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Biossistemas e Biorreações

Prof. Maria Alice Zarur Coelho

Programa de Pós-graduação em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos

Escola de QuímicaUFRJ

Metabolismo – nosso principal ator

Top-down versus Bottom-up

Petranovic and Nielsen, Trends in Biotechnology (2008)

Primeiro Genoma Bacteriano Sequenciado

Número de genomas sequenciados

http://sulab.org/2013/06/sequenced-genomes-per-year/

1. COMPONENTS Determine the system components (genes, proteins and metabolites)2. NETWORKS Identify the component interactions (enzyme-substrate,protein-DNA)3. MODELS Develop a system model (qualitative or quantitative)4. PHYSIOLOGY Model-based design or hypothesis-driven discovery

Bottom-up metabolic systems biology

Usos de outros dados de ômicas em modelos de escala genômica

Reações Químicas e Bioquímicas

• Químicas: fase gás frequente. Altas temperaturas e pressões.• Bioquímicas: fase aquosa duluída. Temperatura ambiente.

• Características:• Químicas: Estequiometria simples. Cinética por ser baseada em

mecanismos detalhados. Transferência de calor e massa são importantes.

• Bioquímicas: Estequiometria complexa que muda com as condições ambientais. Cinética ainda crua. Transferência de calor e massa são raramente importantes.

A célula é o biorreator e a reção é autocatalítica.

Estequiometria

• Síntese de Metanol: CH4 + H2O → CO + 3 H2

2 H2 + CO → CH3OH

Fermentação com leveduras:CH2O + 0.0164 NH3 → 0.510 CH3O1/2 + 0.275 CO2 + 0.077 CH8/3O

+ 0.137 CH1.74O0.60N0.12 + 0.037 H2OCH2O = ”glicose” (1 C-atom)CH3O1/2 = etanol (1 C-atom)CH8/3O = glicerol (1 C-atom)CH1.74O0.60N0.12 = ”biomassa” (1 C-atom)

A estequiometria muda com T, pH, pO2, cNH3, cCH2O etc.

Mas mesmo………...a estequiometria das biorreações pode ser modelada

A conversão de glicose a biomassa, etanol e glicerol pode ser expressa como três caminhos metabólicos:

v1 = -1.12 CH2O + 0.12 CO2 + X + 0.15 NADH -1.80 ATP = 0v2 = - 3/2 CH2O + CH3O1/2 + ½ CO2 + ½ ATP = 0v3 = - CH2O + CH8/3O – 1/3 NADH – 1/3 ATP = 0

Quando os balanços redox (NADH) e energético (ATP) fecham, obtém-se a estequiometria experimental.

Processo de produção de solventes usando Clostridium acetobutylicum

Glucose

BuOH

acn

HBu

AcetoAcCoA

AcCoA

PYRv1

v3

v7

v8

v12v11

CH2O0.5N0.25

v2

CO2

BuCoAv10

CO2

HLacv4

CO2

NADH H2

HAcv6

EtOH

v5

v9 ac

CO2

HBu BuCoA

v13

A rede tem 13 fluxos e 4 nós internos: com um balanço de NADH e outro de ATP, 7 taxas podem ser mensuradas para determinar v1- v13

Rede Estequiométrica com ”caminhos diretos”

Cinética

• Expressões muito simples podem ser usadas:

Estado Estacionário (ou crescimento balanceado):qx = Ypx qp = Ysx qs (kg m-3 h-1) = x rxrx = k cs (Ks + cs)-1 (kg (kg X)-1 h)-1.

Mudanças rápidas no ambiente:Falta de conhecimento do sistema regulatório da célula inibe qualquer

construção de uma cinética geral (com base mecanicística).Pedaços da rede de reações podem ser modelados.

Exceto pela estequiometria ………..

• …….. projeto dos bioprocessos não é muito diferente daqueles relacionados aos processos químicos convencionais.

• O conceito da Análise de Fluxo Metabólico (MFA) é útil para estudar as interações entre os diferentes caminhos

metabólicos e quantificar as distribuições de fluxo em torno do pontos de bifurcação…

• … não possibilita medidas quantitativas do controle do fluxo metabólico!!!

• O controle do fluxo metabólico é importante para:• (i) balancear a taxa de síntese e conversão dos metabólitos

face a uma dada condição ambiental não permitindo um aumento ou uma queda catastrófica nas concentrações intracelulares destes compostos

• (ii) modificação racional dos fluxos metabólicos

•Mecanismos moleculares que possuem papel importante no controle do fluxo metabólico (1950’s): Inibição por feed-back Cooperatividade enzimática Modificações enzimáticas por ligação covalente Controle da síntese enzimática

Controle metabólico normalmente é descrito de forma qualitativa, i.e.:

“… fosfofrutoquinase é a enzima que controla a maior parte do fluxo glicólitico nos músculos.”

ou

“o primeiro passo de uma caminho metabólico é a taxa cinética limitante.”

