
Kälteschock und Auftauen permeabilisiert. Zur positiven und negativen Kontrolle
dienten die bereits oben beschriebenen Cotransformanten.
Eine qualitative Beurteilung der lacZ-Phänotypen erfolgte nach ~ 8 stündiger Umsetzung
des chromogenen Substrates X-Gal. Abbildung 12 zeigt dieses Versuchsergebnis
exemplarisch anhand einer repräsentativen Auswahl isolierter Klone.
Abb. 12: lacZ-Phänotypüberprüfung His+-prototropher Klone am Beispiel derrepräsentativen Klone 341 - 367. Eine Differenzierung der lacZ-Aktivierung erfolgte ebenso wie zuvor bei der HIS3-Aktivierungdurch die Zellkultivierung (3 Tage bei 30°C) in Anwesenheit undAbwesenheit von 1 µM α-Faktor. Die davon erzeugten Filter-replikate wurden nach einer Permeabilisierung der gebundenenZellen 8 Stunden mit dem Substrat X-Gal bei 30°C inkubiert.
3. Ergebnisse
57
In Übereinstimmung mit der zur His+-Prototrophie durchgeführten Parallelanalyse von
α-Faktor induzierten und nichtinduzierten Zellen ergab sich auch in diesem Test keine
Differenz zwischen den induzierenden und nichtinduzierenden Kultivierungs-
bedingungen.
Aufgrund dieses Ergebnisses wurde im weiteren Verlauf von Parallelanalysen dieser Art
Abstand genommen und die entsprechenden Versuche ohne weitere α-Faktor-
Induktionen durchgeführt.
Als Bilanz dieses Selektionsschrittes konnten 63 % der in dem Test eingesetzten His+-
prototrophen Klone aufgrund einer fehlenden lacZ-Reportergen-Aktivierung verworfen
werden. Die übrigen Klone mit einem His+/lacZ+-Phänotyp wurden den weiteren
Analysen zugeführt.
Bevor weitere Analysen zur Verifizierung der Proteininteraktionen durchgeführt werden
konnten war es sinnvoll, die selektierten His+/lacZ+-Klone, die in ihren AD-Vektoren
identische Genbank-DNA enthielten, in Gruppen zusammenzufassen und nur jeweils
einen Gruppenrepräsentanten weiter zu untersuchen. Die Gruppierung wurde an dieser
Position durchgeführt, da die nachfolgenden Versuche wegen des hohen Aufwands mit
einer möglichst geringen Anzahl von Klonen erfolgen sollten.
Eine Gruppenzuordnung durch die Entwicklung von Fragmentmustern einer Restriktion
der kompletten Genbankplasmide erschien hierbei nicht sinnvoll. Hexanucleotid-
spezifische Restriktionsenzyme würden aufgrund zu weniger Restriktionsstellen in der
kurzen Insert-DNA (0,8 - 2,5 kb) keine differenzierbaren Fragmentmuster bilden. Ein
häufiger restringierendes, tetranucleotidspezifisches Enzym hingegen würde zu starke
Überlagerungen durch die Fragmente der 8,1 kb umfassenden Vektorsequenz
verursachen.
Deshalb wurde die genomische Insert-DNA der Genbankplasmide zur Gruppierung der
selektierten His+/lacZ+-Klone zunächst durch eine PCR amplifiziert und die
entsprechenden Produkte später durch eine häufig restringierende Endonuclease in gut
differenzierbare Muster fragmentiert.
3. Ergebnisse
58
Zu dieser Amplifikation dienten die Microwellenlysate der entsprechenden Zellen als
DNA-Template und die mit ihren 3’-Enden 95 bp stromaufwärts und 68 bp strom-
abwärts zur Einklonierungsstelle hybridisierenden Oligonucleotide pACT(FW) und
pACT(RE) als Primer.
Zur Kontrolle der Amplifikation und zur weiteren Bestätigung, daß in den Zellen eines
Klons nur eine uniforme Plasmidspezies etabliert war, wurde ein Aliquot dieser PCR-
Ansätze direkt in einem Agarosegel analysiert. In Abbildung 13a ist diese Analyse
exemplarisch für die Klone 109 - 125 dargestellt.
Ein weiteres Aliquot wurde mit der tetranucleotidspezifischen Endonuclease HaeIII
verdaut und die Fragmentbildung nach einer elektrophoretischen Trennung analysiert
(Abbildung 13b). Die Gruppenzuordnung der einzelnen Klone erfolgte unmittelbar
durch diese Analyse unter der Berücksichtigung einer Größenzuordnung der
unfragmentierten Produktbanden. Ermöglichte das, wie in wenigen Ausnahmen, keine
eindeutige Zuordnung, wurde jeweils ein weiteres Aliquot dieser PCR-Produkte mit der
Endonuclease Sau3AI verdaut, die eine andere Tetranucleotidspezifität besitzt, und
entsprechend analysiert.
Nach dieser Erfassung von Klonen mit identischen Genbank-Inserts wurde von jeder
differenzierbaren Gruppe, deren Mitgliederzahl zwischen 1 und 12 variierte, jeweils ein
Repräsentant im Folgenden weiter untersucht.
3. Ergebnisse
59
Abb. 13: Exemplarische Gruppenzuordnung einzelner Klone (109 - 125)anhand der in pACT2 insertierten Genbank-DNA, die durch PCRamplifiziert wurde.Die Zuordnung erfolgte durch die Analyse der unrestringiertenAmplifikate nach elektrophoretischer Trennung in einem 1 % (w/v)Agarosegel (a) und der Fragmentmuster einer HaeIII-Restriktiondieser Produkte nach elektrophoretischer Trennung in einem 2 %(w/v) Agarosegel (b). Die aufgetragenen Quantitäten entsprechenjeweils 3 µl eines PCR-Ansatzes.Der Marker 2 (pBR322/HaeIII; Sigma-Aldrich Chemie GmbH)besteht aus Fragmenten von 587 bis 8 bp.
3. Ergebnisse
60
Der letzte Schritt in diesem Gesamtkonzept der Überprüfung potentieller Ste7p-
Interaktionspartner diente dem Ausschluß jener Klone, bei denen eine unspezifische
Aktivierung beider Reportergene durch die Gal4p(AD)-Fusionsproteine der Genbank-
plasmide verursacht wurden.
Als mögliche Ursache für eine autonome Transcriptionsaktivierung kommt die
unspezifische Bindung an das relevante Promotorelement GAL1-UAS (upstream
activating sequence = Gal4p-DNA-Bindestelle) der beiden Reportergene bzw. an dort
lokalisierte Proteine in Betracht. In manchen Fällen erfordert dieses noch die
Anwesenheit eines ansonsten belanglosen Gal4p(BD)-Fusionsproteins (z.B. Lamin C).
Des weiteren kann auch eine unspezifische Bindung an die Gal4p-Bindedomäne für eine
falsch positive Aktivierung ursächlich sein (Bartel et al., 1993a).
Eine Differenzierung der Ste7p-spezifischen Aktivierungen von den erwähnten
unspezifischen Aktivierungen konnte dadurch erfolgen, daß die Genbankplasmide der
selektierten Klone nur mit dem pAS2-1-Leervektor oder dem pLAM5’-1-Plasmid
(Lamin C-Kontrollplasmid) als Negativkontrollen in einer Zelle vereinigt wurden und
die Aktivierung der zwei Reportergensysteme gegenüber der Aktivierung durch das
pAS2-1-STE7-Konstrukt verglichen wurden.
Dazu wurde bei den His+/lacZ+-Gruppenrepräsentanten zunächst ein Verlust des BD-
Plasmids pAS2-1-STE7 durch eine Segregation unter Cyhr-Selektion nach 2.12.2.
herbeigeführt, wobei das jeweilige Genbankplasmid erhalten blieb. Das ersparte die
sonst erforderliche Prozedur einer Isolierung und Retransformation dieser AD-Plasmide.
Die Cyhr, Trp-, Leu+-Segreganten wurden anschließend einem β-Galaktosidase-Filtertest
(2.10.5.) unterzogen, um eine eventuell autonome Reportergen-Aktivierung ermitteln zu
können. Zur positiven Kontrolle wurde der nur mit dem pCL1-Plasmid transformierte,
isogene Stamm verwendet. Dieses Plasmid exprimiert das vollständige Gal4-Protein und
komplementiert ebenfalls die Leu--Auxotrophie dieses Stamms. Von den so überprüften
Klonen erwiesen sich 7 % als lacZ+ und wurden deshalb nicht weiter berücksichtigt.
Die so erhaltenen Zellen des Phänotyps Cyhr, lacZ-, Trp-, Leu+ wurden in drei parallelen
Ansätzen jeweils mit den Plasmiden pAS2-1, pAS2-1-STE7 und pLAM5’-1 nach der
3. Ergebnisse
61
Schnellmethode (Gietz und Woods, 1994) retransformiert. Eine Option, die Plasmide
nach einer effizienten Methode durch die Konjugation mit den zuvor transformierten
Zellen des Stamms Y187 (MATα) (Harper et al., 1993) zusammenzuführen bestand
hierbei nicht, da die far1∆-modifizierten Zellen konjugationsdefekt sind (Chang und
Herskowitz, 1990).
Abb. 14: Überprüfung der lacZ-Reportergen-Aktivierung nach einerRetransformation potentiell positiver Klone am Beispiel der reprä-sentativen Klone 217, 220 und 221 mit den drei BD-PlasmidenpAS2-1, pAS2-1-STE7 und pLAM5’-1.Der lacZ-Phänotyp wurde nach 8 stündiger X-Gal-Umsetzung derpermeabilisierten Filterreplikate bestimmt.Die Überprüfungen der His+-Prototrophie waren dazu überein-stimmend.
