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FACULDADE TECSOMA Curso de Biomedicina
Marcos Alan Oliveira Santos
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIMICROBIANO DO ÓLEO DA SEMENTE DE SUCUPIRA (Pterodon emarginatus)
Paracatu-MG 2012
Marcos Alan Oliveira Santos
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIMICROBIANO DO ÓLEO DA SEMENTE DE SUCUPIRA (Pterodon emarginatus)
Projeto monográfico apresentado á
disciplina Trabalho de Conclusão de
Curso I, ministrada pelo professor Geraldo
Benedito B. de Oliveira, do curso de
Biomedicina da Faculdade Tecsoma
como pré-requisito a obtenção do titulo de
bacharel em Biomedicina.
Orientador (a): MSc.Cláudia Peres da
Silva
Orientador Metodológico: Geraldo B.B. de
Oliveira
Paracatu-MG 2012
Santos, Marcos Alan Oliveira S237a Avaliação do potencial antimicrobiano do óleo da semente de sucupira
(Pterodon emarginatus). / Marcos Alan Oliveira Santos. Paracatu, 2012.
39f. Orientador: Cláudia Peres da Silva Monografia (Graduação) – Faculdade Tecsoma, Curso de
Bacharel em Biomedicina.
1. Microbiologia. 2. Staphylococcus aureus. 3. Pterodon emarginatus. 4. Potencial antimicrobiano. I. Silva, Cláudia Peres da. II. Faculdade Tecsoma. III. Título.
CDU: 579:61
Marcos Alan Oliveira Santos
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIMICROBIANO DO ÓLEO DA SEMENTE DE SUCUPIRA (Pterodon emarginatus)
Projeto monográfico apresentado á disciplina
Trabalho de Conclusão de Curso I,
ministrada pelo professor Geraldo Benedito
B. de Oliveira, do curso de Biomedicina da
Faculdade Tecsoma como pré-requisito a
obtenção do titulo de bacharel em
Biomedicina.
______________________________________________
Prof (a): MSc. Cláudia Peres da Silva - FATEC Coordenadora do Curso e Orientadora da Monografia
_______________________________________________ Geraldo Benedito Batista de Oliveira - FATEC
Orientador Metodológico
Paracatu 07 de julho 2012.
Dedico este trabalho á toda minha família.
Aos meus colegas e professores que estiveram comigo nesta caminhada.
Deus obrigado por tudo senhor.
AGRADECIMENTOS
“O senhor guardara a minha entrada e minha saída desde agora e para
sempre.” Salmos121, 8.
A cada vitória o reconhecimento devido ao meu Deus, pois só Ele é
digno de toda honra, glória e louvor.
Agradeço aos meus pais José Maria e Maria dos Anjos pelo apoio e
incentivo que me deram desde o inicio desta caminhada. Aos meus irmãos
Mêcia Jordânia, Maisa Dabiane, Miqueias Danilo e Sâmela Talita que sempre
estiveram comigo.A todos da minha família pelo carinho.
Agradeço aos meus amigos de republica que desde o inicio da
caminhada compartilhamos pelo mesmo ideal de formamos em Paracatu Diogo
Oliveira, Josemar “Chuvisco”, Juscelio, Lázaro Antunes, Marcelo Mendes,
Reinaldo e Danilo “Badia”.
Á primeira turma de Biomedicina “minha turma” que durante quatro anos
buscamos esse objetivo de sermos Biomédicos.
Agradeço aos meus professores de curso. A professora Rita de Cássia,
Flavio Maia, Gilmar, Anderson e Camila que contribuíram e muito para minha
Formação.
Agradeço aos meus supervisores de estágio Carol, Esther, Mardei e
Josimar pela compreensão para comigo.
A minha coordenadora e orientadora Cláudia Peres que me ajudou e
muito de forma inexplicável no meu trabalho de conclusão de curso, me
auxiliando em tudo.
Agradeço principalmente ao meu Deus, obrigado por tudo senhor.
Tudo posso, naquele que me fortalece!
"O pensamento lógico pode levar você de A a B, mas a
imaginação te leva a qualquer parte do Universo." Albert
Einstain
RESUMO
O presente trabalho teve como objetivo avaliar o potencial antimicrobiano do
óleo da semente de sucupira (Pterodon emarginatus) contra a cepa de
Staphylococcus aureus. As sementes de sucupira foram adquiridas no
comercio local da cidade de Paracatu-MG, levadas ao laboratório de
bioquímica e microbiologia da Faculdade Tecsoma onde foram desidratadas
durante 4 dias á 100 °c em estufa da marca Quimis. Em seguida as sementes
foram trituradas obtendo o óleo da mesma. O papel filtro com 6 mm de
diâmetro foi impregnado com 30 μL do óleo da semente de sucupira (Pterodon
emarginatus), onde foi colocado em meio agar Muelle-Hinton com a bactéria
Staphylococcus aureus. O halo de inibição contra cepa de Staphylococcus
aureus foi de 8 mm. O trabalhou analisou o potencial antimicrobiano da
semente da sucupira (Pterodon emarginatus) conforme o halo de inibição.
Palavras chave: Pterodon emarginatus, Staphylococcus aureus, potencial
antimicrobiano.
ABSTRACT
The present work had as objective analyse the antimicrobial potential of the
seed oil sucupira (Pterodon emarginatu)s against strains of the Staphylococcus
aureus. The Sucupira seeds were obtidas in the town market local of the
Paracatu, MG, taken to the laboratory of biochemistry and microbiology at the
Faculty Tecsoma where they were dried for 4 days to 100 ° C in an oven brand
Quimis. Then the seeds were crushed to obtain oil from it. the the filter paper
was impregnated with 30 μl of the oil which was put in Mueller-Hinton Agar with
the bacterium Staphylococcus aureus. The filter paper with 6 mm diameter were
impregnated with 30 μL of the seed oil sucupira (Pterodon emarginatus), where
he was placed on Mueller-Hinton agar with the bacteria Staphylococcus aureus.
The inhibition zone against Staphylococcus aureus strain was 8 mm. The
worked discussed the antimicrobial potential of the seed of sucupira (Pterodon
emarginatus) as the inhibition zone.
Keywords: Pterodon emarginatu, Staphylococcus aureus, antimicrobial
potention.
