indirektna imunofluoroscencija u dijagnostici autoimunih ... · luminiscencija • elektromagnetsko...

Indirektna imunofluorescencija u Indirektna imunofluorescencija u dijagnostici autoimunih bolesti

Jasna Pavela

LuminiscencijaLuminiscencija

• Elektromagnetsko zračenje atoma ili molekula kao • Elektromagnetsko zračenje atoma ili molekula kao posljedica prelaska elektrona iz pobuđenog u niže energetsko stanjeenergetsko stanje

• Fluorescencija- emisija svijetla je simultana sa apsorpcijomapsorpcijom

• Fosforescencija- emisija svijetla traje dulje od ekscitacije

• Poseban oblik fluorescentne tehnike je imunofluorescencija

ImunofluorescencijaImunofluorescencija

� Histokemijska tehnika koja koristi protutijela obilježena � Histokemijska tehnika koja koristi protutijela obilježena fluorokromom odnosno fluoroforom za detekciju antigena u stanicama/tkivima i tjelesnim tekućinama.

� Omogućuje promatranje ponašanja antigena i njihovo � Omogućuje promatranje ponašanja antigena i njihovo posljedično djelovanje na stanice/tkiva

� Omogućuju ranu dijagnozu i praćenje tijeka bolesti � Omogućuju ranu dijagnozu i praćenje tijeka bolesti

� Dijeli se na direktnu imunofluorescenciju (DIF) i indirektnu

imunofluorescenciju (IIF)

ImunofluorescencijaImunofluorescencija

� Koristi svojstvo fluorokroma odnosno fluorofora da nakon � Koristi svojstvo fluorokroma odnosno fluorofora da nakon procesa pobuđivanja svijetlom određene valne duljine (ekscitacija) odašilju svijetlo druge valne duljine (emisija).

� Fluorokromi ili fluorofori su boje koje su sposobne vezivati na � Fluorokromi ili fluorofori su boje koje su sposobne vezivati na određene stanične strukture i time omogućuju vizualizaciju istih

� Neki fluorokromi: FITC (fluorescin izotiocijanat), fikoeritrin, � Neki fluorokromi: FITC (fluorescin izotiocijanat), fikoeritrin, etidij bromid, akridin orange itd.

� Izbor ovisi o vrsti antigena koji se želi detektirati kao i o vrsti mikroskopa odnosno ekscitacijskih i emisijskih filteramikroskopa odnosno ekscitacijskih i emisijskih filtera

ImunofluorescencijaImunofluorescencija

� FITC (fluorescin izotiocijanat) –najkorištenija boja u � FITC (fluorescin izotiocijanat) –najkorištenija boja u tehnikama imunofluorescencije

� Lako topiv u vodi

� Izažena fluorescencija zahvaljujući visokom ekscitacijskom koeficijentu (apsorbira plavo svijetlo i emitria zeleno)

� Pokazuje slabo nespecifično vezivanje na tkiva što omogućuje � Pokazuje slabo nespecifično vezivanje na tkiva što omogućuje jasniju sliku.

Direktna imunofluorescencijaDirektna imunofluorescencija

� Tehnika jednog koraka koja koristi jedno protutijelo koje se � Tehnika jednog koraka koja koristi jedno protutijelo koje se direktno veže na antigene tkiva

� Antigen je fiksiran na podlogu

� Protutijelo obilježeno FITC-om se prelije preko fiksiranog antigena

� Ispiranje nevezanih protutijela� Ispiranje nevezanih protutijela

� Promatranje u UV području pomoću mikroskopa

� Zelena fluorescencija na mjestima gdje je antigen vezan� Zelena fluorescencija na mjestima gdje je antigen vezan

Indirektna imunofluorescencijaIndirektna imunofluorescencija

� Tehnika dva koraka koja koristi dva protutijela primarno i � Tehnika dva koraka koja koristi dva protutijela primarno i sekundarno (protutijelo na imunoglobulin IgG koje je obilježeno fluorokromom)

