effects of structure on radical-scavenging abilities...

2015年度前期ゼミ 雑誌会

Effects of Structure on Radical-Scavenging Abilities and Antioxidative

Activities of Tea Polyphenols: NMR Analytical Approach Using 1,1-

Diphenyl-2-picrylhydrazyl Radicals

National Institute of Vegetable and Tea Science, Kanaya, Shizuoka 428-8501, Japan;

College of Agriculture and Life Science, Chonnam National University, Gwangju 500-757, Korea;

Institute for Chemical Research, Kyoto University, Uji, Kyoto 611-0011, Japan; and Faculty of

Agriculture, Shizuoka University, 836 Ohya, Shizuoka 422-8529, Japan

J. Agric. Food Chem. 2005, 53, 3598-3604

発表日：5/15(Fri)

紹介者：M2 西井洸太

YUSUKE SAWAI,*,† JAE-HAK MOON,‡ KANZO SAKATA,§ AND NAOHARU WATANABE

Introduction 2

＜アスコルビン酸＞

構造：ラクトン構造を持つフランの誘導体（別名ビタミンC）

分布：柑橘類の果物、野菜などに含有

機能：抗酸化作用、酸化防止剤として食品添加物などに利用

＜ポリフェノール＞

構造：分子内に複数のフェノール性OH基

分布：茶葉やコーヒー豆、果物などのほとんどの植物に含有

機能：抗酸化作用、抗炎症作用、抗ガン作用などの生理活性

茶葉に含まれる抗酸化物質

(+)-catechin (-)-epicatechin (-)-epigallocatechin-3-o-gallate

ascorbic acid

Introduction 3

DPPHラジカル消去活性

0

0.4

0.8

1.2

1.6

250 350 450 550 650

Abs

orpt

ion

(abs

.uni

ts)

Wavelength (nm)

DPPH control DPPH + 50 μM 5-CQA(1hour)

Purple Yellow

抗酸化物質

ラジカルが取り除かれ、構造が変化

↓ スペクトルの極大吸収の吸光度の減少

↓ 物質の抗酸化活性を見積もることが出来る

1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl Free Radical (DPPH)

DPPH が持っている不対電子（・）を取り除くことができるのであれば、 酸素から作られるラジカルの不対電子も取り除くことができる可能性を示す

DPPHラジカル消去能 ≒ 抗酸化活性

（抗酸化活性はフェノール性OH基の数に依存していることが言われている）

DPPHは比較的安定で

人工的なラジカル

酸素から発生するラジカルで、生体内で様々な物質を酸化させてしまい、病気や老化の原因となる

活性酵素種 …反応性の高い酸素種

1O2

3O2

e- e- e- + 2H+

O2

-･ H2O2 ･OH

ヒドロキシラジカル 過酸化水素 スーパーオキシドアニオン

励起1重項酸素分子

励起3重項酸素分子

Introduction 4

＜本研究＞

ラジカル消去能の構造活性相関を明らかにする(13C NMR を用いて）

研究背景

＜ 13C NMR を用いたDPPHと抗酸化物質との反応機構に関する報告 ＞

オルトキノン(o-quinone)体の生成

ピロガロール構造

(vicinal trihydroxyl phenolic compounds)

J. Agric. Food Chem. 1998, 46, 111-114

カテコール構造

(o-dihydroxyl phenolic compounds)

DPPHとの反応で得た反応機構に関する知見

↓

Entry Compounds Chemical Structure

4 (+)-taxifolin

5

ethyl

protocatech-

uate

6 quercetin

Introduction 5

Entry Compounds Chemical Structure

1 ascorbic

acid

2 DPPH

3 catechol

3~6 : カテコール構造(o-dihydroxyl phenolic compounds)

今回ターゲットとなる化合物

Introduction 6

Entry Compounds Chemical Structure

7 myricetin

8 pyrogallol

9 ethyl gallate

7~9 : (vicinal trihydroxyl phenolic compounds)