LISTA DE TABELAS
TABELA 1: Valores de halos inibitórios esperados para Staphylococcus spp . 28
TABELA 2: Antibiograma: Staphylococcus aureus ........................................... 32
TABELA 3: Valores de referência dos halos dos antibióticos usados na clinica
Staphylococcus spp ......................................................................................... 32
TABELA 4: Halo de inibição do óleo da semente de Sucupira ........................ 33
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1: Procedimentos Gerais para a Obtenção de Compostos
Biologicamente Ativos ...................................................................................... 21
FIGURA 2: Procedimento Geral de Partição e Provável Separação dos
Principais Metabólitos Secundários Presentes em Plantas .............................. 22
FIGURA 3: Pterodon emarginatus. (A) Árvore, (B) folhas e flores, (C) frutos, (D)
sementes, (E) tronco e (F) madeira ................................................................. 25
LISTA DE GRÁFICOS
GRAFICO 1 : Classificação dos Antibióticos .................................................... 33
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .............................................................................................. 12 1. 1 Justificativa .............................................................................................. 13 2 OBJETIVOS .................................................................................................. 14 2.1 Objetivo Geral ........................................................................................... 14 2.2 Objetivos Específicos .............................................................................. 14 3 REFERENCIAL TEÓRICO ............................................................................ 15 3.1 Metabolismo Vegetal ................................................................................ 15 3.2 Metabolismo Vegetal Secundário ........................................................... 16 3.2. 1. Terpenoides ......................................................................................... 17 3.2.2. Fenólicos ............................................................................................... 18 3.2.3 Compostos Contendo Nitrogênio ........................................................ 19 3.3 Estudos Fitoquímicos – Panorama Geral .............................................. 20 3.4 O Gênero Pterodon ................................................................................. 23 3.5 Aspectos Biológicos Pterodon emarginatus Benth .............................. 24 3.6 Aspectos Quimicos Pterodon emarginatus Benth ................................ 26 3.7 Atividades biológicas descritas ............................................................. 26 3.8 Bactéria ..................................................................................................... 27 3.9 Atividade Antimicrobiana ........................................................................ 28
4 METODOLOGIA .......................................................................................... 29 4.1 Tipo de Estudo ......................................................................................... 29 4.2 Local de Estudo ....................................................................................... 29 4.3 Obtenção de Material Botânico ............................................................... 29 4.4 Extração do Òleo Essencial .................................................................... 29 4.5 Cultura ....................................................................................................... 30 4.6 Ensaio Antimicrobiano ............................................................................ 30 5 RESULTADO E DISCURSÃO ..................................................................... 31 6 CONCLUSÃO .............................................................................................. 36 REFERÊNCIAS ................................................................................................ 37
12
1. INTRODUÇÃO
Um dos maiores problemas de Saúde Pública refere-se ao agravamento
da resistência de cepas bacterianas frente a antibióticos, tal situação agrava o
mundo inteiro, acometendo tanto países desenvolvidos como em
desenvolvimento. Nesta situação, as plantas representam fontes valiosas de
produtos para a manutenção da saúde humana em virtude de sua grande
biodiversidade. (DUARTE, 2006; DUTRA et al, 2009)
Segundo Carvalho e outros (2008) o Brasil é um país de grande
biodiversidade vegetal, sendo que inúmeras plantas são utilizadas por grande
parte de nossa população, na forma de fitoterápicos, nutracêuticos ou
alimentos.
Para Rocha citado por Barraca (1999), as plantas são utilizadas pela
população como fitoterápicos, devido à produção de substâncias ativas, sendo
divididas em dois tipos. O primeiro tipo de substância, essencialmente
sacarídeos é oriundo do metabolismo primário, ocorrendo em todas as plantas
verdes, graças à fotossíntese, ou seja, substâncias estas indispensáveis à vida
das plantas. O segundo tipo de substâncias é oriundo do metabolismo
secundário, resultante essencialmente da assimilação do azoto (nitrogênio
amínico). Estes produtos do metabolismo secundário freqüentemente parecem
ser inúteis á vida das plantas, contudo os seus efeitos terapêuticos, em
contrapartida, são notáveis.
As plantas através do metabolismo secundário são capazes de produzir
substâncias e óleos com propriedades antimicrobianas, os quais são
reconhecidos empiricamente durante séculos em diversas regiões do mundo,
sendo vários os estudos sobre a atividade biológica das plantas. (DUARTE,
2006).
Os extratos e os óleos essenciais oriundos do metabolismo secundário
das plantas são utilizados como mecanismo de defesa contra predação por
microrganismo, insetos e herbívoros. (GOTLIEB apud GONÇALVES;ALVES;
MENEZES,2005).
Essas substâncias se mostram eficientes no controle do crescimento de
uma ampla variedade de microrganismos, incluindo fungos filamentosos,
leveduras e bactérias. (DUARTE, 2006).
13
A planta em estudo, Pterodon emarginatus vogel ou Sucupira branca é
uma árvore aromática nativa muito encontrada no cerrado brasileiro, tendo uma
altura aproximada de 5 a 10 metros, produz sementes que são largamente
comercializadas em mercados populares em virtude de suas propriedades
terapêuticas. É utilizada para tratamento de dores de garganta, disfunções
respiratórias e reumatismo, tendo atividades também analgésica, depurativa,
tônica e antiinflamatória. (LORENZI e MATOS apud DUTRA et al, 2009).
Estudos fitoquímicos realizados no gênero Pterodon emarginatus ou
(sucupira) tem confirmado alcalóides nas cascas das árvores, isoflavonas e
triterpenos na madeira, e no óleo das sementes, isoflavonas e diterpenos.
(TORRENEGRA et al apud DUTRA et al,2009).
Tendo em vista que o agravamento da resistência bacteriana é um dos
mais graves problemas de saúde pública. Sabendo-se de tais problemas o
presente estudo teve como foco avaliar o potencial antimicrobiano do óleo da
semente de sucupira (Pterodon emarginatus).
1.1 Justificativa
Atualmente um dos maiores problemas de saúde publica refere-se á
resistência bacteriana. Tendo em vista tal problema, o estudo teve como foco
avaliar o potencial antimicrobiano do óleo da semente de sucupira.
14
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Esse projeto tem como objetivo avaliar o potencial antimicrobiano do
óleo da semente de sucupira (Pterodon emarginatus) em cepas de
Staphylococcus aureus.
