estudio de la secuencia peptÍdica las proteínas son polipéptidos con una secuencia de...
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ESTUDIO DE LA SECUENCIA PEPTÍDICA
Las proteínas son polipéptidos con una secuencia de aminoácidos definida genéticamente
Esta secuencia de aminoácidos constituye la estructura primaria de la proteína y es el nivel fundamental en el que se basan los niveles más elevados
La secuencia de una proteína es similar entre especies pero no es idéntica
Las proteínas han evolucionado mediante cambios en sus secuencias de aminoácidos. Algunos cambios son conservadores y otros no conservadores
DETERMINACIÓN DE LA SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DE UNA PROTEÍNA: SECUENCIACIÓN
1953: Sanger secuenció la insulina
Método experimental
1ª Fase: Determinar la composición de aa• Hidrólisis ácida• Cromatografía
(Actualmente existen secuenciadores automáticos)
2ª Fase: Identificar el aa N-terminalMarcar el aa N-terminal
1-fluor-2,4 dinitrobenceno (DNF) (der. amarillo)Cloruro de dansilo (ClDNS) (Der. Fluorescente)
Hidrólisis del péptidoSeparación de aa (electroforesis, cromatografía)
Identificación del aa marcado
3ª Fase: Degradación de EDMAN• Marcar el aa N-terminal con fenilisotiocianato (PITC) en medio alcalino (se forma el derivado feniltiocarbanilo)• Se hidroliza el enlace peptídico entre los residuos 1 y 2 (medio ácido anhidro fuerte)• Se identifica el derivado del residuo N-terminal por HPLCEl resto del polipéptido sigue intacto por lo que puede repetirse el proceso para determinar el 2º aminoácidoPor repetición continuada puede secuenciarse el polipéptido desde el extremo N-terminal
Identificación del residuo C-terminal
• Hidrazina (NH2-NH2): rompe enlaces peptídicos y forma
derivados de hidrazina con todos los aa excepto el C-
terminal
• Carboxipeptidasa A: hidroliza el último enlace peptídico
FDNB Sanger2,4-dinitrofluorbenceno
Reactivos para identificar NH2 terminales
Después de la hidrólisis
F
NO2
NO2
NO2
NO2
CR
COOH
HNHAmarillo, se extrae con cloroformo (los demás productos de hidrólisis
ionizados no se extraen)
DNS-Cl Cloruro de dimetilaminonaftalen-5-sulfonilo
Cloruro de dansilo
Después de la hidrólisis
CR
COOH
HNHAnálogo a FDNB pero fluorescente
(detecta cantidades mínimas)
S Cl
O
O
N
CH3
CH3
S
O
O
N
CH3
CH3
Hidrazinolisis NH2-NH2
Después de la hidrólisis
El terminal queda libre y los demás como hidracidas
NH2-NH2CR
COOH
HNH2CR
CO
HNH2
NH NH2
Reactivos para identificar COOH terminales
“Bioquímica” Stryer, Berg y Tymoczko Ed. Reverté, S.A. 2003
DEGRADACIÓN DE EDMAN
Marcaje
Liberación
Marcaje
Liberación
1ª vuelta
2ª vuelta
SECUENCIACIÓN DE PROTEÍNAS
“Bioquímica” Mathews, van Holde y Ahern. Addison Wesley 2002
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