efeitos do exercÍcio fÍsico sobre a via akt/enos e ampk/enos em aorta de ratos wistar com...
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Doutoranda: Viviane Acunha BarbosaOrientador: Prof.Dr.Cláudio T de Souza
Criciúma-SCCriciúma-SC20092009
EFEITOS DO EXERCÍCIO FÍSICO SOBRE EFEITOS DO EXERCÍCIO FÍSICO SOBRE A VIA AKT/eNOS E AMPK/eNOS EM A VIA AKT/eNOS E AMPK/eNOS EM
AORTA DE RATOS WISTAR COM AORTA DE RATOS WISTAR COM INSUFICIÊNCIA CARDÍACA.INSUFICIÊNCIA CARDÍACA.
Projeto de doutorado apresentado ao Programa de Pós Graduação em Ciências da Saúde – PPGCS –
UNESC para o exame de qualificação.
AKT AMPKeNOS
DEFINIÇÃODEFINIÇÃO
“ “ INSUFICIÊNCIA CARDÍACA (IC): INSUFICIÊNCIA CARDÍACA (IC): Síndrome clínicaSíndrome clínica complexa e complexa e progressivaprogressiva, que pode resultar de , que pode resultar de qualquerqualquer distúrbio funcional ou distúrbio funcional ou estrutural do coração que altere sua estrutural do coração que altere sua capacidade de capacidade de enchimentoenchimento e/ou e/ou ejeçãoejeção. . Caracterizada clinicamente por Caracterizada clinicamente por dispnéia, fadiga, edema e redução da dispnéia, fadiga, edema e redução da sobrevidasobrevida.”.”
(Jessup & Brozena, 2003; Neto Rossi, 2004).
Doença CardiovascularDoença CardiovascularPRINCIPAL CAUSA DE MORTE NO PRINCIPAL CAUSA DE MORTE NO
MUNDOMUNDO
The World Health Report 2001. Geneva: WHO; 2001.The World Health Report 2001. Geneva: WHO; 2001.
Insuficiência Cardíaca
Congênitas(CIV, Fallot, etc)
Valvares(IMi, EAo, etc)
Miocárdicas(IAM, entre outras)
Hipertensão Arterial
Tóxicas(álcool, anti-blásticos )Pericárdio
(pericardite constritiva)
ETIOPATOGENIAETIOPATOGENIA
(Albanesi Filho, 2005; Hagen, 2006).
Insuficiência CardíacaInsuficiência CardíacaEtiopatogeniaEtiopatogenia
Principais causas de insuficiência cardíaca dos pacientes internados no INCOR - 1995
1,6622,1
32,6
25,8
6,97
7,41
3,4
Mioc. RestritivaValvopatiaMioc. IsquêmicaMioc. DilatadaHipertensçãoCard. CongênitaOutros
Arq Bras Cardiol vol 71, (nº 1), 1998Arq Bras Cardiol vol 71, (nº 1), 1998
EPIDEMIOLOGIAEPIDEMIOLOGIA
Nettto Rossi, 2004. Rev Soc Cardiol Estado de São Paulo.
EPIDEMIOLOGIAEPIDEMIOLOGIA
Relação entre hospitalizações e Relação entre hospitalizações e sobrevida anualsobrevida anual
World Health Statistics, World Health Organization, 1999.World Health Statistics, World Health Organization, 1999. American Heart Association, 2002 Heart and Stroke Statistical UpdateAmerican Heart Association, 2002 Heart and Stroke Statistical Update..
SOBREVIDA
HOSPITALIZAÇÕES
IMPORTÂNCIA DO EXERCICIO IMPORTÂNCIA DO EXERCICIO FISICO NA ICFISICO NA IC
IMPORTÂNCIA DO EXERCICIO IMPORTÂNCIA DO EXERCICIO FISICO NA ICFISICO NA IC
LIMITAÇÕES DA CAPACIDADE FISICA
Dispneia, fadiga e descondicionamento
Fraqueza muscular
Alterações endoteliaisentre outras
AKT
AMPK
?Disfunção muscularPORQUE?