2.2 Objetivos Específicos
Obter o halo de inibição do óleo de sucupira (Pterodon emarginatus).
Testa o efeito do óleo da semente de sucupira na bactéria gram positiva
Staphylococcus aureus.
Comparar o halo de inibição do óleo com outros antibióticos disponíveis
no mercado.
Verificar se é viável a utilização do óleo da semente de sucupira como
matéria prima para o desenvolvimento de novos fármacos.
Verificar a concentração inibitória mínima do óleo da semente de
sucupira em cepa de Staphylococcus aureus através de revisão da
literatura.
Verificar se o óleo tem efeito bactericida ou bacteriostático através de
revisão da literatura.
15
3 REFERÊNCIAL TEÓRICO
3.1 Metabolismo Vegetal
As plantas produzem uma larga e diversa ordem de componentes
orgânicos divididos em metabólitos primários e secundários. Os metabólitos
primários possuem função estrutural, plástica e de armazenamento de energia.
Os metabólitos secundários, produtos secundários ou produtos naturais,
aparentemente não possuem relação com crescimento e desenvolvimento da
planta. (TAIZ; ZEIGER apud VIZZOTO; KROLOW e WEBER, 2010).
Segundo Kiatkoski (2011) todas as plantas produzem constituintes
químicos, os quais fazem parte de suas atividades metabólicas normais. Estes
podem ser divididos em metabólitos primários, como açúcares, aminoácidos,
nucleotídeos e lipídeos, encontrados em todas as plantas.
O metabolismo primário é responsável pela maioria dos compostos
presentes nas plantas. Esses compostos são polissacarídeos, açúcares,
proteínas e graxas, substâncias essenciais à sobrevivência e desenvolvimento
das plantas. (VERPOORTE e MEMELINK apud LOURENÇO, 2003).
Além desses metabólitos as plantas produzem uma grande variedade de
metabólitos secundários. Esses compostos, não necessariamente essenciais
ao organismo produtor, têm um papel importante na sobrevivência da planta
em seu ecossistema. (SANTOS apud LOURENÇO, 2003).
Para Rocha citado por Barraca (1999), as plantas medicinais produzem
substâncias ativas de dois tipos. O primeiro tipo de substância, essencialmente
sacarídeos, é oriundo do metabolismo primário, ocorrendo em todas as plantas
verdes, graças à fotossíntese, ou seja, substâncias estas indispensáveis à vida
das plantas. O segundo tipo de substâncias é oriundo do metabolismo
secundário, resultante essencialmente da assimilação do azoto (nitrogênio
amínico). Estes produtos do metabolismo secundário frequentemente parecem
ser inúteis á vida das plantas, contudo os seus efeitos terapêuticos, em
contrapartida, são notáveis.
16
3.2 Metabolismo Vegetal Secundário
Para Taiz e Zeiger citado por Kiatkoski (2011) os estudos abordando as
substâncias oriundas do metabolismo secundário foram iniciados pelos
químicos orgânicos do século XIX e início do século XX, devido às suas
diversas aplicações. O homem utiliza muito destes compostos como alimentos
de alto valor nutritivo (nutracêuticos), temperos, aromas e fragrâncias, óleos
vegetais, resinas, inseticidas, matérias-primas agrícolas, bem como
medicamentos e outros fins industriais. Estes usos se refletem diretamente
sobre os metabólitos secundários que são utilizados comercialmente como
compostos biologicamente ativos (produtos farmacêuticos, temperos,
fragrâncias, etc.), gerando produtos de alto valor em pequena quantidade
quando comparados aos metabólitos primários.
Embora os produtos secundários possuam uma variedade de funções
nas plantas, é provável que a sua importância ecológica tenha alguma relação
com potencial efeito medicinal para os seres humanos. Por exemplo, produtos
secundários envolvidos na defesa das plantas através de citotoxicidade para
patógenos microbianos podem ser úteis como medicamentos antimicrobianos
em humanos, se não forem demasiado tóxicos. Da mesma forma, produtos
secundários envolvidos na defesa contra herbívoros através de atividade
neurotóxica poderia ter efeitos benéficos em seres humanos (ou seja, como
antidepressivos, sedativos, relaxantes musculares ou anestésicos) através de
sua ação no sistema nervoso central. (KAUFMAN et al apud VIZZOTO;
KROLOW e WEBER, 2010).
Os metabólitos secundários podem ser classificados com base na sua
estrutura química, composição, a via pela qual é biossintetizado, origem da
planta ou sua solubilidade em vários solventes. (SHERMA; KOWALSKA apud
KIATKOSKI, 2011).
Uma classificação simples inclui três grupos principais:
1. Terpenoides (originários da via do mevalonato, compostos quase que
inteiramente de carbono e hidrogênio).
2. Fenólicos (originários de açúcares simples, contendo anéis
benzênicos, hidrogênio, e oxigênio).
17
3. Compostos contendo nitrogênio (ou também contendo enxofre).
(SIMÕES et al; TAIZ; ZEIGER apud KIATKOSKI ,2011).
3.2.1 Terpenoides
Os terpenos e os seus derivados são moléculas, em regra constituídas
por unidades contendo cinco átomos de carbono derivadas do isopreno
representando o maior e mais amplamente distribuído grupo de metabolitos
secundários, dos quais, mais de 4.000 foram já identificados. De acordo com a
regra do isopreno, os terpenos podem ser considerados usualmente como
produtos resultantes da ligação de várias unidades de isopreno. (FONTES E
ALÇADA apud COELHO, 2009).
Os terpenos ou terpenóides podem ser classificados de acordo com o
número de isoprenos que constituem: hemiterpenóides, monoterpenóides,
sesquiterpenóides, diterpenóides, triterpenóides, tetraterpenóides e
politerpenóides. (OLIVEIRA et al apud JAKIEMIU,2008 )
Segundo Buchanan e outros citado por Coelho (2009) os terpenos mais
simples são os hemiterpenos, formados por apenas uma unidade de isopreno.
Os monoterpenos são constituídos por 2 unidades de isopreno , os
sesquiterpenos por 3 , os diterpenos, por 4 , triterpenos, e tetraterpenos por 6
e 8 e os politerpenos ou poli-isoprenos por números mais elevados.