Não necessariamente correto!!!

Regulação da Atividade Enzimática

Controle da Disponibilidade Enzimática:A quantidade de uma dada enzima na célula depende da sua taxa de síntese e da sua taxa de degradação

Controle da Atividade Enzimática:A atividade catalítica de uma enzima pode ser diretamente regulada por meio de alterações conformacionais ou estruturais

Aspartato transcarbamoilase (ATCase)

H2N – CO – OPO3-2 + -OCO – CH2 – CH – COO- ATCase -OCO – CH2 – CH – COO-

NH3+ NH

carbamoil fosfato aspartato H2N – CO

+ H2PO4-

ligação cooperativa homotrópica positiva para ambos os substratosheterotropicamente inibida pela cistidina trifosfato (CTP)heterotropicamente ativado pela adenosina trifosfato (ATP)

Mudanças conformacionais na ATCase

Enzimas Alostéricas e com Múltiplos Sítios Ativos

A presença do substrato em um dos sítios influencia:- a ligação do substrato aos demais sítios vazios - a taxa de formação de produto nos sítios ocupados

O próprio substrato atua como um modificadorou um efetor

Ativação (incluindo respostas sigmoidais de v verus [S]) ou Inibição

Sítios não-cooperativos

E + S KS ES K

P E + P + + S S

KS KS

E + P KP SE + S KS SES K

P SE + P

KP

ES + P

2S

2

S

2S

2

S

MAX

K]S[

K]S[21

K]S[

K]S[

Vv

++

+

=tPMAX ]E[K2V =

KS - constante de dissociação intrínseca

Constante de dissociação intrínseca

constante de um sítio isolado, ou seja, a constante cinética de um sítio desconsiderando sua associação com os demais sítios da mesma

molécula enzimática

descreve o equilíbrio entre o substrato livre, o sítio ativo livre e o complexo sítio-substrato

descreve o equilíbrio entre o substrato livre, enzima disponível e o complexo enzima-substrato

Constante de dissociação efetiva

Ligações cooperativas

Se a ligação de uma molécula de substrato induz a mudanças estruturais ou eletrônicas que resultam em

alterações nas afinidades dos sítios vazios

a curva de velocidade não seguirá mais o modelo cinético de Henri-Michaelis-Menten

Enzima Alostérica(curvas de velocidade sigmoidais)

Aumento das afinidades dos sítios vazios de ligação:

ligação cooperativa ou cooperatividade positiva com respeito a ligação do substrato, ou resposta homotrópica

positiva

Interações entre substrato e inibidor ou substrato e ativador:

respostas heterotróficas positivas (ativador) ou negativas (inibidor)

Resposta sigmoidal à variação do substrato

proporciona um maior controle da taxa de reação pelas variações na concentração de substrato

Modelos de Interação Seqüencial

assumem mudanças seqüenciais ou progressivas nas afinidades dos sítios vazios a serem ocupados

Modelos de Simetria Orquestrada

a enzima pré-existe como uma mistura em equilíbrio de oligômeros de alta afinidade e oligômeros de baixa afinidade

Distribuição das espécies enzimáticas

enzima com 4 sítios catalíticos idênticos e sem cooperatividade

enzima com 4 sítios catalíticos onde a ligação de cada molécula de substrato aumenta as constantes de ligação dos sítios vazios

isocitrato desidrogenase -NAD dependente (leveduras)

Equação de Hill

n

n

MAX ]S['K]S[

Vv

+=

n = número de sítios de ligação ao substrato por molécula de enzimaK’ = KS

n (an-1bn-2cn-3...z1) = constante envolvendo os fatores de interação (a, b, c, ... z) e a constante de ligação intrínseca

2n

1nMAX

)]S['K(]S[V'Kn

]S[ddv

+=

−

d2v / d[S]2 = 0 - ponto de inflexão

Modelo Genérico de Interação Seqüencial de Koshland-

Nemethy-FilmerE ES ou SE SES

+ S S + S S S

A2 BSA ou ABS B2S2

Modelos tetraédricos:

Modelos lineares:

Modelos quadráticos:

Modelo de Geometria Orquestrada

(Monod, Wyman e Changeux)

T representa a conformação de baixa afinidade em equilíbrio com R a forma da enzima de alta afinidade

Modelos Híbridos

primeira coluna -modelo de simetria orquestrada

quarta coluna -modelo de interação seqüencial