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Diagnosi di infezione da virus
Dengue:
il ruolo del laboratorio
Licia Bordi
Laboratorio Virologia
FLAVIVIRUS
Dengue
West Nile
Encefalite Giapponese
Febbre Gialla
Zika
Usutu
Foresta di Kyasanur
Alkhurma
Omsk
Encefalite trasmessa
da zecca (TBE)
Famiglia: Flaviviridae
Genere: Flavivirus
� Genoma: ssRNA(+)
Dengue Virus (DENV)
4 sierotipi antigenicamente differenti
Denv-1 Denv-2 Denv-3 Denv-4
� DENV è trasmesso all’uomo attraverso la puntura di una zanzara infetta. Una volta che l'insetto viene infettato da uno dei virus della dengue, lo rimane per tutta la vita ed è in grado di trasmetterlo dopo 8-10 giorni d' incubazione.
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http://phil.cdc.gov/PHIL_Images/08051999/00004/dengue_phf/sld006.htm
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Ciclo di trasmissione
� DENV è iniettato in circolo durante il pasto di sangue, con spillover nell’epidermide e nel derma (infezione cellule dendritiche e cheratinociti). Le cellule infette migrano nei linfonodi e l’infezione èdiffusa attraverso il sistema linfatico
Sindromi Cliniche da Dengue :Classificazione WHO - 2009
Ampio spettro di manifestazioni clinicheIl periodo di incubazione è di 2-7 giorni.
Febbre Dengue Dengue severa
Infezione secondaria da
sierotipo differente
• Sanguinamenti locali di varia entità; petecchie•Sindrome emorragica• Grave compromissione degli organi•Sindrome da Shock
• febbre • mal di testa • dolori muscolari e articolari • rash cutaneo • dolore retro-orbitale
Casi di Dengue riscontrati all’INMI “L. Spallanzani” nel 2009-2012 in viaggiatori provenienti da zone endemiche
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� Dei 30 casi con PCR positiva, 10 erano Den-1( ), 6 Den-2 ( ), 6 Den-3 ( ), 3 Den-4 ( ), 5 non caratterizzati
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Dengue in Promed, ultimi 6 mesi del 2014: 1678 allerte
Metodi indirettiELISAImmunofluorescenza indiretta (IFA)Test di microneutralizzazione
Diagnosi di infezione da DENV
Metodi diretti
Ricerca di RNA virale Ricerca di antigeni viraliIsolamento virale
METODI DIRETTI 1: Isolamento Virale (BSL3)
Vero E6 CPEVero E6 Mock
C6/36 e AP61 (cellule di zanzara):C6/36 e AP61 (cellule di zanzara):Sono le linee cellulari più permissive per la crescita del virus; non si osserva
però Effetto Citopatico (CPE) per cui la presenza di virus viene evidenziata mediante RT-
PCR sul terreno di coltura prelevato 6gg dopo l’infezione oppure
mediante anticorpi monoclonali sierotipo-specifici)
Vero E6 e LLCVero E6 e LLC--MK2(cellule di rene di scimmia):MK2(cellule di rene di scimmia):meno permissive; ma una volta isolato
il virus, si osserva un chiaro CPE
Inoculo intracranico nel topo neonatoInoculo intracranico nel topo neonato
Su quali campioni biologici?