Os hemiterpenóides são o menor grupo dos terpenos, sendo que o seu
representante mais conhecido e estudado é o isopreno, um produto volátil
liberado de tecidos fotossinteticamente ativos. (CROTEAU et al apud
JAKIEMIU,2008)
Os monoterpenóides são compostos por duas unidades de isopreno.
Devido a sua baixa massa molecular, estes costumam ser voláteis, sendo os
constituintes das essências voláteis e óleos essenciais, atuando na atração de
polinizadores. (OLIVEIRA et al apud JAKIEMIU,2008).
Segundo Vizzoto; Krolow e Weber (2010) muitos sesquiterpenoides
também são voláteis e, assim como os monoterpenos, estão envolvidos na
defesa da planta contra pragas e doenças. Além disso, numerosos compostos
sesquiterpenoides atuam como fitoalexinas, um antibiótico produzido pelas
18
plantas em resposta a infecções microbianas. Também atuam como defensivos
que desencorajam os herbívoros oportunistas a realizarem o ataque.
Os diterpenóides compreendem um grande grupo de compostos não
voláteis, possuindo uma vasta gama de atividades diferentes que incluem os
hormônios, ácidos resínicos e agentes anticancerígenos. (ROBBERS et al apud
JAKIEMIU,2008).
Os diterpenos dividem-se em várias classes de acordo com o arranjo de
seus esqueletos carbônicos. Assim, são conhecidos diterpenos acíclicos,
bicíclicos dos tipos labdano e clerodano, tricíclicos dos tipos pimarano,
abietano, vouacapano e tetracíclicos. (ROCHA, 2010).
Dentre os diterpenos, tem sido observado certo interesse em relação
aos diterpenos com esqueleto caurânico, pois apresentam uma variedade de
atividades biológicas como antiparasitária, fitotóxica, hormonal, antioxidante,
citotóxica, antiviral, antimicrobiana. (ROCHA, 2010).
Para Vizzoto; Krolow e Weber (2010) as saponinas são uma classe
importante de triterpenos que nas plantas desempenham um importante papel
na defesa contra insetos e microrganismos.
3.2.2. Fenólicos
Os compostos fenólicos por apresentarem atividade farmacológica e
antinutricional e também por inibirem a oxidação lipídica e a proliferação de
fungos são muitos estudados, além de participarem de processos responsáveis
pela cor, adstringência e aroma em vários alimentos. (PELEG et al apud
SOARES,2002).
Para Angelo e Jorge (2007) os compostos fenólicos são originados do
metabolismo secundário das plantas, sendo essenciais para o seu crescimento
e reprodução, além disso, se formam em condições de estresse como,
infecções, ferimentos, radiações UV, dentre outros.
Os compostos fenólicos englobam desde moléculas simples até outras
com alto grau de polimerização. Estão presentes nos vegetais na forma livre ou
ligados a açúcares (glicosídios) e proteínas. (CROFT apud SOARES, 2002).
Segundo Vizzoto; Krolow e Weber (2010) quimicamente, os chamados
compostos fenólicos são substâncias que possuem pelo menos um anel
19
aromático no qual ao menos um hidrogênio é substituído por um grupamento
hidroxila. Esses compostos são sintetizados a partir de duas rotas metabólicas
principais: a via do ácido chiquímico e a via do ácido mevalônico, a qual é
menos significativa.
Alem disto possuem estrutura variável e com isso, são multifuncionais.
Existem cerca de cinco mil fenóis, dentre eles, destacam-se os flavonóides,
ácidos fenólicos, fenóis simples, cumarinas, taninos, ligninas e tocoferóis.
(PELEG; BODINE; NOBLE apud ANGELO; JORGE, 2007).
Ribéreau-Gayon citado por Soares (2002) adotou a seguinte
classificação para estes compostos: pouco distribuídos na natureza, polímeros
e largamente distribuídos na natureza.
Conforme Soares (2002) na família dos compostos fenólicos pouco
distribuídos na natureza estão um número reduzido deles, embora estes sejam
encontrados com certa frequência. Neste grupo estão os fenóis simples, o
pirocatecol, a hidroquinona e o resorcinol. A esta família também pertencem os
aldeídos derivados dos ácidos benzóicos, que são constituintes dos óleos
essenciais como a vanilina.
Para Angelo e Jorge (2007) os polímeros são alguns fenólicos que não
se apresentam na forma livre nos tecidos vegetais, esta família engloba os
taninos e as ligninas.
Ainda segundo Angel e Jorge (2007) na família dos compostos
largamente distribuídos na natureza estão os fenólicos encontrados geralmente
em todo o reino vegetal, mas às vezes podem estar localizados em uma só
planta. Estes fenólicos estão divididos em dois grandes grupos: os flavonóides
e derivados e os ácidos fenólicos (ácidos benzóico, cinâmico e seus derivados)
e cumarinas.
3.2.3 Compostos Contendo Nitrogênio
Segundo Vizzoto; Krolow e Weber (2010) os alcaloides são compostos
orgânicos cíclicos que possuem pelo menos um átomo de nitrogênio no seu
anel. Na sua grande maioria os alcaloides possuem caráter alcalino, pois a
presença do átomo de N representa um par de elétrons não compartilhados.
Os alcaloides são sintetizados no retículo endoplasmático, concentrando-se,
20
em seguida, nos vacúolos e, dessa forma, não aparecem em células jovens.
Essa classe de compostos do metabolismo secundário é famosa pela presença
de substâncias que possuem acentuado efeito no sistema nervoso, sendo
muitas delas largamente utilizadas como venenos ou alucinógenos. O
isolamento da morfina, em 1806 pelo farmacêutico alemão Friedrich Sertürner,
deu origem ao estudo dos alcalóides.
3.3 Estudos Fitoquímicos – Panorama Geral
A pesquisa fitoquímica tem por objetivo conhecer os constituintes
químicos de espécies vegetais ou avaliar a sua presença. (FALKENBERG;
SANTOS; SIMÕES apud BRESOLIN; FILHO, 2010).
Diante da ampla diversidade química encontrada nas plantas medicinais,
a pesquisa nessa área pode ser sumarizada como segue. (NYIREDY apud
BRESOLIN; FILHO, 2010).
