dissertaÇÃo de mestrado · 2017. 11. 4. · as for the quantification of total phenolic content...
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Universidade Federal do Rio Grande do Norte Centro de Tecnologia
Departamento de Engenharia Química Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
EXTRAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO
BIOATIVA DO EXTRATO DE ARRABIDAEA CHICA
Rogério Pitanga Santos
Orientadora: Profª. Drª. Elisa Maria Bittencourt Dutra de Sousa
Natal/RN
Junho/2015
Rogério Pitanga Santos
EXTRAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO
BIOATIVA DO EXTRATO DE ARRABIDAEA CHICA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós –
Graduação de Engenharia Química da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte,
como requisito para a obtenção do grau de
Mestre em Engenharia Química, sob a
orientação da Profª. Drª. Elisa Maria
Bittencourt Dutra de Sousa.
Natal/RN
Junho/2015
Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / CT / DEQ
Biblioteca Setorial “Professor Horácio Nícolás Sólimo”. Santos, Rogério Pitanga.
Extração, caracterização e avaliação bioativa do extrato de Arrabidaea chica / Rogério Pitanga Santos. - Natal, 2015. 89 f.: il.
Orientador: Elisa Maria Bittencourt Dutra de Sousa.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Tecnologia. Departamento de Engenharia Química. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química.
1. Bignoniaceae - Dissertação. 2. Antioxidantes - Dissertação. 3. Plantas medicinais – Dissertação. I. Sousa, Elisa Maria Bittencourt Dutra de. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título. RN/UF/BSEQ CDU 582.916.31(043.3)
Extração, caracterização e avaliação bioativa do extrato de Arrabidaea chica
ii Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
SANTOS, Rogério Pitanga – Extração, caracterização e avaliação bioativa do extrato de
Arrabidaea chica. Dissertação de mestrado. UFRN, Programa de Pós-Graduação em
Engenharia Química. Área de concentração: Engenharia Química. Linha de pesquisa:
Processos de separação. Natal/RN, Brasil.
Orientadora: Profª. Drª. Elisa Maria Bittencourt Dutra de Sousa (DEQ-UFRN).
RESUMO: A utilização de plantas com finalidades medicinais é milenar, sendo bastante
difundida sua aplicação em medicamentos. Apesar das plantas serem fontes promissoras para
a descoberta de novas moléculas de interesse farmacológico, estimativas revelam que apenas
17% delas foram estudadas quanto a sua possibilidade de uso na medicina. Assim, a
biodiversidade da flora brasileira representa um imenso potencial de utilização econômica
pela indústria farmacêutica. A planta Arrabidaea chica, popularmente conhecida como
“pariri”, é comum na região Amazônica, e a ela são atribuídas várias propriedades medicinais.
As folhas desta planta são ricas em antocianinas, que são compostos fenólicos com alto poder
antioxidante. Os compostos antioxidantes desempenham um papel vital na prevenção de
doenças neurológicas e cardiovasculares, câncer e diabetes, entre outras. Dentre as
antocianinas encontradas na Arrabidaea chica, destaca-se a Carajurina (6,7-dihidroxi-5,4’-
dimetoxi-flavilium), que é o principal pigmento encontrado nesta planta. O presente trabalho
teve como objetivo geral o estudo sobre a extração supercrítica e a extração convencional
(sólido-líquido) de folhas da Arrabidaea chica, avaliando-se o rendimento dos processos
extrativos, a atividade antioxidante e a quantificação de Carajurina contida nos extratos. As
extrações supercríticas utilizaram CO2 como solvente, adicionado de co-solvente (mistura
etanol/água), e foram conduzidas pelo método dinâmico em um extrator de leito fixo. Os
ensaios obedeceram a um planejamento fatorial fracionário 24-1, tendo como variáveis
resposta o rendimento do processo, o poder antioxidante e a concentração de Carajurina, e
como variáveis independentes a pressão, a temperatura, a concentração de co-solvente (v/v) e
a concentração de água no co-solvente (v/v). Os rendimentos (massa de extrato seco/massa de
matéria-prima utilizada) obtidos da extração supercrítica variaram de 15,1% a 32%, sendo que
o melhor resultado foi obtido a 250 bar e 40°C, com uso do co-solvente a 30% (v/v) e
concentração de água no co-solvente igual a 50% (v/v). Através de análise estatística,
verificou-se que a concentração de co-solvente apresentou efeito significativo sobre o
rendimento. Os resultados de rendimento em massa para as extrações convencionais foram de
8,1% (água) e 5,5% (etanol). Através de análises cromatográficas em CLAE (Cromatografia
Extração, caracterização e avaliação bioativa do extrato de Arrabidaea chica
iii Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
Líquida de Alta Eficiência), a Carajurina foi quantificada em todos os extratos obtidos e os
valores de concentração (massa de Carajurina/massa de extrato seco) variaram entre 1% e
2,21% para os extratos supercríticos. Quanto às extrações convencionais, não foi detectada
Carajurina no extrato aquoso, enquanto o extrato etanólico apresentou teor de Carajurina igual
a 7,04%, sendo, portanto, mais seletivo em Carajurina do que as extrações supercríticas. A
avaliação do poder antioxidante (método do sequestro do radical 2,2-difenil-1-picril-hidrazil-
DPPH) dos extratos supercríticos resultou em valores de EC50 (concentração efetiva que
neutraliza 50% dos radicais livres) compreendidos entre 38,34 e 86,13 μg/mL, enquanto que
as extrações convencionais resultaram em valores de EC50 de 167,34 (água) e 42,58 (etanol)
μg/mL. Já a quantificação dos compostos fenólicos (método espectrofotométrico de Folin-
Ciocalteau) dos extratos supercríticos resultou em valores compreendidos entre 48,93 e 88,62
mg EAG/g extrato (EAG = Equivalentes de Ácido Gálico), enquanto que as extrações sólido-
líquido resultaram em valores de 37,63 (água) e 80,54 (etanol) mg EAG/g extrato. A boa
atividade antioxidante pode ser atribuída não somente à presença de Carajurina, mas também
à existência de outros compostos fenólicos e antioxidantes na Arrabidaea chica. Através da
otimização do planejamento experimental, foi possível identificar o experimento que
apresentou o melhor resultado considerando as quatro variáveis resposta em conjunto. Este
experimento foi realizado nas seguintes condições: pressão de 200 bar, temperatura de 40°C,
concentração de co-solvente igual a 30% (v/v) e concentração de água no co-solvente igual a
30% (v/v). Conclui-se que, dentro da faixa estudada, é possível obter o resultado ótimo
utilizando condições operacionais mais amenas, o que implica em menores custos e maior
facilidade de operação.
PALAVRAS-CHAVE:
Arrabidaea chica. Extração supercrítica. Carajurina. Atividade antioxidante.
Extração, caracterização e avaliação bioativa do extrato de Arrabidaea chica
iv Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
Extração, caracterização e avaliação bioativa do extrato de Arrabidaea chica
v Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
ABSTRACT
The use of plants for medicinal purposes is ancient, with widespread application in medicinal
drugs. Although plants are promising sources for the discovery of new molecules of
pharmacological interest, estimates show that only 17% of them have been studied for their
possible use in medicine. Thus, biodiversity of Brazilian flora represents an immense
potential for economic use by the pharmaceutical industry. The plant Arrabidaea chica,
popularly known as “pariri”, is common in the Amazon region, and it is assigned several
medicinal properties. The leaves of this plant are rich in anthocyanins, which are phenolic
compounds with high antioxidant power. Antioxidant compounds play a vital role in the
prevention of neurological and cardiovascular diseases, cancer and diabetes, among others.
Within the anthocyanins found in Arrabidaea chica, stands out Carajurin (6,7-dihydroxy-5,4’-
dimethoxy-flavilium), which is the major pigment encountered in this plant. The present work
aimed to study on supercritical extraction and conventional extraction (solid-liquid extraction)
in leaves of Arrabidaea chica, evaluating the efficiency of the extractive processes,
antioxidant activity and quantification of Carajurin contained in the extracts. Supercritical
extraction used CO2 as solvent with addition of co-solvent (ethanol/water mixture) and were
conducted by the dynamic method in a fixed bed extractor. The trials followed a 24-1
fractional factorial design, the dependent variables were: process yield, concentration of
Carajurin and antioxidant activity; and independent variables were: pressure, temperature,
concentration of co-solvent (v/v) and concentration of water in the co-solvent mixture (v/v).
Yields (mass of dry extract/mass of raw material used) obtained from supercritical extraction
ranged from 15.1% to 32%, and the best result was obtained at 250 bar and 40 °C, co-solvent
concentration equal to 30% and concentration of water in the co-solvent mixture equal to
50%. Through statistical analysis, it was found that the concentration of co-solvent revealed
significant effect on the yield. Yields obtained from conventional extractions were of 8.1%
(water) and 5.5% (ethanol). Through HPLC (High-performance liquid chromatography)
analysis, Carajurin was quantified in all the extracts and concentration values (Carajurin
mass/mass of dry extract) ranged between 1% and 2.21% for supercritical extraction. For
conventional extraction, Carajurin was not detected in the aqueous extract, while the ethanol
extract showed Carajurin content of 7.04%, and therefore, more selective in Carajurin than the
supercritical extraction. Evaluation of antioxidant power (radical 2,2-diphenyl-1-picryl-
hydrazyl – DPPH – sequestration method) of the supercritical extracts resulted in EC50 values
(effective concentration which neutralizes 50% of free radicals) ranged from 38.34 to 86.13
Extração, caracterização e avaliação bioativa do extrato de Arrabidaea chica
vi Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
μg/mL, while conventional extraction resulted in EC50 values of 167.34 (water) and 42.58
(ethanol) μg/mL. As for the quantification of total phenolic content (Folin-Ciocalteau
analysis) of the supercritical extracts resulted in values ranged from 48.93 and 88.62 mg
GAE/g extract (GAE = Gallic Acid Equivalents), while solid-liquid extraction resulted in
values of 37.63 (water) and 80.54 (ethanol) mg GAE/g extract. The good antioxidant activity
cannot be attributed solely to the presence of Carajurin, but also the existence of other
compounds and antioxidants in Arrabidaea chica. By optimizing the experimental design, it
was possible to identify the experiment that presented the best result considering the four
dependent variables together. This experiment was performed under the following conditions:
pressure of 200 bar, temperature of 40 °C, co-solvent concentration equal to 30% and
concentration of water in the co-solvent mixture equal to 30%. It is concluded that, within the
studied range, it is possible to purchase the optimum result using milder operating conditions,
which implies lower costs and greater ease of operation.
Keyword:
Arrabidaea chica. Supercritical extraction. Carajurin. Antioxidant activity.
Extração, caracterização e avaliação bioativa do extrato de Arrabidaea chica
vii Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho a Jesus Cristo, meu
Senhor e Salvador.
À minha esposa Carolina e meu filho
Pedro, que são minha base e fortaleza em
todos os momentos.
Extração, caracterização e avaliação bioativa do extrato de Arrabidaea chica
viii Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
AGRADECIMENTOS
Primeiramente, desejo agradecer a Deus por tudo, por cada dia, cada palavra de ânimo,
cada consolo, cada vitória e cada luta. Por ter morrido por mim na cruz e me ofertado
gratuitamente a vida eterna.
À minha família: minha esposa Carolina e meu filho Pedro. Eles são a base de tudo, as
pessoas que me conhecem melhor que eu mesmo, que alegram os meus dias e que me apoiam
quando os dias não são bons.
Aos meus pais, Nilton e Telma, pelos valores sólidos que me foram ensinados, e por
todo o amor e carinho. Sou o que sou graças a eles. Aos meus irmãos, Rafael (in memmorian),
Talita, Rosane e Patrícia, por serem meus companheiros sempre.
À professora e orientadora Elisa Maria Bittencourt Dutra de Sousa, por seus
ensinamentos, paciência, perseverança, dedicação, entusiasmo e conselhos. Ela mais do que
ninguém sabe de todas as dificuldades deste trabalho de dissertação. Sem a sua orientação e
incentivo, seria impossível concluí-lo.
À Profa. Dra. Mary Ann Foglio, à química Ilza Maria de Oliveira Sousa e toda equipe
da divisão de Fitoquímica do Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e
Agrícolas (CPQBA) da Unicamp/SP, pela disponibilidade e apoio na preparação dos extratos
para análise cromatográfica.
A todos do Laboratório de Tecnologia Supercrítica e Biodiesel da UFRN: Anderson,
Nila, Ricardo, André, Ênio, Saulo, Gabriel, Paulo, Felippe, Izana, Isadora, Vitor e Aldo, por
toda a atenção, sugestões e conselhos, além das horas dedicadas à realização dos
experimentos, e por tornarem o laboratório um ótimo ambiente de trabalho.
Aos professores do PPGEQ que contribuíram de forma indireta e direta para a
realização deste trabalho.
Aos funcionários Mazinha e Medeiros por todo o apoio.
A todos os meus irmãos da Igreja do Nazareno de Parnamirim, que de certa forma são
minha segunda família. As orações deles foram essenciais.
Ao CNPq pelo apoio financeiro.
Extração, caracterização e avaliação bioativa do extrato de Arrabidaea chica
ix Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
Sumário 1. Introdução............................................................................................................................ 2
1.1. Considerações iniciais .................................................................................................. 2
1.2. Objetivos ...................................................................................................................... 4
1.2.1. Objetivo geral ....................................................................................................... 4
1.2.2. Objetivos específicos ............................................................................................ 4
2. Revisão Bibliográfica .......................................................................................................... 7
2.1. Arrabidaea chica ......................................................................................................... 7
2.2. Antioxidantes ............................................................................................................... 9
2.2.1. Compostos fenólicos .......................................................................................... 11
2.3. Métodos de extração .................................................................................................. 15
2.3.1. Extração sólido-líquido (extração com solvente) ............................................... 15
2.3.2. Extração supercrítica .......................................................................................... 17
2.4. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) ................................................... 20
2.5. Determinação da atividade antioxidante – Método do sequestro do radical 2,2-
difenil-1-picril-hidrazil (DPPH) ........................................................................................... 22
2.6. Determinação de fenólicos totais – Método espectrofotométrico de Folin-Ciocalteau
24
3. Materiais e métodos .......................................................................................................... 28
3.1. Preparação da amostra ............................................................................................... 28
3.2. Métodos de extração .................................................................................................. 29
3.2.1. Extração sólido-líquido ...................................................................................... 29
3.2.2. Extração supercrítica .......................................................................................... 31
3.3. Planejamento experimental ........................................................................................ 34
3.4. Análises Cromatográficas (CLAE ou HPLC) ............................................................ 34
3.5. Método do sequestro do radical 2,2-difenil-1-picril-hidrazil (DPPH) ....................... 36
3.6. Método espectrofotométrico de Folin-Ciocalteau ..................................................... 38
4. Resultados e discussões ..................................................................................................... 41
4.1. Caracterização da matéria-prima ............................................................................... 41
Extração, caracterização e avaliação bioativa do extrato de Arrabidaea chica
x Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
4.2. Planejamento experimental – Extração Supercrítica ................................................. 41
4.3. Rendimento da extração ............................................................................................. 43
4.3.1. Extrações supercríticas ....................................................................................... 43
4.3.2. Extrações sólido-líquido ..................................................................................... 49
4.4. Análise cromatográfica e quantificação da Carajurina .............................................. 50
4.4.1. Quantificação da Carajurina ............................................................................... 50
4.4.2. Análise estatística de concentração de Carajurina dos extratos supercríticos .... 51
4.4.3. Análise dos cromatogramas ................................................................................ 53
4.5. Determinação da atividade antioxidante – Método do sequestro do radical 2,2-
difenil-1-picril-hidrazil (DPPH) ........................................................................................... 54
4.6. Determinação do teor de Compostos Fenólicos Totais (CFT) – Método
espectrofotométrico de Folin-Ciocalteau ............................................................................. 57
4.7. Otimização do planejamento experimental ................................................................ 59
5. Conclusão .......................................................................................................................... 64
6. Referências ........................................................................................................................ 68
7. Apêndices .......................................................................................................................... 82
7.1. Apêndice A – Curva de calibração da Carajurina ...................................................... 82
7.2. Apêndice B – Diferenças de metodologia na extração supercrítica .......................... 83
7.3. Apêndice C – Cromatogramas ................................................................................... 84
7.4. Apêndice D – Tabela de cálculo do CE50 do Ácido Ascórbico ................................. 88
7.5. Apêndice E – Dados experimentais de absorbância utilizados na construção da curva
padrão de ácido gálico .......................................................................................................... 89
Extração, caracterização e avaliação bioativa do extrato de Arrabidaea chica
xi Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
Índice de figuras Figura 2.1 – Arrabidaea chica (“Pariri”). Fonte: Alves et al. (2010). ....................................... 7
Figura 2.2 – Estrutura química das principais antocianinas presentes na Arrabidaea chica.
Fonte: Paula et al. (2013). .......................................................................................................... 8
Figura 2.3 – Extrato da planta Arrabidaea chica. Fonte: autoria própria (2015). ...................... 9
Figura 2.4 – Mecanismo de ação dos antioxidantes. Fonte: Casagrande (2014)...................... 10
Figura 2.5 – Estrutura básica dos flavonóides. Fonte: Kalegari (2009). .................................. 12
Figura 2.6 – Estrutura geral das antocianinas. Fonte: Castañeda-Ovando et al. (2009). ......... 13
Figura 2.7 – Formas estruturais das antocianinas. Fonte: Malacrida & Motta (2006). ............ 14
Figura 2.8 – Cromatograma de extrato aquoso de Arrabidaea chica. Fonte: Devia et al.
(2002). ...................................................................................................................................... 22
Figura 2.9 – Estrutura molecular do radical DPPH (C18H12N5O6) PM 394,3. Fonte: Saito
(2007). ...................................................................................................................................... 22
Figura 2.10 – Reação química entre o BHT e o radical DPPH. Fonte: Tiveron (2010). .......... 23
Figura 2.11 – Reação de quantificação de compostos fenólicos totais por reagente de Folin-
Ciocalteau. Fonte: Cruz (2008). ............................................................................................... 25
Figura 3.1 – (a) Evaporador rotativo e (b) liofilizador utilizados nos experimentos. Fonte:
autoria própria (2015). .............................................................................................................. 31
Figura 3.2 – Ilustração do aparato de extração com CO2 pressurizado. Fonte: Galvão (2009).
.................................................................................................................................................. 31
Figura 3.3 – Etapas para realização da extração supercrítica. Fonte: autoria própria (2015). . 32
Figura 3.4 – Absorbância em função do comprimento de onda. Fonte: Santos (2013). .......... 38
Figura 4.1 – Matéria-prima após processo de redução do tamanho da partícula. Fonte: autoria
própria (2015). .......................................................................................................................... 41
Figura 4.2 – Diagrama de Pareto para os valores dos efeitos padronizados. ........................... 46
Figura 4.3 – Diagrama de Pareto para os valores de concentração de Carajurina. .................. 52
Figura 4.4 – Curva padrão de ácido ascórbico [AS(%) versus Conc. Ácido Ascórbico
(µg/mL)]. .................................................................................................................................. 55
Figura 4.5 – Curva padrão de ácido gálico [Absorbância versus Conc. Ácido Gálico (µg/mL)].
.................................................................................................................................................. 58
Figura 7.1 – Curva de calibração da Carajurina. ...................................................................... 82
Figura 7.2 – Comparativo entre metodologias de extração dos trabalhos de (a) Paula et al.
