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Grundlagen der Biochemie

• Aminosäuren, Peptide, Proteine (Aufbau, Funktion)

• Kohlenhydrate

• Lipide

• Nukleotide, Nukleinsäuren

• Einführung in die Molekularbiologie: Chromosomen, DNA-

Replikation, DNA-Reparatur

• Transkription, Translation

• Grundlagen der Gentechnik

• Vitamine, Cofaktoren

• Grundlagen des Stoffwechsels

• Mitochondrien, Atmungskette

• Stoffwechsel von Lipiden, Aminosäuren, Nukleotiden

• Zellkommunikation, Stofftransport

• Signalkaskaden, Zellzyklus

Biochemie 02/1

Peptide

GlycinAlanin

Biochemie 02/2

α

α

Peptidbindung

Peptide

Biochemie 02/3

Peptidbindung

N-Terminus C-Terminus

Peptide

Biochemie 02/4

Ala-Leu-Gly-Lys-His

Acetyl, CH3-CO-

Peptide

Biochemie 02/5

Ala-Leu-Gly-Lys(Ac)-His

Ala-Leu-Gly-Lys-His

Peptide

Acetyl,

CH3-CO-

Biochemie 02/6

Ala-Leu-Gly-Lys(Ac)-His

Ac-Ala-Leu-Gly-Lys-His

Ala-Leu-Gly-Lys-His

Ala-Leu-Gly-Lys(Ac)-His

Ac-Ala-Leu-Gly-Lys-His

Ac-Ala-Leu-Gly-Lys-His-NH2

NH2

Säureamid

Peptide

Biochemie 02/7

Ala-Leu-Gly-Lys-His

Verzweigte Peptide

-Peptidbindung

-Peptidbindung

Glutathion

Biochemie 02/8

Cyclopeptide und verzweigte Peptide

Esterbindung

NH2 H2N

COOH

Biochemie 02/10

Peptide: Zusammensetzung

homodete Peptide: nur Amidbindungen (Peptidbindungen)

heterodete Peptide: auch andere Bindungen, wie Disulfidbrücken

mit Ether-Bindung

mit Thioether-Bindung

mit Disulfid-Bindung

mit Ester-Bindung

Biochemie 02/11

Peptide: Bindungen

homodete Peptide: nur Amidbindungen (Peptidbindungen)

heterodete Peptide: auch andere Bindungen, wie Disulfidbrücken

Biochemie 02/12

Peptide: Zusammensetzung

homöomere Peptide: Rückgrat nur aus Aminosäuren

heteromere Peptide: Aminosäuren und Pseudoaminosäuren

z.B. Depsipeptide: Aminosäuren und Hydroxycarbonsäuren

Surfactin (B. subtilis)

AminosäurenFettsäureEster

Amid

Biochemie 02/13

Peptide: Zusammensetzung

homöomere Peptide: Rückgrat nur aus Aminosäuren

heteromere Peptide: Aminosäuren und Pseudoaminosäuren

z.B. Depsipeptide: Aminosäuren und Hydroxycarbonsäuren

Surfactin (B. subtilis) Valinomycin (Streptomyceten)

Aminosäuren

Biochemie 02/14

Hormone

Neurotransmitter

Neuropeptide Peptidtoxine

Peptidantibiotika

Biologisch aktive Peptide

Biochemie 02/15

Peptidtoxine

Phallotoxine (grüner Knollenblätterpilz)

Amatoxine (grüner und

weißer Knollenblätterpilz)

Viscotoxine (Mistel)

Mellitin (Bienengift)

Mastoparan (Wespengift)

Conotoxine (Kegelschneckengift)

Cobratoxin (Schlangengift)

Anuratoxin (Froschgift)

Biochemie 02/16

Ala Trp

Cys

Hyp

variable

Positionen

Pilzgift-Peptide

Phallotoxine

• Mikroheterogenität

• modifizierte, nicht proteinogene Aminosäuren

• oft cyclische Struktur

• ungewöhnliche Verknüpfungen (Thioether Cys – Trp)Biochemie 02/17

Amatoxine

Wirkung:

• Hemmung der DNA-Transkription: RNA Polymerase II

• Blockierung der ribosomalen Proteinbiosynthese (Leber)

• Nekrose der Leberzellen, TodBiochemie 02/18

Pilzgift-Peptide

• Disulfidbrücken-reich (22-50% Cys-Reste)