Von den auf SD-Trp,-Leu-Medium selektierten Cotransformanten wurden jeweils drei
unabhängige Klone jeder Plasmidkombination auf SD-Trp,-Leu,-His,+3-AT-Nährböden
replikaplattiert, um die Aktivierung des HIS3-Reportergens zu überprüfen, während die
lacZ-Aktivierung eines Replika-Abzugs durch einen β-Galaktosidase-Filtertest bestimmt
wurde (Abbildung 14).
3. Ergebnisse
62
Bei allen Klonen waren die Ergebnisse der His3-Aktivierung mit der lacZ-Aktivierung
übereinstimmend. Von den so untersuchten Gruppenrepräsentanten zeigten 51 % ein
falsch positives Verhalten durch die zusätzliche, unspezifische Reportergen-Aktivierung
in Kombination mit dem pAS2-1-Leerplasmid und/oder dem pLAM5’-1-Kontroll-
plasmid. Diese Klone wurden verworfen, während von den übrigen Klonen, die nur in
Kombination mit dem pAS2-1-STE7-Konstrukt eine spezifische Aktivierung der
Reportergene aufwiesen, die genomische Insert-DNA der entsprechenden Genbank-
plasmide einer Sequenzanalyse zugeführt wurden.
3. Ergebnisse
63
3.2. Identifizierung der selektierten Ste7p-Bindungspartner
Zur Identifizierung der durch die Genbankplasmide codierten Ste7p-Interaktionspartner
erfolgte zunächst eine DNA-Sequenzierung (2.9.9.) des GAL4-AD-Fusionsbereichs
dieser pACT2-Plasmide mit der sich stromabwärts fortsetzenden Insert-DNA der
Genbibliothek.
Alternativ zu einer Plasmidisolierung aus den Hefezellen mit anschließender Ampli-
fizierung durch E. coli-Transformanten wurde hierbei das Genbank-Insertfragment durch
eine PCR mit den Primern pACT(FW) und pACT(RE) amplifiziert. Als Template
dienten die microwellenlysierten Zellen der entsprechenden Klone. Die PCR-Produkte
wurden nach erfolgter Elektrophorese aus dem Agarosegel isoliert und ein Aliquot dieser
Eluate zur Quantifizierung mit DNA-Standards abermals elektrophoretisch getrennt. Die
anschließenden DNA-Sequenzierungen (2.9.9.) erfolgten mit jeweils 50 ng der isolierten
Produktbande als Template und dem Oligonucleotid pACT(FW) als Primer, dessen 3’-
Ende 95 bp stromaufwärts zur Fusionsstelle hybridisiert.
Die daraus erhaltenen Sequenzdaten, mit einer auswertbaren Sequenzlänge von 250 -
800 bp, wurden nach einer manuellen Korrektur der entsprechenden Diagramme mit
dem Suchprogramm ‘blastn’ (Version 2.0) des ‘National Center for Biotechnology
Information’ (NCBI) (Benson et al., 1998) gegen die Sequenzdaten der genomischen
S. cerevisiae-Nucleotiddatenbank verglichen.
Aufgrund der von S. cerevisiae vollständig bekannten Genomsequenz ergab sich aus der
jeweils stromabwärts zur Fusionsstelle enthaltenen DNA-Sequenz mit lückenloser
Homologie der exakte Anfangsbereich zu der genomischen DNA des jeweiligen
Chromosoms.
Da Introns enthaltende Gene bei S. cerevisiae im Gegensatz zu anderen Eukaryonten
eine Ausnahme sind, entsprach dies in der Regel dem nicht unterbrochenen
Codierungsbereich eines offenen Leserahmens (= ORF: Open Reading Frame).
Hierdurch konnte ebenfalls die Übereinstimmung der Insertorientierung im Vektor mit
der Leserichtung des chromosomalen Homologs festgestellt werden. Die maximale
3. Ergebnisse
64
Länge dieser ORF’s war durch das zweite Ende der Insert-DNA im Plasmid begrenzt
und ließ sich durch die elektrophoretisch getrennten PCR-Produktbanden anhand der
Fragmentgröße rekonstruieren.
Des Weiteren wurde überprüft, ob der durch die Gal4p-Aktivierungsdomäne
vorgegebene und im insertierten DNA-Bereich fortgesetzte Leserahmen dieser
sequenzierten DNA mit dem Leserahmen des korrespondierenden Genomhomologs
korrekt übereinstimmt. Dazu wurden die Sequenzierungsdaten mit dem Programm ‘ORF
Finder’ des NCBI translatiert und derjenige von den dort ausgewiesenen Leserahmen
ausgewählt, dessen Anfangsbereich der Gal4p(AD)-Proteinsequenz entsprach. Diese
Aminosäuresequenz wurde daraufhin mit Hilfe des Programms ‘blastp’ (NCBI)
gegenüber den Sequenzdaten der S. cerevisiae-Proteindatenbank verglichen und das der
Gal4p(AD)-fusionierten Sequenz entsprechende Protein-/Polypeptidhomolog, mit einer
offensichtlichen Sequenzübereinstimmung, registriert.
Falsche Orientierungen oder Leserahmenverschiebungen einiger der Gal4p(AD)-
fusionierten Sequenzen führten in der Regel zu früh terminierten Peptiden mit einer
Länge von 20 bis 45 Aminosäuren. Ein Vergleich dieser Sequenzen gegen die
Proteineintragungen der entsprechenden Datenbank mit dem ‘blastp’-Programm (NCBI)
ergab in keinem Fall eine sinnvolle Übereinstimmung. Diese Ergebnisse wurden deshalb
nicht weiter berücksichtigt.
Die als genomisch codierten Proteine oder Proteinfragmente identifizierten Ste7p-
Interaktionspartner konnten häufig durch die Genbank-DNA in mehreren unabhängigen
Klonen wiedergefunden werden, die sich im Codierungsbereich meistens durch die
Anfangs- und/oder Endposition unterschieden. Um die bindungsrelevanten
Proteinbereiche einzugrenzen, wurden nur die Klone mit den für jedes Protein
minimalsten Codierungsbereichen in die tabellarische Auswertung (Tabelle 1)
aufgenommen.
Anhand verschiedener Kriterien wurde eine Einteilung dieser Proteine in Kategorien
vorgenommen.
3. Ergebnisse
65
Kate-gorie
Locus Protein Protein-länge (As)
Gal4p(AD)-Fusionsbereich
KlonNr.
I YBL016w Fus3p 353 8 - Ende 388YDR103w Ste5p 917 226 - ~ 893 346YGR040w Kss1p 368 6 - Ende 386YLL021w Spa2p 1466 -17* - ~ 166 186YLR362w Ste11p 717 34 - ~ 300 119
II YHR084w Ste12p 688 278 - ~ 428 399YMR199w Cln1p 546 -18* - ~ 210 319YPL256c Cln2p 545 49 - ~ 232 526
III YBR257w Pop4p 279 1 - Ende 431YCR038c Bud5p 538 -85* - ~ 315 334YDL101c Dun1p 513 25 - ~ 208 357YDR235w Prp42p 544 459 - Ende 58YGL201c Mcm6p 1017 821 - Ende 416YLL026w Hsp104p 908 708 - ~ 858 120
IV YCL024w Ycl024Wp 915 24 - ~ 357 360YHL023c Yhl023Cp 1146 138 - ~ 338 437YKR038c Ykr038Cp 421 182 - Ende 293YLR033w Ylr033Wp 502 2 - ~ 401 516YOL078w Yol078Wp 1176 1093 - Ende 502YOL087c Yol087Cp 1116 1014 - Ende 179
Tabelle 1: Zusammenstellung der in diesem 2-Hybrid-Screening identifiziertenSte7p-Interaktionspartner. In die Tabellierung wurde für jedesProtein nur der Klon mit dem minimalsten Codierungsbereicheingetragen. Die Kategorisierung ist im Text erläutert.* Die Aminosäuren mit negativen Vorzeichen werden durch DNA- Insertsequenzen codiert, die vor dem Startcodon der Gene beginnen, aber eine durchgehende Translation im richtigen Leserahmen erzeugen.
In der Kategorie I sind alle bisher bekannten, direkten Interaktionspartner des Ste7-
Proteins zusammengefaßt, die zu dieser Proteinkinase im Rahmen des Konjugations-
prozesses einen funktionalen Bezug besitzen. Dazu gehören die Komponenten des
Pheromonsignalwegs Ste11p, Ste5p, Fus3p und Kss1p, sowie das an der Ausbildung von
Konjugationsfortsätzen beteiligte Protein Spa2p (1.).
3. Ergebnisse
66
Die Kategorie II faßt alle Proteine zusammen, die zwar als Transcriptionsfaktor (Ste12p)
und G1-spezifische Cycline (Cln1p und Cln2p) mit dem Pheromonsignalweg und dem
Ste7p in einem funktionalen Zusammenhang stehen (siehe Einleitung), von denen jedoch
bisher keine direkte Interaktion mit dem Ste7p bekannt ist.
Proteine mit einer bekannten Zellfunktion, die nach bisherigem Kenntnisstand jedoch
keinen sinnvollen Zusammenhang mit einer Ste7p-Interaktion erkennen lassen, sind in
der Kategorie III vereinigt.
Dazu gehört das Pop4p (processing of precursors), das an der rRNA- und tRNA-
Prozessierung beteiligt ist (Chu et al., 1997), der Guanin-Nucleotid-Austauschfaktor
Bud5p (bud), der im Zusammenhang mit anderen Proteinen bei der vegetativen
Vermehrung die Knospungsstellen determiniert (Camus et al., 1994) und die nucleäre
Dun1p-Proteinkinase (DNA-damage uninducible), die nach einer DNA-Schädigung die
Expression von Reparaturgenen induziert (Zhou und Elledge, 1993). Weitere Proteine
dieser Gruppierung sind das Ribonucleoprotein Prp42p (pre mRNA processing), das in
einem großen Proteinkomplex (U1 snRNP) am Prozeß des prä-mRNA-Spleißens
beteiligt ist (McLean und Rymond, 1998), das DNA-bindende Mcm6p (minichromosom
maintenance deficient) mit einer replikationsinitiierenden Funktion (Rowles und Blow,
1997) und das als Chaperon zur einer Thermotoleranz beitragende Hsp104p (heat shock
protein) (Glover und Lindquist, 1998).