(2013), (b) Paula et al. (2014) e (c) do presente trabalho (R = resíduo; E = extrato) .............. 83
Extração, caracterização e avaliação bioativa do extrato de Arrabidaea chica
xii Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
Figura 7.3 – Cromatograma do extrato supercrítico 1. ............................................................. 84
Figura 7.4 – Cromatograma do extrato supercrítico 2. ............................................................. 84
Figura 7.5 – Cromatograma do extrato supercrítico 3. ............................................................. 84
Figura 7.6 – Cromatograma do extrato supercrítico 4. ............................................................. 85
Figura 7.7 – Cromatograma do extrato supercrítico 5. ............................................................. 85
Figura 7.8 – Cromatograma do extrato supercrítico 6. ............................................................. 85
Figura 7.9 – Cromatograma do extrato supercrítico 7. ............................................................. 86
Figura 7.10 – Cromatograma do extrato supercrítico 8. ........................................................... 86
Figura 7.11 – Cromatograma do extrato aquoso. ..................................................................... 86
Figura 7.12 – Cromatograma do extrato etanólico. .................................................................. 87
Extração, caracterização e avaliação bioativa do extrato de Arrabidaea chica
xiii Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
Índice de tabelas Tabela 2.1 – Poder antioxidante de extratos de plantas medicinais determinado a partir do
método do sequestro do radical DPPH ..................................................................................... 24
Tabela 2.2 – Teor de compostos fenólicos totais (CFT) de extratos de plantas medicinais ..... 26
Tabela 3.1 – Granulometria da matriz sólida a ser utilizada nos experimentos extrativos ...... 28
Tabela 3.2 – Níveis das variáveis do planejamento experimental ............................................ 34
Tabela 3.3 – Condições cromatográficas utilizadas para análise das antocianinas presentes na
Arrabidaea chica ...................................................................................................................... 35
Tabela 3.4 – Programa de gradiente da fase móvel para análises por HPLC-DAD ................. 36
Tabela 4.1 – Rendimento, quantificação da Carajurina e avaliação do potencial antioxidante
dos extratos de Arrabidaea chica obtidos através de extração supercrítica ............................. 44
Tabela 4.2 – Efeitos calculados no Statistica 7.0® para o planejamento experimental (variável
resposta: rendimento) ............................................................................................................... 45
Tabela 4.3 – Rendimentos, quantificação da Carajurina e avaliação do potencial antioxidante
dos extratos de Arrabidaea chica obtidos através de extração sólido-líquido ......................... 49
Tabela 4.4 – Efeitos calculados no Statistica 7.0® para o planejamento experimental (variável
resposta: concentração de Carajurina) ...................................................................................... 51
Tabela 4.5 – Quantidade de ácido ascórbico, de metanol PA e de solução de DPPH para a
montagem da curva do padrão .................................................................................................. 54
Tabela 4.6 – Concentração das soluções primárias .................................................................. 56
Tabela 4.7 – Quantidade de solução amostra, de metanol PA e de solução de DPPH para a
análise dos extratos ................................................................................................................... 56
Tabela 4.8 – Quantidade de reagentes e solventes utilizados para construção da curva de
calibração com ácido gálico ..................................................................................................... 58
Tabela 4.9 – Quantidade de reagentes e solventes utilizados para quantificação de compostos
fenólicos totais em extratos de Arrabidaea chica .................................................................... 59
Tabela 4.10 – Classificação dos resultados obtidos nas extrações supercríticas ...................... 60
Tabela 4.11 – Classificação dos experimentos supercríticos em função do rendimento, da
atividade antioxidante (AA) e dos teores de Carajurina e de compostos fenólicos totais (CFT)
.................................................................................................................................................. 61
Tabela 7.1 – Concentração de Carajurina utilizada para confecção de curva analítica............ 82
Tabela 7.2 – Cálculo do CE50 do ácido ascórbico .................................................................... 88
Tabela 7.3 – Dados experimentais da curva padrão de ácido gálico ........................................ 89
Extração, caracterização e avaliação bioativa do extrato de Arrabidaea chica
xiv Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
Nomenclatura/Abreviações
ABSAmostra – Valor da absorbância da amostra do extrato ou do ácido ascórbico após a reação
com o controle
ABSControle – Valor da absorbância da solução controle (solução contendo apenas DPPH e
metanol PA)
a.C. – antes de Cristo
AS (%) – Percentagem de atividade sequestradora
BHA – Butil-hidroxianisol
BHT - Butil-hidroxitolueno
CE50 – Concentração efetiva que neutraliza 50% dos radicais livres
CFT – Compostos Fenólicos Totais
CLAE – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
CO2 – Dióxido de Carbono
DNA – Ácido Desoxirribonucleico
DPPH – 2,2-difenil-1-picril-hidrazil
DP – Diâmetro médio de partícula (mm)
Dpi – diâmetro da partícula da fração i (mm)
EAG – Equivalentes de Ácido Gálico
EFS – Extração em Fase Sólida
ERO – Espécie Reativa de Oxigênio
EUA – Estados Unidos da América
g – Unidade de massa (grama)
HPLC – High-performance liquid chromatography (cromatografia líquida de alta eficiência)
HPLC-DAD – Cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodos
Humb. & Bonpl. – Alexander von Humboldt & Aimé Bonpland (cientistas)
H2O – Água
H3PO4 – Ácido Fosfórico
mAU – Área de pico
mesh – Unidade de medida de diâmetro de partícula
mg – Unidade de massa (miligrama)
mL – Unidade de volume (mililitro)
mm – Unidade de comprimento (milímetro)
Extração, caracterização e avaliação bioativa do extrato de Arrabidaea chica
xv Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
min – Unidade de tempo (Minutos)
Mi – Massa de amostra na fração i (g)
M – Massa total de amostra (g)
n – números de frações
ND – Não Detectado
nm – Unidade de comprimento (nanômetro)
P – Pressão (bar)
p – Valor de significância (análise estatística)
PA – Alto grau de pureza
Pc – Pressão crítica
PG – Propil galato
pH – Potencial hidrogeniônico
PVDF - Fluoreto Polivinilideno
rpm – Rotações Por Minuto
T – Temperatura (°C)
Tc – Temperatura crítica (°C)
UV – Ultra Violeta
xi – Corresponde à percentagem de amostra retida na fração i
°C – Unidade de temperatura (Grau Celsius)
µg – Unidade de massa (micrograma)
µL – Unidade de volume (microlitro)
µm – Unidade de comprimento (micrômetro)
% m/m – Porcentagem em massa
% v/v – Porcentagem em volume
λ – Comprimento de onda
Capítulo 1
Introdução
Introdução
2 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
1. Introdução
1.1. Considerações iniciais
A utilização de plantas com finalidades medicamentosas é milenar. Há relatos, por
exemplo, do uso de plantas para fins medicinais que datam de 3.000 a.C. (Alves et al., 2010).
Foi através da observação e da experimentação pelos povos primitivos que as propriedades
terapêuticas de determinadas plantas foram sendo descobertas e propagadas de geração em
geração, fazendo parte da cultura popular (Turolla & Nascimento, 2006).
A análise do índice de novos fármacos aprovados para uso terapêutico entre os anos
2000 e 2006 demonstrou que cerca de 50% destes são originários de produtos naturais
(Newman & Cragg, 2007). Estima-se que mais de 50% dos medicamentos prescritos nos
Estados Unidos devam conter princípios de origem natural, sendo que pelo menos 25%
contêm substâncias ativas isoladas de plantas, ou são formas modificadas dos compostos
químicos isolados (Balunas & Kinghorn, 2005). Fitoterápicos são responsáveis por 25% do
receituário médico nos países desenvolvidos e cerca de 80% nos países em desenvolvimento
(Simões et al., 2007).
São inúmeros os exemplos de medicamentos que foram desenvolvidos, direta ou
indiretamente, de fontes naturais, especialmente de plantas, e são aplicados na clínica,
incluindo entre outros a morfina (Papaver somniferum), a pilocarpina (Pilocarpus jaborandi),
os digitálicos (Digitalis purpurea), a quinina (Cinchona spp), a artemisina (Artemisia annua),
a atropina (Atropa belladonna) e a escopolamina (Datura stramonium); vários medicamentos
que são utilizados no tratamento do câncer, entre eles a vimblastina, vincristina (Catharanthus
roseus) e taxol (Taxus brevifolia); além de vários imunossupressores e antibióticos (Calixto,
2001).
Outro fator motivador para o estudo de plantas medicinais é o aumento da resistência de
microorganismos às drogas em uso, o que tem atraído a atenção da comunidade científica para
a pesquisa de drogas provenientes de fontes naturais (Pai, Acharya & Udupa, 2004).
Apesar das plantas serem fontes promissoras para a descoberta de novas moléculas de
interesse farmacológico, estimativas revelam que apenas 17% delas já foram estudadas quanto
a sua possibilidade de uso na medicina. Assim, a biodiversidade brasileira representa um
imenso potencial de utilização econômica pela indústria farmacêutica, justificando esforços
para sua conservação (Taffarelo, 2008).
Introdução
3 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
O Brasil é o país com maior biodiversidade do mundo, contando com mais de 55.000
espécies catalogadas de um total estimado entre 350.000 a 550.000 (Simões et al., 2007).
Entre estas espécies, encontra-se a Arrabidaea chica, popularmente conhecida como “pariri”,
comum na região Amazônica. A medicina tradicional atribui à espécie um amplo espectro de
propriedades, tais como antioxidantes, anti-inflamatórias, adstringentes e terapêuticas, além
de apresentar eficácia no tratamento do câncer (Tafarello, 2008).
As folhas da Arrabidaea chica são ricas em antocianinas (Jorge, 2008), que são
compostos fenólicos vastamente distribuídos na natureza e responsáveis pela coloração azul,
violeta e vermelha presente em algumas flores, frutos, folhas e raízes de plantas (Paula et al.,
2013). Dentre as antocianinas presentes nesta espécie, o principal composto é um pigmento
conhecido como Carajurina (Paula et al., 2014).
Uma das propriedades mais significativas das antocianinas é sua atividade antioxidante,
que desempenha um papel vital na prevenção de doenças neurológicas e cardiovasculares,
câncer e diabetes, entre outras (Castañeda-Ovando et al., 2009).
As antocianinas são pigmentos polares tradicionalmente extraídos através de métodos
convencionais, como extração sólido-líquido, utilizando solventes aquosos ou alcóolicos
levemente acidificados. Além disso, dióxido de carbono supercrítico pode ser usado em
conjunto com etanol e água para extrair compostos polares (Paula et al., 2013).
A extração supercrítica consiste na utilização de um fluido supercrítico como solvente
(geralmente dióxido de carbono), de modo a aproveitar as características especiais deste tipo
de fluido, que possui propriedades intermediárias entre as dos gases e dos líquidos. O fluido
supercrítico apresenta densidade semelhante aos líquidos, e, consequentemente, boa
propriedade de solubilização. Por outro lado, apresenta baixa viscosidade e alto valor de
difusividade, que são propriedades de um gás, o que favorece a penetração na matriz sólida
(Brunner, 1994).
A extração supercrítica utilizando co-solventes (solventes combinados com dióxido de
carbono supercrítico) tem sido empregada para aumentar a eficiência de extração e modificar
a seletividade do solvente. O uso de co-solventes pode alterar algumas características da
mistura CO2 + co-solvente, como polaridade e interações específicas com o soluto, formando
pontes de hidrogênio ou interagindo com os sítios ativos da matriz sólida (Dalmolin et al.,
2010).
É importante destacar que a extração supercrítica apresenta-se como uma alternativa
interessante para extração de produtos naturais, devido principalmente a dois fatores: i) a
possibilidade de utilização de temperaturas mais amenas quando comparadas àquelas
Introdução
4 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
utilizadas em técnicas de extração tradicionais, já que temperaturas elevadas podem ocasionar
a degradação de compostos termossensíveis presentes nas plantas; ii) o fato de que grande
parte dos solventes utilizados nas técnicas tradicionais é prejudicial à saúde e necessita ser
separada do extrato, ao contrário do que ocorre na extração supercrítica (Santos, 2013). O
primeiro fator é importante para a extração da Arrabidaea chica, já que as antocianinas
presentes nos extratos desta planta são substâncias termossensíveis.
Considerando o crescimento da utilização de substâncias de origem natural para
fabricação de fármacos, o estudo da extração dos compostos fenólicos, em especial as
antocianinas, presentes na Arrabidaea chica torna-se de grande valia para o meio científico.
1.2. Objetivos
1.2.1. Objetivo geral
Ampliação do conhecimento científico acerca da extração de compostos fenólicos de
plantas e dos processos de extração supercrítica e de extração sólido-líquido aplicados à
planta Arrabidaea chica, cujo extrato apresenta atividade antioxidante e aplicações na
indústria farmacêutica.
1.2.2. Objetivos específicos
• Obtenção do extrato de folhas de Arrabidaea chica através do processo de extração
supercrítica em diferentes condições operacionais;
• Avaliação preliminar da influência de parâmetros de processo (pressão,
temperatura, concentração de co-solvente na mistura com CO2 e concentração de
água no co-solvente) no rendimento, atividade antioxidante, teor de Carajurina e
teor de compostos fenólicos totais dos extratos obtidos através de extração
supercrítica;
• Obtenção do extrato de folhas de Arrabidaea chica através do processo de extração
sólido-líquido; determinação de rendimento, atividade antioxidante, teor de
Carajurina e teor de compostos fenólicos totais dos extratos; e comparação com
aqueles obtidos através de extração supercrítica.
O presente trabalho encontra-se dividido em sete capítulos. O capítulo 1 aborda as
considerações iniciais e apresenta os objetivos do trabalho. No capítulo 2 é apresentada a
revisão bibliográfica, incluindo tópicos sobre a planta Arrabidaea chica, substâncias
antioxidantes, o grupo das antocianinas e os métodos de extração e de análise utilizados neste
Introdução
5 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
trabalho. No capítulo 3 são descritas as metodologias aplicadas no preparo das amostras e nos
processos de extração e de análise dos extratos obtidos.
O capítulo 4 apresenta os resultados e discussões, incluindo rendimento dos processos
de extração, teor de Carajurina e atividade antioxidante dos extratos obtidos, e a correlação
destes resultados com o método de extração e as condições operacionais empregados. No
capítulo 5 são apresentadas as conclusões derivadas das discussões detalhadas no capítulo
anterior, destacando-se as melhores condições operacionais para obtenção de extratos de
interesse para uso na indústria farmacêutica e sugestões para trabalhos futuros.
Os capítulos 6 e 7 encerram o trabalho, trazendo, respectivamente, a bibliografia
consultada e os apêndices.
Capítulo 2
Revisão Bibliográfica
Revisão Bibliográfica
7 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
2. Revisão Bibliográfica
2.1. Arrabidaea chica
Arrabidaea chica (Humb. & Bonpl.) Verlot (Figura 2.1) é uma espécie da família
Bignoniaceae, nativa de quase todo o Brasil e muito comum na Floresta Amazônica. Esta
espécie recebe várias denominações nas diversas regiões brasileiras, tais como pariri
(denominação mais comum no Estado do Pará), crajiru, puca-panga, coapiranga, chica, cipó-
cruz, entre outras (Jorge, 2008).
Figura 2.1 – Arrabidaea chica (“Pariri”). Fonte: Alves et al. (2010).
A família Bignoniaceae encerra 120 gêneros com aproximadamente 800 espécies, que
são encontradas em sua maioria em regiões tropicais e subtropicais, com dois grandes centros
de distribuição geográfica, o Brasil e o continente africano. Observa-se que o Brasil é
provavelmente a região onde a família apresenta-se com o maior número de espécies,
ocorrendo desde a Amazônia até o Rio Grande do Sul, não possuindo um habitat único (Alves
et al., 2010).
O gênero Arrabidaea ocorre na América, desde o sul do México até o Brasil central.
Este gênero é fonte de antocianinas, flavonóides e taninos, entre outros (Devia et al., 2002;
Pauletti, Bolzani & Young, 2003; Zorn et al., 2001). As espécies pertencentes ao gênero têm
sido usadas na medicina tradicional como agente antioxidante, anti-inflamatório, adstringente,
antimicrobiano e antitumoral (Rocha et al., 2011).
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8 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
Quanto à espécie Arrabidaea chica, o primeiro estudo das folhas desta planta relata o
isolamento da 3-desoxiantocianidina conhecida como Carajurina (Chapman, Perkin &
Robinson, 1927). Posteriormente, Scogin (1980) e Harborne & Willians (1998) propuseram
que a ocorrência deste raro pigmento provavelmente era restrita à Arrabidaea chica. Estudos
posteriores resultaram no isolamento de taninos, flavonóides, antocianidinas e fito-esteróis
(Jorge, 2008).
No Brasil, Arrabidaea chica é usada em tatuagens pelos índios (Taffarelo, 2008). As
propriedades de coloração são devidas à presença de três pigmentos pertencentes ao grupo das
antocianinas (Figura 2.2):
a) 6,7,3’,4’-tetrahidroxi-5-metoxi-flavilium;
b) 6,7,4’-trihidroxi-5-metoxi-flavilium (Carajurona);
c) 6,7-dihidroxi-5,4’-dimetoxi-flavilium (Carajurina).
Figura 2.2 – Estrutura química das principais antocianinas presentes na Arrabidaea chica.
Fonte: Paula et al. (2013).
Várias propriedades são atribuídas à espécie Arrabidaea chica, tais como propriedades
adstringentes e terapêuticas. O chá de suas folhas é utilizado na medicina tradicional para
tratamento de enfermidades de pele, cólicas intestinais, diarreias, anemias, micoses,
corrimento vaginal, sífilis, conjuntivite e leucemia, entre outros usos. Extratos da planta
(Figura 2.3) mostraram atividade antimicrobiana, anti-inflamatória e antioxidante, além de
serem efetivos como agentes anticancerígenos (Alves et al., 2010; Jorge, 2008; Michel et al.,
2015; Paula et al., 2013; Taffarelo, 2008).
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9 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
Figura 2.3 – Extrato da planta Arrabidaea chica. Fonte: autoria própria (2015).
2.2. Antioxidantes
Os radicais livres são átomos ou moléculas capazes de possuir existência independente
contendo um ou mais elétrons não-pareados em seu orbital. São altamente instáveis, com
meia-vida curta e quimicamente muito reativos. O termo Espécie Reativa de Oxigênio (ERO)
é usado para identificar radicais e alguns não-radicais que se apresentam como agentes
oxidantes ou são facilmente convertidos em radicais (Gonçalves, 2008).
Esses radicais são encontrados em todos os sistemas biológicos, podendo ser gerados no
citoplasma, nas mitocôndrias ou na membrana celular. A geração de radicais livres constitui
uma ação contínua e fisiológica, cumprindo funções biológicas essenciais. São formados em
um cenário de reações de óxido-redução, provocando ou resultando essas reações, ou seja,
podem tanto ceder o elétron solitário e serem oxidados, ou podem receber outro elétron e
serem reduzidos. Em condições fisiológicas do metabolismo celular aeróbio, o oxigênio sofre
redução tetravalente, com aceitação de quatro elétrons, resultando na formação de H2O.
Durante esse processo são formados intermediários reativos, como os radicais superóxido
(O2•-), hidroperoxila (HO2•), hidroxila (OH•) e peróxido de hidrogênio (H2O2) (Nascimento,
2010).
As EROs podem ser geradas por fontes endógenas ou exógenas. Alguns processos
biológicos que ocorrem no organismo dão origem às EROs endógenas. Já as fontes exógenas
incluem tabaco, poluição do ar, anestésicos, pesticidas e radiações (Vedana, 2008). Os
sistemas biológicos controlam estes fatores oxidativos via diversos mecanismos antioxidantes
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10 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
que restringem a reatividade dos radicais livres. Muitos componentes da dieta podem
contribuir para estes sistemas de defesa antioxidantes (Baggio, 2006).
Se houver estímulo exagerado na produção das EROs, de modo a suplantar as defesas
naturais do organismo, elas podem induzir a oxidação de lipídios de membrana, proteínas,
enzimas, carboidratos e DNA, prejudicando o equilíbrio e gerando o estresse oxidativo
(Valkon et al., 2007). O dano causado a esses componentes celulares se acumula com o passar
dos anos e contribui para a degeneração de células e indução de doenças crônico-
degenerativas, especialmente associadas ao avanço da idade, tais como câncer, aterosclerose,
mal de Parkinson, mal de Alzheimer e catarata. As EROs encontram-se relacionadas a cerca
de 60 condições clínicas (Scalbert et al., 2005).
Os antioxidantes são substâncias que podem retardar ou inibir a oxidação de lipídios ou
de outras moléculas, evitando o início ou a propagação das reações em cadeia de oxidação
(Zácari, 2008). Eles fazem isso através da doação de um de seus elétrons. Os antioxidantes
são estáveis, por isso não se tornam radicais livres quando doam seus elétrons. Por esse
motivo, são substâncias capazes de estabilizar os radicais livres (Casagrande, 2014).
Do ponto de vista estrutural, os antioxidantes são compostos aromáticos que possuem
ao menos uma hidroxila (Casagrande, 2014). A atuação dos antioxidantes ocorre quando o
átomo de hidrogênio ativo do antioxidante é abstraído pelos radicais livres e radicais
peróxidos, sendo que este ato ocorre mais facilmente do que com os hidrogênios alílicos das
moléculas insaturadas. Deste ato, são formadas espécies inativas para reagir em cadeia e
também um radical inerte (A•) procedente do antioxidante, levando à estabilidade da reação
(Figura 2.4). O radical inerte é estabilizado por ressonância, logo não tem capacidade de
iniciar ou propagar as reações oxidativas. Desta forma, o mecanismo de ressonância que
possuem os antioxidantes (por possuírem um anel de benzeno) os impede de vir a se tornarem
radicais livres e assim potencializar a oxidação lipídica (Ramalho & Jorge, 2006).
Figura 2.4 – Mecanismo de ação dos antioxidantes. Fonte: Casagrande (2014).
Os antioxidantes podem ser endógenos (produzidos no corpo humano) ou exógenos
(obtidos da dieta). Dentre os exógenos, eles podem ser sintéticos, como o butil-hidroxianisol
(BHA), butil-hidroxitolueno (BHT) e o propil galato (PG); ou naturais, substâncias bioativas
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11 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
tais como organosulfurados, fenólicos e terpenos, que fazem parte da constituição de diversos
alimentos e plantas (Nascimento, 2010).
A utilização dos antioxidantes sintéticos teve início na década de 40. Porém, estudos
toxicológicos têm demonstrado que estas substâncias apresentam efeito nocivo ao organismo.
O BHT vem sendo relacionado ao desenvolvimento de doenças pulmonares (Afonso, 2006),
enquanto o BHA mostrou induzir hiperplasia gastrointestinal em roedores por um mecanismo
desconhecido (Ramalho & Jorge, 2006). Frente aos efeitos adversos, o uso de antioxidantes
sintéticos é limitado em muitos países. No Brasil, o Ministério da Saúde estabelece como
concentração máxima permitida 200 mg/kg de BHA, BHT e PG (Anvisa, 2015).
Tendo em vista os indícios de problemas que podem ser causados pelo consumo de
antioxidantes sintéticos, pesquisas têm sido desenvolvidas no sentido de encontrar
antioxidantes provenientes de fontes naturais (Nascimento, 2010). Dentre os antioxidantes
naturais, destacam-se a vitamina E, o ácido ascórbico e principalmente os compostos
fenólicos, que são os antioxidantes mais abundantes da dieta humana (Cerqueira, Medeiros &
Augusto, 2007).
Como antioxidantes naturais, os compostos fenólicos presentes nos vegetais têm
recebido grande importância nos últimos anos.
2.2.1. Compostos fenólicos
Os compostos fenólicos pertencem a um amplo e complexo grupo de fitoquímicos,
sendo produzidos pelo metabolismo secundário de vegetais e tem como estrutura básica um
anel aromático podendo ter uma ou mais hidroxilas. Os compostos fenólicos conforme a sua
estrutura pertencem a classes, e de acordo com o número e posição dos seus grupos hidroxilas
e de outros grupos substituintes que existem na molécula, são separados em subclasses (Melo
et al., 2009).
Os compostos fenólicos podem ser encontrados em plantas comestíveis ou não, os
mesmos podem ter múltiplos efeitos biológicos, incluindo a atividade antioxidante. Os
extratos de materiais vegetais ricos em compostos fenólicos possuem potencial de retardar a
degradação oxidativa dos lipídeos (Casagrande, 2014).