• sehr starr

Wirkung:

• Cardiotoxine: Herzmuskelgifte, irreversible Depolarisation

• Neurotoxine: passen genau in verschiedene Rezeptoren

der Signalübertragung (Rezeptoren, Kanäle),

Atemgifte

Peptidtoxine von Schlangen, Kegelschnecken, Amphibien

Biochemie 02/19

Hydroxyprolin

Cys-reich

Peptidtoxine der Kegelschnecken

Conidae

Neurotoxine: Blockierung von Na+/K+-Kanälen

Biochemie 02/20

Hormone

Neurotransmitter

Neuropeptide Peptidtoxine

Peptidantibiotika

Biologisch aktive Peptide

Biochemie 02/21

• ungewöhnliche Aminosäuren

- D-Aminosäuren

- N-Methyl-Aminosäuren

- Dehydro-Ala, Lanthionin

• ungewöhnliche Bindungen

- Lacton-Bindungen

- Cyclopeptide

• reduzierter enzymatischer Abbau

- durch modifizierte N- und C-Termini

Peptidantibiotika

Biochemie 02/22

• hochaktiv gegen gram-positive Bakterien

Gramicidine

D-Aminosäuren

Ethanolamin

am C-Terminus

Formylgruppe

am N-Terminus

Bacillus brevis

Biochemie 02/23

(C) Gramicidin A

Gramicidine

• hochaktiv gegen gram-positive Bakterien

• hämolytisch, daher NICHT systemisch anwendbar

Biochemie 02/24

Valinomycin

• Depsipeptid

(alternierend Peptid- und Lacton-Bindungen)

(Streptomyces fulvissimus)

Lac = L-MilchsäureD-Hyo = D-α-Hydroxyisovaleriansäure

Biochemie 02/25

• Ionophor:

komplexiert Kationen in

käfigartiger Struktur:

K+ >>> Na+

• Transport durch Membran

• Zerstörung des Potentials

Valinomycin

- K+

+ K+

Biochemie 02/26

Hormone

Neurotransmitter

Neuropeptide Peptidtoxine

Peptidantibiotika

Biologisch aktive Peptide

Biochemie 02/27

Substanzen,

• die das Signal von einer Zelle an viele

weitergeben.

• die von einer Drüsenzelle nach Impuls

freigesetzt und in die Umgebung oder

Blutbahn abgeben werden.

• die an Erkennungsmoleküle

(Rezeptoren) binden.

Was sind Hormone?

Biochemie 02/28

Formen der Hormonstimulation

Biochemie 02/29

Was sind Neurotransmitter?

Substanzen,

• die das Signal von einer Zelle zur

nächsten durch den synaptischen Spalt

weitergeben.

• die von einer Nervenzelle nach Impuls

freigesetzt werden und durch den

synaptischen Spalt diffundieren

• die post- oder präsynaptisch an

Erkennungsmoleküle (Rezeptoren) binden

Biochemie 02/30

• Kommunikationssysteme des Körpers

• Nervensystem: schnell, gezielt, kurz

• Hormonsystem: langsam, breit, langanhaltend

Hormone und Neurotransmitter

Biochemie 02/31

Beispiele für Peptidhormone

Biochemie 02/32

Thyroliberin (TRH):

C-Terminus: amidiert

N-Terminus:

pyro-Glutamat

Gonadoliberin (GnRH):

Strukturelle Besonderheiten

pGlu-His-Pro-NH2 pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2

Glutaminyl-Cyclase (QC):

TRH

pGlu-His-Pro-NH2

Pro-NH2

His

pyro-Glu

Biochemie 02/33

Beispiele für Peptidhormone

Biochemie 02/34

Insulin

Humanes Insulin:

51 Aminosäuren, 5808 Da

Biochemie 02/35

Biosynthese von Insulin

Biochemie 02/36

Hormonregelkreise

CRF: Corticotropin-releasing factor

TRF: Thyrotropin-releasing factor

GnRF: Gonadotropin-releasing factor

GRF: Growth hormone-releasing factor

ACTH: Adrenocorticotropes Hormon

TSH: Thyreocyte-stimulating hormone

FSH: Follikel-stimulierendes Hormon

LH: lutenisierendes Hormon

T3, T4: Schilddrüsenhormone

Biochemie 02/37

Struktur von Proteinen

Biochemie 02/38

Peptide

Peptidbindung ist mesomeriestabilisiert:

Biochemie 02/39

Peptide

Biochemie 02/40

Peptide

Bindungslänge in Å

C=O C-N

Kristallverband

Gasphase

1,241

1,219

1,3181,352

C=N Doppelbindung: 1,24 Å

C-N Einfachbindung: 1,47 Å

Biochemie 02/41

Peptide

Biochemie 02/42

Peptide

Biochemie 02/43

Peptide

non-proline amino acids:

proline amino acids:

Prolin:

Biochemie 02/44

Peptide

Biochemie 02/45

Mage: 02-2ndst.kin/kin1

Peptide

C-C: Ψ

C-N: Φ

Biochemie 02/46

Struktur von Proteinen

Biochemie 02/48

Struktur von Proteinen

Biochemie 02/49

Struktur von Proteinen

Biochemie 02/50

Struktur von Proteinen

Biochemie 02/51

Die -Helix

• rechtsgängige Helix

• 3,6 Aminosäuren/Windung

• Ganghöhe (Pitch): 0,54 nm

• Prolin verzerrt Struktur,

steuert keine H-Brücke

durch N bei: Helix-Brecher

• Torsionswinkel:

Phi (Φ) = -57°

Psi (Ψ) = -47°

Biochemie 02/52

Mage: c3Alpha.kin/Kin1

Die -Helix

Rop-Protein

(bakterielles RNA-bindendes Protein)

Biochemie 02/53

Helikale Strukturen

nm: n = Anzahl der Aminosäuren per turn

m = Anzahl der Atome im durch die H-Brücke geschlossenen Ring

(3.613)

Biochemie 02/54

Helikale Strukturen

310 Helix Helix

(3.613)

Helix

(4.416)

Biochemie 02/55

• Torsionswinkel:

Phi (Φ) = -75°

Psi (Ψ) = 145°

Helikale Strukturen

Polyprolin-Helix

• linksgängige Helix

• 3 Aminosäuren/Windung

• Ganghöhe (Pitch): 0,94 nm

• artifiziell

Biochemie 02/56

Kollagen

• linksgängig

• 3,3 Aminosäuren/Windung

• Ganghöhe (Pitch): 0,96 nm

• keine H-Brücken innerhalb der

Helix!

Biochemie 02/57

Kollagen

Biochemie 02/58

Kollagen

Biochemie 02/59

Kollagen

Kollagen vom Rind:

Biochemie 02/60

Kollagen

Biochemie 02/61

Kollagen

Biochemie 02/62

Keratin

Biochemie 02/63

Keratin

Biochemie 02/64

Struktur von Proteinen

Biochemie 02/65

Das -Faltblatt

Biochemie 02/66

Das -Faltblatt

Biochemie 02/67

Das -Faltblatt

Biochemie 02/68

Kohlenstoff ist

sp3-hybridisiert:

Das -Faltblatt

Biochemie 02/69

Das -Faltblatt

Seide

Mage:

Protein Secondary

Structures/ Kin1

Biochemie 02/70

• komplexere Sekundärstruktureinheiten

• häufig korreliert mit Funktionseinheit

Untereinheit des Enzyms

Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase

Domänen

Glyceraldehyd-3-Phosphat-

Bindung

NAD+-Bindung

Biochemie 02/71

Domänen

• komplexere Sekundärstruktureinheiten

• häufig korreliert mit Funktionseinheit

• bestimmte Domänen in verschiedenen Proteinen gleich

Biochemie 02/72

Wichtige Strukturen aus Proteinen

• -Strukturen

4-Helix-Bündel

• / -Strukturen

- -Fässer

offene - -Strukturen

• antiparallele -Strukturen

-Faltblatt

-Fass

• Strukturen von Membranproteinen

E. coli

Cytochrom b562

Retinol-bindendes Protein

up-and-down barrelBiochemie 02/73

Hämoglobin

Quartärstruktur

Ribosom

• Proteine mit identischen Untereinheiten: Oligomere (Dimer,…)

• identische Untereinheiten: Protomere

Biochemie 02/74

• Struktur: wie sehen Proteine aus?

• Funktion: was machen Proteine

• Faltung: wie wird es aktiv?

• Reinigung: wie isoliere ich ein Protein?