•Sangue intero •Siero o plasma•urine•Tessuti (fegato, milza e altri tessuti)
METODI DIRETTI 2: Rilevazione dell’antigene
Su quali campioni biologici?Siero o plasmaSangue intero
Saggi basati sulla rilevazione NS1:� glicoproteina altamente conservata prodotta sia in forma associata alla membrana che in forma solubile
� fortemente immunogenica; stimola anticorpi con attività fissante il complemento
� presente in elevate concentrazioni nel siero di pazienti infetti in fase acuta molto precocemente (1-9gg dopo comparsa sintomi)
� Saggi ELISA
� Test rapidi immunocromatografici
Pos Neg
Comparazione di tre saggi commerciali per la cattura dell’antigene NS1
PLoS Negl Trop Dis. 2010 Jul 6;4(7):e738
� Pannello di 450 sieri di cui 220 positivi al Dengue e 230 negativi�pan-E rileva con > efficienza Den-2; Platelia il Den-1; STRIP ha la stessa efficienza di rilevazione per Den-1 e-2 ; tutti e tre i test rilevano con < efficienza Den-3�Si osserva per alcuni kit cross-reattività con altri virus (vedi tabella)
Comparazione di tre saggi commerciali per la cattura dell’antigene NS1
PLoS Negl Trop Dis. 2010 Jul 6;4(7):e738
� Sieri positivi all’isolamento virale sono rilevati meglio da tutti e tre i test rispetto ai positivi in PCR� STRIP ha una maggiore efficienza nel rilevare sia infezioni primarie che secondarie; Platelia rileva meglio infezioni primarie rispetto alle secondarie; pan-E ha la minore efficienza di rilevazione per entrambi le infezioni�L’utilizzo di kit basati sulla rilevazione dell’antigene NS1 in combinazione con IgM MAC-ELISA potrebbe essere ottimale
METODI DIRETTI 3: Rilevazione dell’antigene o dell’RNA
Immunoistochimica:� Gli antigeni possono essere visualizzati in sezioni di
tessuto usando anticorpi monoclonali marcati
•Fegato: depositi granulari cell di Kupffer e endotelio
(Fig 1A)
•Macrofagi alveolari (Fig 1B)
•Polmoni: lume vascolare monociti ed endotelio (Fig 1C)
•Milza: citoplasma di macrofagi e cellule binucleate (Fig.
1E)
• Polpa bianca, tessuti linfoidi,simil-immunoblasti e simil-
centroblasti (Fig.1G)
• Linfociti periferici(Fig. 1 I)
Su quali campioni biologici?Sezioni di tessuto (autopsia o biopsia) congelate o in paraffina
Ibridazione in situ:� l’RNA virale può essere visualizzato in sezioni di
tessuto usando riboprobes antisenso marcati• Polpa rossa splenica: citoplasma dei macrofagi (Fig.1D) e cellule binucleate (Fig.1F) •Polpa bianca simil- centroblasti e simil-immunoblasti e (Fig.1 H)• Linfociti periferici e linfociti (Fig. 1 J)
JID 2004:189 (15 April) • 1411
Journal of Clinical Virology 45 (2009) 61-66 Modificata
� Real-Time PCR (3’ UTR)
METODI DIRETTI 4: Rilevazione dell’RNA mediante PCR
� RT-PCR one step o nested di famiglia (NS5) e sequenziamentoI Round II Round
Vector Borne Zoonotic Dis. 2007 ;7(4):467-77 Modificata
Su quali campioni biologici?� Siero: la carica virale è molto alta nei primi giorni dopo l’inizio della sintomatologia e si riscontra fino a 5-7 giorni
METODI DIRETTI 4: Rilevazione dell’RNA mediante PCR
Su quali campioni biologici?� Siero: la carica virale è molto alta nei primi giorni dopo l’inizio della sintomatologia e si riscontra fino a 5-7 giorni
�Urine: La carica virale è più bassa rispetto al siero ma il virus permane fino a circa 14 giorni
�Saliva: La carica virale è più bassa rispetto al siero ma il virus è stato riscontrato anche dopo 8 giorni dalla comparsa dei sintomi
METODI DIRETTI 4: Rilevazione dell’RNA mediante PCR
N:B: Urine e saliva possono essere utili nei casi in cui non si riscontra più il
virus nel sangue e anche laddove fosse difficile prelevare il sangue (es
bambini con sindrome emorragica)
METODI INDIRETTI: saggi sierologici
�La risposta immunitaria all’infezione da Dengue consiste nella produzione di
Immunoglobuline (IgM, IgG, IgA) specifiche, principalmente dirette verso la proteina E
� Poiché la proteina E contiene determinanti antigenici comuni a tutti i flavivirus, si osserva
una marcata cross-reattività tra i membri della famiglia flavivirus
�Durante una infezione primaria la risposta IgM è generalmente ad alti titoli
e più specifica rispetto alla secondaria
� La risposta delle IgG è a titoli più alti in una infezione secondaria rispetto alla primaria
�E’ difficile, se non impossibile, usare la sierologia per identificare il sierotipo in seguito
ad infezione primaria recente, poiché gli anticorpi prodotti sono cross-reattivi con gli
altri sierotipi
�Gli anticorpi che si formano in seguito ad infezione secondaria non solo sono cross-
reattivi tre i differenti sierotipi, ma sono fortemente cross-reattivi anche con altri