AKT
AMPK
CapacidadeOxidativa
Sintetisa
eNOS
L-Citrulina
CL-Miosina
Célula de Músculo Liso Vascular
Membrana Basal
Endotelio
Matriz Extracelular
Função endotelial
Condutância vascular
L-Arginina
BENEFICIOSDO
EXERCÍCIO FÍSICO
Oxido nítrico (NO .): Oxido nítrico (NO .):
Anti-inflamatoria
Anti-apoptosis Pro-fibrinolítica
Anti-plaquetaria
Proliferação e migração CML
NO.
• pesquisas? quais são os fatores ? Disfunções do IAM-IC
Dentre essas investigações
Um mediador na funcionabilidade vascularUm mediador na funcionabilidade vascular+ potente vasodilatador endogeno+ potente vasodilatador endogeno
Atualmente ON: prevenção e na redução dos Sintomas clinicos e hemodinamicos IC
Porem a relevância do ON no endotelio e na vasculatura do Musculo liso
Depende de uma enzima importante
eNOS
Ativação da eNOS por diversos Ativação da eNOS por diversos fatores…fatores…
?
PI3KPLC-γ
AC
PKC
CaMAkt CaMK PKA
oxigenasa CaM reductasa
β γαi
β γ αs
InsP3
DAG
Ca 2+
ATP
AMPc
S1177S635
S617
T497
S116
VEGF-REstrógeno-R Esfingosina-1-P Bradicinina shear stress
IGF-1 e insulina
eNOS
IL-8
integrinas
P
Comini et al., 1996, Viaro& Evora, 2000
NO NO
CÉLULA MUSCULAR VASCULAR LISA
CÉLULA ENDOTELIAL
αs
S-S RPK
ββ TYR
S-S
αα
p85 p110PPPP
IRS-1IRS-2IRS-3IRS-4
PI(4,5)-P2 PI(3,4,5)-P3 PI(4)-P PI(3,4)-P2
P P P
AKT3AKT2
AKT1
PPDK
NOeNOS P
Fosfoinositídeos
PI3K
VEGF, IGF-1 , insulina
shear stress,
(Bertrand et al., 2008;Dimmeler et al., 1999; Fulton et al., 1999; Zecchin, 2007).
A AKT será o mecanismo principal de ativação de eNOS?
P
AKT
Captaçãode glicose
Anti-lipólise
Síntese deglicogênio
Síntese dePTN
Antiapoptose
Dano oxidativo
Choque osmótico
Hipoxia
Privação de glicose
Estímulos patológicosEstímulos fisiológicos
Exercício
Contração do músculo
hormônios
leptina
(Hardie et al. 2003).
AMPK é um kinase e ativada por...
adiponectina
Proteina Kinase ativada por AMP
ATPADP
AMP
ExercícioAMPK sensor energético
P172
AMPK
CB
S
CBS
CB
S
CBSAMPK
GLUT4(Glucose transporter 4)
PFK(Phosphofructokinase}
IRS1(Insulin Receptor
substrate 1)
eNOS mTOR
ACC2(Acetyl-CoA carboxylase)
GPAT(Glicero-3-phosphate
acyltransferase)
PPARLeptin Adipo-
nectin
MCD(Malonyl-CoAcarboxylase)
Triglicerideos e Malonil CoA
Captação de glicose e metabolica
GS(Glycogen synthase)
PKC
CaMKK
TSC1/2
PGC-1(PPAR coactivator)
Geneexpressão
Rheb
AMPKK(LKB1)
Ativada pela redução do conteúdo energético celular
(aumento da relação AMP/ATP)
Inibe as vias metabólicas que
consuma ATP
estimula as vias metabólicas que produzam ATP exercício
PI3K
PI3K
eNOS
AktAMPK
P
VEGF, IGF-1 , insulina
EXERCICIOMODERADO
SHEAR ESTRESS
NOS III
NO NO
CÉLULA VASCULAR LISA
CÉLULA ENDOTELIAL NO
IC
?
Dimmeler et al., 1999; Fulton et al., 1999; Magata et al. 2003; Zechin et al, 2007; Zhang et al, 2009
Exercício físico regular
↑ fluxo sanguíneo
↑Akt↑
eNOS (Ser 1177)
NO.