Os compostos fenólicos vegetais constituem um grupo quimicamente heterogêneo, com
aproximadamente 10.000 compostos, podendo ser classificados em flavonóides e não
flavonóides. Os não flavonóides compreendem o grupo dos ácidos benzoicos (C6 – C1),
tendo como derivados os ácidos salicílicos, vanílico, hidroxibenzóico, gentísico, siríngico,
gálico e protocatéquico. Compreende também o grupo dos não flavonóides, os ácidos
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12 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
cinâmicos, que são portadores de cadeia lateral insaturada (C6 – C3) e outros derivados
fenólicos como os estilbenos (resveratrol) (Flanzy, 2000).
2.2.1.1. Flavonóides
Os flavonóides constituem a maior classe de compostos fenólicos vegetais. O esqueleto
básico dos flavonóides contém 15 carbonos organizados em dois anéis aromáticos, conectados
por uma ponte de três carbonos (Figura 2.5) e incluem um grande número de substâncias
coloridas (Taiz & Zeiger, 2009). São fitoquímicos que beneficiam a saúde. Quase todos os
tecidos de plantas são capazes de sintetizar flavonóides, havendo pelo menos 2.000 de
ocorrência natural. Os flavonóides podem ser divididos em 14 subclasses, sendo os incluídos
na dieta humana divididos essencialmente em 6 grupos: flavanóis, flavonóis, flavonas,
flavanonas, isoflavonóides e antocianidinas (Hubinger, 2009).
Dentre os metabólitos de planta, os flavonóides são provavelmente os mais versáteis.
Eles têm sido considerados como responsáveis pela atividade anti-inflamatória, anti-
hepatotóxica e anti-hipertensiva de várias plantas (Oliveira et al., 2009).
Figura 2.5 – Estrutura básica dos flavonóides. Fonte: Kalegari (2009).
2.2.1.2. Antocianinas
As antocianinas (do grego anthos = flor e kianos = azul) são os pigmentos mais
importantes das plantas vasculares; eles são atóxicos e de fácil incorporação em meios
aquosos, o que os faz interessantes para uso como corantes hidrosolúveis. Estes pigmentos
são responsáveis pela coloração laranja, rosa, vermelha, violeta e azul das flores e frutos de
algumas plantas (Castañeda-Ovando et al., 2009).
Além da capacidade de utilização como corante, outra propriedade importante das
antocianinas é sua atividade antioxidante, que desempenha um papel vital na prevenção de
doenças neurológicas e cardiovasculares, câncer e diabetes, entre outras. Há vários trabalhos
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13 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
focados no efeito das antocianinas no tratamento do câncer, nutrição humana e atividade
biológica (Lule & Xia, 2005; Nichenametla et al., 2006; Stintzing & Carle, 2004).
As antocianidinas são a estrutura básica das antocianinas (Figura 2.6). As antocianidinas
(ou agliconas) consistem em um anel aromático [A] ligado a um anel heterocíclico [C] que
contém oxigênio, o qual é também ligado, por uma ligação carbono-carbono, a um terceiro
anel aromático [B]. Quando as antocianidinas são encontradas na sua forma glicosada (ligadas
a uma porção de açúcar), elas são conhecidas como antocianinas (Konczak & Zhang, 2004).
Figura 2.6 – Estrutura geral das antocianinas. Fonte: Castañeda-Ovando et al. (2009).
Há uma grande variedade de antocianinas na natureza. As principais diferenças entre
elas é o número de grupos hidroxilados, a natureza e a quantidade de açúcares ligados a sua
estrutura, e a posição destas ligações. Até 2008, havia registro de mais de 500 diferentes
antocianinas e 23 antocianidinas (Kong et al., 2003).
As antocianinas isoladas são extremamente instáveis e muito suscetíveis à degradação.
Sua estabilidade é afetada por diversos fatores como pH, temperatura, estrutura química,
concentração, luz e oxigênio. A estabilização química das antocianinas é o principal foco de
recentes estudos devido a sua abundância e aplicações em diversos ramos (Rein, 2005).
Antocianinas podem ser encontradas em diferentes formas químicas de acordo com o
pH da solução. Em pH igual a 1,0, o cátion flavilium é a espécie predominante e contribui
para cores vermelhas e roxas. Em pH entre 2,0 e 4,0, as formas quinoidais, azuis ou violetas,
predominam. Em pH entre 5,0 e 6,0, apenas duas espécies incolores podem ser observadas, a
pseudobase carbinol e a chalcona (Figura 2.7). Para valores de pH maiores que 7 (ou seja, pH
básico), as antocianinas são degradadas dependendo de seus grupos substituintes (Castañeda-
Ovando et al., 2009; Malacrida & Motta, 2006).
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14 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
Figura 2.7 – Formas estruturais das antocianinas. Fonte: Malacrida & Motta (2006).
As antocianinas desempenham importante papel nas interações de insetos com plantas
para a polinização e dispersão de sementes. Também apresentam um papel importante nas
interações ligadas à defesa contra insetos herbívoros (Jorge, 2008).
As antocianinas de frutas vermelhas, como framboesa, amora e morango, demonstraram
potencial no combate a Helicobater pylory, um patógeno nocivo que causa diversas doenças
gastrointestinais, incluindo úlcera duodenal e câncer gástrico (Zafra-Stone, Yasmin & Bagchi,
2007).
O suco de fruta de Aronia melanocarpa, rico em antioxidantes fenólicos, principalmente
antocianinas, demonstrou significante poder de redução de glicose sanguínea em ensaios com
ratos diabéticos (Valcheva-Kuzmanova, Kuzmanov & Tancheva, 2007). Vaccinium
angustifolium Ait. (Lowbush blueberry), também rica em antocianinas, também apresentou
poder antidiabético (Harris et al., 2007).
Estudos demonstram que o tratamento de adipócitos humanos (células que armazenam
gorduras) com antocianina pode controlar a expressão do gene de adipocitocina, melhorando
as funções relacionadas à obesidade e diabetes (Tsuda, Ueno & Yoshikawa, 2006).
As antocianinas apresentam atividade antioxidante. Vários estudos sugerem que a
quantidade de antocianinas em frutas e vegetais contribui para seu efeito protetor contra
doenças degenerativas e crônicas. Vários trabalhos reportam que alguns extratos de plantas e
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15 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
frutos com alto teor de compostos fenólicos apresentam ação como inibidores de mutagênese
e carcinogênese (Hirsch, 2011).
As antocianinas têm mostrado uma atividade antioxidante maior que vitaminas C e E
(Bagchi et al., 1998). Estes compostos são capazes de capturar radicais livres pela doação de
átomos de hidrogênio fenólicos; esta é a razão para sua atividade anticarcinogênica. Foi
também reportada uma correlação linear entre os valores de capacidade antioxidante e a
concentração de antocianinas em amoras, framboesas vermelhas e pretas, e morangos
(Castañeda-Ovando et al., 2009).
Dentre os métodos de separação utilizados para obtenção de antocianinas, o mais
comum é a extração com solvente. Antocianinas são pigmentos polares, logo os solventes
mais utilizados nas extrações são misturas aquosas de etanol, metanol ou acetona. Estas
metodologias implicam na co-extração de substâncias não-fenólicas, tais como açúcares,
ácidos orgânicos e proteínas, requerendo processos de purificação subsequentes, como
extração em fase sólida – EFS (Kahkonen, Hopia & Heinonen, 2001).
Entre os métodos mais comuns, estão aqueles em que etanol ou metanol acidificados
são utilizados como agentes extratores, sendo o uso da acidificação realizado para evitar
degradação, que ocorre em pH básico, conforme explicado anteriormente. A extração com
metanol é mais eficiente, porém na indústria alimentícia, etanol é mais utilizado devido à
toxicidade do metanol. De acordo com o reportado na literatura, pode ser observado que para
extração de maior quantidade de antocianinas, é necessária a utilização de ácidos fracos para
extração, como ácido acético ou fórmico (Castañeda-Ovando et al., 2009).
Adicionalmente, dióxido de carbono pode ser utilizado em combinação com etanol ou
água para extração de compostos polares. A extração supercrítica usando co-solventes
(solventes orgânicos combinados com dióxido de carbono supercrítico) tem sido utilizada
para aumentar a eficiência de extração e modificar a seletividade do solvente. O uso de co-
solventes pode alterar algumas características da mistura CO2+co-solvente, como polaridade e
interações específicas com o soluto, formando pontes de hidrogênio ou interagindo com os
sítios ativos da matriz sólida (Paula et al., 2013).
2.3. Métodos de extração
2.3.1. Extração sólido-líquido (extração com solvente)
A extração sólido-líquido é a técnica mais comum para obtenção de antocianinas a
partir de plantas (Castañeda-Ovando et al., 2009). É uma técnica tradicional, que consiste na
imersão da planta em solvente adequado durante certo período de tempo, com agitação e
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16 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
temperatura controladas. A separação realiza-se quimicamente, sendo o solvente
posteriormente removido por evaporação (Galvão, 2004).
A maior dificuldade na extração sólido-líquido consiste no fato de ser praticamente
impossível remover, sem um grande dispêndio de energia e custos, todo o solvente residual,
podendo este causar alterações químicas nas moléculas e provocar efeitos tóxicos nos
consumidores (Melecchi, 2005).
O uso do método de extração com solvente depende de alguns parâmetros, como a
distribuição e proporção do constituinte solúvel no sólido, e a natureza dos sólidos. Alguns
fatores exercem influência na velocidade de extração, como o tamanho das partículas sólidas,
a seletividade do solvente e a viscosidade. A agitação do solvente favorece o contato
sólido/solvente, e a solubilidade do soluto no solvente é aumentada em temperaturas mais
elevadas (Treybal, 1981).
Zorn et al. (2001) realizaram extração sólido-líquido de folhas de Arrabidaea chica
utilizando éter etílico, obtendo rendimento de aproximadamente 3%. O resíduo desta extração
foi extraído com metanol, e este extrato apresentou atividade anti-inflamatória. Estas
extrações foram o primeiro passo para o isolamento de antocianinas que foi realizado neste
trabalho.
Souza (2007), por sua vez, realizou a extração com uma mistura etanol-água (8:2) com
rendimento de aproximadamente 38%, visando analisar as ações deste extrato sobre o
metabolismo hepático.
Etanol foi o solvente utilizado por Barbosa et al. (2008) para obtenção de extrato de
Arrabidaea chica com rendimento aproximado de 3%, com o objetivo de avaliar propriedades
antifúngicas deste extrato.
Jorge (2008) utilizou metanol acidificado como solvente para realizar a operação de
maceração em folhas de Arrabidaea chica. Neste trabalho, o objetivo foi a avaliação da
atividade cicatrizante do extrato.
Para avaliação do potencial antimicrobiano da Arrabidaea chica, Hofling et al. (2010)
utilizaram extração com diclorometano, seguida por extração do resíduo com metanol.
Paula et al. (2013) utilizaram solventes acidificados (etanol, água e mistura etanol/água
– 70:30, v:v) para obtenção de extrato de folhas de Arrabidaea chica. Os rendimentos obtidos
foram, respectivamente, 3%, 17,5% e 29%.
Segundo Castañeda-Ovando et al. (2009), para obtenção de antocianinas, o mais comum
é utilizar metanol ou etanol acidificados como agentes extratores.
Revisão Bibliográfica
17 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
2.3.2. Extração supercrítica
Gases comprimidos têm sido utilizados como solvente em diversos processos de
extração, devido ao fato das propriedades físico-químicas destes fluidos serem intermediárias
entre as dos gases e dos líquidos (Brunner, 1994). Em condições adequadas de pressão e
temperatura, os gases comprimidos têm densidade semelhante aos líquidos, logo, boas
propriedades de solubilização. Porém, a seletividade destes gases pode ser variada
significativamente pela alteração da pressão ou temperatura, o que não ocorre no caso de
solventes líquidos. Por outro lado, o fato de apresentarem baixa viscosidade e altos valores de
difusividade, que são propriedades de um gás, favorece o aumento do poder de penetração na
matriz sólida. Estas propriedades são responsáveis pelas altas taxas de transferência de massa
observadas quando gases comprimidos são usados como solventes (Galvão, 2004). Uma
importante característica desses gases é o fato de que pequenas alterações na pressão ou
temperatura provocam grandes alterações na densidade da substância.
Um fluido é dito supercrítico quando se encontra a uma temperatura e pressão acima de
sua temperatura e pressão críticas. No caso do dióxido de carbono, sua temperatura e pressão
críticas são 31,1 ºC e 73,8 bar, respectivamente (Smith, Van Ness & Abbott, 2007).
O uso de fluidos supercríticos era bastante limitado até o início dos anos 80, devido às
dificuldades de operação relacionadas às condições operacionais (altas temperaturas e
pressões). Porém, a partir de então, os processos extrativos envolvendo este tipo de fluido têm
crescido, especialmente na extração de óleos essenciais, descafeinização do café, extração de
compostos de plantas medicinais e na remoção de nicotina do tabaco, entre outras aplicações
(Santos, 2013).
Em uma extração supercrítica (ESC), utiliza-se um fluido supercrítico como solvente,
sendo o dióxido de carbono um dos mais utilizados (Oliveira, 2010). Isto porque este fluido é
considerado um “solvente verde”, é um solvente não tóxico e seguro (GRAS = Generally
recognized as safe), não inflamável e de baixo custo. Além disso, o dióxido de carbono
supercrítico apresenta alta compressibilidade, densidade semelhante aos líquidos, alta
difusividade, baixa viscosidade e tensão superficial, propriedades que favorecem a penetração
e transporte do fluido na matriz vegetal (Paula, 2013).
Sendo apolar, o dióxido de carbono supercrítico dissolve preferencialmente compostos
apolares e de baixa polaridade. O aumento da pressão torna este fluido menos apolar, e com
isso, consegue extrair substâncias mais polares. No entanto, substâncias de alta polaridade
também podem ser extraídas com o emprego de co-solventes, tais como etanol e água, já que
as propriedades de solvatação dos fluidos supercrítico podem ser modificadas facilmente pela
Revisão Bibliográfica
18 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
adição de pequenas quantidades dessas substâncias (Vasapollo et al., 2004). A adição de co-
solvente será vantajosa no processo de separação se a seletividade puder ser melhorada devido
a interações específicas entre o co-solvente e componentes específicos de uma mistura
(Temelli, 2008).
Entre as vantagens do uso da extração supercrítica, é possível citar (Galvão, 2004):
• Possibilidade de utilização de baixas temperaturas, o que é vantajoso na obtenção
de extratos de plantas, que muitas vezes contém compostos termossensíveis;
• O processo ocorre na ausência de luz e ar, o que pode reduzir a incidência de
degradação nas extrações, como por exemplo, reações de oxidação de elementos
fotossensíveis;
• O dióxido de carbono é um solvente inerte, logo não há possibilidade de ocorrerem
reações químicas entre ele e as substâncias extraídas;
• A facilidade da remoção do solvente, já que o dióxido de carbono pode ser
removido por completo apenas por redução da pressão ou ajuste da temperatura.
Entre as desvantagens do uso deste método de extração, em especial quando o solvente
é o dióxido de carbono, é possível citar (Galvão, 2009):
• Elevado custo inicial, devido às condições operacionais utilizadas, especialmente as
altas pressões;
• A necessidade de estudo relacionado ao destino a ser dado ao solvente, já que a
liberação de dióxido de carbono na atmosfera acarreta em aumento do efeito estufa
(esse estudo se justifica no caso do CO2 não ser reaproveitado no processo);
• O dióxido de carbono é apolar, portanto deficiente na extração de compostos
polares;
• A adição de co-solventes altera a polaridade do dióxido de carbono, porém neste
caso faz-se necessário um processo de separação do solvente, semelhante ao
realizado na extração sólido-líquido.
Existem vários trabalhos na literatura que utilizaram extração supercrítica em matrizes
sólidas vegetais (raízes, folhas, caules, etc.).
Uquiche, Del Valle & Ortiz (2004) empregaram extração supercrítica com CO2 em
pimentões vermelhos (Capsicum annuum L.), com o objetivo de avaliar e modelar o efeito do
tamanho da partícula, vazão de solvente e pressão no rendimento e taxa de extração. Já Wu et
al. (2006) utilizaram extração com CO2 supercrítico na planta Physalis peruviana, com vistas
a obter extratos com atividade antioxidante e anti-inflamatória.
Revisão Bibliográfica
19 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
Benová et al. (2010) aplicaram extração supercrítica com CO2 e co-solvente (metanol,
etanol e acetonitrila) em raízes da Japanese knotweed para comparação dos resultados obtidos
com a técnica de extração Soxhlet. Eles também avaliaram a influência de variáveis de
processo (tipo de co-solvente, pressão, temperatura e tempo de extração) no rendimento de
extração e na quantidade de compostos de interesse no extrato.
Vários trabalhos utilizaram a técnica de extração em duas etapas. Neste tipo de
extração, geralmente o CO2 supercrítico extrai inicialmente os compostos apolares e de baixa
polaridade, e em seguida é realizada uma extração etanólica ou aquosa, que poderá resultar
em extratos mais concentrados em compostos polares de interesse (Paula, 2013).
Seabra et al. (2010) utilizaram essa metodologia, sendo a primeira etapa com CO2
supercrítico, seguida de extração com uma mistura de CO2/etanol/água em diferentes
proporções, com o objetivo de obter extratos do bagaço de sabugueiro ricos em antocianinas e
com alta atividade antioxidante.
Serra et al. (2010) utilizaram metodologia semelhante para obtenção de extrato da
cereja, sendo que a segunda etapa da extração foi realizada com mistura CO2/etanol em
diferentes proporções, com vistas à obtenção de extratos com alto poder antioxidante e
anticancerígeno.
Martinez-Correa et al. (2011) também aplicaram extração em duas etapas, sendo a
primeira com CO2 supercrítico e a segunda com etanol à pressão atmosférica (extração
convencional), para extração de compostos fenólicos da Eugenia uniflora L.
Já Garcia-Mendoza et al. (2015) utilizaram etanol pressurizado na segunda etapa (sendo
a primeira com CO2 supercrítico) para obtenção de extrato da casca de manga (Mangifera
indica L.) e avaliação da atividade antioxidante dos extratos obtidos.
Considerando mais de duas etapas, Garmus et al. (2015) utilizaram três etapas, sendo a
primeira com CO2 supercrítico e a segunda e terceira etapas com etanol e água pressurizados,
respectivamente. Este tipo de extração foi utilizado para obtenção de compostos fenólicos da
planta Lippia sidoides Cham., que apresentam atividade antioxidante. Já Bitencourt et al.
(2014) chegaram a utilizar quatro etapas na extração da planta Melia azedarach L. para
obtenção de extratos com propriedades antivirais. As etapas foram realizadas nas mesmas
condições, sendo utilizados os seguintes solventes: CO2 supercrítico, mistura CO2 e etanol,
etanol puro (pressurizado) e solução hidroalcoólica (também pressurizada).
Quanto à Arrabidaea chica, os únicos trabalhos encontrados na literatura foram os de
Paula et al. (2013) e Paula et al. (2014), que utilizaram extração supercrítica com CO2 e co-
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20 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
solvente (mistura etanol/água em diferentes proporções) em várias etapas para obterem
extratos ricos em compostos fenólicos.
Em 2013, Paula et al. realizaram extrações supercríticas da Arrabidaea chica em três
etapas: na primeira etapa foi utilizado CO2 supercrítico puro (40°C/300 bar); na segunda
etapa, o resíduo da primeira etapa foi submetido à extração com CO2 supercrítico e co-
solvente, sendo o co-solvente uma mistura de etanol e água em três diferentes proporções
(40°C/300 bar; CO2/etanol/água nas proporções: 80/20/0, 80/14/6 e 80/10/10); na terceira
etapa, o resíduo da segunda etapa foi submetido à extração convencional com água
(40°C/pressão atmosférica). Um dos objetivos desse trabalho foi a avaliação da influência do
co-solvente (tipo e concentração) no processo extrativo.
No ano seguinte, Paula et al. (2014) realizaram as extrações em três etapas: na primeira
etapa foi utilizado CO2 supercrítico puro (40/50°C; 300/400 bar), onde sua temperatura e
pressão críticas são 31,1°C e 73,8 bar, respectivamente (Smith, Van Ness & Abbott, 2007);
condições operacionais: 40/50°C e 300/400 bar); na segunda, etanol pressurizado (40/50°C e
300/400 bar), onde o ponto crítico se encontra na temperatura de 240,8°C e pressão de 61,5
bar (Smith, Van Ness & Abbott, 2007); e na terceira, extração convencional com água
(40/50°C e pressão atmosférica), onde sua temperatura e pressão críticas são 374°C e 220,5
bar, respectivamente (Smith, Van Ness & Abbott, 2007). Um dos objetivos desse trabalho foi
a avaliação da influência da temperatura e pressão no processo extrativo.
2.4. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
Cromatografia é um método de separação de componentes de uma mistura em que a
separação depende da distribuição das diferentes moléculas entre duas fases: uma fase
estacionária e uma fase móvel. Os métodos cromatográficos classificam-se de acordo com a
natureza da fase estacionária e fase móvel, os seus estados físicos e os mecanismos de
separação (Gomes, 2010). A grande variedade de combinações entre fases móveis e
estacionárias a torna uma técnica extremamente versátil e de grande aplicação (Collins, Braga
& Bonato, 1993).
Em todas as separações cromatográficas, a amostra é transportada por uma fase móvel,
que pode ser um gás, um líquido ou um fluido supercrítico. Essa fase móvel é então forçada
através de uma fase estacionária imiscível fixa, colocada na coluna ou numa superfície sólida.
As duas fases são escolhidas de modo que os componentes da amostra se distribuam entre as
fases móvel e estacionária em vários graus (Silva, 2012). Os componentes que são mais
fortemente retidos na fase estacionária movem-se muito lentamente no fluxo da fase móvel.
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21 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
Ao contrário, os componentes que se ligam mais fracamente à fase estacionária movem-se
mais rapidamente. Como consequência dessa diferença na mobilidade, os componentes da
amostra separam-se em bandas ou zonas discretas que podem ser analisadas qualitativa e/ou
quantitativamente (Skoog, Holler & Nieman, 2002).