flavivirus
METODI INDIRETTI 1: saggi basati sulla rilevazione di IgM
•Saggi ELISA per le IgM:I micro-pozzetti sono rivestiti da antigeni del virus. I campioni di siero, pretrattati con sostanza in grado di catturare le IgG, vengono incubati nei pozzetti e tutte le IgM presenti nel campione vanno a legarsi nei pozzetti con l’antigene. Dopo lavaggio per rimuovere i legami aspecifici, un coniugato anti IgM viene dispensato e consente poi la rilevazione delle IgM
• Saggi ELISA a cattura per le IgM:I micro-pozzetti sono rivestiti da anticorpi anti-IgM umane. Una volta diluiti, i campioni di siero e i controlli vengono incubati nei pozzetti e tutte le IgM presenti nel campione vanno a legarsi nei pozzetti agli anticorpi anti-umano (specifici per IgM). I reattivi aspecifici vengono allontanati mediante lavaggi. Gli antigeni del virus della dengue vengono poi aggiunti nei pozzetti e incubati, così che, se nel campione sono presenti IgM anti-DVF, gli antigeni di DVF andranno a legarsi a tali anticorpi specifici nei relativi pozzetti
• Test rapidi per IgM che sfruttano l’immunocromatografia o le particelle agglutinanti (antigeni ricombinanti)
La maggior parte dei saggi per la rilevazione delle IgM utilizza antigeni ricombinanti verso la proteina E dei 4 sierotipi
Emerging Infectious Diseases • www.cdc.gov/eid • Vol. 15, No. 3, March 2009
350 sieri testati da 9 laboratori
Sensibilità e specificità per i test ELISA
Sensibilità e specificità per i test rapidi
�Le metodiche ELISA sembrano avere un miglior compromesso sensibilità/specificità rispetto ai test rapidi, che risultano molto variabili in termini di sensibilità�Si sono riscontrati falsi positivi dovuti ad infezione con Malaria, infezione pregressa da Dengue,positività per fattore reumatoide� Da tener presente che, poiché le IgM possono persistere anche per > 60 giorni, i saggi per le IgM non dovrebbero essere utilizzati come test di conferma in paesi dove la Dengue è endemica� I test per IgM devono essere supportati da altre evidenze diagnostchei, in aggiunta alla clinica e alle informazioni epidemiologiche; è fonfdamentale dimostrare una sieroconversione utilizzando una coppia di sieri
TestN. positives
(prevalence)Sensitivity Specificity VVP VPN
IFA in house 75/165 (45.5%) 100% 100% 100% 100%
Euroimmun DENV
IgG indirect ELISA98/165 (59.4%) 96% 71.1% 73.5% 95.5%
Panbio DENV IgG
indirect ELISA109/165 (66.1%) 98.7% 61.1% 67.9% 98.2%
Panbio DENV IgG
capture ELISA4/165(2.4%) 5.3% 100% 100% 55.9%
Gold standard: IFA
Dengue IgG ELISA indiretta
Ratio Result
< 0.8 Negative
0.8 < Ratio < 1.1 borderline
≥ 1.1 positive
Dengue IgG ELISA a cattura
165 sieri:140: campioni di donatori sani di Zanzibar9: Campioni da 7 pazienti con diagnosi di Dengue effettuata all’INMI1: Campione da paziente negativo2: Pazienti con AHFV o WNV13: pazienti con IgM/IgG perEBV/ CMV/ B19/ Rosolia/ Morbillo/ HAV
METODI INDIRETTI 2: saggi basati sulla rilevazione di IgG
Test N. positives Sensitivity
IFA in house 7 100%
Euroimmun DENV
IgG indirect ELISA5 71.4%
Panbio DENV IgG
indirect ELISA6 85.7%
Panbio DENV IgG
capture ELISA1 14.3%
Sieri di 7 pazienti con diagnosi di Dengue confermata mediante PCR e IFA IgM e IgGanalizzati con i tre metodi ELISA
TEST
IFAEuroimmune DENV
IgG indirect ELISA
Panbio DENV IgG
indirect ELISA
Panbio DENV IgG
capture ELISA
DIAGNOSIS
AHFV POS POS POS NEG
WNV POS POS POS NEG
TBE equivocal borderline POS NEG
JEV equivocal POS POS NEG
YFV vaccine equivocal NEG equivocal NEG
Pazienti con altre infezioni da Flavivirus
Gold standard:IFA
Metodi indiretti 3:Test di Microneutralizzazione (BSL3)
sieriDiluizioni
Seriali dei sieri
100 TCID50/pozz
aggiunta Virus
3-4 giorni37°C
1.5x104
cell/pozz
Piastra di Vero E6
1/2 ora 37°C
Titolazione CPE
� Non consente di discriminare tra differenti sierotipi di dengue
� Consente di fare diagnosi differenziale con altri flavivirus
•Campione Negativo : non compaiono altre bande oltre a quella di controllo (C).•Campione Positivo per le IgM Dengue:appare una banda violacea nella porzione posta subito sotto la banda di controllo (M)Campione Positivo per le IgG Dengue:appare una banda violacea nella porzione posta più distalmente rispetto alla banda di controllo (G) Campione Positivo per le IgG e le IgM Dengue: appaiono 2 bande violacee in corrispondenza delle posizioni (G) ed (M)
N.B.Il risultato positivo non esclude la presenza di altri virus, né identifica il sierotipo specifico.In caso di negatività non si può escludere che la concentrazione degli antigeni del virus nel campione sia inferiore al limite di rilevazione del test.