NO.
↑Força de frição tangencial
célula endotelial
NO CML
AMPK
NO.
Exercício Fisico Tambem ativa
eNOS via ?
NO
IC
Problemática do estudoProblemática do estudo
P
OBJETIVO Geral:OBJETIVO Geral:
• Avaliar os efeitos do Avaliar os efeitos do exercício sobre a via exercício sobre a via
AKT/eNOS e AMPK/eNOS na AKT/eNOS e AMPK/eNOS na aorta de ratos wistar com IC.aorta de ratos wistar com IC.
Objetivos EspecíficosObjetivos Específicos::• Avaliar se em quadro de IC ocorre redução da Avaliar se em quadro de IC ocorre redução da
atividade da Akt e AMPK;atividade da Akt e AMPK;• Avaliar se o exercício físico induz ativação da AKT e Avaliar se o exercício físico induz ativação da AKT e
AMPK e se essas levam o aumento da atividade da AMPK e se essas levam o aumento da atividade da eNOS em ratos com insuficiência cardíaca;eNOS em ratos com insuficiência cardíaca;
• Avaliar os efeitos sobre a fosforização da AMPK e da Avaliar os efeitos sobre a fosforização da AMPK e da eNOS em aorta de ratos com insuficiência cardíaca eNOS em aorta de ratos com insuficiência cardíaca tratados com tratados com ARA – adenina arabinofuranosida;
• Avaliar os efeitos sobre a fosforização da Akt e da Avaliar os efeitos sobre a fosforização da Akt e da eNOS em aorta de ratos com insuficiência cardíaca eNOS em aorta de ratos com insuficiência cardíaca tratados com LY294002.tratados com LY294002.
METODOLOGIA METODOLOGIA (Tipo de estudo e ética)(Tipo de estudo e ética)
• Estudo experimental.Estudo experimental.• Abordagem quantitativa, Abordagem quantitativa, • Comitê de Ética; UNESC e HCPA Comitê de Ética; UNESC e HCPA • Princípios éticos na experimentação Princípios éticos na experimentação
animal e pratica didático-científica; lei animal e pratica didático-científica; lei nº 6.638/ 08/05/ 1979 -COBEAnº 6.638/ 08/05/ 1979 -COBEA
• Após os experimentos procedimentos: Após os experimentos procedimentos: conforme RDC nº 306/2004 da ANVISA .conforme RDC nº 306/2004 da ANVISA .
(Schnaider & Souza, 2003).(Schnaider & Souza, 2003).
METODOLOGIAMETODOLOGIA
•51 ratos machos da linhagem 51 ratos machos da linhagem wistar (HCPA) cIAM-30 diaswistar (HCPA) cIAM-30 dias
Barbetta (2007).Barbetta (2007).
Avaliação / Ecocardiograma
•diâmetros do VE ao final da diástole (DDVE) / sístole (DSVE). A extensão do infarto (%IM),
porcentagem do perímetro total do contorno endocárdico (PE)
Modelos de Modelos de indução de indução de infarto agudo do infarto agudo do MiocárdioMiocárdio AC descente anterior esquerda
cateter periférico intravenoso (Gelko-16G)
reg torácica (4º espaço intercostal esquerdo) O pericárdio será rompido e o AE afastado Johns & Olson, 1954; Pfeffer et al.,1979.
METODOLOGIAMETODOLOGIA• Critérios de inclusão:Critérios de inclusão:- homogeneidade na proporção do peso (em media de 200g a homogeneidade na proporção do peso (em media de 200g a
350 g),350 g),- idade (60 dias- adultos jovens), idade (60 dias- adultos jovens), - gênero (machos), raça (wistar), gênero (machos), raça (wistar), - Todos/ protocolo de adaptação ao exercício de uma semana, Todos/ protocolo de adaptação ao exercício de uma semana,
sendo randomizados os com maior aptidão física,sendo randomizados os com maior aptidão física,- chegar ao final do experimento com bom estado de saúde.- chegar ao final do experimento com bom estado de saúde.
