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Estudio Virológico por Estudio Virológico por

PCR en tiempo realPCR en tiempo real

Diagnóstico Molecular de Herpes virus

MSc. Mónica Cappetta

Lab. Biología Molecular, AEPSM

• Los métodos moleculares han potenciado la capacidad de los

laboratorios de identificar y caracterizar los agentes infecciosos en

profundidad.

• Las aplicaciones incluyen:

detección cualitativa y cuantitativa

genotipado y detección de subtipos

testeo de resistencia molecular

• Cuando se aplican estas metodologías selectivamente en un

laboratorio se potencian los diagnósticos y el manejo clínico de los

pacientes.

Biología Molecular en la Clínica

Agentes Virales

Detección viral directa por amplificación de ác. nucleicos:

- Eliminación en algunos casos de la utilización de métodos indirectos.

- Eliminación del cultivo viral altamente complejo.

- Rápido diagnóstico de infecciones virales.

- Alta sensibilidad y especificidad

Familia Herpes virus

• Principal causa de enfermedad humana viral luego de la gripe.

• Infección – latencia – reactivación

• 25 tipos 8 infectan al hombre.

• Mayoría de población humana infectada; adultos en gral. con Ac para la mayoría de los herpes virus excepto HHV-8.

• Virus envueltos de ADN doble cadena.

• Se clasifican por su localización en el estado latente.

Propiedades de los virus Herpes humanos

Tipo Nombre Sub Familia Células blanco Latencia Transmisión

1 Herpes simplex-1 (HSV-1) Alfaherpesvirinae Mucoepitelio NeuronaContacto cercanoContacto sexualMadre-bebé

2 Herpes simplex-2 (HSV-2) Alfaherpesvirinae Mucoepitelio NeuronaContacto cercano Contacto sexualMadre-bebé

3 Varicella Zoster virus (VSV) Alfaherpesvirinae Mucoepitelio Neurona Contacto

4 Epstein-Barr Virus (EBV) Gamaherpesvirinae Linfocito B, epitelio Linfocito B Saliva, ruta

respiratoria

5 Cytomegalovirus (CMV) BetaherpesvirinaeEpitelio,

monocitos, linfocitos

Monocitos, linfocitos y otros

Secreciones, transfusión sangre, transplan-te, congenita

6 Herpes lymphotropic virus Betaherpesvirinae Linfocitos T y otros

Linfocitos T y otros

Contacto, ruta respiratoria

7 Human herpes virus-7 (HHV-7) Betaherpesvirinae Linfocitos T y

otrosLinfocitos T y

otros Desconocido

8 Human herpes virus-8 (HHV-8) Gamaherpesvirinae Cél. endoteliales Desconocido Intercambio de

fluido corporales?

Manifestaciones clínicas

HSV 1 y 2: Lesiones

VZV: varicela (niños) herpes zoster (adultos/react.)

EBV: Asintomático (niños) Mononucleosis (jóvenes/adultos)

CMV: asintomático

Encefalitis (HSV, VZV)

Neumonia (VZV)

Linfomas luego de transplantes o SIDA (EBV)

Infección congénita (VZV, CMV)

Retinitis, neumonia, esofagitis, encefalitis en inmunodeprimidos (CMV)

Complicaciones

Diagnóstico Molecular de Herpes virus

Encefalitis virales : estudio de LCR

Pacientes inmunodeprimidos

Herpes virus y encefalitis

Agente causal de infecciones SNC

(10% encefalitis virales)

70% tasa mortalidad

diagnóstico precoz - terapia antiviralmorbilidad/moratlidad 20%

en Uruguay: 9% encefalitis viral por HSV

Menos agresivo: Biopsia cerebro vs Punción LCR

Ejemplo Citomegalovirus:

• Las pruebas serológicas presentan un uso limitado:

- individuos con infección latente

- anticuerpos aparecen 2 semanas después de la infección aguda

• Se produce la enfermedad al reactivarse como resultado de

Inmunodepresión: ej transplantes, SIDA, etc.

• La detección del ADN del CMV en plasma permite detectar

esta reactivación.

• Seguimiento de respuesta al tratamiento: carga viral.

Reactivación en inmunodeprimidos

ADN

PCR

2do. round1er. round

2n copiasDNA

Productonested-PCR

Electroforesisen gel

LCROrinaPlasmaBiopsia

Diagnóstico por real time-PCR

Detección rápida.

Detección cualitativa y cuantitativa.

No requiere manipulación post-PCR.

Menor probabilidad de contaminación o errores

de manipulación.

• Detección cualitativa de familia Herpes virus en LCR por PCR en tiempo real:

- Entrega de resultados en unas horas

• Cuantificación de CMV y EBV por PCR en tiempo real:

- Seguimiento de pacientes con reactivación

- Evaluación de tratamientos

Implementación en el laboratorio

Detección cualitativa de familia Herpes por Real time

3 Reacciones de amplificación:

HSV / CMV

EBV / HHV-6

VZV

6 diagnósticos en la misma corrida de amplificación.

Detección por Sybergreen Tm específica

Utilización de Uraciloglicosilasa durante la implementación en el laboratorio del protocolo.

Multiplex

• La Tm depende de la secuencia del ADN, el largo del producto y el contenido de GC.

• La Tm puede variar para:

- Prod. de igual tamaño pero distinto contenido de GC

- Prod. de igual tamaño y %GC pero con una distribución

de GC diferente

- Productos que difieran en 1 o más bases.

Identificación de productos de PCR por perfiles de Curvas de Melting

Análisis:

Se monitorea la fluorescencia de la muestra mientras la T° aumenta.

Se grafica la d/dT de la Fluorescencia en función de la Temp (°C).

Análisis de Tm de los productos amplificados

EBVVZVHHV6

Diagnóstico de Herpes virus: PCR vs PCR en tiempo real

PCR

24-36 hrs

2-4 cicladores

Alta manipulación

Riesgo de contaminación

Utilización de Kit comercial

Costos más elevados

Diagnóstico de Herpes virus: PCR vs PCR en tiempo real

PCR

24-36 hrs

2-4 cicladores

Alta manipulación

Riesgo de contaminación

Áreas pre y post-amplificación físicamente separadas

Cabina de UV

Diagnóstico de Herpes virus: PCR vs PCR en tiempo real

PCR

24-36 hrs

2-4 cicladores

Alta manipulación

Riesgo de contaminación

PCR tiempo real

2-3 hrs

LightCycler

Poca manipulación

Riesgo de contaminación

Multiplex con Sybergreen

Menor costo que Kit comercial

MUCHAS GRACIAS !!