glicogenosi di tipo 2 diagnostica biochimica e molecolare
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GLICOGENOSI DI TIPO 2Diagnostica Biochimica e
Molecolare
AOU “Santa Maria della Misericordia”Udine, 25 Novembre 2014
Glicogenosi di tipo II
• Malattia autosomica recessiva (1:40000)
• Deficit dell’enzima lisosomiale a-glucosidasi acida (GAA) o maltasiacida
• Accumulo di glicogeno nei lisosomi.
Glicogenosi tipo IIPhenotypic continuum
•Manifests in children or adults
•Progressive muscular weakness
•No cardiac involvement
•Respiratory insufficiency
•Exercise intolerance
•Swallowing difficulty
•Moderate hepatomegaly
•Elevated CK
•Residual GAA activity
Infantile onset Late onset
•Manifests soon after birth
•Rapidly progressive disease
course
•Progressive muscle weakness
•Cardiomegaly and
cardiomyopathy
•Hypotonia
•Respiratory insufficiency
•Feeding difficulties
•Moderate hepatomegaly
•Markedly elevated CK
•no GAA activity
La proteina GAA
Extracellular environment
Plasma membrane
Early endosomepH 6.0
Late endosomepH 5.0-6.0
LysosomepH <5.0
GlcNac-1-phosphotransferase
M6P-receptor
Lysosomal enzyme + M6P residue
La proteina GAA
• Precursore di 110 kDa inattivo
• Forma intermedia di 95 kDa inattiva
• Le forme di 70 e 76 kDa sono attive
ACTIVE SITE
Diagnosi di laboratorio
Tests specifici
Parametri di laboratorio non-specifici
CK, LDH, AST, ALT
Oligosaccaridi in urina
Accumulo di glicogeno in muscolo
Misurazione dell’attività enzimatica nelle cellule del paziente
Biochimico
Molecolare Analisi di mutazioni del gene GAA
Substrato(4-methyllumbelliferyl-a-D-glucoside )
+
GAA
Cellule del paziente
Prodotto Fluorescente
(4-Metilumbelliferone)
+ glucosio
Diagnosi biochimicaDosaggio dell’attività enzimatica dell’alpha glucosidasi acida
•Linfociti•Leucociti (acarbose inibitore della maltasi glucoamylase)•DBS (acarbose inibitore della maltasi glucoamylase)
20-25 gg•Coltura linfociti immortalizzati•Coltura fibroblasti
Risultati in giornata
Studi futuri
pH Acido
Diagnosi biochimica
Non sufficiente nei casi di PSEUDODEFICIENZE
Condizione presente nella popolazione generale determinata da polimorfismi
Caratterizzata da attività enzimatica ridotta non associata a malattia
c.1726G>A (p.G576S)
Presente in omozigosi nel 4% degli Asiatici
Diagnosi molecolare
Conferma diagnostica
Approfondimento diagnostico Correlazione genotipo/fenotipo
Consulenza genetica
ATG TAG
GAA gene 17q25.2 – q25.3
20Kb
Circa 400 mutazioni descritte. La maggior parte puntiformi e “private”http://www.pompecenter.nl
- prognosi
- diagnosi prenatale - identificazioneportatori
Diagnosi molecolare
Campione DNA (cellule nucleate)
PCR di ogni uno dei 20 esoni della GAA
Sequenziamento automatico
mutazioni
Conferma nei genitori
Una o nessuna mutazione
Coltura di fibroblasti
Analisi del mRNA per mutazioni di slipicing e delezioni
descritta
nuova
Patogenetica ???
Caratterizzazione in vitro dei mutanti GAA
Mutagenesi sito diretta
• Attività enzimatica• Western blot• Immunofluorescenza
pcDNA3
GAA cDNA WT
pcDNA3
GAA cDNA MUT
0
20
40
60
80
100
120
WT c.399C>A c.670C>T c.1064T>C c.2104C>T c.2188G>T
% r
esid
ua
l G
AA
acti
vit
y
Espressione di mutazioni missensoin COS-1 cells
c.1064T>C c.2104C>TGAA wt
76
11095
70
WT ALDP
Correlazione genotipo/fenotipo
Infantile GSDII
Profilo di mutazioni molto eterogeneo
Tutte le mutazioni descritte sono severe
Late onset GSDII
Mutazioni severe in eterozigosi con mutazione “mild” porta ad una forma LO
c.-32-13T>G è la più frequente
c.525delT(11.8%)
c.1064T>C(7.9%)
c.1655T>C(10.5%)
c.-32-13T>G (42.3%)
La mutazione c.-32-13T>G
ATG TAG
Normale Mutato
c.-32-13T>G
Pt#(sex)
Age(years)
First symptoms noted Mobility status % residual enzyme activity
Respiratory follow-up
onset Diagnosis At diagnosis Follow-up
1(F)
13 14 Elevated CK, AST, ALTLower limb weakness,
Fatigue
unrestricted With help 18 (M)
Reduction of pulmonary
function
2(F)
2 2 Elevated CK, AST, ALT unrestricted unrestricted NA Normal
3(F)
30 31 Elevated CK, FatigueGeneralized weakness
unrestricted With walker or wheelchair
4.3 (L)
Respiratory distress
4 (M)
18 27 Elevated CK, AST, ALTGeneralized weakness
unrestricted With help 10(M)
non invasive ventilation
5(F)
30 52 Difficulty in walking up steps
Fatigue
unrestricted With help absent Supplemental oxygen
6 (M)
22 46 Generalized weaknessFatigue
unrestricted With help 0.1(L)
Reduction of pulmonary
function
7(M)
38 38 Generalized weaknessFatigue
unrestricted With difficulty 8 (L)
Reduction of pulmonary
function
8(M)
1 2 Elevated CK, AST, ALTMuscular weakness
Impaired ambulation
With wheelchair
3.7(M)
non invasive ventilation
9(M)
1 10 Elevated CK, AST, ALT unrestricted unrestricted 0.02(M)
Normal
Clinical data of late onset GSDII patients carrying the c.-32-13T>G/c.2237G>A (p.Trp746X) genotype
Diagnosi prenatale
E’ possibile quando c’è un paziente diagnosticato in famiglia
I genitori, entrambi portatori, hanno una probabilità ¼di avere un figlio affetto
Mamma (portatrice) Papa (portatore)
Sano25%
Malato25%
Portatori50%
Non affetti 75%
Campione: Villo coriale (12^sett.) o amniociti (16^sett)
Diagnosi biochimica: Analisi dell’ attività enzimatica
Diagnosi molecolare: Analisi delle mutazioni del gene GAA presenti nella famiglia.
Solo utile in famiglie in cui le 2 mutazioni sono state caratterizzate.
Esclusione della contaminazione con DNA materno
Diagnosi prenatale
Ringraziamenti
Bruno Bembi
Andrea Dardis
Silvia CattarossiMarta DeganutoErika MaliniAnnalisa Pianta Milena RomanelloIrene Zanin
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