Barbetta (2007).Barbetta (2007).
METODOLOGIAMETODOLOGIACritérios de exclusão: Critérios de exclusão: - complicações como infecções, complicações como infecções, - necroses, necroses, - debilitação do estado geral;debilitação do estado geral;- problemas ou desconforto ao animal - problemas ou desconforto ao animal
durante o período do experimentodurante o período do experimento- morte dos mesmos, morte dos mesmos, - não conseguirem realizar a semana de não conseguirem realizar a semana de
adaptação na esteira. adaptação na esteira.
7 diasciclo 12 h claro/ciclo 12 h claro/escuro, 22,5ºCescuro, 22,5ºC
Adaptaçãobiotério
30 dias PO-IAMHCPA
de Gava et al., 1995. Bertagnoli, 2004; Zanchi et al., 2006; Ferreira et al., 2007;
Protocolo exercício físico em esteira
4m/min -10min> gradativamente
por dia
5dias
Adaptação Protocolo
(4º/5º+aptos)
1º semana
de Gava et al., 1995. Bertagnoli, 2004; Zanchi et al., 2006; Brum et al., 2007;
5m/min - 10min> A cada 3’ até exaustão
Pré-treinamento5 semanas (Ajuste)
11 semanas (Aferição final)
TesteEsforçoMáximo
2º semana
de Gava et al., 1995. Bertagnoli, 2004; Zanchi et al., 2006;Ferreira et al., 2007;
Grupos experimentais
Sedentário Exercício
Grupo Controle
N-6
Sham Treinado (ST)
N-6
IC Treinado (ICT)
N-9
IC Treinado LY200940(ICT-LY)
N-9
IC Treinado adenina arabinofuranosida
(ICT-ARA) N-9
Grupo Sham
N-6
Grupo ICN-6
semansemanaa temptempoo0202 10100303 15150404 20200505 25250606 30300707 35350808 40400909 45451010 50501111 50501212 5050
ProtocoloTreinamento
Físico
5m/min5m/min
60%-TEM
5 min 5 min-10 min a 50 min-2ª a 10ª
2º 12º semana
de Gava et al., 1995. Bertagnoli, 2004; Zanchi et al., 2006; Ferreira et al., 2007;
7 dias4m/min -10min
> gradativamente por dia
5dias
Adaptação Protocolo
Adaptaçãobiotério
30 dias PO-IAMHCPA
(4º/5º+aptos)
1º semana
5m/min - 10min> A cada 3’ até exaustão
Pré-treinamento5 semanas (Ajuste)
11 semanas (Aferição final)
TesteEsforçoMáximo
2º semana
ProtocoloTreinamento
Físico
5m/min5m/min
60%-TEM
5 min 5 min-10 min a 50 min-2ª a 10ª
semansemanaa temptempoo0202 10100303 15150404 20200505 25250606 30300707 35350808 40400909 45451010 50501111 50501212 5050
de Gava et al., 1995. Bertagnoli, 2004; Zanchi et al., 2006; Ferreira et al., 2007;
2º 12º semana
Vel. treino (m.min) = Vel. max (m.min-1) . 60%
100%
HistologiaHistologia Tamanho do IAMTamanho do IAM
Hangen, 2006 (Hangen, 2006 (Mill el at., 1990)
Area de infarto= massa da região infartada x 100%(massa do VE + massa do VD
Verificar a deposição ou não de colageno
e análise da musculatura lisa
Area infartada e não infartada:
•PESADAS •DESENHADAS
(PAPEL MILIMETRADO)•Recortado e pesado
•(VE/VD)
YI
Eppendorf
YYYI
Western BlotWestern Blot
Macerada em nitrogenio
liquido
Homogeneizada em tampão especifico
Adicionado triton
Centrifugado 40 min
sobrenadante
Será processado e aplicado em gel SDS (apósCorrida)
TransferidasMemb de nitrocelulose
Incubadas com antocorpo primariosecundario
Tranf. Filme de raiox
Analises Moleculares via de sinalização da insulina
Imunoblot:
PI 3-KPI 3-K
AKTAKT
P172
AMPK
C
BS
CBS
CB
S
CBSAMPK
L-ARGL-ARG
eNOSeNOS
ON
Nagata et al., 2003; Reihill et al. 2007; Reihill, 2009
AVALIAR A EXPRESSÃO
E A FOSFORILAÇÃO DA
Analises Moleculares via de sinalização da insulina
Imunoblot:
PI 3-KPI 3-K
AKTAKT
LY200940
ARA – adenina arabinofuranosida
P172
AMPK
C
BS
CBS
CB
SCBS
AMPK
L-ARGL-ARG
eNOSeNOS
ON
AVALIAR A FOSFORILAÇÃO DA eNOS mediante o inibidor
A utilização dos inibidores e para mostrar a importância da AKT e AMPK neste processo
Analise estatisticaAnalise estatistica• A analise estatística será pelo teste A analise estatística será pelo teste
de Student (não pareados) e ANOVA de Student (não pareados) e ANOVA para comparar as múltiplas médias. para comparar as múltiplas médias. Será adotado o nível de significância Será adotado o nível de significância p<0,05.p<0,05.
