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UNDERSTANDING THE HCV LIFE CYCLE/MONITORING TOOLS/RESISTANCE

Fernando Gonçales Jr Professor Associado do Departamento de

Clinica Médica da FCM-UNICAMP Coordenador do Grupo de Hepatites da FCM-UNICAMP

Conflito de interesses • Fernando Lopes Gonçales Junior é Coordenador do Grupo

de Hepatites da Disciplina de Infectologia da Faculdade de

Ciencias Médicas da Universidade Estadual de Campinas ,

tendo já participado de estudos clínicos de fase III,

patrocinados pelos laboratórios ROCHE, SCHERING-

PLOUGH,GSK,JANSEN e BRISTOL MYERS SQUIBB.

Participou de palestras , congressos e eventos médicos

patrocinados por laboratórios farmacêuticos.

Proteinas envelope E1 e E2

Envelope lipídeo (derivado da cel hospedeira)

Ácido nucleíco (RNA)

Proteinas do núcleo-capsídeo viral (Core)

VHC : antigenos virais RNA virus da familia Flaviridae , classificado como genero separado (Hepacivirus)

Visualização do VHC

Virus da hepatite C

Região hipervariável HVR1 (27 aa)

(muitas mutações)

capsideo proteína

do envelope

protease helicase

RNA dependente

RNA polimerase

c22

5’

core E1 E2 NS2 NS3

33c

NS4

c-100

NS5

3’

• Região estrutural : proteina do core (C) + 2 glicoproteinas do envelope (E1 e E2)

• Proteina E2 com uma porção de 27 amino-ácidos : região hipervariável 1 (HVR1) • A região NS inclui várias proteinas : P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B

Protease (NS2, NS3 e NS4A) Helicase (NS3)

RNA- polimerase (NS5B)

Farci P. SEMINARS IN LIVER DISEASE; 31, 4:356-374, 2011

Genoma do VHC e proteinas

C E1 E2 p7 NS2 NS3 NS4A NS4B NS5A NS5B

Protease

Kwong A, et al. Beyond interferon and ribavirin: Antiviral therapies for hepatitis C virus.

Drug Discovery Today: Therapeutic Strategies 2006;3:211-220.

Genoma VHC ≈ 9.6 kb, possui uma open reading frame (ORF) que codifica uma proteina precursora de ≈ 3.000 aa com as regiões do VHC que é clivada em proteinas simples pelas

proteases celulares e virais.

As proteases clivam a poliproteina do VHC iniciando a replicação viral

NS3/4A Protease

NS4B

NS5A

NS5B

NS2 P7

E2

E1

C

Clivagem

Kwong A, et al. Beyond interferon and ribavirin: Antiviral therapies for hepatitis C virus.

Drug Discovery Today: Therapeutic Strategies 2006;3:211-220.

Inibindo a protease a droga impede a clivagem da cadeia de poliproteinas bloqueando a replicação

Inibidor de Protease se liga à protease A clivagem proteica

não se processa

Protease

Kwong A, et al. Beyond interferon and ribavirin: Antiviral therapies for hepatitis C virus.

Drug Discovery Today: Therapeutic Strategies 2006;3:211-220.

Inibidores de Entrada Ribozymes

Nucleotideos anti-sense

Inibidores de protease

Inibidores de Polimerase

Inibidores de Glucosidase Adaptado de: Pawlotsky et al., Antivir Ther 2006

A protease viral NS3/4 (serina) é a mais bem caracterizada das enzimas do HCV

Contém 3 residuos altamente conservados compreendendo uma triade catalitica

É fundamental para a síntese da poliproteína Viral. A monoterapia inevitavelmente leva ao desenvolvimento de cepas resistentes