Em cromatografia líquida, a fase móvel é um líquido que escoa ao longo da fase
estacionária numa direção definida. O processo de escoamento dos compostos, que são
arrastados pela fase móvel ao longo da coluna até à saída, designa-se por eluição. O detector
registra o resultado na forma de um cromatograma, que é a resposta do detector na forma de
gráfico, representando a concentração de analito no efluente (também pode ser qualquer outra
medida de quantidade) em função do tempo ou do volume de eluição (Gomes, 2010).
A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE ou HPLC - High Performance Liquid
Chromatography) iniciou-se na década dos anos 60. É uma extensão da cromatografia líquida
clássica e está caracterizada pelo uso de colunas em aço inox mais estreitas, com diâmetro
interno de 2-5 mm, empacotadas com partículas de tamanho muito pequeno, 3-10 μm, que
constituem a fase estacionária. A fase móvel circula sob alta pressão ao longo da coluna com
fluxo controlado. A alta pressão permite análises mais rápidas e o uso de fases estacionárias
constituídas por micro partículas permite uma elevada eficiência na separação (Gomes, 2010).
A HPLC é a mais usada de todas as técnicas analíticas de separação. As razões para a
popularidade do método são a sua sensibilidade, a fácil adaptação para determinações
quantitativas, a sua adequação à separação de espécies não voláteis ou termicamente frágeis e,
acima de tudo, a sua ampla aplicabilidade a substâncias de grande interesse para a indústria e
ciência (Silva, 2012).
Entre as desvantagens deste método, encontra-se o fato do equipamento e a sua
manutenção ser dispendiosa, de ser um sistema complexo, apresentar baixa sensibilidade
perante alguns compostos e ser dependente da experiência do operador (Sequeira, 2012).
Vários trabalhos na literatura reportam o uso de HPLC para análise de extratos de
Arrabidaea chica. Devia et al. (2002) obtiveram extratos de folhas de Arrabidaea chica
através da técnica de maceração, utilizando solução aquosa, e os extratos foram analisados por
HPLC. No cromatograma (Figura 2.8) pode ser observada a presença de alguns compostos:
6,7,3’,4’-tetrahidroxi-5-metoxi-flavilium (pico 1); 6,7,4’-trihidroxi-5-metoxi-flavilium –
Carajurona (pico 2); e 6,7-dihidroxi-5,4’-dimetoxi-flavilium – Carajurina (pico 3).
Jorge (2008) e Paula et al. (2013 e 2014) também utilizaram HPLC para análise de
extratos da planta, sendo possível a identificação e quantificação de antocianinas extraídas,
incluindo a Carajurina e Carajurona.
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22 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
Figura 2.8 – Cromatograma de extrato aquoso de Arrabidaea chica. Fonte: Devia et al.
(2002).
2.5. Determinação da atividade antioxidante – Método do sequestro do
radical 2,2-difenil-1-picril-hidrazil (DPPH)
O DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazil - Figura 2.9) é um radical orgânico livre e estável,
que em solução metanólica ou etanólica, produz uma coloração violeta. Este radical aceita um
elétron ou radical hidrogênio para se tornar uma molécula estável, ou seja, é reduzido na
presença de uma molécula antioxidante, conforme pode ser observado na Figura 2.10, onde é
ilustrada a reação do radical DPPH com o antioxidante sintético BHT (Casagrande, 2014).
Figura 2.9 – Estrutura molecular do radical DPPH (C18H12N5O6) PM 394,3.
Fonte: Saito (2007).
O método do sequestro do radical DPPH foi sugerido primeiramente em meados da
década de 50, originalmente para descobrir doadores de hidrogênio em produtos naturais, e
Revisão Bibliográfica
23 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
mais tarde para determinar o potencial antioxidante em fenólicos individuais e alimentos
(Roginski & Lissi, 2005). Atualmente é um dos métodos mais utilizados para verificação de
atividade antioxidante, por tratar-se de um método fácil e rápido (Kalegari, 2009).
A medida da capacidade sequestrante a ser determinada pelo método DPPH baseia-se
no princípio de que o DPPH, sendo um radical estável de coloração violeta, é reduzido na
presença de um antioxidante e adquire coloração amarela. Na forma de radical, o DPPH
possui uma absorção característica a 515-517 nm, que desaparece à medida que ele vai sendo
reduzido pelo hidrogênio doado por um composto antioxidante (Tiveron, 2010). O grau desta
descoloração, que é monitorada espectrofotometricamente, indica a habilidade do antioxidante
em sequestrar o radical livre (Nascimento, 2010).
Figura 2.10 – Reação química entre o BHT e o radical DPPH. Fonte: Tiveron (2010).
O decaimento e a absorbância encontrados pela quantidade remanescente do radical
DPPH variam significativamente com os diferentes tipos e concentrações de antioxidantes.
Atualmente, utiliza-se a técnica do EC50, que foi proposta para determinar a eficiência
antirradical por meio da quantidade de antioxidante necessária para cair em 50% a
concentração inicial do radical DPPH e o tempo necessário para alcançar a estabilidade na
concentração do mesmo. Esta metodologia é limitada pelo fato dos radicais DPPH interagirem
com outros radicais (alquil), e a curva de resposta em tempo para atingir o estado estacionário
não ser linear, com diferentes relações de antioxidante/DPPH (Tiveron, 2010).
A utilização do método do DPPH para determinação de atividade antioxidante de
extrato de Arrabidaea chica foi relatada no trabalho de Jorge (2008), onde foi identificada
moderada atividade antioxidante (EC50 = 15,98 ± 0,78 µg/mL) de extrato obtido através de
maceração com metanol acidificado.
Esta metodologia também foi utilizada em vários outros trabalhos para avaliação de
poder antioxidante de diversas plantas, um resumo pode ser observado na Tabela 2.1.
Revisão Bibliográfica
24 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
Tabela 2.1 – Poder antioxidante de extratos de plantas medicinais determinado a partir do
método do sequestro do radical DPPH
Referência bibliográfica
Planta EC50 (μg/mL)
Saito (2007)
Chá-verde brasileiro (Camellia sinensis var.
assamica) ~ 8
Kalegari (2009)
Rourea induta Planch 3,2 – 199,9
Seabra et al. (2010)
Bagaço de sabugueiro (Sambucus nigra L.)
21 - 262
Martinez-Correa et al. (2011)
Pitanga (Eugenia uniflora L.)
5,2 – 200
Martinez-Correa et al. (2012)
Alecrim do campo (Baccharis
dracunculifolia) 35 – 200
Martins (2012)
Pau-santo (Kielmeyera coriacea
Mart. & Zucc) 4,3 - 133
Santos (2013)
“Azedinha” (Rumex acetosa)
6,05 – 18,43
Garmus et al. (2015)
“Alecrim-pimenta” (Lippia sidoides Cham.)
17 - 200
2.6. Determinação de fenólicos totais – Método espectrofotométrico de
Folin-Ciocalteau
A determinação do teor de compostos fenólicos totais (CFT) é muito importante, pois
vários estudos têm demonstrado que eles são os principais responsáveis pela atividade
antioxidante dos vegetais (Tiveron, 2010). A quantificação destes compostos pode ser
realizada por meio de uma variedade de métodos, como métodos eletroquímicos,
cromatográficos (cromatografia gasosa e CLAE) e espectrofotométricos (método de Folin-
Denis, teste da vanilina, etc.) (Angelo & Jorge, 2007). Todavia, o que utiliza o reagente de
Folin-Ciocalteau é o mais extensivamente utilizado. Este método tem sido amplamente
Revisão Bibliográfica
25 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
utilizado em pesquisa de produtos naturais antioxidantes porque é simples, sensível e preciso
(Rezende, 2010).
Esta metodologia foi desenvolvida em 1927 por Otto Folin e Vintila Ciocalteau para
medição de tirosina, sendo adaptada em 1965 por Vernon Singleton e Joseph Rossi para
avaliação de compostos fenólicos totais em vinho (Santos, 2013).
A quantificação dos compostos fenólicos totais por este método se baseia na redução
dos ácidos fosfotungstico (H3PW12O40) e fosfomolíbdico (H3PMo12O40), presentes no
reagente de Folin-Ciocalteau, pelos compostos fenólicos presentes na amostra, a óxido de
tungstênio (W3O23) e óxido de molibdênio (Mo3O23) em meio alcalino (Figura 2.11). Estes
óxidos formados apresentam coloração azulada, sendo possível a quantificação da
absorbância da solução na região do visível (760 nm) (Cruz, 2008).
Figura 2.11 – Reação de quantificação de compostos fenólicos totais por reagente de Folin-
Ciocalteau. Fonte: Cruz (2008).
O tempo médio para este teste é de 2 horas. Uma solução contendo ácido gálico é
preparada em diversas concentrações e colocada para reagir com o reagente Folin-Ciocalteau,
sendo então lida a absorbância. Desta forma, é estabelecido um padrão de referência para a
análise de amostras nas quais a quantidade de fenóis é desconhecida (Haminiuk et al., 2012).
Geralmente os resultados das análises são expressos em mg EAG/ g de extrato (miligrama de
equivalente em ácido gálico por grama de extrato seco).
A utilização do método de Folin-Ciocalteau para quantificação de compostos fenólicos
totais de extratos de Arrabidaea chica foi relatada nos trabalhos de Jorge (2008), Paula et al.
(2013) e Paula et al. (2014). Jorge (2008) obteve teor de compostos fenólicos igual a 67,69
mg EAG/g extrato obtido através de maceração com metanol acidificado. Já Paula et al., nos
trabalhos de 2013 e 2014, realizou extrações sólido-líquido e extrações supercríticas em
diferentes condições operacionais, e obteve teores de compostos fenólicos entre 13,1 e 178
mg EAG/g extrato.
Esta metodologia também foi utilizada em vários outros trabalhos para quantificação de
compostos fenólicos totais de diversas plantas, um resumo pode ser observado na Tabela 2.2.
Revisão Bibliográfica
26 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
Tabela 2.2 – Teor de compostos fenólicos totais (CFT) de extratos de plantas medicinais
Referência bibliográfica
Planta CFT
(mg EAG/g extrato)
Wu et al. (2006)
Physalis peruviana 14,53 – 90,80
Martinez-Correa et al. (2011)
Pitanga (Eugenia uniflora L.)
51 – 504
Martinez-Correa et al. (2012)
Alecrim do campo (Baccharis
dracunculifolia) 48,4 – 197
Santos (2013) “Azedinha”
(Rumex acetosa) 85,30 – 237,80
Bitencourt et al. (2014)
Melia azedarach L. 5,7 - 22
Garmus et al. (2015)
“Alecrim-pimenta” (Lippia sidoides Cham.)
38,20 – 230,5
Garcia-Mendoza et al. (2015)
Mangifera indica L. 15,80 – 41,63
Capítulo 3
Materiais e Métodos
Materiais e Métodos
28 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
3. Materiais e métodos
3.1. Preparação da amostra
A matéria-prima utilizada nos experimentos foi a folha da Arrabidaea chica. As
amostras foram adquiridas, já secas (secagem natural, à sombra), em Belém/PA, de um único
local de cultivo (agricultura doméstica).
Inicialmente, a matéria prima bruta foi armazenada em um saco plástico não
transparente e acondicionada em ambiente refrigerado. A seguir, foi realizada a redução do
tamanho das folhas com o auxílio de um multiprocessador doméstico (ARNO, modelo PRO),
no qual cada porção da amostra foi triturada durante 15 segundos.
Assim que o processo de redução do tamanho de partículas foi concluído, deu-se início
ao processo de separação granulométrica, o qual foi realizado em um agitador de peneiras
(Produtest-reostat) que utiliza peneiras da série Tyler, durante 15 minutos. Ao fim do processo
de separação, a granulometria da amostra a ser utilizada nos experimentos extrativos foi
determinada e fixada, como mostra a Tabela 3.1.
Tabela 3.1 – Granulometria da matriz sólida a ser utilizada nos experimentos extrativos
Percentagem Tamanho (MESH)
24,54% +8 MESH
26,79% -8 / +12 MESH
14,22% -12 / +16 MESH
14,17% -16 / +24 MESH
11,44% -24 / +32 MESH
8,84% +48 MESH
A faixa de granulometria foi adotada levando-se em conta as características das
extrações supercríticas, onde não é interessante a utilização de partículas muito pequenas, que
podem provocar perdas de extrato e entupimento do equipamento. A seleção das peneiras foi
Materiais e Métodos
29 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
baseada em trabalhos que utilizaram extração supercrítica em plantas, como os de Paula et al.
(2013), Martinez-Correa et al. (2011), Bitencourt et al. (2014), Garcia-Mendoza et al. (2015),
Santos (2012), Mesomo (2013) e Santos (2013). Todos os trabalhos citados utilizaram faixas
granulométricas semelhantes as do presente trabalho.
O diâmetro médio das partículas foi determinado a partir da Equação (1).
�� = �∑ �������∑ �������� (1)
Em que:
xi = Mi / M - corresponde à fração de amostra retida na fração i;
Mi – massa de amostra na fração i;
M – massa total de amostra;
Dp – diâmetro médio das partículas;
Dpi – diâmetro da partícula da fração i;
n – números de frações.
3.2. Métodos de extração
Conforme descrito no item 2.2.1.2, as antocianinas são compostos instáveis e de fácil
degradação. Por este motivo, é necessário estabelecer alguns cuidados nos processos de
extração, de modo a evitar a perda dos componentes de interesse.
As antocianinas são sensíveis à luz, termossensíveis e sofrem degradação na presença
de oxigênio. Assim sendo, todos os processos extrativos do presente trabalho foram realizados
ao abrigo da luz. As vidrarias utilizadas foram envolvidas em papel laminado, e também
foram usados frascos âmbar quando possível. A temperatura máxima utilizada foi 50 ºC, tanto
nas extrações como na evaporação do solvente. Além disso, evitou-se ao máximo o contato
dos extratos com oxigênio, utilizando sistemas a vácuo (por exemplo, rotavapor com vácuo)
ou sistemas fechados/isolados.
3.2.1. Extração sólido-líquido
Na extração sólido-líquido, o método utilizado foi o descrito por Jorge (2008), com
modificações. Folhas de Arrabidaea chica, já secas e trituradas, foram imersas em uma
Materiais e Métodos
30 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
mistura de solvente e solução aquosa de ácido cítrico 0,3%, em ambiente com temperatura e
agitação controladas. Os solventes utilizados foram água e etanol PA (Synth, Brasil),
separadamente.
As folhas da espécie (5 g) foram extraídas com 150 mL da mistura de solvente com
ácido cítrico, de modo que a matriz sólida ficasse totalmente submersa na fase líquida. A
extração foi realizada em incubadora (marca Tecnal, modelo TE-422), sendo adotada a
agitação de 250 rpm e a temperatura de 50 ºC, pelo período de 4 horas. Para evitar incidência
de luz, as vidrarias utilizadas na extração foram envolvidas em papel laminado.
A velocidade de agitação e a temperatura foram escolhidas com base no fato de que, na
extração sólido-líquido, normalmente há uma relação direta entre estas variáveis e a eficiência
da extração (ver item 2.3.1). Assim sendo, foi selecionada a máxima agitação da incubadora e
a máxima temperatura permitida para a Arrabidaea chica. A duração da extração foi baseada
no trabalho de Jorge (2008).
A solução de ácido cítrico foi preparada através da pesagem de 0,3 g de Ácido Cítrico
Anidro P.A., e solubilização em 100 mL de água destilada. Esta solução (150 mL) foi então
adicionada ao solvente de modo a garantir pH ácido, pois, conforme relatado no item 2.2.1.2,
as antocianinas sofrem degradação em pH básico. O pH final da solução ficou na faixa entre 4
e 5, ou seja, pH ácido, e portanto adequado a experimentos com antocianinas.
Após a extração, para retirada de resíduos sólidos e do solvente, foi realizada filtração a
vácuo (bomba a vácuo TECNAL, modelo TE-058), secagem em evaporador rotativo (marca
BÜCHI, modelo B204 - Figura 3.1a) à temperatura de 40 ºC em condições de vácuo, e por
fim a liofilização (liofilizador Virtis, modelo 8 L - Figura 3.1b). Após estes processos, foi
obtido o extrato seco, e o rendimento da extração foi realizado por meio do cálculo da razão
(massa total de extrato seco/massa de folhas de Arrabidaea chica utilizada na extração).
A liofilização ou freeze-drying é uma operação de desidratação na qual a matéria-prima
(neste caso, o extrato contendo água) previamente congelada é submetida a determinadas
condições de temperatura e pressão que ocasionam a sublimação da água. Neste caso, a água
não passa pelo estado líquido, e a dinâmica entre vácuo e baixa temperatura promove a
sublimação. Dessa forma, o procedimento pode ser adotado para remoção de água de produtos
sensíveis ao calor, como é o caso dos extratos ricos em antocianinas (Araújo, 2014).
Materiais e Métodos
31 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
Figura 3.1 – (a) Evaporador rotativo e (b) liofilizador utilizados nos experimentos. Fonte:
autoria própria (2015).
3.2.2. Extração supercrítica
Para a extração com CO2 supercrítico, foi utilizado o aparato experimental ilustrado na
Figura 3.2.
Figura 3.2 – Ilustração do aparato de extração com CO2 pressurizado. Fonte: Galvão (2009).
Na Figura 3.2, RCO2 representa o cilindro de CO2, de 25 kg; FL representa o filtro de
linha; RT representa o tanque pulmão; BT1 e BT2 representam os banhos termostáticos; B1 e
B2 representam, respectivamente, as bombas para o CO2 e para o co-solvente (mistura
etanol/água, em diferentes proporções); CE (coluna extratora); FS (reservatório de co-
solvente); MP1 representa um manômetro com escala de 0 a 100 kgf/cm2; MP2 e MP3
representam manômetros com escala de 0 a 600 bar; TC (tubo de captura de voláteis); BO
Materiais e Métodos
32 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
(“bolhômetro” – medidor de vazão); VA (válvula de alívio); V, V1, V2, V3, V4 representam
válvulas; VM (válvula micrométrica); e FC (frasco coletor).
Na Figura 3.3 são apresentadas as etapas da extração supercrítica, de forma
esquemática.
Figura 3.3 – Etapas para realização da extração supercrítica. Fonte: autoria própria (2015).
Liofilização
Limpeza do aparato experimental
Filtração do extrato (a vácuo)
Evaporação do co-solvente (evaporador rotativo)
Despressurização do sistema
Remoção da CE e “desempacotamento” da matriz sólida
Coleta do extrato
Fim da extração
Início da extração supercrítica (4 horas de duração)
Acondicionamento de esferas de vidro na CE, até completar o volume
Estabilização das condições operacionais desejadas
Acondicionamento da amostra na CE
Pesagem da amostra
Pesagem do extrato seco
Acondicionamento do extrato em ambiente refrigerado protegido da luz
Materiais e Métodos
33 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
Para cada extração supercrítica, foi acondicionada na coluna extratora (CE) uma massa
de 5 ± 0,01 g da amostra (folhas secas de Arrabidaea chica), com composição granulométrica
conforme item 3.1. Para completar o volume da coluna, foram utilizadas esferas de vidro
(material inerte) de 5,0 mm de diâmetro. Visando uma boa compactação de toda a amostra,
foi utilizada uma haste de ferro a fim de permitir a uniformidade na porosidade do leito de
partículas e evitar ao máximo a formação de caminhos preferenciais do solvente na matriz
sólida. É importante destacar que a amostra foi sendo adicionada aos poucos na CE, e cada
vez que isto acontecia, a haste de ferro era utilizada para compactação. Desta forma, um leito
homogêneo de partículas foi formado no interior da CE. O mesmo procedimento foi adotado
para as esferas de vidro, com o detalhe de que estas não necessitaram de muito esforço na
compactação, por se tratar de um material mais rígido que as folhas da Arrabidaea chica.
Após o processo de empacotamento da amostra, foram colocadas as telas de proteção
nas extremidades da coluna, e após isso a CE foi posicionada no aparato experimental. Em
seguida todas as válvulas foram verificadas e devidamente fechadas, com exceção da válvula
micrométrica VM, que deve permanecer um pouco aberta. O passo seguinte foi acionar os
banhos termostáticos BT1 e BT2, sendo o primeiro responsável pelo resfriamento do CO2 do
tanque pulmão RT (temperatura desejada: -10°C) e o segundo responsável pelo controle da
temperatura na coluna extratora CE (ou seja, deve ser ajustada para a temperatura a ser
utilizada na extração, neste caso, 40°C ou 50°C).
O processo de aquecimento da válvula micrométrica VM foi iniciado nesta etapa
(temperatura desejada: 60°C, temperatura em que não ocorrem entupimentos), visto a
necessidade de combater o efeito Joule Thomson. Em seguida, a válvula V e VI foram abertas
e a pressão foi monitorada pelo manômetro MP1; logo após seguiu-se a pressurização do
sistema.
Quando a temperatura ideal do tanque pulmão (RT) foi atingida, a bomba de
pressurização do CO2 foi acionada e a válvula V2 foi aberta. Como foi utilizado co-solvente
nos experimentos, então o frasco de co-solvente (FS) foi acoplado à tubulação de entrada na
bomba B2 (tubulação livre de bolhas de ar). Assim que a pressão de trabalho foi atingida
(manômetros MP2 e MP3), a válvula V4 foi aberta. Cabe salientar que a válvula V4 é
responsável pelo ajuste “grosso” da vazão de trabalho do experimento. Já a válvula
micrométrica VM é responsável pelo ajuste fino da vazão de solvente.
A vazão média foi de 1,0 ± 0,1 g/min, o tempo total de extração foi de 4 horas (tempo
iniciado a partir da abertura da V4 e VM) e o extrato final foi coletado no frasco coletor (FC).
Decorrido o tempo de 4 horas de extração, o cilindro de CO2 foi fechado e o sistema
Materiais e Métodos
34 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
despressurizado a fluxo constante. Após o processo de despressurização, seguiu-se o
“desempacotamento” da coluna extratora. A massa residual das folhas de Arrabidaea chica
presente na coluna foi descartada e a limpeza da CE foi realizada.