Die Kategorie IV beinhaltet alle Ste7p-interagierenden Proteine mit unbekannter
Zellfunktion, die nicht nur von hypothetischen Leserahmen codiert werden, sondern von
denen die Expression entsprechender Transcripte bereits nachgewiesen werden konnten
(DeRisi et al., 1997).
Die Charakterisierung dieser Proteine beschränkt sich auf vereinzelte Domänen-
homologien, die sich aus den Strukturdaten ableiten lassen und in der MIPS-Datenbank
(Munich Information Center for Protein Sequences) (Mewes et al., 1998) zusammen-
gefaßt sind.
3. Ergebnisse
67
Demnach besitzt das Ycl024W-Protein eine große Domänenhomologie zu Serin/-
Threonin-spezifischen Proteinkinasen, wobei der in Klon 360 codierte N-Terminus die
Strukturen einer ATP-Bindestelle und des katalytischen Bereichs beinhaltet.
Das Protein Ykr038Cp hingegen weist eine hohe Sequenzübereinstimmung zu den
konservierten Regionen der Glycoproteasen (O-Sialoglycoprotein Endopeptidasen) auf
und enthält die Struktur einer Calcium-Bindedomäne (EF-Hand), die Bestandteil des in
Klon 293 codierten Proteinbereichs ist.
Demgegenüber weist das Protein Yol087Cp die homologe Struktur der β-Transducin-
Proteinfamilie in Form eines repetitiven WD-40 Segments (Tryptophan-Asparaginsäure-
Wiederholungen) auf, das allerdings kein Bestandteil des codierten Proteinbereichs in
Klon 179 ist. Dieses Protein ist nicht essentiell (Pearson et al., 1998).
Die übrigen dieser Kategorie zugeordneten Proteine Yhl023Cp, Ylr033Wp und
Yol078Wp besitzen keine markanten Charakteristika.
3. Ergebnisse
68
3.3. Charakterisierung Ste7p-bindender Proteine mit unbekannter Zellfunktion
Aufgrund bisher bekannter Charakterisierungen und Funktionszuweisungen der in den
ersten drei Kategorien (Tabelle 1) zusammengefaßten 2-Hybrid-Interaktionspartner des
Ste7p, konnte keinem dieser Proteine die offensichtliche Aufgabe eines MEK-
regulierenden Kontrollelements zugewiesen werden.
Im Gegensatz dazu beschränken sich die Informationen zu den nachweislich
exprimierten Ste7p-Bindungspartnern der vierten Kategorie im Wesentlichen auf deren
Primärstrukturen und davon ableitbare, vereinzelt vorhandene Domänenhomologien.
Über weitere Eigenschaften oder Funktionen ist hingegen bisher nichts bekannt. Daher
konnte bei diesen Proteinen nicht ausgeschlossen werden, daß sie eine Funktion in der
Ste7p-Regulation besitzen.
Aus diesem Grund erschien eine darauf ausgerichtete Charakterisierung dieser
Bindungspartner sinnvoll.
Ein elementarer Versuchsansatz, zur Charakterisierung von Proteinen unbekannter
Funktion, ist die Erzeugung von Deletionen des relevanten Gens und der anschließende
Nachweis eines dadurch veränderten Zellphänotyps, wodurch sich gegebenenfalls eine
Aufgabenzuordnung ableiten läßt.
Diese Methodik ließ sich auch zur Charakterisierung der Proteine Ycl024Wp,
Yhl023Cp, Ykr038Cp, Yol078Wp und Yol087Cp anwenden.
Zur Charakterisierung des Proteins Ylr033Wp erschien dieser Methodenansatz jedoch
nicht zweckmäßig. Aus den Untersuchungen im Rahmen eines europäischen
Genomprojektes war bereits bekannt, daß YLR033w ein essentielles Gen von
S. cerevisiae ist und entsprechende Deletionsmutanten haploider Zellen nicht lebensfähig
sind (R. Erdmann, persönliche Mitteilung). Wie in solchen Fällen üblich, wurden zur
alternativen Funktionsanalyse dieses Proteins deshalb äquivalente Phänotypcharakteri-
sierungen bei einer Überexpression des codierenden Gens vorgesehen.
3. Ergebnisse
69
Mit den in dieser Weise durch Deletion und Überexpression modifizierten Stämmen
konnten eventuelle Veränderungen relevanter, phänotypischer Verhaltensmerkmale und
daraus ableitbare Funktionsrückschlüsse der entsprechenden Proteine durch zwei
unabhängige Methodenansätze aussagekräftig erfaßt werden.
Als ein relevanter Funktionstest bot sich die Konfrontation von modifizierten MATa-
Zellen mit dem Pheromon α-Faktor in einem Hemmtest an. Bei einer Bedeutung eines
dieser sechs Gene der Kategorie IV, hinsichtlich der Regulation des Pheromonsignalwegs
auf der Ebene der Ste7p-Proteinkinase, sollte sich ein verändertes Hemmverhalten im
Vergleich zu den jeweiligen Wildtypzellen ergeben, das sich durch die Intensität des
G1-Arrests differenzieren läßt. Diese Überprüfung wurde mit zwei voneinander
unabhängigen S. cerevisiae-Stämmen vorgesehen, da der genetische Hintergrund des
Genoms unter Umständen den Phänotyp beeinflussen kann (Bilsland et al., 1998).
Die Aussagekraft dieses Versuchs kann durch eine weitere Überprüfung der modifi-
zierten Zellen in einer quantitativen Konjugation ergänzt werden. Im Gegensatz zum
Hemmtest werden hierdurch außer einer Regulation des G1-Arrests auch andere,
mögliche Funktionen dieser sechs Ste7p-Interaktionspartner in der Vielzahl aller
konjugationsrelevanten Prozesse durch eine Verhaltensänderung erfaßt. Um paarungs-
typspezifische Effekte einzubeziehen, sollten die Konjugationen mit gleichartig
modifizierten Zellen beider Paarungstypen durchgeführt werden.
3.3.1. Voraussetzungen der phänotypischen Analysen
3.3.1.1. Deletionsmutationen der korrespondierenden Gene
Die zu den phänotypischen Analysen erforderlichen Deletionsmutanten der Loci
YCL024w, YHL023c, YKR038c und YOL078w wurden durch homologe Rekombination
nach Zelltransformationen mit den durch PCR synthetisierten Substitutionskassetten
erzeugt (2.9.8.).
3. Ergebnisse
70
Der darin enthaltene Resistenzmarker kanMX4 wurde dabei von den jeweiligen
Zielsequenzen der zu deletierenden Loci durch die Primerpaare YCLKAN(FW/RE),
YHLKAN(FW/RE), YKRKAN(FW/RE) und YOLKAN(FW/RE) flankiert. In der
Amplifikationsreaktion diente das Plasmid pUG6 als Template. Rezipienten dieser PCR-
Produkte waren die Zellen der Stämme UTL-7A und die aus einer Sporulation (2.11.2.,
2.11.3.) des Stamms FY1679 isolierten Derivate FY1679-1A (MATα) und FY1679-7C
(MATa). Die durch eine kanMX4-Substitution des Locus YOL087c modifizierten
MATa- und MATα-Zellen des Stamms FY1679 konnten von dem europäischen
Gemeinschaftsprojekt ‘EUROSCARF’ bezogen werden.
Abb. 15: Genomische PCR-Analysen der kanMX4-substituierten LociYCL024w, YHL023c, YKR038c, YOL078w und YOL087c inMutanten der MATa-Derivate des Stamms FY1679 und der nichtmodifizierten Parentalzellen (WT) zur negativen Kontrolle.Die Mutanten-Analysen des Stamms UTL-7A und der MATα-Derivate des Stamms FY1679 waren hierzu identisch.Die Probentrennung erfolgte in einem 1 % (w/v) Agarosegel.
Bei allen Deletionsmutanten wurde die korrekte Substitution der Loci durch genomische
PCR-Amplifikationen mikrowellenlysierter Zellen überprüft. Dazu wurden die in den
3. Ergebnisse
71
jeweiligen nichtcodierenden 5’-Genbereichen (sense) hybridisierenden Primer
YCL(FW), YHL(FW), YKR(FW), YOL78(FW), YOL87(FW) in Kombination mit dem
spezifisch im kanr-Strukturgen (antisense) hybridisierenden Primer kan(RE) verwendet.
Die elektrophoretische Analyse der Produkte (Abbildung 15) bestätigte die korrekte
kanMX4-Substitution der Loci YCL024w, YHL023c, YKR038c, YOL078w und YOL087c
in den Mutanten durch den Nachweis der erwarteten PCR-Fragmente von 1.060 bp,
814 bp, 750 bp, 944 bp und 742 bp während die Signale bei den zur negativen Kontrolle
verwendeten, nicht modifizierten Parentalzellen fehlten.
3.3.1.2. Konstruktion eines Überexpressionsvektors für das Gen YLR033w
Zur konditionalen Überexpression des Gens YLR033w wurde ein Konstrukt mit dem
Vektor pRS6myc erstellt. Dieser besitzt einen durch Kupfer induzierbaren CUP1-
Promotor, durch den die Expressionsstärke bei einer Zytotoxizität des Produktes
gegebenenfalls durch eine Änderung der Induktorkonzentration moduliert werden kann.
Im Gegensatz zu den durch Galaktose induzierbaren Promotoren kann bei den
vorgesehenen Phänotypanalysen die gleiche Kohlenstoffquelle wie für die Deletions-
mutanten benutzt werden, so daß hierdurch gleiche Versuchsbedingungen gewährleistet
sind.