� Antigen je fiksiran na podlogu� Antigen je fiksiran na podlogu

� Primarno protutijelo se prelije preko fiksiranog antigena

� Ispiranje nevezanih protutijela� Ispiranje nevezanih protutijela

� Sekundarno protutijelo obilježeno FITC-om

� Ispiranje nevezanih protutijela� Ispiranje nevezanih protutijela

� Promatranje u UV području pomoću mikroskopa

� Zelena fluorescencija na mjestima gdje je antigen vezan

Prednosti i nedostaci indirektne imunofluorescencijeimunofluorescencije

� Više obilježenih sekundarnih protutijela se mogu vezati na � Više obilježenih sekundarnih protutijela se mogu vezati na primarno protutije što daje jači i jasniji signal

� Indirektna detektira protutijelo a direktna antigen

� Vremenski je zahtjevnija u odnosu na direktnu imunofluorescenciju

Primjena indirektne Primjena indirektne imunofluorescencijeimunofluorescencije

DermatologijaDermatologija

Mikrobiologija

Patologija

Laboratorijska dijagnostika- autoimune bolesti Laboratorijska dijagnostika- autoimune bolesti

Autoimune bolestiAutoimune bolesti

� Posljedica poremećene imunološke homeostaze� Posljedica poremećene imunološke homeostaze

� Stvaranje protutijela na antigene vlastitih stanica

� Učestalost u populaciji 5-7% uz tendenciju porasta� Učestalost u populaciji 5-7% uz tendenciju porasta

� Kronične bolesti koje često imaju nespecifične simptome

� Dijagnoza se postavlja kombinacijom kliničkih znakova i laboratorijskih testovalaboratorijskih testova

Laboratorijska dijagnoza autoimunih bolestiLaboratorijska dijagnoza autoimunih bolesti

� Kompletna krvna slika� Kompletna krvna slika

� Sedimentacija eritrocita

� Određivanje upalnih biljega Klinički nespecifične� Određivanje upalnih biljega

� Metabolički profil

� Hormonski status

Laboratorijska dijagnoza autoimunih bolestiLaboratorijska dijagnoza autoimunih bolesti

� Određivanje protutijela jer su esencijalni biomarker u SARD-u � Određivanje protutijela jer su esencijalni biomarker u SARD-u (sistemske autoimune reumatološke bolesti)

� Pozitivan nalaz protutijela bitan ne samo za dijagnozu već i praćenje tijeka bolestipraćenje tijeka bolesti

� ANA protutijela (antinuklearna protutijela)

� Prvi ANA test 1948. god. – LE stanice� Prvi ANA test 1948. god. – LE stanice

� Različite imunokemijske metode određivanja ali zlatni standard je IIFT (indirektni imunofluorescentni test)

Laboratorijska dijagnoza autoimunih bolestiLaboratorijska dijagnoza autoimunih bolesti

� Određivanje protutijela jer su esencijalni biomarker u SARD-u � Određivanje protutijela jer su esencijalni biomarker u SARD-u (sistemske autoimune reumatološke bolesti)

� Pozitivan nalaz protutijela bitan ne samo za dijagnozu već i praćenje tijeka bolestipraćenje tijeka bolesti

� ANA protutijela (antinuklearna protutijela)

� Prvi ANA test 1948. god. – LE stanice� Prvi ANA test 1948. god. – LE stanice

� Različite imunokemijske metode određivanja ali zlatni standard je IIFT (indirektni imunofluorescentni test)

Laboratorijska dijagnoza autoimunih bolestiLaboratorijska dijagnoza autoimunih bolesti

� Podloga (supstrat)- bilo koja eukariotska stanica ali najčešće � Podloga (supstrat)- bilo koja eukariotska stanica ali najčešće jetra štakora ili HEp2 stanice

� HEp2 stanice (human epithelia carcinoma cells) dobivene uzgojem iz staničnih kultura karcinoma larinksauzgojem iz staničnih kultura karcinoma larinksa

� Velike unutarstanične strukture – bolja vidljivost antigena

� Stanice u fazi mirovanja i fazi dijeljenja te je moguće uočiti više � Stanice u fazi mirovanja i fazi dijeljenja te je moguće uočiti više različitih antigena.