O co-solvente utilizado nas extrações supercríticas foi uma mistura de etanol PA (Synth,
Brasil) e água. A mistura foi preparada separadamente e transferida para o frasco de co-
solvente (FS), sendo introduzida no sistema a partir deste recipiente, conforme explicado
anteriormente. A escolha do co-solvente se deu com base no trabalho de Paula et al. (2013),
que concluiu que a adição de água na mistura de solventes (CO2 + etanol) foi essencial para
combinar alto rendimento de extração com alta concentração dos compostos de interesse.
3.3. Planejamento experimental
Para as extrações supercríticas, de acordo com a literatura, foram selecionadas 4
variáveis de interesse: temperatura, pressão, concentração de CO2 (na mistura com o co-
solvente) e concentração de água no co-solvente. Por limitações de amostra, foi realizado um
planejamento fatorial fracionário. Os níveis das variáveis escolhidas podem ser vistos na
Tabela 3.2, e o planejamento experimental é detalhado no item 4.2.
Tabela 3.2 – Níveis das variáveis do planejamento experimental
Nível baixo (-
1) Nível alto
(+1)
Temperatura (°C) 40 50
Pressão (bar) 200 250
Concentração de CO2 (na mistura com o co-solvente) (%)
70 80
Concentração de água no co-solvente (%) 30 50
3.4. Análises Cromatográficas (CLAE ou HPLC)
A concentração de Carajurina nos extratos da Arrabidaea chica foi determinada por
HPLC. As análises cromatográficas foram realizadas no Centro Pluridisciplinar de Pesquisas
Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA), localizado em Campinas/SP. Este centro de
pesquisas tem histórico de estudo da Arrabidaea chica, tendo desenvolvido diversos trabalhos
de pesquisa relacionados a esta planta, por exemplo, os trabalhos de Jorge (2008), Taffarello
Materiais e Métodos
35 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
(2008) e Paula (2013). Neste local, a Arrabidaea chica é cultivada em campo experimental, e
o padrão de Carajurina (utilizado em HPLC) foi isolado. As análises foram realizadas
segundo metodologia descrita por Devia et al. (2002).
A fase móvel foi filtrada em sistema de filtração Millipore usando membrana PVDF de
0,45 µm e 47 mm de diâmetro sob vácuo e sonificação simultaneamente. Acidificou-se H2O
com H3PO4 pH 2,0 ± 0,1, medido em pHmetro (Micronal) calibrado com soluções padrão
certificadas em pH 4 e 7. Essa fase móvel denominou-se fase móvel “A”. A fase móvel “B”
consistiu de metanol grau HPLC (JT Baker, EUA).
As análises foram realizadas por HPLC (Shimadzu) acoplado ao detector de UV com
arranjo de diodos (Shimadzu). As condições cromatográficas e o gradiente da fase móvel
utilizados estão descritos na Tabela 3.3 e Tabela 3.4, respectivamente.
Tabela 3.3 – Condições cromatográficas utilizadas para análise das antocianinas presentes na Arrabidaea chica
Equipamentos e acessórios Especificação
Bomba Shimadzu LC 10 atm
Coluna C18 Gemine-Phenomenex 5 µm 110A°
(250 mm x 4,6 mm x 5 µm)
Volume de injeção 20 µL
Vazão de fluxo 1 mL/min
Detector Shimadzu UV-DAD M10AVP
Fase móvel H2O/metanol (gradiente)
Comprimento de onda 470 nm
Forno CTO-10ASVP 35 °C
Software Class VP-5
Injetor automático Sil-20AT HT
Materiais e Métodos
36 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
Tabela 3.4 – Programa de gradiente da fase móvel para análises por HPLC-DAD
Tempo (min) Solvente H2O+H3PO4
pH 2,0 ± 0,1 %A
Solvente metanol
%B
0 – 5 55 45
5 – 20 10 90
20 – 30 0 100
30 – 45 55 45
Para o preparo da curva de calibração, utilizou-se o marcador analítico (Carajurina)
previamente isolado, com pureza determinada por HPLC-UV e espectrometria de massas.
Pesou-se então 12,1 mg de Carajurina com 83% de pureza. Em um balão volumétrico
de 10 mL, solubilizou-se a Carajurina em metanol grau HPLC (JT Baker, EUA), obtendo uma
solução estoque de 1004 µg/mL. As diluições foram realizadas com pipeta automática em
balões volumétricos, obtendo-se concentrações de 5 a 502 µg/mL, e assim foram construídas
as curvas analíticas. A tabela com as áreas e a curva de calibração são apresentadas no
Apêndice A.
Foram estabelecidas três curvas analíticas com soluções de Carajurina isolada na faixa
de concentração informada. Os limites de detecção e quantificação foram calculados através
destas curvas, resultando em: limite de detecção de 2,69 µg/mL e limite de quantificação de
8,97 µg/mL.
3.5. Método do sequestro do radical 2,2-difenil-1-picril-hidrazil (DPPH)
Este método tem como finalidade quantificar o poder antioxidante dos extratos, como
foi definido no item 2.5, por meio de uma reação com mudança de coloração e consequente
mudança de absorbância. A metodologia empregada seguiu o método descrito por Lucena et
al. (2010). Basicamente, o método consiste na preparação de três soluções: solução de DPPH,
solução metanólica de ácido ascórbico e soluções metanólicas diluídas do extrato seco.
Para o preparo de 500 mL da solução de DPPH foram pesadas 11,80 mg de DPPH
(Sigma-Aldrich, EUA), que em seguida foram solubilizadas em metanol PA (Vetec, Brasil)
até que se completasse o volume de 500 mL do balão volumétrico utilizado. A solução
formada foi homogeneizada e transferida para um frasco âmbar envolvido com papel
Materiais e Métodos
37 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
laminado, para o abrigo total da luz. É importante frisar que foi preparada uma solução para
cada dia de análise. A concentração final da solução de DPPH foi de 23,6 μg/mL.
No preparo da solução de ácido ascórbico (controle positivo) foram pesadas 10,0 mg de
ácido ascórbico (Vetec, Brasil) e, em seguida, transferidas para um balão volumétrico de 100
mL. O volume do balão volumétrico foi completado com metanol PA (solvente utilizado) e,
logo após, a solução formada foi homogeneizada. A concentração final de ácido ascórbico foi
de 0,1 mg/mL. Esta solução foi utilizada como base para realizar as diluições necessárias para
construção da curva padrão de ácido ascórbico (ver item 4.5).
Após a preparação das soluções reacionais, as mesmas foram colocadas em um
ambiente protegido da luz, à temperatura ambiente e em repouso por um tempo de 30
minutos. O passo seguinte foi a realização da leitura da absorbância em UV-visível em
espectrofotômetro (VARIAN modelo 50 conc), no λ = 517 nm, em duplicata. O metanol PA
foi utilizado como branco.
A preparação da solução amostra foi realizada da seguinte maneira: após a obtenção dos
extratos secos, estes foram diluídos em 10 mL de metanol PA, obtendo as soluções primárias.
Como as massas de extratos secos variaram de experimento para experimento, obtiveram-se
soluções primárias com diferentes concentrações de extrato. Estas soluções foram utilizadas
como base para realizar as diluições necessárias para construção das curvas referentes às
amostras (ver item 4.5).
Como descrito no item 2.5, para este método existem três soluções: uma solução padrão
(geralmente utilizando ácido ascórbico para reagir com o DPPH), uma solução amostra (que
utiliza as diluições das amostras dos extratos para reagir com o DPPH) e uma solução controle
de DPPH. Sempre a solução controle de DPPH é misturada à solução padrão ou à solução
amostra.
O cálculo é realizado em função da razão das absorbâncias da solução controle de
DPPH (absorbância antes da reação) e de toda a reação após o tempo de 30 minutos. Essa
razão das absorbâncias é descrita pela Equação (2), na qual AS (%) significa a atividade
sequestradora da amostra, em percentagem; ����������� significa o valor da absorbância da
solução controle (solução contendo apenas DPPH e metanol PA) e ���������� significa o
valor da absorbância da amostra do extrato ou do ácido ascórbico após a reação com o
controle. �� (%) = 100 ������������ − ��������������������� ! (2)
Materiais e Métodos
38 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
A Figura 3.4 ilustra o princípio da atividade sequestradora do DPPH e a consequente
queda no valor da absorbância.
Figura 3.4 – Absorbância em função do comprimento de onda. Fonte: Santos (2013).
3.6. Método espectrofotométrico de Folin-Ciocalteau
A determinação do conteúdo de fenólicos totais (CFT) presentes nos extratos de
Arrabidaea chica foi realizada pelo método espectrofotométrico de Folin-Ciocalteau descrito
por Singleton & Rossi (1965).
O método consistiu na preparação de três tipos de soluções principais e consequente
mistura e reação das substâncias presentes nestas soluções. As três soluções foram: uma
solução aquosa de carbonato de sódio (Na2CO3) a 15% massa; uma solução de ácido gálico a
0,5 mg/mL; e as soluções das amostras dos extratos analisados (concentração variável).
Em um béquer, pesou-se 3,75 g de Na2CO3 (Vetec, Brasil), logo após foram
adicionados 20 mL de água destilada e agitou-se até completa solubilização. Após
resfriamento, foi adicionada água destilada a esta solução, até o volume total de 25 mL.
A solução de ácido gálico foi preparada a partir do padrão puro e sólido (à temperatura
ambiente) da Sigma-Aldrich (EUA). Foram pesadas 10 mg do ácido gálico e em seguida
foram transferidas para um balão volumétrico de 10 mL (volume completado com água
destilada), originando uma solução de ácido gálico com concentração de 1 mg/mL. O próximo
passo foi a diluição para 0,5 mg/mL adicionando água destilada. A preparação das diluições e
da curva de calibração para o ácido gálico seguiu o planejamento apresentado no item 4.6.
Após a preparação das soluções reacionais em duplicata, as mesmas foram colocadas
em um ambiente protegido da luz, à temperatura ambiente e em repouso por um tempo de 2
Materiais e Métodos
39 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
horas. O passo seguinte foi a realização da leitura da absorbância em UV-Visível em
espectrofotômetro (VARIAN, modelo 50 conc), no λ = 760 nm. A água destilada foi utilizada
como branco e a curva padrão de ácido gálico foi construída através do gráfico de absorbância
(ABS) versus concentração de ácido gálico (µg/mL).
O mesmo foi realizado com as amostras dos extratos de Arrabidaea chica. A preparação
das diluições e soluções reativas pode ser visualizada no item 4.6.
A partir da equação (regressão linear) gerada através da calibração com o ácido gálico,
foi possível quantificar o poder antioxidante das amostras a partir de um referencial (ácido
gálico). Essa equação gerada tem como ordenada os valores de absorbância e como abcissa os
valores de concentração de ácido gálico. Os valores de absorbância obtidos para cada um dos
extratos foram correlacionados com a curva padrão de ácido gálico, e o teor de compostos
fenólicos totais (CFT) foi determinado através da Equação (3). Os resultados foram expressos
em mg EAG/g de extrato.
(3)
Onde: EAG é o equivalente em ácido gálico obtido através da curva padrão; e CAmostra
representa a concentração das amostras.
Capítulo 4
Resultados e discussões
Resultados e discussões
41 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
4. Resultados e discussões
4.1. Caracterização da matéria-prima
As amostras das folhas da Arrabidaea chica utilizadas nos experimentos foram
caracterizadas em relação à granulometria e diâmetro médio das partículas.
Quanto à granulometria, foram utilizadas as frações retidas nas peneiras de 8, 12, 16,
24, 32 e 48 mesh, conforme Tabela 3.1. O diâmetro médio da partícula foi igual a 0,485 mm.
As amostras já foram adquiridas secas, por isso não foi realizada análise de umidade.
A Figura 4.1 representa a matéria-prima com a granulometria apresentada na Tabela
3.1.
Figura 4.1 – Matéria-prima após processo de redução do tamanho da partícula. Fonte: autoria
própria (2015).
4.2. Planejamento experimental – Extração Supercrítica
Conforme informado no item 2.3.2, os únicos trabalhos encontrados na literatura com
extração supercrítica da Arrabidaea chica foram os de Paula et al. (2013) e Paula et al.
(2014). O planejamento experimental do presente trabalho foi baseado principalmente nestes
artigos.
Porém, é importante ressaltar que há diferenças significativas no método de extração
empregado, já que, no caso dos trabalhos de Paula et al., foram utilizadas extrações em várias
etapas, enquanto no presente trabalho foi utilizada extração em etapa única. De forma
Resultados e discussões
42 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
simplificada, as diferenças nas metodologias de extração citadas podem ser visualizadas no
Apêndice B.
Além dos trabalhos de Paula et al., foi utilizado como referência o trabalho de Santos
(2013), que foi realizado no extrator supercrítico do Laboratório de Tecnologia Supercrítica e
Biodiesel da UFRN. Nesse trabalho, a concentração de co-solvente foi uma das variáveis
analisadas e demonstrou importância nos estudos de extração.
Com base nos trabalhos citados, foram selecionadas 4 variáveis: temperatura, pressão,
concentração de CO2 (que é o complemento à concentração de co-solvente) e concentração de
água no co-solvente.
A faixa de trabalho da temperatura foi escolhida baseando-se no trabalho de Paula et al.
(2014): 40°C e 50°C. A faixa de concentração de água no co-solvente foi selecionada de
acordo com o trabalho de Paula et al. (2013): 30% e 50%.
A escolha da faixa de concentração de CO2 foi baseada no trabalho de Paula et al.
(2013), onde foi utilizado 80% de CO2 (20% de co-solvente). Para o presente trabalho,
adotou-se esta mesma concentração e também a de 70% de CO2 (30% de co-solvente), de
modo a avaliar o efeito do aumento da concentração de co-solvente nas variáveis
dependentes.
Já a pressão foi selecionada de acordo com a literatura, mas também considerando as
limitações do equipamento utilizado. Nos trabalhos de Paula et al. (2013 e 2014) foram
utilizadas pressões de 300 e 400 bar. Porém, o extrator supercrítico do Laboratório de
Tecnologia Supercrítica e Biodiesel da UFRN tem um limite máximo de pressão para
operação segura, igual a 250 bar. Desta forma, foram escolhidos os valores de 200 e 250 bar.
A escolha da vazão dos experimentos obedeceu aos mesmos critérios observados para a
variável pressão. Nos trabalhos de Paula et al. (2013 e 2014), foi utilizada vazão de 1,65 g
CO2/min, porém no extrator supercrítico do Laboratório de Tecnologia Supercrítica e
Biodiesel da UFRN não foi possível manter esta vazão estável. Desta forma, trabalhou-se com
vazão fixa de 1,0 ± 0,1 g CO2/min. A duração dos experimentos foi escolhida baseando-se em
outros trabalhos que utilizaram o mesmo equipamento: 4 horas.
O planejamento fatorial completo para 4 variáveis com ponto central resulta num total
de 19 experimentos (24 + 3 = 19). Porém, havia um problema de disponibilidade de amostra,
de modo que não havia quantidade suficiente para tantos experimentos. Assim, definiu-se pela
realização de um planejamento fatorial fracionário, resultando em 8 experimentos (24-1 = 23).
O planejamento fracionário é utilizado quando é desejado o estudo de muitos fatores
(geralmente, um número superior a 3), e há impossibilidade de realizar grande quantidade de
Resultados e discussões
43 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
experimentos. Este tipo de planejamento permite, com poucos experimentos, determinar se
alguns fatores não são significativos. Por exemplo, com 4 fatores a se estudar, em vez de
partir diretamente para o planejamento completo, que requer 19 experimentos, é possível
realizar o planejamento fracionário com 8 experimentos. Se nestes experimentos for
determinado que um dos fatores não é significativo, então o estudo passa a ser de um
planejamento completo com 3 fatores, que resultaria em 11 experimentos, considerando o
ponto central (2³ + 3 = 11). Como, do total de 11 experimentos, 8 já foram realizados, só resta
fazer mais 3. Conforme explicado, é possível suprimir 8 experimentos, economizando tempo
e recursos.
Para este trabalho, por limitações de quantidade de amostra disponível, a proposta foi
realizar apenas os 8 experimentos iniciais do planejamento fracionário, e através destes
determinar os fatores significativos, deixando a tarefa de executar o planejamento fatorial
completo para trabalhos futuros.
4.3. Rendimento da extração
4.3.1. Extrações supercríticas
Os rendimentos das extrações supercríticas realizadas podem ser visualizados na Tabela
4.1.
.
Resultados e discussões
44 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
Tabela 4.1 – Rendimento, quantificação da Carajurina e avaliação do potencial antioxidante dos extratos de Arrabidaea chica obtidos através de extração supercrítica
Experimento Pressão (bar) [P]
Temperatura (°C) [T]
Conc. CO2 (% v/v)
[CC]
Conc. H2O no co-solvente
(%v/v) [CA]
% Rendimento (%m/m)
% Carajurina (%m/m)
CE50 (μg/mL)
CFT (mg EAG/ g extrato)
1 250 [+1] 50 [+1] 80 [+1] 50 [+1] 15,8 1,00 61,28 48,93
2 200 [-1] 50 [+1] 70 [-1] 50 [+1] 23,7 1,41 50,07 75,84
3 250 [+1] 40 [-1] 70 [-1] 50 [+1] 32,0 1,65 74,17 60,33
4 200 [-1] 40 [-1] 80 [+1] 50 [+1] 15,1 2,22 38,34 88,62
5 250 [+1] 50 [+1] 70 [-1] 30 [-1] 25,1 1,53 86,13 61,17
6 200 [-1] 50 [+1] 80 [+1] 30 [-1] 19,0 1,31 43,95 65,76
7 250 [+1] 40 [-1] 80 [+1] 30 [-1] 17,9 1,49 46,57 70,65
8 200 [-1] 40 [-1] 70 [-1] 30 [-1] 24,0 1,81 42,49 75,49
Resultados e discussões
45 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
Conforme pode ser observado na Tabela 4.1, o melhor rendimento (32%) foi obtido no
experimento 3, enquanto o rendimento mais baixo (15,1%) foi obtido no experimento 4. Nota-
se que nos experimentos onde a concentração de CO2 foi igual a 70% (ou concentração de co-
solvente igual a 30%), os maiores rendimentos foram obtidos (experimentos 3, 5, 8 e 2).
Os efeitos das variáveis escolhidas para este processo extrativo (pressão, temperatura,
concentração de CO2 e concentração de água no co-solvente) foram calculados utilizando o
software Statistica 7.0®, e são apresentados na Tabela 4.2.
Os efeitos das variáveis sobre o rendimento de extração supercrítica são analisados tanto
pela Tabela 4.2 quanto pela Figura 4.2 (Diagrama de Pareto). Quando um efeito é positivo,
significa que a variável apresenta um incremento positivo no valor do rendimento, quando
negativo o comportamento é inverso. O efeito será tão significativo quanto mais à direita da
linha pontilhada ele estiver, considerando um nível de probabilidade de confiança de 95%
(significância %5).
Tabela 4.2 – Efeitos calculados no Statistica 7.0® para o planejamento experimental (variável
resposta: rendimento)
Variáveis Intervalo Efeitos p-valor
Conc. CO2 [CC] (%v/v) (X1) 70 – 80 -0,092 0,039
Conc. H2O [CA] (%v/v) (X2) 30 – 50 0,002 0,953
Temperatura [T] (°C) (X3) 40 – 50 -0,013 0,648
Pressão [P] (bar) (X4) 200 – 250 0,023 0,450
Resultados e discussões
46 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
Figura 4.2 – Diagrama de Pareto para os valores dos efeitos padronizados.
Percebe-se que a concentração de CO2 apresentou-se como a única variável significativa
para uma confiança de 95% na análise dos efeitos sobre o rendimento de extração
supercrítica, na faixa estudada.
Inicialmente, é necessário explicar que, como o valor do efeito para esta variável é
negativo, significa que quanto maior a concentração de CO2, menor o rendimento da extração.
Já que a concentração de CO2 é o complemento da concentração de co-solvente, significa que
quanto maior a concentração de co-solvente, maior o rendimento.
Este resultado é coerente com o apresentado na literatura. Galvão (2009) utilizou
extração supercrítica com CO2 e co-solvente (etanol) para extrair o óleo vegetal de sementes
de linhaça (Linum usitatissimum L.), e concluiu que a concentração de co-solvente foi o fator
mais significativo para o rendimento da extração. O valor deste efeito foi positivo, ou seja,
quanto maior a concentração de co-solvente, maior o rendimento, na faixa estudada. Galvão
atribuiu o fato às interações intermoleculares entre o co-solvente e os componentes da matriz
sólida (lipídios presentes nas sementes), citando também que, nos estudos realizados por
Guclu-Ustundag e Temelli (2005 apud Galvão, 2009), a adição de co-solvente (etanol) na
extração supercrítica com CO2 promoveu aumento de solubilidade de ácidos graxos, devido
principalmente à formação de pontes de hidrogênio.
No trabalho de Santos (2013), também foi utilizada extração supercrítica com CO2 e co-
solvente (etanol), para extração de raízes da planta Rumex acetosa. Tal planta, assim como a
Arrabidaea chica, é rica em compostos fenólicos e outros antioxidantes. Nesse trabalho, a
concentração de co-solvente não foi significativa para o nível de probabilidade de confiança
Resultados e discussões
47 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
de 95%, porém ficou claro que se trata de uma variável importante no processo de extração
supercrítica. O autor atribuiu esta importância à presença de grupos hidroxilas no co-solvente,
que formariam ligações de hidrogênio com compostos que apresentam hidroxilas, como
compostos fenólicos e outros antioxidantes, citando o trabalho de Lu et al. (2006 apud Santos,
2013), que compartilha este mesmo raciocínio.
Santos (2012) afirma que a presença de etanol afeta positivamente a extração de
polifenóis, fato este relacionado às interações covalentes (ligações de hidrogênio) e dipolo-
dipolo, que aumentam a solubilidade de compostos fenólicos.