Campione Positivo
controllo Negativo
Allestimento di vetrini per IFA mediante infezione di colture cellulari di C6/36 e di Vero E6
Risultati:
Vetrini C6/36: poco idonei a causa di un’alta fluorescenza di fondo, dovuta verosimilmente alla presenza nei sieri umani di anticorpi diretti contro le cellule di insetto
Vetrini Vero E6: non presentano fluorescenza di fondo, consentendo una più nitida lettura dei risultati
METODI INDIRETTI 4: (BSL3)Immunofluorescenza con vetrini home-made
METODI INDIRETTI 5:Immunofluorescenza con vetrini commerciali per flavivirus
L
’
L’utilizzo di vetrini a mosaico in grado di vedere i 4 sierotipi di Dengue e altri
Flavivirus (TBE,YF,WN,JE) ha un valore aggiunto:
� In alcuni casi mette in luce la presenza di anticorpi specifici per altri flavivirus in
assenza di anticorpi per dengue (es: YF)
� In altri casi la forte creoss-reattività delle IgG per tutti i flavivirus in presenza
di IgM cross-reattive può essere un campanello di allarme…
Symptoms: 2 days later, during the flight to Italy, he developed high fever,
shaking chills, anorexia, malaise, nausea and vomiting, Over the following 5
days the symptoms worsened and he was admitted to hospital (May 10)
Travel history and retrospective reconstruction of possible exposure:
Frequent traveler; (vaccinated against yellow fever in 1998). April 29 he
visited the camel market of Shalatin; tick bite on a foot, followed by a small
papular lesion and (48 hours after the bite) blurred vision
Laboratory results: leukopenia (white blood cells: 2250/mmc),
thrombocytopenia (platelets: 67000/mmc);
increased liver enzymes (AST 469, ALT 406 U/L) d
Aetiology: not defined
Discharged 11 days after hospitalization, in good general condition despite
persistence of asthenia
A recent experience at INMI
Collection dateSample type WNV
Serology
Dengue
Serology
May 10th
(Day 10 post
exposure)
Serum IgG: ≥1:640
IgM: ≥ 1:20
IgG: ≥ 1:640
IgM: ≥ 1:20
May 27th Serum IgG: ≥ 1:640
IgM: ≥ 1:20
IgG: ≥ 1:640
IgM: ≥ 1:20
Samples were referred to the Virology Lab at INMI with request for
Dengue and WNV serology for retrospective diagnosis
Sequence analysis of NS5
Mosquito-borne
Flaviviruses
Tick-borne
Flaviviruses
RT-PCR / real-time RT-PCR• RNA virale nel siero fino a 5-7 giorni dalla comparsa dei sintomi
• RNA virale nellle urine e nella saliva fino a 14 giorni dalla comparsa dei sintomi
• Identificazione del sierotipo
Ricerca Antigene NS11 – 9/10 giorni dalla comparsa dei sintomi
Diagnosi sierologica infezione primariaELISA / IFA
IgM: 5 giorni dalla comparsa dei sintomi (80% casi)
IgG: 7 giorni dopo la comparsa dei sintomi
Diagnosi sierologica infezione secondariaELISA / IFA
IgM hanno titoli più bassi e durano meno.
IgG presenti durante la fase viremica ed aumentano velocemente
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