� Humano podrijetlo

� Postojanost

� Rezultati se izražavaju opisno i semikvantitativno

� Pozitivan rezultat je ona dilucija kod koje je još uvijek prisutna � Pozitivan rezultat je ona dilucija kod koje je još uvijek prisutna fluorescencija

� Varijacije u opisu antigena

ICAP klasifikacijaICAP klasifikacija

� ICAP (International consensus on ANA pattterns) � ICAP (International consensus on ANA pattterns)

� Radna skupina osnovana 2014. god

� Podjela svih antigena u četiri osnovne skupine mogućih � Podjela svih antigena u četiri osnovne skupine mogućih fluorescentnih uzoraka

� Svaka skupina se dalje dijeli u grupe i podgrupe koje nose oznake AC (anti-cell) i pripadajući broj AC-1 do AC-28oznake AC (anti-cell) i pripadajući broj AC-1 do AC-28

� Klasifikacijsko stablo koje se mijenja ovisno o povratnim informacijama korisnika

ICAP klasifikacijaICAP klasifikacija

Slika 1. Vrste ANA uzoraka

www. ANA pattern organisationSSSS

ICAP klasifikacijaICAP klasifikacija

� 1. Negativni uzorak: AC-0� 1. Negativni uzorak: AC-0

� 2. Nuklearni uzorak: AC-1 do AC-14, AC-29.Obuhvaća homogenu, granuliranu fluorescenciju, centromere, diskretne nuklearne točkice, nuklearne točkicei pleomorfni uzorak.nuklearne točkice, nuklearne točkicei pleomorfni uzorak.

� 3. Citoplazmatski uzorak: AC-15 do AC-23. Obuhvaća fibrilarni, granulirani, retikularni/mitohondrijima sličan, fibrilarni, granulirani, retikularni/mitohondrijima sličan, polarni/Golgy-ovom aparatu sličan uzorak, te štapići i prstenovi.

� 4. Mitotski uzorak : AC-24-AC-28. Obuhvaća centroosme, diobeno vreteno nuklearni mitotski aparat, interstanični mostovi.diobeno vreteno nuklearni mitotski aparat, interstanični mostovi.

Neki primjeri ANA fluorescentnih Neki primjeri ANA fluorescentnih uzorakauzoraka

Slika2. Uniformno difuzno obojenje cijele jezgre stanica u interfazi. Kromosomska regija u mitotskim stanicama pokazuje intenzivno obojenje. Takav uzorak pokazuje intenzivno obojenje. Takav uzorak pokazuje ds DNA i najzastupljeniji je u SLE (Sistemski lupus)

Neki primjeri ANA fluorescentnih Neki primjeri ANA fluorescentnih uzorakauzoraka

Slika 3. Scl-70 (topoizomeraza I)Slika 3. Scl-70 (topoizomeraza I)

Nukleoplazma je obojena kod stanica u interfazi kao i kromosomska regija u mitozi. Često se vide pozitivni nukleoli. Najčešće se pojavljuju kod SS (Sistemska skleroza) i pojavljuju kod SS (Sistemska skleroza) i predstavljaju jedan od dijagnostičkih kriterija za postavljanje dijagnoze.

Neki primjeri ANA fluorescentnih Neki primjeri ANA fluorescentnih uzorakauzoraka

Slika 4. SS-A/RoSlika 4. SS-A/Ro

Finogranulirana fluorescencija jezgre. U kromosomskoj regiji mitotskih stanica nema fluorescencije. Pojavljuju se kod pacijenata sa SjS (Sjogrenov sindrom) gdje su jedan od sa SjS (Sjogrenov sindrom) gdje su jedan od dijagnostičkih kriterija, SLE a ponekad i kod miozitisa i skleroderme. Prisutnost protutijela kod majke povezana je sa pojavom neonatalnog Lupusa.neonatalnog Lupusa.