A relação direta entre concentração de co-solvente e rendimento da extração também foi
observada nos seguintes trabalhos: Wu et al. (2006), onde foi utilizada extração supercrítica
com CO2 e co-solvente (etanol) em folhas da Physalis peruviana (PP), uma erva medicinal
rica em agentes antioxidantes (os maiores rendimentos foram obtidos na máxima
concentração de co-solvente utilizada – 5%); e Serra et al. (2010), onde foi utilizada extração
em duas etapas em cerejas (Prunus avium) ricas em polifenóis, sendo a segunda etapa com
CO2 supercrítico e etanol, em diferentes concentrações (observou-se um aumento de
rendimento à medida que a concentração de co-solvente era incrementada).
Quanto à Arrabidaea chica, conforme pode ser observado na Figura 2.2, as antocianinas
possuem hidroxilas em sua estrutura. Assim, é possível utilizar o mesmo raciocínio de Santos
(2013) e atribuir o efeito positivo da concentração de co-solvente às ligações de hidrogênio
formadas entre as hidroxilas dos compostos presentes na Arrabidaea chica e do co-solvente
(etanol). Fato este ainda mais favorecido pela presença de água no co-solvente, que também é
fonte de grupos hidroxila, o que é comprovado na Tabela 4.1.
Além disso, a polaridade do co-solvente também é um fator importante. Conforme
informado no item 2.2.1.2, as antocianinas são pigmentos polares. Como o etanol (polaridade
= 5,2) e a água (polaridade = 9,0) são solventes muito polares, há uma afinidade entre estes e
as antocianinas, de forma a facilitar sua extração. Já o CO2 é apolar e por essa razão não é
adequado, isoladamente, para extração de compostos polares da Arrabidaea chica, fato que é
comprovado na literatura, em vista dos baixos rendimentos de extração obtidos quando da
utilização de CO2 supercrítico isoladamente (Paula et al., 2013; Paula et al., 2014).
É importante analisar também o efeito da temperatura, que foi não significativo e
negativo na faixa estudada, ou seja, quanto menor a temperatura, maior o rendimento da
extração. Quanto ao fato de ser não significativo, isto provavelmente se deve à limitação de
temperatura máxima utilizada no presente estudo, imposta pela presença de antocianinas
termossensíveis na Arrabidaea chica. Para evitar degradação térmica destes compostos, foi
Resultados e discussões
48 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
utilizada a mesma faixa de temperatura usada por Paula et al. (2014): 40 °C e 50 °C. Por se
tratar de uma faixa muito estreita de valores provavelmente afetou a significância deste fator
no rendimento da extração, já que a literatura reporta a importância desta variável em
extrações supercríticas.
Porém, a literatura não é conclusiva sobre o efeito da temperatura. Reátegui (2014),
realizando extração supercrítica do bagaço de amora-preta (Rubus sp.), reporta diminuição do
rendimento com o aumento da temperatura, e atribui este fato à redução da solubilidade do
soluto devido à diminuição da densidade do solvente supercrítico, o que consequentemente
reduz seu poder de solvatação.
Santos (2013), porém, reporta efeito positivo da temperatura no rendimento da extração
supercrítica de raízes da Rumex acetosa, e cita os trabalhos de Benová et al. (2010) e Lu et al.
(2006), que chegaram à mesma conclusão. Neste caso, o efeito é atribuído ao aumento da
transferência de massa associado ao aumento da temperatura.
Michielin (2002) e Santos (2012) explicam que o poder de solvatação do solvente sofre
influência da temperatura mediante dois mecanismos: com o aumento da temperatura, ocorre
a redução da densidade do solvente, porém há um aumento da pressão de vapor do soluto.
Estes dois efeitos são contrários e a influência da temperatura no rendimento da extração é
determinada pelo efeito dominante, e isso depende também da pressão.
Esta dependência entre o efeito da temperatura e a pressão de trabalho pode ser
observada em Paula et al. (2014). Em seu trabalho, tais autores (2014) realizaram extrações
supercríticas com CO2 variando a temperatura e a pressão. Para a pressão de 300 bar, o
melhor rendimento foi obtido à temperatura de 40 °C. Já à pressão de 400 bar, o maior
rendimento foi obtido a 50 °C. Uma análise estatística dos dados do trabalho de Paula et al.
(2014) mostra que a temperatura não foi um fator significativo dentro da faixa estudada, assim
como no presente trabalho.
Por fim, cabe uma análise da concentração de água no co-solvente, que também se
apresentou como uma variável não significativa. Conforme já citado, Paula et al. (2013)
estabeleceram a importância da adição de água no co-solvente para aumento do rendimento da
extração da Arrabidaea chica. Segundo Paula et al. (2013), quando o co-solvente utilizado foi
etanol puro, foram obtidos rendimentos da ordem de 3%, enquanto que com misturas etanol-
água ficou na ordem de 30%. Esta influência da presença da água também foi identificada no
presente trabalho, em que foram obtidos rendimentos na faixa de 15% a 32%.
Por outro lado, o trabalho de Paula et al. (2013), apesar de não ser conclusivo acerca
deste tópico, demonstra que a concentração da água no co-solvente não impactou o
Resultados e discussões
49 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
rendimento de forma significativa, o que também foi observado no presente trabalho. O fator
de influência é a presença ou ausência de água no co-solvente.
Quanto à faixa de valores de rendimento obtidos, apesar de estarem na mesma ordem
de grandeza daqueles obtidos por Paula et al. (2013), apresentam valores menores. Isso se
justifica pelo fato da vazão e pressões do presente trabalho (1,0 g CO2/min; 200/250 bar)
serem inferiores à vazão e pressões do trabalho de Paula et al. (2013) (1,65 g CO2/min;
300/400 bar). Além disso, o processo extrativo utilizado por Paula et al. (2013) foi diferente,
pois utilizou extrações em múltiplas etapas, enquanto as extrações do presente trabalho foram
realizadas em apenas uma etapa.
4.3.2. Extrações sólido-líquido
Os rendimentos de extração para os processos de extração sólido-líquido estão
apresentados na Tabela 4.3.
Tabela 4.3 – Rendimentos, quantificação da Carajurina e avaliação do potencial antioxidante
dos extratos de Arrabidaea chica obtidos através de extração sólido-líquido
Solvente % Rendimento
(%m/m) % Carajurina
(%m/m) CE50
(μg/mL) CFT (mg EAG/
g extrato)
Água 8,1 ND (< 0,03%) 167,34 37,63
Etanol PA 5,5 7,04 42,58 80,54
No presente trabalho, a extração com água apresentou melhores resultados em relação
ao etanol, o que é coerente com o descrito na literatura. A água, mais polar, apresenta melhor
rendimento pelo fato das folhas da Arrabidaea chica serem ricas em compostos polares.
Os valores obtidos possuem a mesma ordem de grandeza daqueles encontrados na
literatura. Barbosa et al. (2008) e Paula et al. (2013) realizaram extrações sólido-líquido da
Arrabidaea chica utilizando etanol, obtendo rendimentos de 2,89% e 3%, respectivamente.
Paula et al. (2013) também realizaram extração com água, obtendo rendimento de 17,5%.
Já a diferença de valores de rendimento com relação aos relatados na literatura pode
também ser justificada pela origem das amostras utilizadas nos experimentos. Diferenças de
solo, tipo de plantio e condições climáticas, entre outros aspectos, resultam em plantas com
características diferentes, o que provoca alterações no rendimento e composição dos extratos
obtidos.
Resultados e discussões
50 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
4.4. Análise cromatográfica e quantificação da Carajurina
4.4.1. Quantificação da Carajurina
Na Tabela 4.1 são apresentados os resultados de concentração do pigmento Carajurina.
Tais concentrações foram obtidas a partir das injeções de soluções das amostras no HPLC e
posterior comparação das áreas dos picos gerados com a equação da reta fornecida pela
regressão dos resultados das injeções dos padrões (item 3.4).
Observa-se que, para a extração supercrítica, não houve grande variação no teor de
Carajurina nos extratos obtidos, variando entre 1,0% e 2,2%.
Paula et al. (2013), considerando as duas primeiras etapas do processo extrativo
(primeira etapa: CO2 supercrítico puro; segunda etapa: CO2 supercrítico + co-solvente),
obtiveram teores totais de Carajurina iguais a 5,8% e 11%. O teor de 5,8% foi obtido quando,
na segunda etapa da extração, foi utilizada a mistura CO2/etanol/água, enquanto o de 11% foi
obtido quando utilizada a mistura CO2/etanol na segunda etapa da extração, isto é, com
ausência de água no co-solvente. Já no ano seguinte, Paula et al. (2014) aplicaram extração
supercrítica com CO2, obtendo teores de Carajurina da ordem de 3%.
Ou seja, no presente trabalho o teor de Carajurina ficou abaixo do reportado na
literatura. Este fato é justificado pela diferença na metodologia de extração, já que extrações
em várias etapas são mais seletivas na extração de compostos de interesse. Além disso, a
diferença de condições operacionais como vazão e pressão também afetam o resultado. Por
fim, diferenças relacionadas à fonte da matéria-prima (solo, tipo de plantio, diferenças
climáticas etc.) promovem diferente teor de Carajurina.
Deve-se também citar o fato de que houve certo espaço de tempo entre as extrações e as
análises. Este lapso de tempo deveu-se ao fato das análises terem sido realizadas no Centro
Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA), localizado em
Campinas/SP, enquanto as extrações foram realizadas no Laboratório de Tecnologia
Supercrítica e Biodiesel da UFRN, localizado em Natal/RN. Mesmo que todos os cuidados
relacionados à conservação dos extratos tenham sido tomados (acondicionamento em
ambiente refrigerado, proteção da luz e do oxigênio), há possibilidade de ter havido
degradação dos extratos.
Exposto este fato, é importante ressaltar que todas as extrações do presente trabalho
foram realizadas em um curto espaço de tempo (10 dias). Todas as análises cromatográficas
das amostras coletadas foram realizadas em um único dia. Assim, pode-se estimar que, se
houve degradação dos extratos, esta foi semelhante para todas as amostras, o que permite
Resultados e discussões
51 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
observações comparativas acerca do teor de Carajurina nos extratos obtidos e sua dependência
com relação às variáveis de processo da extração supercrítica.
Quanto ao teor de Carajurina nas extrações sólido-líquido, Paula et al. (2013) reportam
um teor de 0,6% para extração convencional com água acidificada e de 10% com etanol
acidificado. Considerando os fatores expostos nos parágrafos anteriores, observa-se que os
resultados do presente trabalho estão na mesma ordem de grandeza, e portanto, coerentes com
a literatura.
4.4.2. Análise estatística de concentração de Carajurina dos extratos
supercríticos
Na Tabela 4.4, visualizam-se todos os efeitos estimados das variáveis consideradas na
quantificação da Carajurina. Os efeitos das variáveis escolhidas para o processo de extração
supercrítica foram calculados utilizando o software Statistica 7.0®.
Tabela 4.4 – Efeitos calculados no Statistica 7.0® para o planejamento experimental (variável
resposta: concentração de Carajurina)
Variáveis Intervalo Efeitos p-valor
Conc. CO2 [CC] (%v/v) (X1) 70 – 80 -0,001 0,676
Conc. H2O [CA] (%v/v) (X2) 30 – 50 0,0003 0,888
Temperatura [T] (°C) (X3) 40 – 50 -0,005 0,109
Pressão [P] (bar) (X4) 200 – 250 -0,003 0,281
A Figura 4.3 ilustra o Diagrama de Pareto para os valores obtidos. Percebe-se que
nenhuma variável foi significativa, pois todas estão localizadas à esquerda da linha vermelha
do Diagrama de Pareto, que considera um nível de probabilidade de confiança de 95%
(significância %5)
Resultados e discussões
52 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
Figura 4.3 – Diagrama de Pareto para os valores de concentração de Carajurina.
Paula et al. (2014) realizaram extração da Arrabidaea chica com CO2 supercrítico,
variando a temperatura e a pressão. Através de análise estatística dos dados apresentados
naquele trabalho, foi verificado que a pressão e a temperatura não foram significativas na
concentração de Carajurina nos extratos obtidos através de extração supercrítica com CO2.
Já Paula et al. (2013), realizaram extração da Arrabidaea chica em três etapas, sendo as
duas primeiras etapas em condições supercríticas. Considerando apenas a segunda etapa (CO2
+ co-solvente), foram obtidos teores de Carajurina iguais a 7,71% e 2,52%, para as seguintes
proporções da mistura CO2/etanol/água: 80/20/0 e 80/14/6, respectivamente. Isto é, observou-
se a influência negativa da adição de água no co-solvente. Porém, há de se ressaltar que no
trabalho de Paula et al. (2013) foram comparados dois cenários, onde em um deles não havia
presença de água no co-solvente, e no outro havia. No presente trabalho, não foi testado um
cenário sem presença de água. Em todos os experimentos do presente trabalho, havia água no
co-solvente, variando apenas a concentração deste elemento, que não foi uma variável
significativa com relação ao teor de Carajurina, na faixa estudada. Assim, conclui-se que em
outras faixas de estudo há a possibilidade de que a concentração de água no co-solvente tenha
influência na concentração de Carajurina, e provavelmente este efeito será negativo, ou seja,
quanto menor a concentração de água, maior a concentração deste pigmento no extrato.
Este resultado é coerente com os valores de Carajurina encontrados nas extrações
sólido-líquido, onde é observado alto teor de Carajurina em extrato etanólico, enquanto no
extrato aquoso não foi detectada presença de Carajurina.
Resultados e discussões
53 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
Estabelecida esta correlação, é importante ressaltar que também foi observado por Paula
et al. (2013) que a presença de água no co-solvente da extração supercrítica com CO2
contribui para obtenção de maiores rendimentos de extração (item 4.3.1). Ou seja, a presença
de água no co-solvente afeta positivamente o rendimento da extração e negativamente a
concentração de Carajurina, sendo interessante realizar estudos para verificar se existe algum
valor de concentração ótima de água no co-solvente. Os elevados valores de rendimento
quando da utilização de água mostram que outros componentes são extraídos na presença de
água.
Outro ponto importante a ser observado é que, apesar da Carajurina ser a principal
antocianina da Arrabidaea chica, ela não é a única, nem é o único composto responsável por
propriedades benéficas desta planta, como o potencial antioxidante. Assim, além da
quantificação da Carajurina, é importante também analisar o teor dos compostos fenólicos
totais (ver item 4.6).
4.4.3. Análise dos cromatogramas
Os cromatogramas de todos os extratos podem ser visualizados no Apêndice C. Através
da observação destes, é possível notar que:
• O tempo de retenção da Carajurina é de aproximadamente 17 minutos, o que é
coerente com a literatura (ver item 2.4);
• O pico da Carajurina no cromatograma do extrato etanólico é superior ao dos
extratos supercríticos, o que reflete a maior concentração de Carajurina neste
extrato;
• No cromatograma do extrato aquoso, não é possível observar o pico relacionado à
Carajurina, já que não foi identificado o pigmento neste extrato;
• Os picos da Carajurina nos cromatogramas dos extratos supercríticos são
semelhantes, o que reflete a baixa variação de concentração da substância nestes
extratos;
• Podem ser observados outros dois picos nos cromatogramas, relacionados aos
compostos: 6,7,3’,4’-tetrahidroxi-5-metoxi-flavilium; e 6,7,4’-trihidroxi-5-metoxi-
flavilium (Carajurona).
Resultados e discussões
54 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
4.5. Determinação da atividade antioxidante – Método do sequestro do
radical 2,2-difenil-1-picril-hidrazil (DPPH)
A atividade antioxidante dos extratos das folhas da Arrabidaea chica foi avaliada a
partir dos extratos oriundos das extrações supercrítica e sólido-líquido. Como padrão de
referência, foi utilizado o ácido ascórbico (ver item 3.5), que é um composto antioxidante
utilizado como padrão na literatura (Lucena et al., 2010). Na presença de antioxidantes, o
DPPH torna-se estável, consequentemente, sua absorbância diminui e sua coloração muda,
tornando-se amarelado.
Como descrito no item 3.5, foi preparada uma solução de ácido ascórbico cuja
concentração final foi de 0,1 mg/mL. Através dessa solução, foi preparada a curva padrão de
ácido ascórbico, sendo a Tabela 4.5 utilizada na preparação das diluições. A curva padrão de
ácido ascórbico está apresentada na Figura 4.4, enquanto que os dados utilizados na
construção da curva do padrão encontram-se no Apêndice D. Para a montagem desta curva, as
análises foram realizadas em duplicata.
Tabela 4.5 – Quantidade de ácido ascórbico, de metanol PA e de solução de DPPH para a montagem da curva do padrão
Concentração final das soluções de Ác. Ascórbico
(µg/mL)
Volume de solução de Ác. Ascórbico a 0,1mg/mL (µL)
Volume de metanol PA
(µL)
Volume de solução do reagente
DPPH (µL)
0,5 30 570 5400
1,0 60 540 5400
2,0 120 480 5400
3,0 180 420 5400
4,0 240 360 5400
Resultados e discussões
55 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
Figura 4.4 – Curva padrão de ácido ascórbico [AS(%) versus Conc. Ácido Ascórbico
(µg/mL)].
Para análise da atividade antioxidante dos extratos, as soluções primárias foram
utilizadas como base para realizar as diluições necessárias para construção das curvas
referentes às amostras, conforme já descrito no item 3.5. Estes dados podem ser visualizados
na Tabela 4.6 e Tabela 4.7.
y = 18,881x + 8,53
R² = 0,9996
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 1 2 3 4 5
Ati
vid
ade
Seq
ues
trad
ora
AS(
%)
Concentração Ácido Ascórbico (µg/mL)
Resultados e discussões
56 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
Tabela 4.6 – Concentração das soluções primárias
Experimento Concentração da solução
primária (mg/mL)
Extração Supercrítica
Exp 1 9,9
Exp 2 5,8
Exp 3 7,4
Exp 4 5,8
Exp 5 6,7
Exp 6 7,4
Exp 7 7,1
Exp 8 5,9
Extração sólido-líquido
Água 9,5
Etanol PA 4,7
Tabela 4.7 – Quantidade de solução amostra, de metanol PA e de solução de DPPH para a
análise dos extratos
Concentração final das soluções amostra (µg/mL)
Volume de solução amostra (µL)
Volume de metanol PA
(µL)
Volume de solução do reagente
DPPH (µL)
Variável, de acordo com a
concentração da solução primária correspondente
10 590 5400
20 580 5400
30 570 5400
60 540 5400
80 520 5400
100 500 5400
Resultados e discussões
57 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
A atividade antioxidante é apresentada em CE50 (concentração efetiva a 50%). A Tabela
4.1 e Tabela 4.3 apresentam os valores de EC50 dos extratos obtidos por diferentes técnicas de
extração. É importante ressaltar que quanto menor o valor de CE50, maior a atividade
antioxidante do extrato analisado. Ou seja, uma menor quantidade de extrato é necessária para
inibir 50% da atividade dos radicais livres (DPPH).
Os extratos demonstraram bom potencial antioxidante, se comparado com outras plantas
medicinais e alguns vinhos (Tabela 2.1). Como se pode observar, os valores de CE50
determinados no presente trabalho estão coerentes com os valores médios encontrados na
literatura para várias plantas medicinais. Dito isso, o poder antioxidante dos extratos obtido
no presente trabalho é menor que o do extrato de Arrabidaea chica obtido por Jorge (2008) –
ver item 2.5. Isto provavelmente ocorreu devido a diferenças relacionadas à fonte da matéria-
prima (solo, tipo de plantio, condições climáticas etc.).
Outro ponto importante a se observar é que, nas extrações sólido-líquido, o extrato
etanólico apresenta maior poder antioxidante do que o extrato aquoso.
4.6. Determinação do teor de Compostos Fenólicos Totais (CFT) – Método
espectrofotométrico de Folin-Ciocalteau
O teor de compostos fenólicos totais dos extratos das folhas da Arrabidaea chica foi
avaliado a partir dos extratos oriundos das extrações supercrítica e sólido-líquido. A análise
foi realizada através do método de Folin-Ciocalteau, e como padrão de referência foi utilizado
o ácido gálico (ver item 3.6).
A preparação das diluições para construção da curva padrão de ácido gálico seguiu o
planejamento apresentado na Tabela 4.8 (reagente de Folin-Ciocalteau da Sigma-Aldrich,
EUA). A curva, para as diferentes concentrações testadas, está apresentada na Figura 4.5. A
equação da reta gerada por esta curva foi utilizada para o cálculo do teor de compostos
fenólicos totais das amostras. Os dados experimentais de absorbância utilizados para a
construção da curva podem ser visualizados no Apêndice E.
Resultados e discussões
58 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
Tabela 4.8 – Quantidade de reagentes e solventes utilizados para construção da curva de calibração com ácido gálico
Concentração final soluções
Ác. Gálico (µg/mL)
Volume de solução
Ác. Gálico 0,5 mg/mL
(µL)
Volume de água
destilada (µL)
Volume de reagente
Folin-Ciocalteau
(µL)
Volume de solução Na2CO3
15% (µL)
1,0 20 9180 200 600
2,5 50 9150 200 600
5,0 100 9100 200 600
7,5 150 9050 200 600
10,0 200 9000 200 600
12,5 250 8950 200 600
15,0 300 8900 200 600
20,0 400 8800 200 600
Figura 4.5 – Curva padrão de ácido gálico [Absorbância versus Conc. Ácido Gálico (µg/mL)].