Análise qualitativa e quantitativa dos constituintes das plantas
medicinais;
Fracionamento, purificação e determinação estrutural de novas
moléculas;
Avaliação biológica dos extratos, frações e compostos isolados;
Otimização dos procedimentos utilizados para obtenção dos compostos
responsáveis pelos efeitos terapêuticos ou das propriedades estruturais.
Segundo Bresolin e Filho (2010) métodos de separação rápidos e
eficientes são imprescindíveis para o direcionamento no processo de obtenção,
pois uma simples planta possa conter centenas de metabólicos secundários
diferentes.
Para Kiatkoski (2011) a primeira etapa da investigação fitoquímica é a
coleta do material vegetal. É essencial que a seleção do material coletado seja
feita com cuidado, evitando coletar partes do vegetal afetadas por doenças,
parasitas e também materiais estranhos, tais como outras plantas ou mesmo
partes da própria planta que não sejam de interesse para a investigação. Deve-
se registrar o local, a hora e a data da coleta, já que o meio ambiente, a hora
do dia e a época do ano exercem grande influência sobre a produção e o
acúmulo dos metabólitos vegetais.
21
Posteriormente a escolha adequada do material vegetal, segue-se á
preparação dos extratos brutos que será o ponto de partida para uma posterior
purificação. A escolha do solvente para extração dever ser feita tendo em vista
os objetivos do estudo e os resultados da abordagem. Para obter uma extração
eficiente é necessária a utilização de solventes puros e condições brandas,
utilizando sempre que possível solvente de baixa reatividade. (GHISALBERTI
apud BRESOLIN; FILHO, 2010).
FIGURA 1: Procedimentos Gerais para a Obtenção de Compostos Biologicamente Ativos.
FONTE: Niero et al,citado por KIATKOSKI (2011).
.
Conforme Kiatkoski (2011) outro aspecto importante a ser considerado é
o processo utilizado na extração, dentre eles, a turbolização, a maceração e a
22
percolação (extrações à frio); infusão, turbolização e decocção (extrações à
quente em sistemas abertos); e extração sob refluxo e a em aparelho de
Soxhlet (extrações à quente em sistemas fechados).
Segundo Gobbo-Neto e Lopes citado por Bresolin e Filho (2010) a
composição química, na maioria dos casos, pode variar nas distintas partes da
planta. Muitas vezes, uma mesma espécie botânica que ocorre em diferentes
regiões pode apresentar diferença devido às variações climáticas (temperatura,
índice pluviométrico, altitude, poluição atmosférica). Outros fatores que podem
coordenar ou alterar a taxa de produção de metabólitos secundários
isoladamente ou em conjunto com os fatores supracitados são os seguintes:
sazonalidade, ritmo circadiano e método de cultivo.
FIGURA2: Procedimento Geral de Partição e Provável Separação dos Principais Metabólitos Secundários Presentes em Plantas.
FONTE: Niero et al,citado por KIATKOSKI (2011).
As plantas secas ao ar ou sob-baixa temperaturas são extraídas com
uma variedade de solvente e algumas vezes sequencialmente de baixa para
23
alta polaridade. Outra alternativa para obtenção do extrato bruto pode ser a
utilização do metanol ou etanol. A utilização desses solventes possibilita a
extração de um maior numero de compostos líquidos, com solvente de
polaridade crescente como hexano, diclorometano, acetato de etila e butanol.
Esses solventes possibilitam a seperação (semipurificação) das substancias
por meio de suas polaridades. (CECHINEL-FILHO e YUNES apud BRESOLIN;
FILHO, 2010)
3.4 O Gênero Pterodon
Segundo Euzébio e outros citado por Kiatkoski (2011) o gênero Pterodon
é amplamente distribuído sobre as savanas do Brasil Central e compreende
quatro espécies nativas brasileiras: P. abruptus Benth, P. apparuccuri
Pedersoli, P.pubescens Benth (P. emarginatus Vog.) e P. polygalaeflorus
Benth. Sua distribuição é disjuntiva e populações mistas não foram
observadas, o que pode indicar algumas características do solo como fator
limitante para o seu desenvolvimento.
De acordo com Lorenzi e Matos citado por Dutra e outros (2009) devido
suas propriedades terapêuticas as sementes de Sucupira são largamente
comercializadas em mercados populares.
As sementes são popularmente utilizadas para dores na coluna, dor de
garganta, reumatismo, e até mesmo como tônico (fortificante) e depurativo.
(SPINDOLA apud KIATKOSKI, 2011).
Extratos alcoólicos dos frutos destas plantas são utilizados na medicina
popular como antiinflamatórios (principalmente contra reumatismo), para dores
de garganta e analgesia em geral. Os óleos dos frutos ou da semente de pelo
menos três espécies têm ação protetora contra a infecção por Schistosoma
mansoni inibindo a penetração de cercárias na pele. (EUZÉBIO apud
KIATKOSKI, 2011).
Segundo Torrenegra e outros citado por Dutra e outros (2009) estudos
fitoquímicos do gênero Pterodon (sucupira) tem confirmado alcalóides nas
cascas das árvores, isoflavonas e triterpenos na madeira, e no óleo das
sementes, isoflavonas e diterpenos.
24
3.5 Aspectos Biológicos Pterodon emarginatus Benth
Segundo Lorenzi e Matos citado por Kiatkoski (2011) Pterodon
emarginatus Benth é conhecida popularmente como faveiro, sucupira,
sucupira-branca, fava-de-sucupira, fava-de-santo-inácio ou sucupira-lisa.
Conforme Lorenzi e Matos citado por Dutra e outros (2009), Pterodon
emarginatus vogel ou Sucupira branca tem uma altura aproximada de 5 a 10
metros. Sendo nativa dos estados de Tocantins, Mato Grosso, Goiás, Minas
Gerais, São Paulo e Mato Grosso do Sul.
Ainda segundo Lorenzi e Matos citado por Kiatkoski (2011) suas folhas
são caracterizadas por serem compostas de pinadas, com 20-36 folíolos. A
sucupira floresce em setembro e outubro. Suas flores são esbranquiçadas ou
róseas, dispostas em panículas axilares e apicais amplas.
Para Lorenzi citado por Kiatkoski (2011) é quando a planta esta quase
totalmente despida da folhagem que ocorre a maturação dos frutos isto é
verificado de junho a julho. Os frutos são caracterizados como vagens tipo
sâmara (pterocarpo) arredondadas, indeiscentes e aladas, contendo uma única
semente fortemente protegida dentro de uma cápsula fibro-lenhosa e envolvida
externamente por uma substância oleosa amarga numa estrutura esponjosa
como favos de mel.