Funktion von Proteinen

Biochemie 02/75

• Einteilung nach der Herkunft:

- bakterielle, virale, pflanzliche, tierische Proteine

• Einteilung nach der Struktur:

- globuläre, fibrilläre Proteine

- mit/ohne Cofaktoren/Coenzyme, prosthetische Gruppen

• Einteilung nach der Funktion:

- Strukturproteine

- Enzyme

- Transportproteine

- Bewegungsproteine

- Speicherproteine

- Verteidigungsproteine

- Regulatorische Proteine

Möglichkeiten zur Einteilung

Biochemie 02/76

Seide

Haare

Strukturproteine

Geißeln

Muskulatur

Mikrotubuli

GeißelnBiochemie 02/77

Strukturproteine

Keratin: Haare, Fingernägel, Federn

fest, unlöslich

-Helices

Collagen: Knorpel, Bindegewebe

fibrillös

Collagen-Helix

Elastin: Ligamente

dehnbar in zwei Richtungen

Fibroin: Seidenfasern, Spinnweben -Faltblatt

Biochemie 02/78

katalysieren eine chemische Reaktion

Enzyme

Biochemie 02/79

• binden spezifische Moleküle oder Ionen

• transportieren sie im Blutplasma

• transportieren sie durch die Zellmembran

Beispiele:

Hämoglobin: Sauerstoff

Lipoproteine: Lipide

Albumin

Aminosäuren-Transporter

Glykoprotein P (ABC-Transporter)

Transportproteine

Biochemie 02/80

Hämoglobin

Biochemie 02/81

• Actin und Myosin

kontraktile Skelettmuskeln

Bewegungsproteine

Biochemie 02/82

Bewegungsproteine

• Tubulin

Protein der Mikrotubuli, Geißeln, Cilien

Biochemie 02/83

• Ovalbumin (Eiweiss)

Speicherproteine

• Ferritin (Eisenspeicher im Gewebe)

• Casein (Milch)

Biochemie 02/84

• Proteine der Blutgerinnung:

Fibrinogen, Thrombin

Verteidigungsproteine

• Schlangengifte, bakterielle, pflanzliche Toxine

• Proteine des Immunsystems:

Immunglobuline, Cytokine, Interferone

Biochemie 02/85

• Protein-Hormone:

Wachstumshormon

Parathormon

Regulatorische Proteine

• Repressoren/Aktivatoren

regulieren die Transkription, Biosynthese

Biochemie 02/86

Reinigung und Analytik von Proteinen

Proteinisolierung zur

• Untersuchung von Strukturen

• Bestimmung der Eigenschaften von Proteinen

• Bestimmung der Funktion, biologischen Aktivität

dazu

• Analytik

• Funktionelle Tests

Biochemie 02/87

Eigenschaften von Proteinen

• Größe von Proteinen

- Je größer ein Protein, desto schwieriger seine Isolierung und

Reinigung

• Verfügbare Mengen

- Reinigung wird mit steigender Mengen eines Proteins um ein

Vielfaches einfacher

• Säure-Base-Eigenschaften

- Ausnutzung in Ionenaustauschchromatographie und

Elektrophorese

Biochemie 02/88

Eigenschaften von Proteinen

• Biologische Aktivität

- beruht auf einer bestimmten molekularen und räumlichen

Anordnung

- unterschiedliche Stabilität unter verschiedenen Umgebungs-

bedingungen (zu hohe oder zu niedrige Pufferkonzentration,

Temperatur, Kontakte zu unphysiologischen Oberflächen, fehlende

Cofaktoren, etc.)

- Zerstörung = Denaturierung

• Stabilität

- Schutz vor Proteasen, Aggregation zu unlöslichen Komplexen

Biochemie 02/89

Reinigungsschema für verschiedene Proteine

Biochemie 02/90

Zellruption/Homogenisation

Reinigungen aus intaktem Gewebe:

• Zerstörung von komplexen Zellverbände durch Homogenisieren

• Gemisch aus intakten und aufgebrochenen Zellen (Zellorganellen, Membranfragmenten, Cytoplasma und beschädigten subzellulären Kompartimenten)

Homogenisationsmedium

• Schutz der Zellen vor osmotischem Platzen

• Schutz vor Proteasen

• Schutz der biologischen Aktivität (Funktion)