Todas as análises de teor de compostos fenólicos totais que foram realizadas com as
amostras seguiram o planejamento descrito na Tabela 4.9.
y = 0,0578x - 0,0086
R² = 0,9971
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
1,25
0 5 10 15 20 25
Ab
sorb
ânci
a (7
60
nm
)
Concentração de ácido gálico (µg/mL)
Resultados e discussões
59 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
Tabela 4.9 – Quantidade de reagentes e solventes utilizados para quantificação de compostos fenólicos totais em extratos de Arrabidaea chica
Concentração final das soluções
dos extratos (µg/mL)
Volume de solução amostra
(µL)
Volume de água
destilada (µL)
Volume de reagente
Folin-Ciocalteau (µL)
Volume de solução Na2CO3
15% (µL)
Variável, de acordo com a
concentração da solução primária correspondente (ver Tabela 4.6)
200 9000 200 600
500 8700 200 600
1000 8200 200 600
2000 7200 200 600
A Tabela 4.1 e Tabela 4.3 apresentam os valores de teor de compostos fenólicos totais
dos extratos obtidos por diferentes técnicas de extração. Quanto às extrações supercríticas
(Tabela 4.1), é possível notar que não há uma variação significativa nos teores de compostos
fenólicos totais obtidos. Além disso, é possível observar que há uma boa correlação entre o
teor de compostos fenólicos e a atividade antioxidante dos extratos (por exemplo, o extrato do
experimento 4, que apresenta a melhor atividade antioxidante entre as extrações supercríticas,
também apresenta o maior teor de compostos fenólicos totais). Porém, é importante destacar
que a relação entre estas variáveis resposta não é direta.
Quanto às extrações sólido-líquido (Tabela 4.3), observa-se que o teor de compostos
fenólicos do extrato etanólico é superior ao do extrato aquoso, o que é coerente com a
literatura (Paula et al., 2013) e com o fato de a atividade antioxidante do extrato etanólico ser
superior a do extrato aquoso (ver item 4.5).
Os extratos apresentaram teores de compostos fenólicos totais coerentes com os valores
médios encontrados na literatura para várias plantas medicinais (Tabela 2.2).
4.7. Otimização do planejamento experimental
O processo de otimização do planejamento experimental consiste na identificação dos
experimentos que apresentaram os melhores resultados, ou seja, aqueles que combinaram alto
valor de rendimento com boa atividade antioxidante, elevado teor de Carajurina e alta
concentração de compostos fenólicos totais.
Conforme pode ser observado na Tabela 4.1, não se trata de uma identificação direta.
Por exemplo, o experimento 3 apresenta o maior valor de rendimento (32,0%) entre as
Resultados e discussões
60 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
extrações supercríticas, porém baixa atividade antioxidante (CE50 = 74,17 µg/mL) e reduzido
teor de compostos fenólicos totais (60,33 mg EAG/g extrato). Já o experimento 4 apresenta o
melhor potencial antioxidante e maiores teores de Carajurina e de compostos fenólicos totais
entre as extrações supercríticas (respectivamente: CE50 = 38,34 µg/mL; 2,21%; e 88,62 mg
EAG/g extrato), porém o menor rendimento (15,1%).
Para atingir este objetivo, foi desenvolvida uma metodologia de otimização, que permite
também identificar os níveis das variáveis independentes que devem ser empregados para
obtenção de resultados otimizados.
Para isso, inicialmente procedeu-se à classificação dos resultados obtidos (variáveis
resposta). Por exemplo, quanto ao rendimento: o maior rendimento recebe a posição 1, o
segundo maior rendimento a posição 2, e assim por diante, até a posição 8 (já que no presente
trabalho foram realizadas 8 extrações supercríticas). A mesma lógica se aplica aos teores de
Carajurina e de compostos fenólicos totais. Já com relação à atividade antioxidante, a lógica é
inversa, já que quanto menor o valor de CE50, melhor o potencial antioxidante do extrato.
Assim, o menor valor de CE50 recebe a posição 1, e assim por diante, até o maior valor de
CE50 (posição 8). A classificação pode ser visualizada na Tabela 4.10.
Tabela 4.10 – Classificação dos resultados obtidos nas extrações supercríticas
Posição % Rendimento
(%m/m) % Carajurina
(%m/m) CE50
(μg/mL)
CFT (mg EAG/ g extrato)
1 32,0 2,21 38,34 88,62
2 25,1 1,82 42,49 75,84
3 24,0 1,65 43,95 75,49
4 23,7 1,52 46,57 70,65
5 19,0 1,48 50,07 65,76
6 17,9 1,41 61,28 61,17
7 15,8 1,32 74,17 60,33
8 15,1 1,00 86,13 48,93
Resultados e discussões
61 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
A partir desta classificação, é possível ordenar os experimentos conforme seus
resultados. Através da comparação da Tabela 4.1 com a Tabela 4.10, tem-se a Tabela 4.11,
que apresenta uma classificação dos experimentos de acordo com os resultados obtidos.
Tabela 4.11 – Classificação dos experimentos supercríticos em função do rendimento, da
atividade antioxidante (AA) e dos teores de Carajurina e de compostos fenólicos totais (CFT)
Exp. Posição
Rendimento Posição
AA Posição
Carajurina Posição
CFT Resultado Ordem
1 7 6 8 8 29 8
2 4 5 6 2 17 3
3 1 7 3 7 18 4
4 8 1 1 1 11 2
5 2 8 4 6 20 6
6 5 3 7 5 20 7
7 6 4 5 4 19 5
8 3 2 2 3 10 1
Na Tabela 4.11, a coluna “Resultado” é a soma das colunas “Posição Rendimento”,
“Posição AA”, “Posição Carajurina” e “Posição CFT”. Ou seja, quanto menor o valor da
coluna “Resultado”, mais otimizado o resultado do experimento, pois significa que os valores
de rendimento, atividade antioxidante e teores de Carajurina e de compostos fenólicos totais
alcançaram boas posições (ou seja, posições baixas). Isto é refletido na coluna “Ordem”, que
simplesmente classifica os experimentos de acordo com a coluna “Resultado” (quanto menor
o valor da coluna “Resultado”, melhor a classificação).
Há de se destacar que alguns experimentos possuem o mesmo valor na coluna
“Resultado”, e para se realizar a classificação, foi necessário dar prioridade a uma das
variáveis resposta. Assim, em caso de empate, o experimento melhor classificado é aquele
que apresenta o maior rendimento (ou seja, o menor valor na coluna “Posição Rendimento”).
Através da Tabela 4.11, é possível observar que o experimento 8 apresentou o melhor
resultado, enquanto o experimento 1 apresentou o pior. Nota-se que o experimento 8
apresenta, dentre as extrações supercríticas realizadas no presente trabalho, o terceiro melhor
Resultados e discussões
62 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
rendimento, segundo maior teor de Carajurina, terceira maior concentração de compostos
fenólicos totais e segundo melhor potencial antioxidante.
Através da Tabela 4.1, observam-se, neste experimento, os níveis mínimos de todas as
variáveis independentes (pressão: 200 bar; temperatura: 40 °C; concentração de CO2: 70%
v/v; e concentração de água no co-solvente: 30% v/v). À exceção da concentração de CO2,
cujo nível mínimo é consequentemente o nível máximo de concentração de co-solvente (30%
v/v), este resultado indica que, dentro da faixa estudada, é possível obter o resultado ótimo
utilizando condições operacionais mais amenas, o que implica em menores custos e maior
facilidade de operação.
Capítulo 5
Conclusão
Conclusão
64 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
5. Conclusão
A partir dos resultados obtidos no presente trabalho e as discussões dos mesmos, foi possível
chegar às conclusões expostas a seguir.
Quanto aos experimentos supercríticos:
� A concentração de co-solvente apresentou efeito significativo sobre a variável resposta
rendimento em massa.
� Dentro da faixa estudada, nenhuma variável apresentou efeito significativo sobre a
variável resposta teor de Carajurina.
� Os rendimentos (massa de extrato seco obtido/ massa de matéria prima utilizada) para
o processo de extração supercrítica variaram de 15,1% a 32%
� Dentro da faixa operacional avaliada, o mais alto rendimento (32%) foi obtido na
seguinte condição: nível alto de pressão (250 bar), concentração de co-solvente (30%)
e concentração de água (50%) e nível baixo de temperatura (40 °C).
Quanto à extração sólido-líquido:
� As extrações sólido-líquido apresentaram um rendimento em massa de 8,1% quando
utilizou-se água e 5,5% com a utilização do etanol.
Quanto às análises cromatográficas:
� As concentrações de Carajurina para o processo de extração supercrítica variaram
entre 1% e 2,21%. A condição que apresentou a maior concentração (2,21%) foi: nível
alto de concentração de água (50%) e nível baixo de pressão (200 bar), temperatura
(40 °C) e concentração de co-solvente (20%).
� Quanto à extração sólido-líquido, obteve-se alta concentração de Carajurina (7,04%)
quando utilizou-se etanol como solvente. Na extração com água, não foi detectada
presença de Carajurina.
Conclusão
65 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
Quanto à atividade antioxidante:
� A quantificação da atividade antioxidante utilizando o método do DPPH resultou em
valores de CE50 que variaram entre 38,34 e 86,13 µg/mL para os extratos supercríticos,
enquanto que para as extrações sólido-líquido com água e etanol resultaram em 167,34
e 42,58 µg/mL, respectivamente. Desta forma, os extratos obtidos por todas as
técnicas demonstraram bom poder antioxidante se comparado com outros
antioxidantes naturais reportados na literatura.
Quanto ao teor de compostos fenólicos totais:
� A quantificação dos compostos fenólicos totais utilizando o método de Folin-
Ciocalteau resultou em valores que variaram entre 48,93 e 88,62 mg EAG/g extrato
para os extratos supercríticos, enquanto que para as extrações sólido-líquido com água
e etanol resultaram em 37,63 e 80,54 mg EAG/g extrato, respectivamente. Não houve
variação significativa dos teores nos extratos supercríticos. O extrato etanólico
apresentou maior teor de fenólicos que o extrato aquoso (extração sólido-líquido), o
que é coerente com a literatura e com a atividade antioxidante destes extratos.
Quanto à otimização do planejamento experimental:
� O experimento 8 (pressão: 200 bar; temperatura: 40 °C; concentração de CO2: 70%
v/v; concentração de água no co-solvente: 30% v/v) apresentou o melhor resultado em
termos das variáveis resposta estudadas: terceiro maior rendimento, segundo maior
teor de Carajurina, terceira maior concentração de compostos fenólicos totais e
segundo melhor potencial antioxidante. Destaca-se que, neste experimento, as
variáveis independentes estão em seu nível mínimo, o que significa que é possível
obter um resultado otimizado em condições operacionais mais amenas, implicando em
menores custos e maior facilidade de operação.
Conclusão
66 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
Quanto a aspectos econômicos:
� A presença de água no co-solvente da extração supercrítica ou o uso deste solvente na
extração sólido-líquido, além de incrementar o rendimento da extração, ainda traz
como resultado positivo o barateamento do processo.
� Se o interesse da extração for maior teor de Carajurina, o processo ideal é a extração
sólido-líquido com etanol, que é uma opção mais barata que a extração supercrítica.
Referências Bibliográficas
Referências Bibliográficas
68 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
6. Referências
AFONSO, G. Utilização da metodologia de superfície de resposta no desenvolvimento de um
molho tipo Pesto visando a atividade antioxidante. 2006. Dissertação (Mestrado) – Programa
de Pós-Graduação Interunidades em Nutrição Humana Aplicada, Universidade de São Paulo,
São Paulo/SP.
ALVES, M. S. M.; MENDES, P. C.; VIEIRA, J. G. P.; OZELA, E. F.; BARBOSA, W. L. R.;
SILVA JÚNIOR, J. O. C. Análise farmacognóstica das folhas de Arrabidaea chica (Humb. &
Bonpl.) B. Verlt., Bignoniaceae. Brazilian Journal of Pharmacognosy, v. 20, p. 215-221, 2010.
ANGELO, P. M.; JORGE, N. Compostos fenólicos em alimentos – Uma breve revisão. Rev.
Inst. Adolfo Lutz, v. 66, p. 1-9, 2007.
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RDC nº 64, de 16 de
Setembro de 2008. Disponível em http://portal.anvisa.gov.br, acesso em 09/06/2015.
ARAÚJO, A. L. M. Polpa de jambolão (Syzygium cumini) desidratada por liofilização e
secagem em leito de jorro: caracterização físico-química e funcional e impacto da secagem.
2014. Dissertação (Mestrado em Engenharia Química) – Centro de Tecnologia, Programa de
Pós-Graduação em Engenharia Química, Universidade Federal do Rio Grande do Norte,
Natal.
BAGCHI, D.; GARG, A.; KROHN, R. L.; BAGCHI, M.; BAGCHI, B. J.; BALMOORI, J.
Protective effects of grape seed proanthocyanidins and selected antioxidants against TPA-
induced hepatic and brain lipid peroxidation and DNA fragmentation, and peritoneal
macrophage activation in mice. General Pharmacology, v. 30, p. 771-776, 1998.
BAGGIO, J. Avaliação dos resíduos (casca e pó orgânico) de café (Coffea arabica L.) como
provável fonte de substâncias bioativas. 2006. 77 p. Dissertação (Mestrado em Ciência dos
Alimentos) – Centro de Ciências Agrárias, Departamento de Ciência e Tecnologia de
Referências Bibliográficas
69 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
Alimentos, Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos, Universidade Federal de
Santa Catarina, Florianópolis/SC.
BALUNAS, M. J.; KINGHORN, D. A. Drug discovery from medicinal plants. Life Sciences,
v. 28, p. 431-441, 2005.
BARBOSA, W. L. R.; PINTO, L. N.; QUIGNARD, E.; VIEIRA, J. M. S.; SILVA JÚNIOR.,
J. O. C.; ALBUQUERQUE, S. Arrabidaea chica (HBK) Verlot: phytochemical approach,
antifungal and trypanocidal activities. Brazilian Journal of Pharmacognosy, v. 18, p. 544-548,
2008.
BENOVÁ, B.; ADAM, M.; PAVLÍKOVÁ, P.; FISCHER, J. Supercritical fluid extraction of
piceid, resveratrol and emodin from Japanese knotweed. The Journal of Supercritical Fluids,
v. 51, p. 325-330, 2010.
BITENCOURT, R. G.; QUEIROGA, C. L.; DUARTE, G. H. B.; EBERLIN, M. N.; KOHN,
L. K.; ARNS, C. W.; CABRAL, F. A. Sequential extraction of bioactive compounds from
Melia azedarach L. in fixed bed extractor using CO2, ethanol and water. The Journal of
Supercritical Fluids, v. 95, p. 355-363, 2014.
BRUNNER, G. Gas extraction: An introduction to fundamentals of supercritical fluids and
the application to separation processes. New York: Springer, 1994, 386p.
CALIXTO, J. B. Medicamentos fitoterápicos. In: Plantas medicinais sob a ótica da química
medicinal moderna. In: YUNES, R. A.; CALIXTO, J. B., ed. Argos, Chapecó, 2001.
CASAGRANDE, M. Avaliação do potencial antioxidante de coprodutos de indústrias de
suco de uva e de vinho visando sua aplicação em linguiça de frango. 2014. 121 f. Dissertação
(Mestrado em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos) – Programa de Pós-
Graduação em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos, Universidade Tecnológica
Federal do Paraná, Pato Branco.
Referências Bibliográficas
70 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
CASTAÑEDA-OVANDO, A.; PACHECO-HERNÁNDEZ M. L.; PÁEZ-HERNÁNDEZ, M.
E.; RODRÍGUEZ, J. A.; GALÁN-VIDAL, C. A. Chemical studies of anthocyanins: A review.
Food Chemistry, v. 113, p. 859-871, 2009.
CERQUEIRA, F. M.; MEDEIROS, M. H. G.; AUGUSTO, O. Antioxidantes dietéticos:
controvérsias e perspectivas. Química Nova, São Paulo, v. 30, n. 2, p. 441-449, 2007.
CHAPMAN, E.; PERKIN, A. G.; ROBINSON, R. The colouring matters of Carajura.
Journal of the Chemical Society (London), p. 3015-3041, 1927.
COLLINS, C. H.; BRAGA, G. L.; BONATO, P. S. Introdução a métodos cromatográficos. 5a
ed. Campinas: Editora da Unicamp, 1993.
CRUZ, A. P. G. Avaliação do efeito da extração e da microfiltração do açaí sobre sua
composição e atividade antioxidante. 2008. 88f. Dissertação (Mestrado em Ciências) –
Instituto de Química, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Universidade Federal do
Rio de Janeiro, Rio de Janeiro/RJ.
DALMOLIN, I.; MAZUTTI, M. A.; BATISTA, E. A. C.; MEIRELES, M. A. A.;
OLIVEIRA, J. V. Chemical characterization and phase behaviour of grape seed oil in
compressed carbon dioxide and ethanol as co-solvent. The Journal of Chemical
Thermodynamics, v. 42, p. 797-801, 2010.
DEVIA, B.; LLABRES, G.; WOUTERS, J.; DUPONT, L.; ESCRIBANO-BAILON, M. T.;
PASCUAL-TERESA, S.; ANGENOT, L.; TITS, M. New 3-Desoxyanthocyanidins from
leaves of Arrabidaea chica. Phytochemical Analysis, v. 13, p. 114-120, 2002.
FLANZY, C. Enología: Fundamentos Científicos Y Tecnológicos. Editora Madrid: Mundi
Prensa, 1a ed., 783p, 2000.
GALVÃO, E. L. Extração do óleo essencial de Cymbopogon winterianus J. com CO2
pressurizado. 2004. 99p. Dissertação (Mestrado em Engenharia Química) – Centro de
Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Universidade Federal do
Rio Grande do Norte, Natal.
Referências Bibliográficas
71 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
GALVÃO, E. L. Extração supercrítica do óleo de linhaça: construção do extrator, estudo de
parâmetros de processo, avaliação química e antioxidante do produto. 2009. 142 f. Tese
(Doutorado em Engenharia Química) – Centro de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação
em Engenharia Química, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal.
GARCIA-MENDOZA, M. P.; PAULA, J. T.; PAVIANI, L. C.; CABRAL, F. A.;
MARTINEZ-CORREA, H. A. Extracts from mango peel by-product obtained by
supercritical CO2 and pressurized solvent processes. LWT – Food Science and Technology,
v. 62, p. 131-137, 2015.
GARMUS, T. T.; PAVIANI, L. C.; QUEIROGA, C. L.; CABRAL, F. A. Extraction of
phenolic compounds from pepper-rosmarin (Lippia sidoides Cham.) leaves by sequential
extraction in fixed bed extractor using supercritical CO2, ethanol and water as solvents. The
Journal of Supercritical Fluids, v. 99, p. 68-75, 2015.
GOMES, S. M. C. Determinação de antioxidantes por cromatografia líquida de alta pressão
com detecção electroquímica. 2010. Dissertação (Mestrado em Química) - Universidade de
Coimbra.
GUCLU-USTUNDAG, O.; TEMELLI, F. Solubility behavior of ternary systems of lipids,
cosolvents and supercritical carbon dioxide and processing aspects. J. Supercrit. Fluids, v.
36, n. 1, p. 1-15, 2005.
GONÇALVES, A. E. S. S. Avaliação da capacidade antioxidante de frutas e polpas de frutas
nativas e determinação dos teores de flavonóides e vitamina C. 2008. Dissertação (Mestrado
em Ciências Farmacêuticas) – Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Programa de Pós-
Graduação em Ciência dos Alimentos, Universidade de São Paulo, São Paulo/SP.
HAMINIUK, C. W. I.; MACIEL, G. M.; PLATA-OVIEDO, M. S. V.; PERALTA, R. M.
Phenolic compounds in fruits – an overview. International Journal of Food Science and
Technology, v. 47, p. 2023-2044, 2012.
HARBORNE, J. B.; WILLIAMS, C. A. Anthocyanins and other flavonoids. Natural Product
Report, v. 15, p. 631-652, 1998.
Referências Bibliográficas
72 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
HARRIS, C. S.; BURT, A. J.; SALEEM, A.; LE, P. M.; MARTINEAU, L. C.; HADDAD, P.
S.; BENNETT, S. A.; ARNASON, J. T. A single HPLC-PAD-APCI/MS method for the
quantitative comparison of phenolic compounds found in leaf, stem, root and fruit extracts of
Vaccinium angustifolium. Phytochemical Analysis, v. 18, p. 161-169, 2007.
HIRSCH, G. E. Valor nutricional e capacidade antioxidante de diferentes genótipos de
amora-preta (Rubus sp.). 2011. Dissertação (Mestrado em Ciência e Tecnologia dos
Alimentos) – Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos,
Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria/RS.
HOFLING, J. F.; ANIBAL, P. C.; OBANDO-PEREDA, G. A.; PEIXOTO, I. A. T.;
FURLETTI, V. F.; FOGLIO, M. A.; GONÇALVES, R. B. Antimicrobial potential of some
plant extracts aginst Candida species. Brazilian Journal of Biology, vol. 70, no. 4, p. 1065-
1068, 2010.
HUBINGER, S. Z. Estudo farmacognóstico e desenvolvimento de fitocosmético de ação
antioxidante dos frutos de Dimorphandra mollis Benth. (Leguminosae-Caesalpinioideae).
2009. 148 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) – Faculdade de Ciências
Farmacêuticas, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Araraquara/SP.
JORGE, M. P. Atividade cicatrizante do extrato bruto de Arrabidaea chica (Humb. & Bonpl.)
Verlot. 2008. Dissertação (Mestrado em Clínica Médica) – Faculdade de Ciências Médicas,
Pós-Graduação da Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Estadual de Campinas,
Campinas/SP.
KAHKONEN, M. P.; HOPIA, A. I.; HEINONEN, M. Berry phenolics and their antioxidant
activity. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 49, p. 4076-4082, 2001.
KALEGARI, M. Composição fitoquímica e atividades biológicas de Rourea induta Planch,
Connaraceae. 2009. 119 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) – Setor de
Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade
Federal do Paraná, Curitiba/PR.
KONCZAK, I.; ZHANG, W. Anthocyanins-more than naturés colours. Journal of
Biomedicine and Biotechnology, p. 239-240, 2004.
Referências Bibliográficas
73 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
KONG, J. M.; CHIA, L. S.; GOH, N. K.; CHIA, T. F.; BROUILLARD, R. Analysis and
biological activities of anthocyanins. Phytochemistry, v. 64, p. 923-933, 2003.
LU, H.; NI, W.; LIANG, Y.; MAN, R. Supercritical CO2 extraction of emodin and physcion
from Polygonum cuspidatum and subsequent isolation by semipreparative chromatography.