25
FIGURA 3: Pterodon emarginatus. (A) Árvore, (B) folhas e flores, (C) frutos, (D) sementes, (E) tronco e (F) madeira.
FONTE: adaptado de Lorenzi ,citado por Kiatkoski (2011)
26
3.6 Aspectos Químicos Pterodon emarginatus Benth
As principais substâncias isoladas de Pterodon emarginatus Benth são
os diterpenos, estruturas pertencentes ao grupo dos terpenos, ou terpenóides,
os quais constituem a maior classe de metabólitos secundários. As diversas
substâncias desta classe são, em geral, insolúveis em água e sintetizados a
partir de acetilCoA ou de intermediários glicolíticos . (TAIZ e ZEIGER apud
KIATKOSKI, 2011).
3.7 Atividades biológicas descritas
Varias são as atividades biológicas descritas para Pterodon emarginatus
um dos estudos relata que os diterpenos e alguns derivados, isolados de P.
pubescens, tem sido associados à ação protetora contra infecção por cercárias
de Schistosoma mansoni, quando aplicados topicamente em caudas de ratos.
(COELHO et al apud KIATKOSKI ,2011).
Segundo Vieira e outros citado por Kiatkoski (2011) o ácido 6α,7β-
dihidroxivouacapan-l7β-óico isolado de P. pubescens apresenta atividade
antiproliferativa de células de melanoma humano.
Para Menna-Barreto e outros citado por Kiatkoski (2011), o
geranilgeraniol é o principal composto responsável pela atividade anti-
Tripanossoma cruzi da espécie.
Dentre as demais atividades biológicas já estudadas nesta espécie
encontram-se:
Quimioprofilática contra Schistosoma mansoni. (KATZ et al apud
KIATKOSKI , 2011).
Citotóxica. (SABINO et al apud KIATKOSKI, 2011).
Toxicidade subaguda. (COELHO et al apud KIATKOSKI ,2011).
Antinociceptiva. (COELHO et al apud KIATKOSKI ,2011).
Antimicrobiana e Leshmanicida. (DUTRA et al,2009)
27
3.8 Bactéria
As bactérias são seres procaríotos que se reproduzem por divisão
assexuada. São formadas por várias estruturas, porém há uma estrutura
essencial, a membrana citoplasmática. A maioria das bactérias possui
externamente á membrana uma espessa e rígida camada, a parede celular,
que é externamente á membrana resistente. Envolvendo a parede, pode
ocorrer uma terceira camada, a cápsula. No interior da célula, se encontram o
citoplasma, núcleo e diversos grânulos. Partindo da superfície, pode haver
flagelos e fimbrias. (JUNQUEIRA; CARNEIRO; MURRAY et al apud
VIOLANTE,2008 ).
Para Schaechter e outros citado por Violante (2008) as características
da parede celular, das bactérias podem ser classificadas em Gram-positivas ou
Gram-negativas. As diferenças estão baseadas nas suas propriedades de
permeabilidade e nos componentes de superfície.
O principal componente estrutural da parede celular é o peptideoglicano,
um polímero misto de açúcares e aminoácidos. Nas bactérias Gram-positivas o
peptideoglicano forma uma camada espessa (20-80nm), constituindo uma
estrutura extremamente forte em tensão, sendo menos espessa (5-10nm) nas
Gram-negativas e consequentemente, mais frágil. Contudo, a parede na célula
Gram-negativa é constituída por estruturas complexas, que a envolvem
externamente, como as lipoproteínas, membrana externa e os
lipopossacarideos. (TRABULSI et al,2008).
Segundo Santos e outros (2007) os Staphylococcus são cocos Gram e
catalase-positivos, com aproximadamente 0,5 a 1,5 µm de diâmetro, imóveis,
não esporulados e geralmente não encapsulados. Essa bactéria pode
apresentar-se em diversas formas, que vão desde isolados, aos pares, em
cadeias curtas, ou agrupados irregularmente (com aspecto semelhante a um
cacho de uvas), devido à sua divisão celular, que ocorre em três planos
perpendiculares. O Staphylococcus foi descrito pela primeira vez em 1880, em
pus de abscessos cirúrgicos, pelo cirurgião escocês Alexandre Ogston e
atualmente é um dos microorganismos mais comuns nas infecções piogênicas
em todo o mundo.
28
Ainda segundo Santos e outros (2007) o gênero Staphylococcus
pertence à família Micrococcae, juntamente como os gêneros Planococcus,
Micrococcus e Stomatococcus. Atualmente, o gênero Staphylococcus possui
33 espécies, sendo que 17 delas podem ser isoladas de amostras biológicas
humanas. Geralmente, esse gênero faz parte da microbiota da pele humana
normal e de outros sítios anatômicos. A espécie de maior interesse médico,
principalmente em ambiente nosocomial, é o Staphylococcus aureus, que está
frequentemente relacionado com diversas infecções em seres humanos.
TABELA 1: Valores de halos inibitórios esperados para Staphylococcus
spp
AGENTE DISCO RESISTENTE INTERMEDIARIO SENSÍVEL
Amoxicilina +Clavulanato
20/10 μg 19 - 20
Ciprofloxacin 5 μg 15 16-20 21 Gentamicina 10 μg 12 13-14 15 Imipenem 10 μg 13 14-15 16 Sulfazotrim 23,75/1,25
μg
10 11-15 16
FONTE: Adaptado do Manual para Antibiograma Difusão em Disco, 2011.
3.9 Atividade Antimicrobiana
Segundo Tavares citado por Machado (2005), os agentes
antimicrobianos provocam dois tipos de efeitos em células microbianas: a
morte da bactéria ou a interrupção do seu crescimento e reprodução, desde
que a bactéria seja sensível ao agente. No primeiro caso denomina-se efeito
bactericida e no segundo efeito bacteriostático.
Segundo Tralbusi e outros citado por Machado (2005) a concentração
inibitória dos antimicrobianos pode ser determinados direta ou indiretamente. A
determinação direta é feita pelos métodos de diluição e, a indireta pelo método
de difusão em placa ou método de disco.