Des weiteren wird durch eine dem Promotor folgende Partialsequenz des c-myc-Proto-
Onkogens die Translation eines Myc-Epitops (16 Aminosäuren des N-Terminus) initiiert,
wodurch die Expression eines daran C-terminal fusionierten Proteins mit Hilfe
spezifischer α-Myc-Antikörper immunologisch detektiert werden kann. Die Transcrip-
tion wird durch die abschließende Terminationssequenz des CYC1-Gens beendet.
Zur Erzeugung solch einer Fusion wurde der codierende Genbereich des YLR033w per
PCR mit einer Proofreading-DNA-Polymerase (Pwo) aus dem Genom des Wildtyp-
stamms X2180-1A amplifiziert (2.9.7.). Die dazu verwendeten Primer YLR(FW) und
3. Ergebnisse
72
YLR(RE) enthielten eine BclI-Restriktionsstelle, die zu BglII kompatible Enden erzeugt,
und eine XhoI-Restriktionsstelle. Nach der Restriktion dieses Produkts (1.542 bp) mit
den entsprechenden Endonucleasen wurde das aus einem Agarosegel isolierte Fragment
mit dem linearisierten Vektor pRS6myc ligiert, der zuvor durch eine BglII/XhoI-
Restriktion und der anschließenden Isolierung aus einem Agarosegel vorbereitet wurde.
Der durch das Myc-Epitop vorgegebene Leserahmen wird dabei stromabwärts der
BglII/BclI-Fusionsstelle durch das YLR033w-Gen fortgesetzt (Abbildung 16).
........GGT ATG CAG ATC ATG ACA GAA AGT..........
Abb. 16: Schematische Darstellung des c-myc-YLR033w-Fusionsbereichs ausdem Vektorkonstrukt pRS6myc-YLR033w.
Mit diesem Ligationsprodukt wurde der E. coli-Stamm DH5α transformiert und aus
kultivierten Ampr-Einzelklonen die isolierte Plasmid-DNA durch eine BamHI/XhoI-
Restriktion überprüft.
Die erwartete Fragmentbildung dieses pRS6myc-YLR033w-Konstrukts von 4.898 bp und
2.002 bp zeigte die Analyse einer elektrophoretischen Trennung (Abbildung 17) und
bestätigte das richtige Klonierungsprodukt der Isolate aus den überprüften Klonen 1
und 2.
CYC1T pRS6mycYLR033wc-myc(1-48)CUP1P
BamHI BglII/BclI XhoI
ATG TAA
c-myc YLR033w
3. Ergebnisse
73
Abb. 17: Elektrophoretische Trennung des BamHI/XhoI-restringierten pRS6-myc-YLR033w-Konstrukts der überprüften Klone 1 und 2, sowie despRS6myc-Leervektors (ko) als Kontrolle in einem 1 % (w/v)Agarosegel.
Die korrekte Einhaltung des Leserahmens, der durch das Myc-Epitop vorgegeben ist,
konnte über den Fusionsbereich hinaus durch eine DNA-Sequenzierung (2.9.9.) dieses
Konstrukts mit dem Primer pRS(FW) bestätigt werden, der mit seinem 3’-Ende 84 bp
stromaufwärts zur Fusionsstelle hybridisiert.
3.3.1.3. Kontrolle der Zytotoxizität und der Expression des Myc-Ylr033Wp- Fusionsproteins
Zur Überprüfung einer eventuellen Zytotoxizität dieses Fusionsproduktes wurden die mit
dem Konstrukt pRS6myc-YLR033w und mit dem Leerplasmid pRS6myc transformierten
Stämme FY1679-7C und UTL-7A auf selektiven SD-Ura-Nährböden angezüchtet, die
zur Induktion des CUP1-Promotors mit 25 µg/ml CuSO4 supplementiert waren.
Zwischen beiden Transformanten eines Stamms konnten keine Wachstumsunterschiede
festgestellt werden. Von dem Ylr033Wp-Fusionsprotein ging, unter der Annahme einer
vollständigen und stabilen Überexpression, somit keine Beeinträchtigung der Zell-
vitalität aus.
3. Ergebnisse
74
Da die stabile und vollständige Expression des c-myc-fusionierten YLR033w-Gens eine
wichtige Voraussetzung für die vorgesehene phänotypische Charakterisierung war,
erfolgte zur Klärung des Sachverhalts eine Analyse von Proteinextrakten durch einen
Westerblot mit anschließender Immundetektion dieses Fusionsproteins.
Dazu wurden aus den unter Induktionsbedingungen in SD-Ura,+CuSO4 (25 µg/ml)
angezüchteten Hauptkulturen der Stämme FY1679-7C und UTL-7A, die mit dem
Konstrukt pRS6myc-YLR033w oder dem Leervektor pRS6myc (negative Kontrolle)
transformiert waren, Proteinextrakte nach 2.10.1. erstellt und diese nach einer
elektophoretischen Trennung in einem Polyacrylamid-Gel auf eine Nitrocellulose-
membran transferiert (2.10.3.).
Das Fusionsprotein konnte auf diesem Westernblot durch die Bindung von monoklonalen
Primär-Antikörpern (Maus α-Human Myc-Epitop) mit den Peroxidase konjugierten
Sekundär-Antikörpern (Ziege α-Maus IgG - Peroxidase) und dem ECL-Westernblot-
Detektionsreagens als chemilumineszentes Signal auf einem Röntgenfilm detektiert
werden.
3. Ergebnisse
75
Abb. 18: Überprüfung der Expression des Myc-Ylr033Wp-Fusionsproteinsdurch die Immunoblot-Analyse von Proteinextrakten CuSO4-induzierter Parallelkulturen UTL7A + pRS6myc-YLR033w undUTL7A + pRS6myc.Das zusätzlich auftretende Signal des Myc-Ylr033Wp-Fusions-proteins ist gekennzeichnet (Ù). Die Probenanalyse des StammsFY1679-7C war hierzu identisch.Von jedem Proteinextrakt wurde das Zelläquivalent aus 0,2 OD600-Einheiten zur Elektrophorese auf ein Acrylamidgel aufgetragen. DiePositionen des im gleichen Gel getrennten Molekulargewichts-markers sind links eingetragen. Die Expositionsdauer des Röntgen-films betrug 0,5 min.
Wie die Röntgenfilmanalyse in Abbildung 18 zeigt, trat bei der Kultur der pRS6myc-
YLR033w transformierten Zellen gegenüber der mit dem pRS6myc-Leervektor trans-
formierten Kontrollkultur ein zusätzliches, dominantes Signal (Ù) auf. Die Migration in
der Höhe von ~ 60 kDa entspricht eindeutig dem erwarteten Molekulargewicht des
Fusionsproteins (Ylr033Wp: ~ 57,8 kDa + Myc-Epitop: ~ 1,7 kDa).
Die stabile und vollständige Expression dieses Myc-Ylr033Wp-Fusionsproteins konnte
somit in den Stämmen FY1679-7C und UTL-7A bestätigt werden.
3. Ergebnisse
76
3.3.2. Phänotypische Untersuchungen zur Charakterisierung der Proteine mit unbekannter Zellfunktion
3.3.2.1. Konfrontation mit dem Pheromon αααα-Faktor
Um eine Funktionszuweisung durch die Charakterisierung eines veränderten Phänotyps
zu ermöglichen, wurden die deletionsmutierten Zellen und die YLR033w-überexpri-
mierenden Zellen zunächst in einem Hemmtest mit unterschiedlichen Konzentrationen
des Pheromons α-Faktor konfrontiert. Dabei wurde eine zeitlich veränderte Rückkehr in
den normalen Proliferationszyklus (‘Recovery’) im Vergleich zu dem parentalen
Wildtypstamm erwartet, die durch die Kolonienbildung aus Einzelzellen differenziert
werden kann.
Dazu wurden jeweils 1.000 Zellen vereinzelt auf Nährböden ausplattiert, die mit 500,
100, 50, 10 und 0 nM α-Faktor supplementiert waren. Für die Deletionsmutanten, sowie
deren parentale Kontrollstämme FY1679-7C und UTL-7A, wurden dazu YEPD-Medien
benutzt, während die mit dem Überexpressionskonstrukt pRS6myc-YLR033w und dem
Leervektor pRS6myc (Kontrolle) transformierten Stämme FY1679-7C und UTL-7A zum
Plasmiderhalt auf SD-Ura-Medium unter Induktionsbedingungen (25 µg/ml CuSO4)
kultiviert wurden. Die Inkubationen erfolgten bei einer täglichen Bewertung des
Zellwachstums über 5 Tage bei 30 °C.
Die Abbildung 19 zeigt das Stadium der Kolonienausbildung als Folge eines
Zellwachstums der ausplattierten Mutante ykr038c∆ (UTL-7A) im Vergleich zu den
nichtmodifizierten Zellen des Parentalstamms (UTL-7A) nach einer dreitägigen
Inkubation.
3. Ergebnisse
77
Abb. 19: Phänotypische Analyse der Mutante ykr038c∆ durch einenHemmtest mit unterschiedlichen α-Faktor-Konzentrationen.Als Kontrolle dienten die Zellen des Parentalstamms UTL-7A (WT).Pro Nährboden wurden ~ 1.000 Zellen ausplattiert und diese 3 Tagebei 30°C inkubiert.
Ohne α-Faktor ergaben sich demnach keine Wachstumsunterschiede zwischen den
deletionsmutierten und den parentalen Zellen. Damit wurde bestätigt, daß durch die
Modifikation keine Vitalitätsbeeinträchtigung erfolgt, was eine unbedingte Voraus-
setzung für den direkten Wachstumsvergleich auf den pheromonsupplementierten
Medien war.
In Abhängigkeit von der verwendeten α-Faktor-Konzentration kehrten die Zellen
unterschiedlich schnell in den Proliferationszyklus zurück. Zwischen den durch Deletion
bzw. Überexpression modifizierten Zellen und den jeweiligen Kontrollzellen der nicht
transformierten Parentalstämme bzw. der mit dem Leervektor pRS6myc transformierten
3. Ergebnisse
78
Parentalstämme, traten durch die Konfrontation mit der jeweils gleichen α-Faktor-
Konzentration keine Wachstumsdifferenzen der Kolonienbildung auf.