no: 2009 J F M A M J J A S O N DElaboração do projeto x x x x x x x x x x xAvaliação pelo Comitê de ética x xelaboração e apresentaçãoQualificação x xQualificação x
no: 2010 J F M A M J J A S O N DInfarto dos animais-HCPA/Deslocamento UNESC x x xProtocolo de Exercício C/I aerobio X X XEutanásia UNESC/coleta de tecidos xAnalises molecularese histológicas x x x x x xAnalise dos dados e elaboração de artigo x x x
CRONOGRAMA
Ano: 2011 J F M A M J J A S O N D
Analises moleculares/bioquímicas e histológicas
x x x x x
Analise dos dados e elaboração de artigo x x x x x x x x x x x x
Ano: 2012 J F M A M J J A S O N D
Defesa da tese x x
CRONOGRAMA
Quantidade Material Valor (R$) Fonte
51 Ratos Wistar 1020,00 HCPA-UNESC
Diversos Reagentes para Western blot
4.000,00 CNPq
Diversos Anticorpos 15.000,00 UNICAMP e HCPA
Histologia 1.000,00 UNICAMP
Diversos Material de Consumo/condução
para animais/eventos
4.000,00 UNESC
TOTAL 25.020,00
ORÇAMENTO
O que busca-se :O que busca-se : • ........que esses resultados demonstrem um ........que esses resultados demonstrem um
novo mecanismo biológico pelo qual o exercício novo mecanismo biológico pelo qual o exercício físico possa induz relaxamento vascular e físico possa induz relaxamento vascular e proporcione importantes informações acerca da proporcione importantes informações acerca da modulação vascular na insuficiência cardíaca. modulação vascular na insuficiência cardíaca.
• OBs.: é importante ressaltar que existem OBs.: é importante ressaltar que existem fármacos já comercializados que aumentam a fármacos já comercializados que aumentam a atividade da AKT e da AMPK porem.....atividade da AKT e da AMPK porem.....
O não farmacologico?O não farmacologico?
Evitar.......Evitar.......
“Ter problemas na vida é inevitável, ser derrotado por eles e opcional”.
(Anonimo)
Valeu Gabi te adoro!!!
?
PI3K
PI3KAC
eNOS
CAAkt
AMPK
PKA
P
ATP
AMPc
CaM
insulina EXERCICIOMODERADO
SHEAR ESTRESS
NOS III
BH4
NO
PGIS
NO
CÉLULA VASCULAR LISA
CÉLULA ENDOTELIAL
αs
αS
β γ
PROSTAGLANDINAS
NO
1
3
4
2
1. Canal de sodio. 2. Canal L de calcio. 3. Inter Na+/Ca2+
4. Na+/K+ ATPasa.
5. SERCA-PLN. 6. RYR2
RS5
6
Sodio
Calcio
Potasio
Sitio de união dos gicosideos Cardiacos
4
7. Ca 2+ ATPasa
7
3 Na+
2 K+
Recaptura de Ca 2+
1 Ca2+
3 Na+
Ca2+
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