今回ターゲットとなる化合物

Introduction 7

抗酸化活性の優劣

アスコルビン酸 ＞ フェノール性OH基3つ ＞ フェノール性OH基2つ

3 1

5

4

9

8

6

7

J. Agric. Food Chem. 2000, 48, 6247-6253

Results & Discussion 8

Figure 1-1. 13C NMR analyses (acetone-d6, 125 MHz) to examine the reactivity of catechol with DPPH (2): (A) 3 (0.015mmol); (B) reaction mixture of 3 (0.015 mmol) and 2 (0.030 mmol) ); (▽) 1,4-dioxane (external standard);

(▼) 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazine.

Catechol(3) とDPPHの反応

C=Oピークの出現(d181.2)

→ オルトキノン体生成の示唆

Results & Discussion 9

Figure 1-2. 13C NMR analyses (acetone-d6, 125 MHz) to examine the reactivity ethyl protocatechuate (5) with DPPH (2): (C) 5 (0.015 mmol); (D) reaction mixture of 5 (0.015 mmol) and 2 (0.030 mmol); (▽) 1,4-

dioxane (external standard); (▼) 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazine.

ethyl protocatechuate (5)とDPPHの反応

カテコール構造を持っているが、

オルトキノンのシグナルは観測されず

･･･

Results & Discussion 10

Figure 1-3. 13C NMR analyses (acetone-d6, 125 MHz) to examine the reactivity of catechol (3) and

ethyl protocatechuate (5) with DPPH (2): (A) 3 (0.015mmol); (C) 5 (0.015 mmol); (E)2 (0.030 mmol)

added to a mixture of 3 (0.015 mmol) and 5 (0.015 mmol); (3) 1,4-dioxane (external standard); (1) 1,1-

diphenyl-2-picrylhydrazine; (O)remaining peaks of 5.

Catechol(3) とethyl protocatechuate (5) とDPPHの反応

3のシグナルが消え 5のシグナルは残っている

ラジカル消去スピード 3 ＞ 5

競合

Results & Discussion 11

Figure 2-1. 13C NMR analyses (acetone-d6, 125 MHz) to examine the reactivity of quercetin (6) with DPPH (2): (A) 6 (0.015 mmol); (B) reaction mixture of 6 (0.015 mmol) and 2 (0.030 mmol); (▽) 1,4-dioxane (external

standard); (▼) 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazine.

quercetin(6)とDPPHの反応

カテコール構造を持っているが、

オルトキノンのシグナルは観測されず

Results & Discussion 12

Figure 2-2. 13C NMR analyses (acetone-d6, 125 MHz) to examine the reactivity of (+)-taxifolin (4) with DPPH (2): (C) 4 (0.015 mmol); (D) reaction mixture of 4 (0.015 mmol) and 2 (0.030 mmol); (▽) 1,4-dioxane (external

standard); (▼) 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazine; (O) .

(+)-taxifolin(4)とDPPHの反応

C=Oピークの出現(d180.5,180.8)

→ オルトキノン体生成の示唆

Results & Discussion 13

Figure 2-3. 13C NMR analyses (acetone-d6, 125 MHz) to examine the reactivity of quercetin (6) and (+)-taxifolin

(4) with DPPH (2): (A) 6 (0.015 mmol); (C) 4 (0.015 mmol); (E) 2 (0.030mmol) added to a mixture of 6 (0.015 mmol) and 4 (0.015 mmol); (▽) 1,4-dioxane (external standard); (▼) 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazine; (○)

remaining peaks of 4.