Journal of Separation Science, v. 29, p. 2136-2142, 2006.
LUCENA, A. P. S.; OLIVEIRA, E. J.; NASCIMENTO, R. J. B.; MACIEL, J. A. C.;
TAVARES, J. X.; BARBOSA-FILHO, J. M. Antioxidant activity and phenolics content of
selected Brazilian wines. Journal of Food Composition and Analysis, v. 23, p. 30-36, 2010.
LULE, S. U.; XIA, W. Food phenolics, pros and cons: a review. Food Reviews International,
v. 21, p. 367-388, 2005.
MALACRIDA, C. R.; MOTTA, S. Antocianinas em suco de uva: composição e estabilidade.
Boletim do Centro de Pesquisa e Processamento de Alimentos (CEPPA), Curitiba, v. 24, n. 1,
p. 59-82, 2006.
MARTINEZ-CORREA, H. A.; MAGALHÃES, P. M.; QUEIROGA, C. L.; PEIXOTO, C. A.;
OLIVEIRA, A. L.; CABRAL, F. A. Extracts from pitanga (Eugenia uniflora L.) leaves:
influence of extraction process on antioxidant properties and yield of phenolic compounds.
The Journal of Supercritical Fluids, v. 55, p. 998-1006, 2011.
MARTINEZ-CORREA, H. A.; CABRAL, F. A.; MAGALHÃES, P. M.; QUEIROGA, C. L.;
GODOY, A. T.; SÁNCHEZ-CAMARGO, A. P.; PAVIANI, L. C. Extracts from the leaves of
Baccharis dracunculifolia obtained by a combination of extraction processes with
supercritical CO2, ethanol and water. The Journal of Supercritical Fluids, v. 63, p. 31-39,
2012.
MARTINS, C. M. Estudo químico, atividade antioxidante, atividade antimicrobiana e análise
do óleo essencial da espécie Kielmeyera coriacea Mart. & Zucc (Pau-santo) do Cerrado.
2012. Dissertação (Mestrado em Química) – Instituto de Química, Programa de Pós-
Graduação em Química, Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia.
Referências Bibliográficas
74 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
MELO, E. A.; MACIEL, M. I. S.; LIMA, V. L. A. G.; SANTANA, A. P. M. Capacidade
antioxidante de hortaliças submetidas a tratamento térmico. Nutrire: Revista da Sociedade
Brasileira de Alimentação e Nutrição, v. 34, n. 1, p. 85-95, 2009.
MELECCHI, M. I. S. Caracterização química de extratos de Hibiscus tiliaceus L.: estudo
comparativo de métodos de extração. 2005. 218f. Tese (Doutorado em Química) – Instituto
de Química, Programa de Pós-Graduação em Química, Universidade Federal do Rio Grande
do Sul, Porto Alegre/RS.
MESOMO, M. C. Obtenção de extrato de gengibre (Zingiber officinale Roscoe) usando CO2
supercrítico e propano comprimido: cinética de extração e atividade biológica. 2013. 74f.
Tese (Doutorado em Engenharia de Alimentos) – Setor de Tecnologia, Programa de Pós-
Graduação em Engenharia de Alimentos, Universidade Federal do Paraná, Curitiba/PR.
MICHEL, A. F. R. M.; MELO, M. M.; CAMPOS, P. P.; OLIVEIRA, M. S.; OLIVEIRA, F.
A. S.; CASSALI, G. D.; FERRAZ, V. P.; COTA, B. B.; ANDRADE, S. P.; SOUZA-
FAGUNDES, E. M. Evaluation of anti-inflammatory, antiangiogenic and antiproliferative
activities of Arrabidaea chica crude extracts. Journal of Ethnopharmacology, n. 165, p. 29-
38, 2015.
MICHIELIN, E. M. Z. Avaliação do processo de extração com fluido supercrítico da
oleoresina de Cavalinha (Equisetum arvense). 2002. Dissertação (Mestrado em Engenharia
de Alimentos) – Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de
Alimentos, Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis.
NASCIMENTO, R. J. Potencial antioxidante do resíduo agroindustrial da goiaba. 2010.
Dissertação (Mestrado em Ciência e Tecnologia de Alimentos) – Departamento de Ciências
Domésticas, Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos,
Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife/PE.
NEWMAN D. J.; CRAGG, G. M. Natural products as sources of new drugs over the last 25
years. Journal of Natural Products, v. 70, p. 461-77, 2007.
Referências Bibliográficas
75 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
NICHENAMETLA, S. N. TARUSCIO, T. G.; BARNEY, D. L.; EXON, J. H. A review of the
effects and mechanisms of polyphenolics in cancer. Critical Reviews in Food Science and
Nutrition, v. 46, p. 161-183, 2006.
OLIVEIRA, D. A. Caracterização fitoquímica e biológica dos extratos obtidos de bagaço de
uva (vitis vinifera) das variedades merlot e syrah. 2010. 211f. Dissertação (Mestrado em
Engenharia de Alimentos) – Centro Tecnológico, Departamento de Engenharia de Alimentos,
Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos, Universidade Federal de Santa
Catarina, Florianópolis/SC.
OLIVEIRA, D. P. C.; BORRÁS, M. R. L.; FERREIRA, L. C. L.; LÓPEZ-LOZANO, J. L.
Atividade anti-inflamatória do extrato aquoso de Arrabidaea chica (Humb. & Bonpl.) B. Verl.
sobre o edema induzidos por venenos de serpentes amazônicas. Brazilian Journal of
Pharmacognosy, v. 19, p. 643-649, 2009.
PAI, M. R.; ACHARYA, L. D.; UDUPA, N. Evaluation of antiplaque activity of Azadirachta
indica leaf extract gel – a 6-week clinical study. Journal of Ethnopharmacology, v. 90, p. 99-
103, 2004.
PAULA, J. T.; LOSIANE, C. P.; FOGLIO, M. A.; SOUSA, I. M. O.; CABRAL, F. A.
Extraction of anthocyanins from Arrabidaea chica in fixed bed using CO2 and
CO2/ethanol/water mixtures as solvents. The Journal of Supercritical Fluids, n. 81, p. 33-41,
2013.
PAULA, J. T.; LOSIANE, C. P.; FOGLIO, M. A.; SOUSA, I. M. O.; DUARTE, G. H. B.;
JORGE, M. P.; EBERLIN, M. N.; CABRAL, F. A. Extraction of anthocyanins and luteolin
from Arrabidaea chica by sequential extraction in fixed bed using supercritical CO2, ethanol
and water as solvents. The Journal of Supercritical Fluids, n. 86, p. 100-107, 2014.
PAULA, J. T. Obtenção de extratos de folhas de Arrabidaea chica (Humb. Bonpl.) Verlot por
extração fracionada em leito fixo a alta pressão usando dióxido de carbono supercrítico,
etanol e água como solventes. 2013. Dissertação (Mestrado em Engenharia de Alimentos) –
Faculdade de Engenharia de Alimentos, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de
Alimentos, Universidade Estadual de Campinas, Campinas/SP.
Referências Bibliográficas
76 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
PAULETTI, P. M.; BOLZANI, V. S.; YOUNG, M. C. M. Constituintes químicos de
Arrabidaea samydoides (Bignoniaceae). Química Nova, v. 26, n. 5, p. 641-643, 2003.
RAMALHO, V. C.; JORGE, N. Antioxidantes utilizados em óleos, gorduras e alimentos
gordurosos. Química Nova, v. 29, n. 4, 2006.
REÁTEGUI, J. L. P. Extração de compostos do bagaço de amora-preta (Rubus sp.) usando
CO2 supercrítico assistido por ultrasom. 2014. Dissertação (Mestrado em Engenharia de
Alimentos) – Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas,
Campinas.
REIN, M. Copigmentation reactions and color stability of berry anthocyanins. Helsinki:
University of Helsinki, pp. 10-14, 2005.
REZENDE, L. C. Avaliação da atividade antioxidante e composição química de seis frutas
tropicais consumidas na Bahia. 2010. Tese (Doutorado em Química) – Instituto de Química,
Programa de Pós-Graduação em Química, Universidade Federal da Bahia, Salvador/BA.
ROCHA, C. Q.; VILELA, F. C.; CAVALCANTE, G. P.; SANTA-CECÍLIA, F. V.;
SANTOS-E-SILVA, L.; SANTOS, M. H.; GIUSTI-PAIVA, A. Anti-inflammatory and
antinociceptive effects of Arrabidaea brachypoda (DC.) Bureau roots. Journal of
Ethnopharmacology, v. 133, p. 396-401, 2011.
ROGINSKI, V.; LISSI, E. A. Review of methods to determine chain-breaking antioxidant
activity in food. Food Chemistry, Kidlington, v. 92, n. 2, p. 235-254, 2005.
SAITO, S. T. Estudo químico e avaliação da atividade antioxidante de chá-verde brasileiro
(Camellia sinensis var. assamica) cultivar IAC-259. 2007. 112 f. Dissertação (Mestrado em
Ciências Farmacêuticas) – Faculdade de Farmácia, Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre/RS.
SANTOS, D. N. E. Extração com dióxido de carbon supercrítico e estudo da composição dos
extratos de sementes de Pitanga (Eugenia uniflora L.). 2012. 99 f. Dissertação (Mesttrado em
Ciências da Engenharia de Alimentos) – Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos,
Departamento de Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo, Pirassununga.
Referências Bibliográficas
77 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
SANTOS, E. R. M. Extração, caracterização e avaliação bioativa do extrato de Rumex
acetosa. 2013. 90 f. Dissertação (Mestrado em Engenharia Química) – Centro de Tecnologia,
Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Universidade Federal do Rio Grande
do Norte, Natal.
SCALBERT, A.; MANACH, C.; MORAND, C.; RÉMÉSY, C. Dietary polyphenols and the
prevention of diseases. Critical Review in Food Science and Nutrition, v. 45, p. 287-306,
2005.
SCOGIN, R. Anthocyanins of the Bignoniaceae. Biochemical Systematics and Ecology, v. 8,
p. 273-276, 1980.
SEABRA, I. J.; BRAGA, M. E. M.; BATISTA, M. T.; SOUSA, H. C. Effect of solvent
(CO2/ethanol/H2O) on the fractionated enhanced solvent extraction of anthocyanins from
elderberry pomace. The Journal of Supercritical Fluids, v. 54, p. 145-152, 2010.
SEQUEIRA, C. B. Análise de açúcares e ácidos orgânicos em sumos comerciais: aplicação
de HPLC-SEC-UV-IR e língua eletrónica. 2012. Dissertação (Mestrado em Qualidade e
Segurança Alimentar) – Escola Superior Agrária, Instituto Politécnico de Bragança, Bragança.
SERRA, A. T.; SEABRA, I. J.; BRAGA, M. E. M.; BRONZE, M. R.; SOUSA,, H. C.;
DUARTE, C. M. M. Processing cherries (Prunus avium) using supercritical fluid technology.
Part 1: Recovery of extract fractions rich in bioactive compounds. The Journal of
Supercritical Fluids, v. 55, p. 184-191, 2010.
SILVA, P. D. Determinação de compostos fenólicos por HPLC. 2012. Dissertação (Mestrado
em Química Industrial) – Universidade da Beira Interior, Covilhã.
SIMÕES, C. M. O.; SCHENKEL, E. P.; GOSMANN, G.; MELLO, J. C. P.; MENTZ, L. A.;
PETROVICK, P. R. Farmacognosia: da planta ao medicamento. Florianópolis: Editora da
UFSC; Porto Alegre: Editora da UFRGS, 2007.
Referências Bibliográficas
78 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
SINGLETON, V. L.; ROSSI, J. A. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-
phosphotungstic acid reagents. American Journal of Enology and Viniculture, v. 16, p. 144-
158, 1965.
SKOOG, D. A.; HOLLER, F. J.; NIEMAN, T. A. Princípios de análise instrumental. 5a ed.
Porto Alegre: Bookman (SBQ), p. 598-676, 2002.
SMITH, J. M.; VAN NESS, H. C; ABBOTT, M. M. Introdução à termodinâmica da
engenharia química. 7a ed. Rio de Janeiro: LTC, 2007.
SOUZA, A. S. As ações do extrato de Arrabidaea chica sobre o metabolismo hepático. 2007.
38 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) – Programa de Pós-Graduação em
Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Maringá, Maringá/PR.
STINTZING, F. C.; CARLE, R. Functional properties of anthocyanins and betalains in plants,
food, and in human nutrition. Trends in Food Science and Technology, v. 15, p. 19-38, 2004.
TAFFARELO, D. Extratos de Arrabidaea chica (Humb. & Bonpl.) Verlot obtidos por
processos biotecnológicos: otimização da extração e avaliação farmacológica. 2008. 191 f.
Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) – Instituto de Ciências Biomédicas, Programa de
Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia USP/Instituto Butantan/IPT, Universidade de
São Paulo, São Paulo/SP.
TAIZ, L.; ZEIGER, E. Fisiologia vegetal, 4a ed. São Paulo: Artmed, 819p, 2009.
TEMELLI, F. Perspectives on supercritical fluid processing of fats and oils. J. Supercrit.
Fluids, 2008.
TIVERON, A. P. Atividade antioxidante e composição fenólica de legumes e verduras
consumidos no Brasil. 2010. 102f. Dissertação (Mestrado em Ciências) – Escola Superior de
Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade de São Paulo, Piracicaba.
TREYBAL, R. E. Mass transfer operations. 3 ed. McGraw-Hill Book Co., 1981.
Referências Bibliográficas
79 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
TSUDA, T.; UENO, Y.; YOSHIKAWA, T. Microarray profiling of gene expression. In
human adipocytes in response to anthocyanins. Biochemical Pharmacology, v. 71, p. 1184-
1197, 2006.
TUROLLA, M. S. R.; NASCIMENTO, E. Informações toxicológicas de alguns fitoterápicos
utilizados no Brasil. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences, v. 42, p. 125-131, 2006.
UQUICHE, E.; DEL VALLE, J. M.; ORTIZ, J. Supercritical carbon dioxide extraction of red
pepper (Capsicum annuum L.) oleoresin. Journal of Food Engineering, v. 65, p. 55-66, 2004.
VALCHEVA-KUZMANOVA, S.; KUZMANOV, K.; TANCHEVA, S. Hypoglycemic and
hypolipidemic effects of Aronia melanocarpa fruit juice in streptozotocin induced diabetic
rats. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, v. 29, p. 101-105,
2007.
VALKON, M.; LEIBFRITZ, D.; MONCOL, J.; CRONIN, M. T. D.; MAZUR, M.; TELSER,
J. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. The
International Journal of Biochemistry and Cell Biology, v. 39, p. 44-84, 2007.
VASAPOLLO, G.; LONGO, L.; RESTIO, L.; CIURLIA, L. Innovative supercritical CO2
extraction of Lycopene from tomato in the presence of vegetable oil as co-solvent. Journal of
Supercritical Fluids, v. 29, n. 1-2, p. 87-96, 2004.
VEDANA, M. I. S. Efeito do processamento na atividade antioxidante da uva. 2008. 85f.
Dissertação (Mestrado em Tecnologia de Alimentos) – Setor de Tecnologia, Programa de
Pós-Graduação em Tecnologia de Alimentos, Universidade Federal do Paraná, Curitiba/PR.
WU, S. J.; TSAI, J. Y.; CHANG, S. P.; LIN, D. L.; WANG, S. S.; HUANG, S. N.; NG, L. T.
Supercritical carbon dioxide extract exhibits enhanced antioxidant and anti-inflammatory
activities of Physalis peruviana. Journal of Ethnopharmacology, v. 108, p. 407-413, 2006.
ZÁCARI, C. Z. Estabilidade oxidativa de óleo extra-virgem de castanha do Pará com ervas
aromáticas antioxidantes. 2008. Dissertação (Mestrado em Ciência e Tecnologia de
Referências Bibliográficas
80 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
Alimentos) - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Universidade de São Paulo,
Piracicaba/SP.
ZAFRA-STONE, S.; YASMIN, T.; BAGCHI, M. Berry anthocyanins as novel antioxidants
in human health and disease prevention. Molecular Nutrition & Food Research, v. 51, p. 675-
683, 2007.
ZORN, B.; GARCÍA-PIÑERES, A. J.; CASTRO, V.; MURILLO, R.; MORA, G.;
MERFORT, I. 3-Desoxyanthocyanidins from Arrabidaea chica. Phytochemistry, v. 56, p.
831-835, 2001.
Apêndices
Apêndices
82 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
7. Apêndices
7.1. Apêndice A – Curva de calibração da Carajurina
Tabela 7.1 – Concentração de Carajurina utilizada para confecção de curva analítica
Concentração (µg/mL) Área Carajurina
(mAU)
5 360039
10 720508
20 1510885
40 3042155
100 7639871
201 14838293
402 29180134
502 37353197
Figura 7.1 – Curva de calibração da Carajurina.
y = 73670x + 39447
R² = 0,9997
0,0E+00
5,0E+06
1,0E+07
1,5E+07
2,0E+07
2,5E+07
3,0E+07
3,5E+07
4,0E+07
0 100 200 300 400 500 600
Áre
a p
ico
car
aju
rin
a (m
AU
)
Concentração de carajurina (µg/mL)
Apêndices
83 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
7.2. Apêndice B – Diferenças de metodologia na extração supercrítica
Figura 7.2 – Comparativo entre metodologias de extração dos trabalhos de (a) Paula et al.
(2013), (b) Paula et al. (2014) e (c) do presente trabalho (R = resíduo; E = extrato)
1ª etapa
CO
2 su
perc
ríti
co
CO
2 su
perc
ríti
co
+ c
o-so
lven
te
Águ
a
2ª etapa 3ª etapa
Matéria-prima 1ª etapa
CO
2 su
perc
ríti
co
Águ
a
2ª etapa 3ª etapa
EtO
H p
ress
uriz
ado
Matéria-prima Etapa única
R R
R R
E E R
E E E R
CO
2 su
perc
ríti
co
+ c
o-so
lven
te
R E
(eta
nol +
águ
a)
(eta
nol +
águ
a)
E
Matéria-prima
(a)
(b)
(c)
Apêndices
84 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
7.3. Apêndice C – Cromatogramas
Figura 7.3 – Cromatograma do extrato supercrítico 1.
Figura 7.4 – Cromatograma do extrato supercrítico 2.
Figura 7.5 – Cromatograma do extrato supercrítico 3.
Minutes
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
mA
U
0
200
400
600
mA
U
0
200
400
600
6.6
64
9.0
14
17
.19
7
DAD-470 nm
ESC-1
ESC-1
Retention Time
Minutes
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
mA
U
0
200
400
mA
U
0
200
400
6.6
20
8.9
56
17
.13
8
DAD-470 nm
ESC-2
ESC-2
Retention Time
Minutes
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
mA
U
0
250
500
750
mA
U
0
250
500
750
6.6
06
8.9
74
17
.16
7
DAD-470 nm
ESC-3
ESC-3
Retention Time
Apêndices
85 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
Figura 7.6 – Cromatograma do extrato supercrítico 4.
Figura 7.7 – Cromatograma do extrato supercrítico 5.
Figura 7.8 – Cromatograma do extrato supercrítico 6.
Minutes
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
mA
U
0
250
500
750
mA
U
0
250
500
750
6.7
48
9.2
29
17
.42
9
DAD-470 nm
ESC-4
ESC-4
Retention Time
Minutes
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
mA
U
0
200
400
600
mA
U
0
200
400
600
6.7
47
9.2
14
17
.40
0
DAD-470 nm
ESC-5
ESC-5
Retention Time
Minutes
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
mA
U
0
200
400
600
mA
U
0
200
400
600
6.7
54
9.2
13
17
.40
6
DAD-470 nm
ESC-6
ESC-6
Retention Time
Apêndices
86 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
Figura 7.9 – Cromatograma do extrato supercrítico 7.
Figura 7.10 – Cromatograma do extrato supercrítico 8.
Figura 7.11 – Cromatograma do extrato aquoso.
Minutes
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
mA
U
0
200
400
600
mA
U
0
200
400
600
6.7
95
9.2
75
17
.46
0
DAD-470 nm
ESC-7
ESC-7
Retention Time
Minutes
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
mA
U
0
200
400
600
mA
U
0
200
400
600
6.8
23
9.3
10
17
.47
7
DAD-470 nm
ESC-8
ESC-8
Retention Time
Minutes
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
mA
U
0
20
40
60
mA
U
0
20
40
60
32
.02
4
DAD-470 nm
EC-1
EC-1
Retention Time
Apêndices
87 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
Figura 7.12 – Cromatograma do extrato etanólico.
Minutes
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
mA
U
0
1000
2000
mA
U
0
1000
2000
3.1
65 6
.61
0
9.1
94
17
.46
0
20
.02
52
0.7
17
21
.11
7
22
.65
72
3.0
98
24
.74
1
DAD-470 nm
EB-3
EB-3
Retention Time
Apêndices
88 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
7.4. Apêndice D – Tabela de cálculo do CE50 do Ácido Ascórbico
Tabela 7.2 – Cálculo do CE50 do ácido ascórbico
Padrão – Ácido Ascórbico
Concentração (μg/mL) Absorbância 1 Absorbância 2 Média %AS
0,5 0,5158 0,5074 0,5116 17,52378
1,0 0,4456 0,4453 0,44545 28,18797
2,0 0,3393 0,3295 0,3344 46,0906
3,0 0,2081 0,2285 0,2183 64,80735
4,0 0,0876 0,1073 0,09745 84,28986
Absorbância DPPH 0,6204
EC50 2,20 ± 0,2
Apêndices
89 Rogério Pitanga Santos, Junho de 2015
7.5. Apêndice E – Dados experimentais de absorbância utilizados na
construção da curva padrão de ácido gálico
Tabela 7.3 – Dados experimentais da curva padrão de ácido gálico
Padrão – Ácido Gálico
Concentração (μg/mL) Absorbância
1,0 0,0590
2,5 0,1432
5,0 0,2736
7,5 0,4075
10,0 0,5805
12,5 0,7288
15,0 0,8195
20,0 1,1707
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