De acordo com Sejas e outros (2003) o método de disco-difusão foi
idealizado por Bauer e outros. O teste de disco-difusão baseia-se na difusão,
através do ágar, de um antimicrobiano impregnado em um disco de papel-filtro.
A difusão do antimicrobiano leva à formação de um halo de inibição do
crescimento bacteriano, cujo diâmetro é inversamente proporcional à
concentração inibitória mínima.
29
4 METODOLOGIA
4.1 Tipo de Estudo
Trata-se de um trabalho experimental, qualitativo do potencial
antimicrobiano do óleo da semente de sucupira.
Para Cervo, Bervian e Silva (2007), a pesquisa é uma atividade voltada
para a investigação de problemas práticos ou teóricos por meio do emprego de
processos científicos, buscando uma resposta ou solução.
De acordo com Cervo, Bervian e Silva (2007), a experimentação
consiste no conjunto de processos utilizados para verificar as hipóteses.
4.2 Local do Estudo
O estudo foi desenvolvido no laboratório de microbiologia e bioquímica
da Faculdade Tecsoma, situado no município de Paracatu. O município
encontra-se localizado na região do Noroeste do Estado de Minas Gerais,
tendo como limites municipal ao norte a cidade de Unai-MG, ao sul as cidades
de Vazante-MG e Guarda-mor MG, ao Leste João Pinheiro-MG e Lagoa
Grande-MG e a oeste a cidade de Cristalina-GO.Ficando a 220Km de Brasília,
capital federal. (IBGE, 2011).
4.3 Obtenção do Material Botânico
As sementes de sucupira (Pterodon emarginatus) foram obtidas no
comercio local da cidade de Paracatu-MG.
4.4 Extração do Óleo Essencial
Após obtenção das sementes de sucupira (Pterodon emarginatus) no
comercio local da cidade de Paracatu-MG, essas foram levadas ao laboratório
de bioquímica e microbiologia da Faculdade Tecsoma, em seguida foram
desidratadas em estufa da marca Quimis, durante 4 dias, á temperatura de
30
100°c . Posteriormente foram trituradas em moinhos de faca, obtendo assim o
óleo bruto da semente de sucupira.
4.5 Cultura
Para elaboração do meio de cultura, inicialmente mediu-se 2.52
gramas de agar Muelle-Hintom , sendo colocados no vidro de relógio. Em
seguida mediu-se 62,5ml de água com a proveta e transferiu, tanto a água
como o meio agar Muelle-Hintom para o balão volumétrico. Posteriormente o
meio (Agua+ agar Muelle-Hintom) foi levado para o tripé e tela de amianto,
sobre o bico de Bulsen, depois procedeu-se com a homogeneização da
solução com o bastão de vidro, até o ponto de fervura. Logo após vedou-se a
abertura do balão volumétrico com algodão para ser esterilizado na autoclave.
Em seguida o meio de cultura foi distribuído nas placas de Petri.
4.6 Ensaio Antimicrobiano
Para avaliação in vitro, discos estéreis de papel filtro com 6 mm de
diâmetro foram impregnados com 30 μL, baseado na técnica descrita por Bauer
e outros citado por Araujo (2010) de óleo essencial da semente de sucupira
(Pterodon emarginatus) e depois distribuídos em meio agar Muelle- Hilton com
a bactéria Staphylococcus aureus.
31
5 RESULTADO E DISCURSÃO
A resistência aos antimicrobianos tornou-se um dos grandes problemas
de saúde pública do mundo contemporâneo, a resistência progressiva tem
despertado uma preocupação mundial, principalmente na busca continua de
novos antimicrobianos. O aumento de cepas resistentes a vários
antimicrobianos tem se tornado comum, destacando-se o Staphylococcus
aureus como um dos agentes mais frequentemente isolados em infecções
humanas. (DANTAS et al, 2010).
Neste contexto, segundo Melo citado por Kiatkoski (2011) as plantas
sempre desempenharam e continuam a desempenhar um papel fundamental
na manutenção da vida humana, não apenas pelo fornecimento de alimentos,
mas também por prover outras necessidades como o fornecimento de energia
térmica e medicamentos.
Durante séculos, as plantas foram a única fonte de agentes
terapêuticos para o homem, e o profundo conhecimento do arsenal químico da
natureza, pelos povos primitivos e indígenas pode ser considerado fator
fundamental para o descobrimento de substâncias tóxicas e medicamentosas
ao longo do tempo. (HOSTETTMAN; QUEIROZ; VIEIRA apud KIATKOSKI,
2011).
Para Cos e outros citado por Bresolin e Filho (2010) as principais fontes
de antimicrobianos tem sido as bactérias e os fungos, bem como a química
orgânica,entretanto deve-se ressalta que é crescente o interesse por outras
fontes, como as plantas.
O entusiasmo em relação ao uso de plantas medicinais e seus extratos
na assistência à saúde podem ser entendidos pela sua aceitabilidade, derivada
da inserção cultural e pela atual disponibilidade desses recursos, ao contrário
do que ocorre com outros medicamentos, que na sua maioria são dependentes
de matéria-prima e tecnologias externas. (SCHENKEL et al; SIMÕES et al apud
DUTRA et al, 2009).
No presente trabalho realizou-se antibiograma utilizando antibióticos
fornecidos pelo laboratório Laborclínica contra Staphylococcus aureus, em que
o resultado obtido é esboçado na seguinte tabela 2:
32
TABELA 2: Antibiograma: Staphylococcus aureus
Antibióticos Milímetros (mm)
Imipenem 22 mm
Sulfazotrim 11 mm
Norfloxacino 12 mm
Amoxilina + ácido Clavulânico 13 mm
Acido Pipemidico 2 mm
Gentamicina 11 mm
Ciprofaflaxcina 17 mm
Nitrofuramtoina 7 mm
FONTE: Elaborado pelo acadêmico Marcos Alan Oliveira Santos
Para classificação dos antibióticos testados em cepa de Staphylococcus
aureus, utilizamos como referência, os valores apresentados pelo manual para
antibiograma difusão em disco, conforme apresentado na seguinte tabela 3.
TABELA 3: Valores de referência dos halos dos antibióticos usados na clinica Staphylococcus spp
AGENTE DISCO RESISTENTE INTERMEDIARIO SENSÍVEL
Amoxicilina +Clavulanato
20/10 μg 19 - 20
Ciprofloxacin 5 μg 15 16-20 21 Gentamicina 10 μg 12 13-14 15 Imipenem 10 μg 13 14-15 16 Sulfazotrim 23,75/1,25
μg
10 11-15 16
FONTE: Adaptado do Manual para Antibiograma Difusão em Disco (Kieby e Bauer), 2011.