Ciclo no citoplasma do hepatócito

VHC replica no citoplasma dos hepatócitos

A Inibição da Protease NS3/4A do HCV Pode Inibir o Ciclo de Vida do VHC 1,2

1. Adaptação autorizada por MacMillan Publishers Ltd: Manns MP et al. Nat Rev Drug Discov. 2007;6:991–1000. Copyright 2007. 2. Mauss S et al, eds. Hepatology: A Clinical Textbook. 2nd ed. Dusseldorf, Germany: Flying Publisher; 2009. www.hepatologytextbook.com. Acess 24 /5/11

Ligação dos receptores e endocitose

Fusão e desencap-sulamento

Transporte e liberação

(+) RNA

Translação e processamento de poliproteínas Replicação do RNA

Montagem do vírion

Rede membranosa

Lúmen do RE

LD

LD Lúmen do RE

LD

1

2

3

4

5

A protease NS3/4A do HCV é essencial para a replicação do vírus

Quasispecies do VHC

O que são quasispecies ?

• Há 30 anos, Domingo descreveu a enorme heterogeneidade genética de uma população de RNA virus;

• O genoma RNA não é único e abriga um enxame de genomas mutantes chamados ‘‘quasispecies’’.

• Quasispecies: conjunto de genomas não identicos correlacionados e submetidos a um contínuo processo de variação genética, competição e seleção.

Farci P. SEMINARS IN LIVER DISEASE; 31, 4:356-374, 2011

Quasispecies na HVC

Martell et al. J Virol. 1992;66:3225-3236.

Por sua alta taxa de replicação e de mutações o VHC circula in vivo como quasispecies

Composição das quasispecies

Farci P. SEMINARS IN LIVER DISEASE; 31, 4:356-374, 2011

Sequencia das

quaasispecies

• A sequencia de consenso é definida como a sequencia que

contém os nucleotídeos mais frequentemente detectados em cada

posição entre muitas variantes;

• Em um dado momento a sequencia master pode deixar de ser o

ancestral das sequencias posteriores

• As quasispecies virais consistem de 1 ou mais genomas

masters , que são quantitativamente predominantes e múltiplos

genomas menores em proporções variáveis;

• Sequencias préviamente dominantes podem persistir dentro das

quasispecies em baixa frequencia (‘‘memória’’)

Como se produz uma quasispecie

sequencia de consenso sequencia mutante

Como se produz uma quasispecie Sequencia

de consenso

Espectro mutante

Extinção Sobrevida

Fitness

Representação esquemática da evolução ( mudança na composição) de uma quasispecie viral sem modificação da sequencia de consenso

Domingo E et al. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2012;76:159-216

• Linhas descontínuas: genomas com ≥ 5 mutações (inviável) como template. • Genoma 2 (esquerda) incorpora mutações qdo replica gerando genomas 2 e 3 • Excesso de mutações no genoma 2 na terceira distribuição impede sua replicação • Evolução constante no espectro mutante pode produzir a mesma sequencia de consenso (linha inferior) • Em uma população viral o número de genomas em uma única célula infectada pode chegar a milhares

implicando um espectro mutante altamente dinâmico e indeterminado ou n

O maior fitness relativo de um genoma mutante altera a dominância na população

Domingo E et al. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2012;76:159-216

• A mutação em asterisco negro no genoma 8 produz vantagem seletiva que resulta em dominância desta mutação após alguns rounds.

• Na evolução ocorre modificação da sequencia de consenso

Fitness evolution of RNA virus populations.

Domingo E et al. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2012;76:159-216

Geração e evolução das quasispecies

Farci P. SEMINARS IN LIVER DISEASE; 31, 4:356-374, 2011

• Genomas novos com mutações deletérias para a replicação sofrem forte seleção negativa

• Há seleção positiva dos genomas com vantagens replicativas como as mutações que facilitam o escape do sistema imune e dos anti-virais.

• Qdo um virus está bem adaptado novas mutações tendem a ser deletérias diminui seu fitness.

• Virus menos adaptados podem apresentar mutações vantajosas.