• Verhinderung von Aggregation

• möglichst wenig Zerstörung von Organellen

• keine Interferenzen mit biologischen Analysen und funktionellen Tests

Biochemie 02/91

Trennmethoden für Biomoleküle

PulsfeldelektrophoreseZentrifugation

2D

Elektro-

phorese

1D CE

Chromatographie

Biochemie 02/92

Ultrazentrifugation

Biochemie 02/93

Ultrazentrifugation

• 80-100.000 rpm (~1.500 Umdrehungen pro Sekunde)

• etwa 600.000 G (1g ½ Tonne)

Biochemie 02/94

Chromatographische Trennverfahren

• Ionenaustausch-Chromatographie

• Gelfiltrations-Chromatographie

• Affinitätschromatographie

• Hydroxylapatit-Chromatographie

• Reversed-Phase-Chromatographie

• Hydrophobe Wechselwirkungs-

Chromatographie

Ausnutzung von Wechselwirkungen zwischen

stationärer Phase und dem gelösten Substanzgemisch

Biochemie 02/95

Ionenaustauschchromatographie

Biochemie 02/96

Ionenaustauscher: Funktionelle Gruppen

Biochemie 02/97

Gelfiltrationschromatographie

Biochemie 02/98

Gelfiltrationschromatographie

Bestimmung der molekularen Masse mittels Gelfiltration:

Korrelation von relativem Elutionsvolumen

und dem Logarithmus der molaren Masse

verschiedener Proteine

Biochemie 02/99

Affinitätschromatographie

Biochemie 02/100

Dialyse

Biochemie 02/101

• Proteinbestimmung

• Elektrophorese

• Massenspektrometrie

• Edman-Sequenzierung

• Funktionstests

Protein-Analytik

Biochemie 02/102

Proteinbestimmungsmethoden

• Direkte photometrische Bestimmung (UV)

• Biuret-Methode

• Lowry-Methode

• BCA-Methode

• Bradford-Methode

Biochemie 02/103

Proteinbestimmungsmethoden

Prinzip: aromatische Aminosäuren (Tryptophan,

Tyrosin) absorbieren bei 280nm (UV)

Nachteile:• geringere Sensitivität

• störanfällig: kontaminierende

Nukleinsäuren, Nukleotide

• Direkte photometrische Bestimmung (UV)

Biochemie 02/104

Proteinbestimmungsmethoden

• Bradford-Methode

Farbstoff bindet an Arginin, Tryptophan, Histidin, Phenylalanin

Dabei verschiebt sich sein Absorptionsmaximum von 465 zu 595nm.

Coomassie Brilliant Blue G-250

Biochemie 02/105

Proteinbestimmungsmethoden

Voraussetzung: Messung in linearem Bereich

Biochemie 02/106

Elektrophoretische Trennmethoden

• Agarose-Gele

• Polyacrylamidgelelektrophorese

• SDS-PAGE

• Isoelektrische Fokussierung

• 2D-Elektrophorese

Biochemie 02/107

Papierelektrophorese

Biochemie 02/108

Gelelektrophorese

Biochemie 02/109

SDS-Gelelektrophorese.mov

SDS-Gelelektrophorese

Biochemie 02/110

Diskontinuierliche Gelelektrophorese

pH 6,8

pH 8,8

Glycin(IEP: Zwitterion)

2

Glycin(Anion)

Biochemie 02/111

Diskontinuierliche Gelelektrophorese

Biochemie 02/112

Diskontinuierliche Gelelektrophorese

SDS

Biochemie 02/113

Isoelektrische Fokussierung

2 10 Protein ist am pI ungeladen,

wandert nicht mehr weiter

Bei niedrigem pH sind die

Proteine hoch protoniert und

positiv geladen, wandern zur

Kathode

Bei hohem pH sind die Proteine

deprotoniert und negativ

geladen, wandern zur Anode

Biochemie 02/114

2D-Gelelektrophorese

Biochemie 02/115

Wo ist mein Protein???

Protein

Markerspur

Biochemie 02/116

Western Blot

farbiges Produkt

Biochemie 02/117

Western Blot

SDS-Gel Western Blot

Biochemie 02/118

Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Biochemie 02/119

Biologische Aktivität

• Enzymtests

• Immunchemische Methoden

Biochemie 02/120

Proteinanalytik

• Massenspektrometrie: MALDI, ESI-MS

• Edman-Sequenzierung

Biochemie 02/121