Diese Darstellung ist aufgrund eines identischen Wachstumsverhaltens für alle anderen,
auf gleiche Weise überprüften Deletionsmutanten und überexprimierenden Zellen der
beiden Stämme FY1679-7C und UTL-7A repräsentativ.
Demnach konnte unter den gewählten Bedingungen dieses α-Faktor-Hemmtests für
keines der hier überprüften Gene YCL024w, YHL023c, YKR038c, YLR033w, YOL078w
und YOL087c eine Einflußnahme auf die Intensität des G1-Arrests erwiesen werden.
3.3.2.2. Quantitative Konjugation
Ein weiterer, zu dem vorausgehenden Hemmtest unabhängiger Methodenansatz, der sich
zur Erfassung einer relevanten Funktion der betreffenden Gene in der Regulation des
Pheromonsignalwegs oder in anderen konjugationsrelevanten Prozessen anbietet, beruht
auf dem Nachweis eines veränderten Konjugationsverhaltens der Deletionsmutanten
bzw. der überexprimierenden Zellen.
Zur Überprüfung einer Bedeutung der Gene YCL024w, YHL023c, YKR038c, YLR033w,
YOL078w und YOL087c für den Konjugationsprozeß wurde mit den entsprechend
modifizierten, haploiden MATα- und MATa-Derivaten des Stamms FY1679 eine
quantitative Konjugation (2.11.4.) durchgeführt und die Anzahl der in einer definierten
Zeiteinheit aus den haploiden Ausgangszellen gebildeten diploiden Zellen als
Paarungsrate ermittelt. Als Referenz dienten die Parentalstämme FY1679-1A und
FY1679-7C bzw. die mit dem Leerplasmid pRS6myc transformierten, identischen
Stämme. Im Gegensatz zu den Deletionsmutanten wurden die mit den Plasmiden
pRS6myc und pRS6myc-YLR033w transformierten Zellen dabei nicht in YEPD-
Vollmedium, sonder in SD-Ura-Medium unter Induktionsbedingungen (25 µg/ml
CuSO4) angezüchtet.
Nach der erfolgten Konjugation wurden die diploiden Zellen mit den komplementieren-
den Genmarkern zur Bestimmung der Paarungsrate in Verdünnungen auf MV+Ura- bzw.
3. Ergebnisse
79
MV-Medien selektiv angezüchtet. Durch Supplementierung dieser Medien mit Histidin
bzw. Tryptophan wurden auf parallelen Nährböden zusätzlich die verbliebenen haploiden
Ausgangszellen des Paarungstyps MATa dieser Konjugationsansätze zu Kolonien
kultiviert. Die Paarungsrate ergab sich aus dem jeweiligen Quotienten der Kolonien-
anzahl. Sie bezeichnet den Anteil der Ausgangszellen, der in dem definierten Zeitraum
eine Konjugation eingegangen ist.
KonjugationsansätzeFY-1679 MATa x FY-1679 MATα
Paarungsrate[%]
Wildtyp x Wildtyp 70,2
ycl024w∆ x ycl024w∆ 83,2
yhl023c∆ x yhl023c∆ 82,7
ykr038c∆ x ykr038c∆ 82,9
yol078w∆ x yol078w∆ 88,6
yol087c∆ x yol087c∆ 87,1
pRS6myc x pRS6myc 62,6
pRS6myc-YLR033w x pRS6myc-YLR033w 52,6
Tabelle 2: Paarungsraten aus einer quantitativen Konjugation von MATα- undMATa-Deletionsmutanten bzw. überexprimierenden Zellen sowieder entsprechenden Wildtypstämme als Referenz.Die Auswertung erfolgte anhand ausplattierter 10-3-Verdünnungs-stufen mit einer Kolonienanzahl von 200 bis 600 pro Medienplatte.Angegeben sind die jeweiligen Mittelwerte aus unabhängigenDoppelbestimmungen.
Wie die in der Tabelle 2 dargestellten Versuchsergebnisse zeigen, wies keine der so
überprüften Mutanten und überexprimierenden Zellen eine von der jeweiligen Wildtyp-
kontrolle signifikant abweichende Paarungsrate auf.
Demzufolge konnte durch diese Analyse eine Relevanz der hier überprüften Proteine, die
von den Genen YCL024w, YHL023c, YKR038c, YLR033w, YOL078w und YOL087c
codiert werden, für den Konjugationsprozeß nicht nachgewiesen werden.
4. Diskussion
80
4. Diskussion
Unter den geschilderten Aspekten (1.) sollte im Rahmen dieser Arbeit eine gezielte
Isolierung von potentiell negativen Kontrollelementen der zentralen Proteinkinase Ste7p
des Pheromonsignalwegs von S. cerevisiae aus einer Genbibliothek erfolgen.
Die meisten der bisherigen, genetischen Methodenansätze zur Identifizierung von
Komponenten, die eine Aktivierung des Pheromonsignalwegs negativ beeinflussen,
waren in der Regel sehr unspezifisch ausgerichtet.
Dazu gehörten die klassischen Screeningkonzepte von Genbanken, bei denen ein
ausgelöster G1-Arrest durch Komplementation oder Suppression revertiert werden
konnte, was mit Multicopyplasmiden wie zum Beispiel dem YEp13 (Nasmyth und
Tatchell, 1980) unter der Expressionskontrolle geneigener Promotoren erfolgte.
Zum einen konnten durch die Komplementation von Mutationen auf diese Weise
Faktoren mit einer adaptierenden Funktion, wie z.B. die Gene SSL2/SST2 und BAR1
(Steden et al., 1989; Dietzel und Kurjan, 1987; MacKay et al., 1988), gefunden werden.
Zum anderen wurde durch den Effekt der Gendosiserhöhung (‘dominante Genetik’) mit
parentalen Wildtypzellen die Fus3p-MAPK negativ regulierende Proteinphosphatase
Msg5p (Doi et al., 1994) und die dazu coregulierenden Proteinphosphatasen
Ptp2p/Ptp3p (Zhan et al., 1997) als dominante Inhibitoren (‘Multicopysuppressoren’)
des aktivierten Signalwegs isoliert und identifiziert.
Eine häufig angewendete Variation dieser ‘dominant negativen Selektion’ von Genen,
die mit dem Zellzyklusarrest des aktivierten Signalwegs interferieren, erfolgte durch
Plasmidbibliotheken, deren genomische Insertfragmente oder cDNA-Äquivalente durch
starke Fremdpromotoren überexprimiert wurden und bei entsprechender Relevanz
ebenfalls einen selektierbaren Far--Phänotyp in parentalen Wildtypzellen verursachten
(Edwards et al., 1997; Caponigro et al., 1998).
4. Diskussion
81
Durch diese methodischen Ansätze konnten bisher jedoch keine Proteine ermittelt
werden, durch die eine negative Kontrolle der übergeordneten Signalwegkomponente
MEK (Ste7p) oder der MEKK (Ste11p) analog zu einer Regulation der MAPK
vollzogen wird, obwohl für Ste7p dazu Hinweise bestehen.
Das kann einerseits darin begründet sein, daß Gene mit stringent regulierten Eigen-
promotoren auch bei einer Gendosiserhöhung keinen Effekt der Multicopysuppression
zeigen können (Ramer et al., 1992). Andererseits besteht im Fall der Überexpression
durch Multicopyplasmide sowie unter der Kontrolle von Fremdpromotoren die
Möglichkeit, daß notwendige Intermediärelemente, wie regulatorische Untereinheiten,
die z.B. für eine spezifische Substratbindung multifunktionaler Phosphatasen notwendig
sind, durch die endogene Codierung nicht proportional exprimiert vorliegen und deshalb
kein phänotypischer Effekt hervorgerufen werden kann.
Die Isolierung von negativen Ste7p-Kontrollelementen aus einer Genbibliothek unter der
Verwendung des 2-Hybrid-Systems, bei der die genetische Selektion ausschließlich auf
in vivo-Proteinwechselwirkungen beschränkt ist und Funktionsaspekte zunächst
unberücksichtigt bleiben, stellt demgegenüber einen bisher noch nicht verwendeten,
innovativen Methodenansatz dar, mit dem sich die oben genannten Probleme umgehen
lassen.
Durch die Verwendung eines einzigen Zielproteins ist dieses System im Vergleich zu
den anderen Methoden außerdem sehr spezifisch auf die Komponenten ausgerichtet, die
nur mit diesem Protein in einem Zusammenhang stehen, und eignet sich deshalb
besonders, um der hier aufgegriffenen Fragestellung nachzugehen.
Zu den Systemvoraussetzungen dieses Konzepts gehörten der native Konformations-
zustand mit einer daraus resultierenden Funktionalität als Proteinkinase und die
Modifikationsmöglichkeit des als Zielprotein durch das pAS2-1-STE7-Konstrukt
exprimierten Ste7p, um eine optimale Kompetenz für die Bindung der erwarteten
Interaktionspartner zu gewährleisten.
4. Diskussion
82
Die dazu durchgeführte Überprüfung durch eine Westernblot-Analyse (3.1.2.3.) ergab,
daß ein beträchtlicher Anteil dieses vollständig exprimierten Proteins bereits ohne eine
vorausgegangene Signalwegaktivierung in der hyperphosphorylierten Isoform
modifiziert vorlag, die normalerweise dem Zustand nach einer Aktivierung entspricht.