• Na infecção aguda as quasispecies são pouco complexas e mais homogeneas • Na Infecção cronica a complexidade aumenta pois as mutações se acumulam • Imunosuprimido < % mutações/ano que imunocompetentes pela < pressão imune

Quasispecies nas infecções agudas e cronicas

Forns X ,Purcell & Bukh J.Trends in Microbiology ; 7:402-409,1999.

Infecção aguda

Infecção cronica

Hospedeiro 1 Imunosuprimido

Hospedeiro 2 Imunocompetente

Resposta imune humoral contra proteinas do envelope (E2)

• (a)Ac contra variante predominante (verde) exercem pressão seletiva • (b)Variantes menores emergem e prevalecem ( amarelo) • (c) Variantes recebem nova pressão seletiva do sitema imune

Tamanho da população pode afetar a evolução posterior

Domingo E et al. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2012;76:159-216

• Resistente a drogas : vermelho,branco e amarelo • Sensível a drogas : azul

VHC vs

sistema imune

Sumário dos eventos necessáripos para clarear o virus da hepatite C

Como se processa o escape viral ?

VHC Sistema imune

Sobrevida do virus

A resposta imune celular tem que ser vigorosa para reconhecer todos os epítopos virais e clarear o VHC

Persistencia da infecção

Patogenicidade da infecção

Progressão da doença

Para escapar do sistema imune celular o VHC alteras seus epítopos que não serão identificados pelas cels T

Petrovic D et al.Eur. J. Immunol.2012;42:17-26

Mecanismo do escape viral da célula TCD8+

A. Peptídeos derivados do VHC selvagem apresentado pela cels MHC classe I são reconhecidos pelas células TCD8+ levando à ativação celular e funcional.

Mecanismo do escape viral da célula TCD8+

B. Ausencia da diversidade do TCR (cels T de resposta) leva a falha das cels TCD8+ em reconhecer peptídeos mutantes e se produz o escape viral.

Mecanismo do escape viral da célula TCD8+

C.Alternativamente a TCR pode ligar o peptídeo mutado mas emite um sinal negativo para as cels T

Mecanismo do escape viral da célula TCD8+

D.O peptídeo mutado não se adapta a terminação da MHC classe 1 resultando em falha de ligação e ativação das cels T.

Regras de parada na HC

Courtesy of Christoph Sarrazin, MD.

Quasispecies com dominância de virus selvagem e variantes

pouco resistentes

PegIFN/ RBV

PI + PegIFN/RBV

Baseline

Terapia tripla com IPs

Virus selvagem Resistencia média ( + fitness)

Alta resistencia /sem fitness Resistencia com fitness aumentado

Após ~ 4-24 virus selvagem é eliminado

Queda da viremia com PEGIFN aumenta com adição de TVR

Mutações de resistencia surgiram no braço TVR monoterapia dentro de 4-7 dias que foram suprimidas por PegIFN/RBV

Kieffer TL, et al. Hepatology. 2007;46:631-639.

1 Análise das sequencias

-6 -5 -4 -3 -2 -1 0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Dias

Mud

ança

no

RN

A-V

HC

do

base

line

(log 1

0 IU

/mL)

TVR + PegIFN (n = 8)

TVR (n = 8)

PegIFN + placebo (n = 4)

15

Resistencia à drogas em BOC e TVR

• Maioria dos isolados de pacientes sem RVS nos estudos de fase III tinham substituições de resistencia ao TVR [1].

• Entre os tratados com BOC sem RVS nos estudos de fase III, 53% tinham ≥ 1 mutações de R [2] .

• Todas estas mutações reduzem a atividade do TVR ou BOC em culturas de células ou testes bioquímicos[1,2]

• Para evitar resistencia é fundamental seguir regras de parada.

1. Telaprevir [package insert]. May 2011. 2. Boceprevir [package insert]. May 2011.

Regras de parada para Boceprevir ou Telaprevir + PegIFN/RBV

1. Boceprevir [package insert]. May 2011. 2. Ghany MG, et al. Hepatology. 2011;54:1433-1444. 3. Telaprevir [package insert]. May 2011.