Analisando as duas tabelas expostas, observa-se que a cepa de
Staphylococcus spp, mostrou sensibilidade ao Imipenem e Ciprofloxacin.
Moderada inibição do halo a Amoxilicina+Clavulanato e resistente a
Gentamicina.
33
Observando as duas tabelas apresentadas, pode-se classificar quatro
antibióticos como é apresentado no seguinte gráfico 1.
GRÁFICO 1 : Classificação dos Antibióticos
FONTE: Elaborado pelo acadêmico Marcos Alan Oliveira Santos
Para avaliar o potencial antimicrobiano do óleo da semente de sucupira
utilizou-se o método de disco-difusão idealizado por Bauer e outros citado por
Sejas e outros (2003) em que o óleo da semente foi impregnado em discos de
papel-filtro e difundido no ágar Mueller-Hintom. A difusão do óleo levou a
formação de um halo de inibição do crescimento bacteriano.
TABELA 4: Halo de inibição do óleo da semente de Sucupira
Staphylococcus aureus
Óleo Milímetros
Óleo de sucupira 8 mm
FONTE: Elaborado pelo acadêmico Marcos Alan Oliveira Santos
34
O halo de inibição apresentado pelo óleo da semente de sucupira contra
cepa de Staphylococcus aureus correspondeu a 8mm.
Para Campos (2006) a atividade antimicrobiana é medida in vitro para
determinar a sensibilidade de um dado microorganismo a concentrações
conhecidas de determinado antimicrobiano. A determinação dessa atividade
pode ser efetuada por dois métodos principais: Diluição ou difusão.
O método de difusão, embora ainda seja muito utilizado, tem sido
substituído por outros métodos, pois não fornece bons resultados para
amostras pouco solúveis em sistema aquoso, bem como não permite a
comparação adequada entre diferentes amostras. Portando, para que se
obtenha resultados confiáveis nos testes de atividade antimicrobiana in vitro
deve-se levar em consideração as características físico-químicas da amostra
em teste. (BRESOLIN; FILHO, 2010).
Segundo Campos (2006) entre os numerosos fatores que afetam a
atividade antimicrobiana in vitro estão pH do meio,composição do meio,
estabilidade da amostra, tamanho do inoculo,tempo de incubação e atividade
metabólica do microorganismo.
Segundo Ricardo (2008) A concentração inibitória mínima do óleo,
consiste na menor concentração do antimicrobiano necessário para inibir a
multiplicação de um isolado bacteriano. Portanto a concentração inibitória
mínima é a menor concentração de um agente antibiótico que inibe o
crescimento visível de um após incubação in vitro.
Segundo Sejas e outros (2003) a difusão do antimicrobiano leva à
formação de um halo de inibição do crescimento bacteriano, cujo diâmetro é
inversamente proporcional à concentração inibitória mínima. Esse método é
qualitativo, ou seja, permite classificar a amostra bacteriana em suscetível,
intermediária ou resistente ao antimicrobiano.
Segundo Bresolin e Filho (2010) para á classificação da atividade
antimicrobiana, de extratos ou seus produtos de fracionamento podem ser
empregados os seguintes critérios: para concentração inibitória entre 10 e
100microlitros/ mL, é considerado como boa; entre 100 e 500 microlitros, como
atividade moderada; entre 500 e 1000microlitros/mL, como fraca atividade, e
quando a concentração inibitória mínima for maior que 1000microlitros/mL,
esses produtos podem ser classificado como inativos.
35
Utilizando a técnica de diluição, com o extrato da fração do óleo da
semente de sucupira, Dutra e outros (2009) relataram concentração inibitória
mínima de 2,5 gramas/mL para Staphylococcus aureus, e tendo a fração
atividade característica bactericida.
Segundo Araujo (2010) pode-se avaliar a eficácia dos extratos vegetais
considerados eficazes, ou seja, com atividade antimicrobiana desenvolvem
halo de inibição de maior ou igual a 8 mm.
O halo de inibição da semente de sucupira obteve inibição do halo de
8mm, tendo este halo boa eficácia na inibição de Staphylococcus aureus.
Não há um consenso sobre o nível de inibição aceitável de com base
no diâmetro do halo de inibição formado ao redor dos discos, extratos de óleos
ou outros produtos naturais quando comparados com antibióticos padrões.
Portando não se pode comparar o óleo de sucupira com os antibióticos
utilizados no antibiograma acima relacionado. (DUARTE, 2006).
Outro ponto importante é relatado quanto ao halo de inibição, pois
quanto menor o halo maior a concentração inibitória mínima, segundo Sejas
(2003) o diâmetro do halo é inversamente proporcional à concentração
inibitória mínima.
Contudo segundo Bresolin e Filho (2010) apesar das recentes pesquisas
com organismo marinhos e animais, e do reconhecimento da importância dos
antimicrobianos obtidos total ou parcialmente por síntese, ainda não existe
nenhum composto antimicrobiano obtido de plantas sendo empregado na
clinica.
36
6 CONCLUSÃO
Conclui-se no presente trabalho que, um dos maiores problemas de
Saúde Pública refere-se ao agravamento da resistência de cepas bacterianas
frente a antibióticos. No estudo desenvolvido foi avaliado o potencial
antimicrobiano do óleo da semente de sucupira, Pterodon emarginatus, contra
a cepa de Staphylococcus aureus. O óleo demonstrou um bom efeito
antimicrobiano, tendo sido avaliado pela técnica de difusão em agar. Outra
característica foi o efeito bactericida do óleo, frente ao Staphylococcus aureus
de com Dutra e outros (2009). Outro importante relato abordado no trabalho
corresponde ao fato de que, não possui nenhum antibiótico utilizado na clinica
proveniente de plantas, mesmo com tanta disponibilidade e aceitabilidade
desses recursos pela população e de serem reconhecidamente como
importantes antimicrobianos. Outro relato importante corresponde ao fato de
que não existe consenso sobre o nível de inibição aceitável de óleos ou outros
produtos naturais quando comparados com antibióticos padrões.
37
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