Neki primjeri ANA fluorescentnih Neki primjeri ANA fluorescentnih uzorakauzoraka

Slika 5. Protutijela na nuclear dots (Sp100 Slika 5. Protutijela na nuclear dots (Sp100

protein)

Fluorescencija 1-24 točkice u jezgri. Najčešće zastupljena kod PBC (Primarna bilijarna ciroza), ponekad se javljaju i kod bilijarna ciroza), ponekad se javljaju i kod promijelocitne leukemije.

Neki primjeri ANA fluorescentnih Neki primjeri ANA fluorescentnih uzorakauzoraka

Slika 6. Protutijela na mitohondrijalne Slika 6. Protutijela na mitohondrijalne

proteine (Piruvat dehidrogenaza AMA-M2

te AMA-M1, AMA-M3-M9))

Grubo granulirano, filamentozno obojenje citoplazme. Često se javljaju kod PBC citoplazme. Često se javljaju kod PBC (Primarna bilijarna ciroza) i predstavljaju kriterij za postavljanje dijagnoze

Neki primjeri ANA fluorescentnih Neki primjeri ANA fluorescentnih uzorakauzoraka

Slika 7. Protutijela na lizosome Slika 7. Protutijela na lizosome

(lizosomalni protein katepsin i lizosomalni

membranski protein)

Velike nepravilne granule raširene po citoplazmi. Nije jasna klinička korelacija ali citoplazmi. Nije jasna klinička korelacija ali ponekad se javljaju u SLE (Sistemski lupus) i neurološkim bolestima.

Neki primjeri ANA fluorescentnih Neki primjeri ANA fluorescentnih uzorakauzoraka

Slika 8. Protutijela na Golgy-evo tijelo Slika 8. Protutijela na Golgy-evo tijelo

(Golgin-95, Golgin-97, giantin)

Nepravilno granularno obojenje citoplazme smješteno oko jezgre. Ponekad se javljaju kod pacijenata sa SLE (Sistemski lupus) te kod pacijenata sa SLE (Sistemski lupus) te RA (Reumatoidni artritis)

Neki primjeri ANA fluorescentnih Neki primjeri ANA fluorescentnih uzorakauzoraka

Slika 9. Protutijela na mitotski aparat (Nu-Slika 9. Protutijela na mitotski aparat (Nu-

MA)-2

Obojeni su diobeno vreteno i polovi u mitotskim stanicama. Stanice u interfazi nisu obojene. Pojavljuju se kod SLE.obojene. Pojavljuju se kod SLE.

Detekcija protutijela koja nisu ANADetekcija protutijela koja nisu ANA

• Supstrat nisu Hep-2 stanice već različite stanice i tkiva npr.• Supstrat nisu Hep-2 stanice već različite stanice i tkiva npr.

• Neutrofilni granulociti – p ANCA i c ANCA

• Spermiji- spermalna protutijela

• Tkivo želuca- protutijela na glatku muskulaturu

• Tkivo štitinjače- protutijela na tiroidnu peroksidazu

• Tkivo bubrega- protutijela na glomerularnu bazalnu membranu• Tkivo bubrega- protutijela na glomerularnu bazalnu membranu

Interferencije u IIFA testovimaInterferencije u IIFA testovima

� Lažno pozitivni rezultati:� Lažno pozitivni rezultati:

� nedovoljno ispiranje

� prisutnost reumatoidnog faktora

� križno reagirajuće protutijelo

� Lažno negativni rezultati:� Lažno negativni rezultati:

� preveliko ispiranje

� prozonski učinak

� blokirajuće protutijelo� blokirajuće protutijelo

� neki antigeni se slabo vide SS-A/Ro

ZaključakZaključak

� ANA test je zlatni standard u laboratorijskoj dijagnostici autoimunih � ANA test je zlatni standard u laboratorijskoj dijagnostici autoimunih bolesti

� Visoka osjetljivost

� Test probira koji je potrebno potvrditi drugim imunokemijskim testovima� Test probira koji je potrebno potvrditi drugim imunokemijskim testovima