Teste deveria ter o menor limite de quantificação do HCV RNA de ≤ 25 IU/mLe um limite de detecção do RNA-VHC de ~ 10-15 IU/mL.

Boceprevir [1,2] .

Tempo Critério Ação

Sem 12 HCV RNA detectável Descontinuar toda a terapia

Sem 24 HCV RNA detectável Descontinuar toda a terapia

Telaprevir[2,3] .

Tempo Critério Ação

Sem 4 ou 12 HCV RNA > 1000 UI/mL Descontinuar toda a terapia

Sem 24 HCV RNA detectável Descontinuar pegIFN/RBV

Regras de parada : mutaçõe multiplas podem ser mais problemáticas

Perda da resistencia em pacientes com variantes resistentes à terapia com TVR + pegIFN/RBV

V36M sómente* R155K sómente† V36M + R155K % de 1a falha (selvagem: 16%) 10 20 46

Média mensal para perda (95% CI) 6 (4-9) 10 (9-13) 13 (10-13)

Pro

babi

lidad

e

Meses após falha do tratamento

R155K alone (n = 41)

V36M alone (n = 22)

V36M + R155K (n = 124)

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Sullivan J, et al. EASL 2011. Abstract 8.

*Comparison of V36M vs V36M + R155K: P < .0001. †Comparison of R155K vs V36M + R155K: P = .48.

Perda de resistencia detectada em pacientes que pararam BOC + PegIFN/RBV

• Análise de pacientes com follow-up e variantes de R na falha

Variante HCV resistente Pacientes sem variantes resistentes após follow-up longo (6-14 Mos), %

T54A 94

A156S 88

V55A 86

V36M 75

R155K 68

T54S 68

Barnard RJ, et al. AASLD 2011. Abstract 164.

Perfil de resistencia dos IPs

*Mutations associated with resistance in vitro only. Halfon P, et al. J Hepatol. 2011;55:192-206. Resistance mutations of NS3 PIs with a ≥ and < 4-fold increase in EC50 shown in red and white, respectively.

V36A/M T54A V55A Q80R/K R155K/T/Q A156S A156V/T D168A/V/T/H V170A

Telaprevir (linear) * *

Boceprevir (linear) *

SCH900518 (linear)

BILN-2061 (macrocyclic)

ITMN191 (macrocyclic) * *

MK7009 (macrocyclic) *

TMC435350 (macrocyclic)

BI-201335 (linear)

MK5172 (macrocyclic)

GS-9256 (macrocyclic)

ABT 450 (macrocyclic)

BMS-791325 (macrocyclic)

Teste de resistencia do VHC

• Teste comercial disponível para mutações do HCV NS3/4

• Determina sequencias genéticas para proteinas não estruturais das regiões NS3 e NS4A dos genótipos 1a e 1b do VHC

• Papel do teste de resistencia pré-tratamento ainda não definido

• Não há recomendações para testar resistencia para pacientes falhando à terapia

Parâmetros que contribuem para progressão da doença

Domingo E et al. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2012;76:159-216

• Variantes resitentes ocorrem naturalmente em 5-7% dos pacientes antes do tratamento (1,2,3)

• Na falencia terapêutica as variantes resistentes diminuem com o tempo, qdo o IP é suspenso , podendo permanecer detectáveis por até 2,5 anos[4,5]

• Genótipo 1a tem < barreira genética para resistencia que o genótipo 1b (número de mutações necessárias para superar a atividade da droga)

• Aderencia às regras de parada são fundamentais 1. Pawlotsky JM. Clin Liver Dis. 2003;7:45-66. 2. Telaprevir [package insert]. May 2011.

3. Boceprevir [package insert]. May 2011. 4. Vierling JM, et al. EASL 2010. Abstract 2016. 5. Sullivan JC, et al. EASL 2011. Abstract 8.

Resumo da resistencia ao VHC com TVR/BOC

Obrigado