Dieser Effekt konnte bereits von Cairns et al. (1992) beobachtet werden. Seine genauen
Ursachen sind noch nicht eindeutig geklärt, jedoch scheint die starke Protein-
überexpression dafür maßgeblich zu sein. Da auch in fus3∆/kss1∆-Doppelmutanten mit
einem daraus resultierenden Attenuierungsdefekt bei einer starken Überexpression ein
beträchtlicher Anteil des Ste7p in der hyperphosphorylierten Isoform vorliegt, werden
inadäquate Mechanismen wie intermolekulare Autophosphorylierungen oder
Modifikationen durch strukturverwandte, nicht am Pheromonsignalweg beteiligte
Kinasen in Betracht gezogen (Zhou et al., 1993).
Es ist jedoch erwiesen, daß von einer starken STE7-Überexpression keine
konjugationsrelevante, autonome Aktivierung des Signalwegs ausgeht, was im
Gegensatz dazu bei anderen Komponenten dieser Transduktionskaskade wie z.B. STE4,
STE5, STE11 oder STE12 (Akada et al., 1997; Akada et al., 1996; Dolan und Fields,
1990; Whiteway et al., 1990) der Fall ist.
Daß die starke Hyperphosphorylierung in keinem äquivalenten Zusammenhang mit einer
Signalwegaktivierung steht, konnte auch mit der Funktionsanalyse des Ste7p durch die
Induktion eines FUS1-Promotorkonstrukts (3.1.2.4.) bestätigt werden.
Ohne α-Faktor-Induktion war hierbei eine geringe Erhöhung der Basisaktivität dieses
Signalwegs zu verzeichnen. Da Proteinkinasen auch eine geringe Aktivität in
Abwesenheit eines Signals besitzen und sich daraus eine Basisaktivität dieses
Signalweges ergibt (Zhou et al., 1993), resultierte durch die Überexpression der
zentralen MEK erwartungsgemäß eine adäquate Amplifikation dieses Signals.
4. Diskussion
83
Durch die α-Faktor-Induktion einer Parallelkultur konnte hingegen eine signifikante
Aktivitätssteigerung des Signalwegs gegenüber der nicht Ste7p überexprimierenden
Kultur verzeichnet werden, die ebenfalls in der Signalamplifikation durch die MEK-
Überexpression begründet ist.
Beide Fakten weisen auf die Integrität des plasmidcodierten Ste7p in der Transduktions-
kaskade hin.
Daß es sich dabei um einen Amplifikationseffekt durch die funktionale Integrität des
überexprimierten Proteins handelt und nicht um Sekundärmechanismen, wie etwa
unbekannte Kompetitionseffekte der Überexpression, konnte durch einen weiteren
Versuch (3.1.2.4.) zur Überprüfung der Funktionalität belegt werden.
Dabei erwies sich das Ste7p-Fusionsprotein in einer ste7-Mutante durch die
Regenerierung des fertilen Phänotyps als mutationskomplementierend und bestätigte
somit eine Funktionalität als Proteinkinase auf der MEK-Ebene des Signalwegs. Das
Protein erfüllte damit die geforderten Voraussetzungen.
Bemerkenswert ist an diesem Ergebnis jedoch, daß es in einem Widerspruch zu den
Untersuchungsergebnissen von Edwards et al. (1997) steht. Dort wurde im Rahmen
eines Genbank-Screenings nach Far1--Phänotypen das STE7-Gen isoliert, dessen
Überexpression eine Pheromonresistenz verursachte.
Im Vergleich zu anderen Untersuchungsergebnissen scheint dieses jedoch eine
Ausnahmeerscheinung zu sein. Weder durch analoge Genbank-Screenings (Espinet et
al., 1995; Ramer et al., 1992) noch durch gezielte Analysen mit überexprimiertem Ste7p
(Cairns et al., 1992; Zhou et al., 1993) ist dieser Effekt bei ähnlichen Expressionsstärken
bisher bekannt geworden. Diese Ergebnisse stehen in Übereinstimmung zu dem eigenen
Befund und bestätigen das hier erzielte Versuchsresultat.
Neben den Systemvoraussetzungen, die für das Zielprotein bestanden, waren die
Eigenschaften der verwendeten Plasmidbibliothek für eine erfolgreiche Isolierung der
erwarteten Interaktionspartner ebenso bedeutend.
4. Diskussion
84
Dieses wurde durch die im 2-Hybrid-Screening verwendete Genbank pACT2-FRYL
(2.5.) berücksichtigt.
Der rekombinante Anteil dieser Plasmide, durch den die Gal4p(AD)-Fusionsproteine
codiert werden, besteht aus genomischen DNA-Fragmenten, die bei S. cerevisiae zur
direkten Einklonierung besonders geeignet sind, weil im Gegensatz zu anderen
Eukaryonten für diesen Organismus Introns enthaltende Gene eher die Ausnahme sind.
Gegenüber den sonst üblichen cDNA-Bibliotheken ergeben sich dadurch prägnante
Vorteile, die in der ausgewogeneren und vollständigeren Repräsentation der protein-
codierenden Genbereiche dieses Genoms bestehen.
Zudem sind in cDNA-Bibliotheken die Genäquivalente als rekombinante Plasmidanteile
nur entsprechend dem jeweiligen Expressionsmuster in der Zelle vertreten, was zu einer
starken Unterrepräsentierung von schwach oder konditional exprimierten Genen führen
könnte. Hinsichtlich der Isolierung von signalmodulierenden bzw. regulatorischen
Proteinen, wie in diesem Fall vorgesehen, könnte das eine ungünstige Voraussetzung
sein.
Da die Selektion mit diesem System auf den Bindungseffekten und nicht auf den
funktionalen Effekten der Proteine basiert, kann die insertierte DNA der pACT2-
Genbankplasmide aus relativ kurzen Genomfragmenten (0,8 - 2,5 kb) bestehen, die nicht
die gesamten proteincodierenden Genbereiche repräsentieren. Dadurch wird die
Komplexität der Genbank erhöht und gewährleistet, daß ein heterogener Pool mit
unterschiedlichen Fusionsstellen jedes Gens Bestandteil der Genbibliothek ist. Auf diese
Weise lassen sich unter Umständen Faltungs- und Stabilitätsprobleme mancher Proteine
umgehen (James et al., 1996) und führt bei ihnen zu einem bindungskompetenten
Verhalten.
Ferner wurde durch die Verwendung genomische DNA aus einem deletionsmutierten
gal4-542, his3-200, gal80-538 S. cerevisiae-Stamm (Fromont-Racine et al., 1997) bei
der Erstellung dieser Genbank schon im Vorfeld dafür gesorgt, daß bei der
nachfolgenden Selektion von genbankcodierten Bindungspartnern weder durch Gal4-
4. Diskussion
85
Proteine eine falsch positive Aktivierung der Reporterpromotoren noch durch His3-
Proteine eine Interferenz mit der konditionalen Wachstumsselektion oder durch Gal80-
Proteine eine Inhibierung der assoziierten Gal4p-Domänen erfolgen kann.
Aufgrund des Befunds (3.1.2.3.), daß nur durch eine pheromoninduzierte Signalweg-
aktivierung die Modifikation des gesamten plasmidcodierten Ste7-Proteins erfolgt,
wurde die Isolierung potentieller Bindungspartner durch das 2-Hybrid-Screening (3.1.3.)
in Gegenwart des Pheromons α-Faktor durchgeführt. Bei der anschließenden
Verifizierung dieser Interaktionen durch eine Überprüfung der HIS3- und der lacZ-
Aktivierung (3.1.4.) wurde zusätzlich versucht, die Phänotypen der isolierten Klone in
Abhängigkeit von dem Aktivierungszustand des Pheromonsignalwegs (+/- α-Faktor) zu
differenzieren. Diese Versuche ergaben jedoch keine offensichtliche Abweichung in der
Aktivierung der Reportergene.
Dies könnte darin begründet sein, daß der methodische Nachweis der Aktivierung nur
eine semiquantitative Differenzierung zuläßt.
In Analogie zu dem eigenen Befund konnten von Printen und Sprague bei gezielten
2-Hybrid-Bindungsstudien mit zentralen Komponenten des Pheromonsignalwegs in
Abhängigkeit von deren Aktivierungszustand ebenfalls keine differenzierbaren
Wechselwirkungen festgestellt werden, obwohl diese offensichtlich bestehen (Printen
und Sprague, 1994).
Das verdeutlicht die offenbaren Grenzen dieses Systems. Die erzeugten Signalstärken
korrelieren zwar mit den aus in vitro-Versuchen bekannten Bindungsverhalten von
Proteinen, lassen aber nur in einer groben Abstufung sehr undifferenziert auf die
Wechselwirkungsintensität rückschließen (Estojak et al., 1995).
Auf der anderen Seite konnte durch die Westernblot-Analyse (3.1.2.3.) festgestellt
werden, daß der überwiegende Anteil des Ste7p-Fusionsproteins bereits ohne eine
Aktivierung des Signalwegs in der phosphorylierten Modifikationsform vorlag. Dieser
4. Diskussion
86
könnte bei einer entsprechenden Interaktion den geringeren Anteil des Ste7-Proteins
überlagern, der in Abhängigkeit von der Signalwegaktivierung modifiziert wird und
auch nur davon abhängig interagieren kann, so daß eine deutliche Differenzierung nicht
nachzuweisen wäre.
Demnach konnte aus diesen zwei Möglichkeiten geschlossen werden, daß eventuell
unter den isolierten Interaktionspartnern durchaus pheromonabhängige
Wechselwirkungen bestehen, diese jedoch aufgrund unzureichender
Differenzierungsmöglichkeiten nicht detektierbar sind.
Nachdem diese und weitere Interaktionsüberprüfungen zur Aussonderung falsch
positiver Wechselwirkungen (3.1.4.) abgeschlossen waren, erfolgte die Identifizierung
der auf diese Weise selektierten Ste7p-Bindungspartner (3.2.).