quercetin(6)と(+)-taxifolin(4)とDPPHの反応

6のシグナルが消え 4のシグナルは残っている

ラジカル消去スピード 6 ＞ 4

競合

Results & Discussion 14

ラジカル消去能の優劣

オレフィン ＞ なし ＞ カルボニル

カテコール構造まとめ

反応機構

3 5

4

6

･･･

Results & Discussion 15

Figure 3-1. 13C NMR analyses (acetone-d6, 125 MHz) to examine the reactivity of pyrogallol (7) with DPPH (2): (A) 8 (0.015 mmol); (B) reaction mixture of 8 (0.015 mmol) and 2 (0.045 mmol); (▽) 1,4-dioxane (external standard); (▼) 1,1-diphenyl-2-

picrylhydrazine.

pyrogallol(8)とDPPHの反応

8 由来のシグナルは消え 新しいピークは出ず

→ 8はラジカルとして安定

Results & Discussion 16

Figure 3-2. 13C NMR analyses (acetone-d6, 125 MHz) to examine the reactivity of myricetin (7) with DPPH

(2): (C) 7 (0.015 mmol); (D) reaction mixture of 7 (0.015 mmol) and 2 (0.030 mmol); (E) 2 (0.045mmol) added to a mixture of 8 (0.015 mmol) and 7 (0.015 mmol); (▼) 1,4-dioxane (external standard); (1) 1,1-diphenyl-2-

picrylhydrazine; (O) .

myricetin(7)とDPPHの反応

7 由来のシグナルは消え 新しいピークは出ず

→ 7はラジカルとして安定

Results & Discussion 17

Figure 3-3. 13C NMR analyses (acetone-d6, 125 MHz) to examine the reactivity of pyrogallol (8) and

myricetin (7) with DPPH (2): (A) 8 (0.015 mmol); (C) 7 (0.015 mmol); (E) 2 (0.045mmol) added to a mixture of 8 (0.015 mmol) and 7 (0.015 mmol); (▽) 1,4-dioxane (external standard); (▼) 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazine;

(○) remaining peaks of 7.

pyrogallol(8)とmyricetin(7) DPPHの反応

8のシグナルが消え 7のシグナルは残っている

ラジカル消去スピード 8 ＞ 7

競合

Figure 4-1. 13C NMR analyses (acetone-d6, 125 MHz) to examine the reactivity of ethyl gallate (9), myricetin

(7), and quercetin (6) with DPPH (2) (A) 9 (0.015 mmol); (B) 2 (0.030 mmol) added to a mixture of 7 (0.015 mmol) and 9 (0.015 mmol); (C) 2 (0.045 mmol) added to a mixture of 9 (0.015 mmol) and 6 (0.015 mmol); (▽)

1,4-dioxane (external standard); (▼) 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazine; (O) remaining peaks of 9; (●) remaining

peaks of 6.

Results & Discussion 18

ethyl gallate(9)とmyricetin(7) DPPHの反応

ethyl gallate(9)とquercetin(6) DPPHの反応

競合

Results & Discussion 19

ラジカル消去能の優劣

なし ＞ オレフィン ＞ カルボニル

反応機構

7 9 8

ピロガロール構造まとめ

Results & Discussion 20

Figure 4-2. 13C NMR [acetone-d6/methanol-d4 ) 1:1 (v/v), 125 MHz] to examine the reactivity of ascorbic acid

(1) and pyrogallol (8) with DPPH (2): (A) 8 (0.015 mmol); (D) 1 (0.015 mmol); (E) 2 (0.030 mmol) added to a mixture of 1 (0.015 mmol) and 8 (0.015 mmol); (▽) 1,4-dioxane (external standard); (▼) 1,1-diphenyl-2-

picrylhydrazine; (◇) remaining peaks of 8.

pyrogallol(8)とascorbic acid(1)とDPPHの反応

1のシグナルが消え 8のシグナルは残っている

ラジカル消去スピード 1 ＞ 8

競合

Summary 21

3☆

5

4☆

6

＞ ＞ ＞

＞

7 9 8

＞ ＞

1

DPPHラジカル消去能 構造活性相関まとめ ☆：オルトキノン体の生成