Dabei konnten u.a. die Proteine Ste5p, Ste11p, Fus3p und Kss1p ermittelt werden, die
alle an der Signaltransduktion im Pheromonsignalweg beteiligt sind und einen
unmittelbaren, funktionalen Bezug zum Ste7-Protein besitzen (1.). Zusammen mit dem
für die morphologische Differenzierung relevanten Spa2p repräsentieren diese Proteine
somit das Spektrum bekannter Interaktionspartner, die auch aufgrund der Ergebnisse
gezielter Bindungsanalysen erwartet werden konnten (Printen und Sprague, 1994; Sheu
et al., 1998; Marcus et al., 1994; Inouye et al., 1997).
Ihre Isolierung bestätigte einerseits, daß unter den gewählten Bedingungen das
Detektionssystem erfolgreich eingesetzt werden konnte und zum anderen, daß die
Anzahl der ~ 15 x 106 so überprüften Cotransformanten ausreichte sowie, daß das
Genom in der verwendeten Genbank vollständig repräsentiert war.
Deren genügende Komplexität konnte ferner durch die oftmalige Isolierung
unabhängiger Klone mit verschiedenen Codierungsbereichen des selben Gens erwiesen
werden.
Aufgrund dieses Resultats wurden die Voraussetzungen zur Isolierung der erwarteten
Kontrollelemente als aussichtsreich betrachtet.
4. Diskussion
87
In Übereinstimmung mit den oben genannten Proteinen besitzt der als Ste7p-
Interaktionspartner isolierte, pheromonabhängige Transcriptionsfaktor Ste12p und die
G1-spezifischen Cycline der Zellzyklusregulation Cln1p und Cln2p ebenso einen
funktionalen Bezug zum Pheromonsignalweg (1.). Direkte Wechselwirkungen mit dem
Ste7p sind hingegen nicht bekannt und aufgrund bisheriger Untersuchungsergebnisse
auch nicht anzunehmen. Wahrscheinlicher ist in diesen Fällen eine indirekte Interaktion,
die durch endogen codierte ‘Brückenproteine’ vermittelt werden könnten. Diese
Ausbildung trimerer Interaktionskomplexe ist ein bekanntes Phänomen (Finley und
Brent, 1994) und wird unter Umständen, wie in diesem Fall, durch die
Interaktionsanalyse in einem homologen System gefördert.
Als mögliche Brückenproteine kämen für die indirekten Interaktionen des Ste12p,
entsprechend der bisherigen Auffassung der Komponentenkonstellationen durch
epistatische und funktionale Analysen (Elion et al., 1993; Errede et al., 1993), die MAP-
Kinasen Fus3p und Kss1p in Betracht. Ein Hinweis für diesen Sachverhalt besteht
dadurch, daß der isolierte Codierungsbereich des Ste12p genau der bekannten Kss1p-
Interaktionsdomäne entspricht (Bardwell et al., 1998).
Für die Interaktion der isolierten Cycline hingegen, die untereinander eine sehr hohe
Sequenzhomologie aufweisen, wäre eine indirekte Wechselwirkung durch das Ste11p
durchaus denkbar. Wie von Wassmann und Ammerer nachgewiesen werden konnte,
interferiert das überexprimierte Cln2p mit der Signaltransduktion auf dem Niveau der
MEKK Ste11p (Wassmann und Ammerer, 1997), wodurch eine indirekte
Wechselwirkung mit dem Ste7p möglich werden könnte.
Eine genaue Aufklärung dieser Möglichkeiten könnte u.a. durch 2-Hybrid-Analysen mit
Deletionsmutanten der vermuteten Intermediärkomponenten erfolgen (Printen und
Sprague, 1994).
Die weiteren als Bindungspartner von Ste7p isolierten Proteine Pop4p, Bud5p, Dun1p,
Prp42p, Mcm6p und Hsp104p, die bereits in 3.2. kurz charakterisiert wurden, lassen
aufgrund ihrer bekannten Zellfunktionen keinen unmittelbaren Zusammenhang für die
Ste7p-Interaktionen erkennen.
4. Diskussion
88
Möglich wären hierbei entfernte Strukturverwandtschaften mit Proteinen, die einen
Funktionsbezug zu dem Ste7p besitzen. In Folge der starken Überexpression könnte das
ein falschpositives Interaktionsverhalten provozieren. Als Beispiel dafür kann die
Hyperphosphorylierung des überexprimierten Ste7p ohne vorherige Signalweg-
aktivierung betrachtet werden.
Dieses Phänomen könnte durch Interaktionsanalysen mit AD-Vektoren der pGAD-Serie
(Bartel et al., 1993) verifiziert werden, die einen verkürzten ADH1-Promotor besitzen
und dadurch eine schwächere Expression der einklonierten DNA aufweisen als der hier
verwendete pACT2-Vektor.
Analog zu den Proteinen Ste12p und Cln1p/Cln2p ist auch bei diesen Proteinen eine
indirekte Wechselwirkung durch trimere Komplexbildungen nicht auszuschließen,
wobei die Zuordnung verantwortlicher Brückenproteine kaum möglich ist und dadurch
eine gezielte Verifizierung mit entsprechenden Deletionsmutanten nicht in Betracht
kommt. Möglicherweise könnte die Interaktion dieser Proteine mit dem Ste7p durch eine
Immuncopräzipitation aus dem Zellysat aufgeklärt werden.
Mit den Proteinen Ycl024Wp∗, Yhl023Cp, Ykr038Cp, Ylr033Wp, Yol078Wp und
Yol087Cp wurden schließlich Ste7p-Bindungspartner identifiziert, deren Charakteri-
sierungen sich auf Domänenhomologien durch die Strukturdaten beschränkten (3.2.) und
denen darüber hinaus keine zellulären Funktionen zugewiesen werden konnten.
Das machte diese Proteine gegenüber den zuvor beschriebenen Proteinen besonders
interessant, da bei ihnen eine mögliche Aufgabe als MEK-Kontrollelement nicht
auszuschließen war, auch wenn die Domänenhomologie zu Serin/Threonin-spezifischen
Proteinkinasen bei dem Ycl024Wp und zu Glycoproteasen bei dem Ykr038Cp für diese
Proteine nicht unmittelbar auf eine negative Kontrollfunktion durch Dephosphory-
lierungsreaktionen hinwiesen.
∗ Nach dem Abschluß der eigenen Arbeit konnte diesem Protein eine Zellfunktion zugewiesen werden.Demnach erfüllt das Ycl024Wp (= Kcc4p) eine Aufgabe bei der Regulation des Zellteilungszyklus durch dasCytoskelett (Barral et al., 1999).
4. Diskussion
89
Es war jedoch nicht auszuschließen, daß sie durch einen anderen, noch nicht bekannten
Prozeß indirekt, mit der Funktion ihres Domänencharakters, an dieser Aufgabe beteiligt
sein könnten, zumal bei einer Überprüfung der stromaufwärts gelegenen Gensequenzen
bei dem Gen YKR038c, im Gegensatz zu den übrigen fünf Genen, 444 bp vor dem
Startcodon eine PRE-Sequenz (pheromone-response element) ermittelt werden konnte,
was auf die Möglichkeit einer pheromoninduzierten, Ste12p-abhängigen Regulation
dieses Gens hinwies.
Die Familienzuordnung des Yol087Cp aufgrund des WD-40 Segments hingegen ließ
wegen der bekannten Funktionsheterogenität der übrigen Familienmitglieder (Smith et
al., 1999) ebensowenig auf eine spezifische Zellfunktion schließen, wie das Fehlen von
markanten Charakteristika bei den übrigen Proteinen Yhl023Cp, Ylr033Wp und
Yol078Wp.
Auch bei diesen vier Proteinen konnte allein aufgrund fehlender Domänenhomologien
zu den Familien bekannter, katalytischer Proteine nicht ausgeschlossen werden, daß sie
an einer negativen Ste7p-Kontrolle beteiligt sind.
So existieren z.B. für viele multifunktionale Proteinphosphatasen, die in ihren
katalytischen Domänen hochkonservierte Homologiebereiche besitzen, eine große
Anzahl unterschiedlicher, regulatorischer Proteine ohne derartig hochkonservierte
Domänen, die für die Aktivitätsmodulation, die Substratspezifität und die Lokalisation in
der Zelle erforderlich sind.
Aus diesem Grund erschien es sinnvoll, zur Funktionsanalyse eine Charakterisierung
dieser Proteine mit Hilfe modifizierter Zellen durchzuführen (3.3.), die eine
Deletionsmutation des codierenden Gens enthielten (3.3.1.1.) oder im Fall des
essentiellen Gens YLR033w das Protein überexprimierten (3.3.1.2.).
4. Diskussion
90
Die phänotypischen Charakterisierungen dieser Zellen erfolgten durch zwei spezifische
Untersuchungen, die für eine Beeinflussung der Pheromonsignalwegregulation eine hohe
Aussagekraft besitzen. Das war zum einen die Überprüfung eines veränderten G1-Arrests
durch die Konfrontation mit dem Pheromon α-Faktor und zum anderen das
Konjugationsverhalten mit den Zellen des reziproken Paarungstyps (3.3.2.).
Aus beiden Untersuchungen ergaben sich keine eindeutigen Verhaltensabweichungen
der modifizierten Zellen zu den als Referenz verwendeten, unmodifizierten
Wildtypzellen.
Aufgrund dieser Kriterien konnte keinem der sechs als Interaktionspartner isolierten
Proteine mit unbekannter Zellfunktion unmittelbar eine Funktion in der negativen
Kontrolle der MEK Ste7p zugewiesen werden.
Diesem Befund entsprechend könnte unter Berücksichtigung der identifizierten Proteine
mit bekannter Zellfunktion gefolgert werden, daß mit diesem 2-Hybrid-System keine
Isolierung des gesuchten Kontrollelements aus der Genbank erzielt wurde, wodurch auch
dessen Existenz zunächst fragwürdig erscheint.
Obwohl die Effizienz des Systems durch die Isolierung der bekannten Ste7p-
Bindungspartner bestätigt wurde, kann trotzdem nicht ausgeschlossen werden, daß
systembedingte Eigenschaften zu diesem Ergebnis führten und andere System-
komponenten hinreichendere Bedingungen bieten könnten.
So ist zum Beispiel bekannt, daß die Mediensupplementierung mit hohen 3-Amino-
1,2,4-triazol-Konzentrationen (25 mM), die aufgrund des nicht stringent regulierten
HIS3-Promotors für den Stamm Y190 notwendig sind, das Detektionssystem
unempfindlich machen und dadurch positive Interaktionen inhibiert werden können
(James et al., 1996). Die Verwendung von 2-Hybrid-Stämmen wie HF7c oder CG-1945
hingegen, bei denen das HIS3-Reportergen zur Wachstumsselektion unter der
stringenten Kontrolle eines GAL1-Promotors steht (Feilotter et al., 1994), würde sich als
eine mögliche Systemverbesserung anbieten.
4. Diskussion
91
Außerdem könnte das Fehlen der erwarteten Ste7p-Interaktionspartner auch mit einer
möglichen Zytotoxizität der Gal4p(AD)-Fusionsprodukte in einem Zusammenhang
stehen. Dieser Effekt kann bei der konstitutiven, starken Überexpression, wie in diesem
Fall durch den ADH1-Promotor des pACT2-Vektors, besonders für regulatorische
Proteine nicht ausgeschlossen werden. Die Verwendung von Vektoren mit schwächeren
Promotor-Konstrukten, wie z.B. die pGAD-Vektoren (Bartel et al., 1993), wären zur
Isolierung derartiger Proteine eine mögliche Alternative.
Ungeachtet dieser Möglichkeiten, die eine Isolierung der gesuchten Kontrollelemente
beeinträchtigt haben könnten, besteht weiterhin die Frage nach der Bedeutung der
Interaktionen des Ste7p mit den Proteinen unbekannter Zellfunktion, denen durch die
phänotypischen Analysen offensichtlich nicht die erwartete Funktion zugewiesen werden
konnten.
Auch hierfür könnte die Ursache in der Methodik des 2-Hybrid-Systems liegen.
So ist es nicht auszuschließen, daß es sich auch bei diesen Proteinen, ähnlich wie bei
Ste12p und Cln1p/Cln2p, um indirekte Interaktionen des Ste7p handeln könnte, die
durch Brückenproteine vermittelt werden. Da jedoch die Brückenproteine unbekannt
sind, kann diese Möglichkeit nicht mit Hilfe von entsprechenden Deletionsmutanten
überprüft werden. Gegebenenfalls könnten hier biochemische und immunologische
Methoden zu einer Aufklärung verhelfen.
Andererseits kann durch die ausschließliche Selektion auf der Basis von
Proteinwechselwirkungen in diesem System nicht verhindert werden, daß durch
Bindungspartner anderer Signalwege möglicherweise Interferenzen auftreten, die nicht
differenziert werden können.
Es kann deshalb nicht ausgeschlossen werden, daß die hier isolierten Interaktionspartner
mit einer unbekannten Zellfunktion in einem anderen MAPK-Regulationsweg einen
funktionalen Bezug zum Ste7-Protein besitzen. Potentiell kommt dafür der
4. Diskussion
92
Regulationsweg des Pseudohyphenwachstums von diploiden Zellen bzw. des invasiven
Wachstums von haploiden Zellen in Betracht, da dort neben anderen Komponenten des
Pheromonsignalwegs auch das Ste7p an der Signaltransduktion beteiligt ist. Diese
Möglichkeit könnte jedoch durch darauf ausgerichtete, spezifische Phänotypanalysen der
hier modifizierten Zellen verifiziert werden (Roberts und Fink, 1994).
Neben diesen möglichen Ursachen aufgrund von systembedingten Gegebenheiten, durch
die unterstellt werden könnte, daß keines der isolierten und charakterisierten Proteine
mit unbekannter Zellfunktion dem gesuchten Kontrollelement entspricht, besteht
dennoch Grund zu der Annahme, daß eines dieser Ste7p-Bindungspartner durchaus diese
regulatorische Aufgabe besitzen kann.
So ist nicht auszuschließen, daß durch die funktionale Redundanz eines weiteren,
unbekannten Zellproteins die jeweilige Deletionsmutation unwirksam geworden sein
könnte. Dadurch verursachte Null-Phänotypen oder subtile Phänotypen ließen sich mit
den hier angewendeten Methoden der Phänotypanalysen nicht differenzieren.
Die Frage, ob die in dieser Arbeit charakterisierten Proteine eine relevante Funktion bei
der negativen Kontrolle des Ste7p besitzen, kann deshalb nicht unbedingt verneint
werden.
5. Zusammenfassung
93
5. Zusammenfassung
Der Pheromonsignalweg von Saccharomyces cerevisiae, ein repräsentatives und
experimentell gut zugängliches Modellsystem der bei Eukaryonten weitverbreiteten
mitogen-aktivierten-Proteinkinase-(MAPK)-Regulationswege, ist hinsichtlich der
Aktivierungsmechanismen durch die sukzessive Abfolge einzelner Kinasereaktionen gut
charakterisiert. Im Gegensatz dazu beschränken sich die bisher bekannten Dephosphory-
lierungsreaktionen zur notwendigen Reversion des aktivierten Signalwegzustands auf
die MAP-Kinase Fus3p.
Da Hinweise für eine ähnliche Regulation der übergeordneten MEK Ste7p bestanden,
wurde versucht, die dazu in Frage kommenden ‘negative Kontrollelemente’ auf der
Basis einer Proteinbindung mit Hilfe des 2-Hybrid-Systems zu isolieren. Die relevante
Funktionszuweisung sollte im Anschluß durch eine spezifische Charakterisierung
erfolgen.
Das dazu verwendete System beinhaltete den BD-Vektor pAS2-1, den AD-Vektor
pACT2 (Genbank) und den Detektorstamm Y190, der aufgrund des Screeningkonzepts
durch eine far1∆-Mutation modifiziert werden mußte.
Die Bindungskompetenz des als Zielprotein exprimierten Ste7p sollte dabei durch die
native Konformation des vollständigen Proteins mit einer darauf beruhenden Funktion
als MEK und durch den modifizierten Phosphorylierungsgrad in Folge einer Pheromon-
induktion gewährleistet sein. Diese Eigenschaften konnten vorab durch eine Westernblot-
Analyse, eine MEK-spezifische Signalamplifikation und eine Mutationskomplemen-
tation bestätigt werden.
5. Zusammenfassung
94
Unter den aus einer genomischen Plasmidbibliothek isolierten Bindungspartnern
konnten nach einer Verifizierung der Wechselwirkungen vier Kategorien von Proteinen
identifi-ziert werden.
1. Komponenten des Pheromonsignalwegs (Ste5p, Ste11p, Fus3p, Kss1p) und das
Spa2p, die einen konjugationsrelevanten Funktionsbezug zu dem Ste7p besitzen und
deren erwartete Isolierung die Effizienz des 2-Hybrid-Systems sowie die
vollständige Repräsentation des Genoms in der Genbibliothek bestätigten.
2. Proteine, die mit dem Pheromonsignalweg in einem Zusammenhang stehen
(Ste12p, Cln1p, Cln2p), die jedoch nach den bisherigen Erkenntnissen keinen
direkten Funktionsbezug zu dem Ste7-Protein besitzen.
3. Proteine mit einer bekannten Zellfunktion (Pop4p, Bud5p, Dun1p, Prp42p Mcm6p
und Hsp104p), die in keinem offensichtlichen Zusammenhang zu der Interaktion mit
Ste7p stehen.
4. Proteine, die aufgrund unbekannter Zellfunktionen potentiell für die Aufgabe als
Ste7p-Regulationsproteine in Betracht kamen (Ycl024Wp, Yhl023Cp, Ykr038Cp,
Ylr033Wp, Yol078Wp und Yol087Cp).
Die spezifische Charakterisierung dieser Proteine der 4. Kategorie erfolgte durch die
Phänotypanalysen deletionsmutierter Zellen bzw. überexprimierender Zellen und ergab
keine Verhaltensabweichungen. Somit konnte diesen Proteinen keine offensichtliche
Funktion der MEK-Regulation zugewiesen werden.
Inwieweit ungeeignete Systemparameter bei der Isolierung der Interaktionspartner oder
ein mit den angewendeten Analysen nicht ermittelbarer Phänotyp dafür verantwortlich
waren kann nicht eindeutig entschieden werden.
Deshalb muß die Frage nach ‘negativen Kontrollelementen’ der Ste7p-Regulation
derzeit noch unbeantwortet bleiben.
6. Literatur
95
6. Literatur
Akada, R., Kallal, L., Johnson, D.I. und Kurjan, J. (1996) Genetic relationships between
the G protein beta gamma complex, Ste5p, Ste20p and Cdc42p: investigation of
effector roles in the yeast pheromone response pathway Genetics, 143, 103-17.
Akada, R., Yamamoto, J. und Yamashita, I. (1997) Screening and identification of yeast
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signal transduction in Saccharomyces cerevisiae requires the sequential function
of three protein kinases Mol Cell Biol, 13, 2069-80.
Danksagung
Bei Herrn Prof. Dr. W. Duntze möchte ich mich persönlich für die
Überlassung des interessanten Themas, sowie für die Unterstützung
und Betreuung während der Anfertigung dieser Arbeit bedanken.
Herrn Prof. Dr. E. W. Weiler danke ich für die freundliche Übernahme
des Koreferats.
Herrn Dr. R. Betz danke ich für die Diskussionsbereitschaft und Hilfe-
stellungen bei Versuchsdurchführungen.
Frau S. Wütrich möchte ich für die engagierten Fotoarbeiten danken.
Schließlich möchte ich mich bei den ehemaligen und jetzigen
Mitarbeitern des Lehrstuhls für Physiologische Chemie für Rat und Tat
und für die gute Zusammenarbeit bedanken.
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