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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E IMUNOLOGIA
Deisy Yurley Rodríguez Sarmiento
Desenho, síntese e caracterização de novos análogos de Bradicinina
RIBEIRÃO PRETO – SP
2017
2
Deisy Yurley Rodríguez Sarmiento
Desenho, síntese e caracterização de novos análogos de Bradicinina
Orientador: Prof. Dr. Claudio Miguel da Costa-Neto
Co-orientador: Dr. Lucas T. Parreiras e Silva
RIBEIRÃO PRETO – SP
2017
Tese apresentada à Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo, para
obtenção do título de Doutor em
Ciências.
Área de concentração: Bioquímica
3
Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer
meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que
citada a fonte.
FOLHA DE APROVAÇÃO
Rodríguez S., Deisy Yurley
Desenho, síntese e caracterização de novos análogos de Bradicinina.
Ribeirão Preto, 2017.
XX p.: il., 30 cm.
Tese apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo, para obtenção de título de Doutor em Ciências.
Área de concentração: Bioquímica.
Orientador: Prof. Dr. Claudio Miguel da Costa-Neto Co-orientador: Dr. Lucas T. Parreiras e Silva
1. Análogos de BK. 2. Receptor B2. 3. Sinalização 4. Agonismo tendencioso
4
Nome: Rodríguez S., Deisy Yurley
Título: Desenho, síntese e caracterização de novos análogos de Bradicinina.
Aprovado em: ___ / ___ / ______
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. ______________________________ Instituição:
___________________
Julgamento: ___________________________ Assinatura:
__________________
Prof. Dr. ______________________________ Instituição:
___________________
Julgamento: ___________________________ Assinatura:
__________________
Prof. Dr. ______________________________ Instituição:
___________________
Julgamento: ___________________________ Assinatura:
__________________
Prof. Dr. ______________________________ Instituição:
___________________
Julgamento: ___________________________ Assinatura:
__________________
Prof. Dr. ______________________________ Instituição:
___________________
Julgamento: ___________________________ Assinatura:
__________________
Tese apresentada à Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo, para
obtenção do título de Doutor em
Ciências.
Área de concentração: Bioquímica
5
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por estar sempre ao meu lado, mostrando suas
bendições na minha vida de maneira constante.
Ao meu pãe Humberto que me fiz prometer para ele que nunca ia parar
de estudar e ser uma excelente pessoa e professional.
À minha mãe Yolanda, que é minha maior motivação para ser sempre o
orgulho dela.
Ao meu namorado Sergio, quem sempre esteve ao outro lado do
telefone pronto para me escutar e me aconselhar quando precisei.
Ao meu orientador Prof. Dr. Claudio Miguel da Costa-Neto pela
oportunidade e os grandes ensinamentos.
Ao Prof. Dr. Eduardo Brandt de Oliveira pelas discussões científicas e
por compartilhar sua sabedoria.
Ao meu co-orientador Dr. Lucas T. Parreiras e Silva, por sua ajuda geral
no desenvolvimento deste projeto e por sua amizade.
A todos os técnicos e funcionários do Departamento de Bioquímica e
Imunologia, em especial as técnicas Lúcia e Cacilda pela organização do
laboratório e auxílio nos experimentos.
Aos companheiros de laboratório: Andrea, André, Diego, Larissa, Ligia e
Sarah, pelas discussões, auxílio nos experimentos e amizade.
Aos meus grandes amigos da Colômbia que mesmo na distancia,
sempre encontrei em eles o apoio para seguir adiante. Em especial a Adriana
que todos os dias estava disponível para me escutar e fazer meus dias felizes.
6
À FAPESP, CNPq, FAEPA e a CAPES por apoiar financeiramente a
realização deste trabalho.
7
RESUMO
Rodríguez S., D. Y. Desenho, síntese e caracterização de novos análogos de Bradicinina. XX Folhas. Tese (Doutorado) – Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2017.
Receptores acoplados a proteína G (GPCRs) são proteínas integrais de
membrana caracterizados por possuírem sete α-helices transmembranares e
por isso também são chamados de receptores 7TM. Esta superfamília de
receptores medeia um grande numero de processos fisiológicos e é alvo para
aproximadamente 40% de todas as drogas no mercado. O receptor de
Bradicinina de tipo 2 (B2) é o principal mediador do sistema Calicreina-Cinina e
é classicamente ativado pelo nonapeptídeo Bradicinina (BK). Trabalhos
recentes descreveram agonistas para diferentes GPCRs, que podem ativar
seletivamente (ou pelo menos preferencialmente) vias de sinalização
dependentes de proteína G ou do acoplamento de β-arrestina, sendo este
fenômeno denominado agonismo tendencioso (do inglês “biased agonism”).
Neste trabalho estão sendo desenhados e sintetizados uma serie de análogos
com o objetivo de produzir novos ligantes com distintas propriedades
bioquímicas e farmacológicas. Alguns destes análogos já sintetizados
apresentaram características interessantes nos perfis de ativação. Estes
análogos devem ser utilizados como modelos para a síntese e caracterização
de novas gerações de análogos com potenciais propriedades de agonismo
tendencioso. Nos acreditamos que o desenho de novos agonistas tendenciosos
pode levar ao desenvolvimentos de uma nova geração de drogas, seletivas
para ativação não somente de um subtipo de receptor, mas também de uma
via de sinalização especifica.
Palavras-chave: Análogos de BK. Receptor B2. Sinalização. Agonismo
tendencioso.
8
ABSTRACT
Rodríguez S., D. Y. Design, synthesis and characterization of novel
analogs of Bradykinin. XX Pages. Thesis (Doctoral Program) – Faculdade de
Medicina, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2017.
G-protein coupled receptors (GPCRs) are integral membrane proteins
characterized by bearing seven transmembrane α-helices, and are therefore
also known as 7TM receptors. This receptor superfamily mediates a large
number of physiological processes and is subject to approximately 40% of all
drugs on the market. The type 2 Bradykinin receptor (B2) is the primary
mediator of the Kallikrein-Kinin System and is classically activated by the
nonapeptide Bradykinin (BK). Recent studies have described different GPCRs
agonists which can selectively activate (or at least preferably) dependent
signaling pathways of G protein or β-arrestin coupling, this phenomenon is
called biased agonism. This work are based in design and synthesize a series
of analogs with the goal of producing new ligands with different biochemical and
pharmacological properties. Some of these synthesized analogs have
presented interesting characteristics in activation profiles. These analogs should
be used as templates for the synthesis and characterization of novel analogs
with properties of biased agonism. We believe that the design of novel agonists
can lead to development of a new generation of drugs, not only selective for
activation of a receptor subtype but also a specific signaling pathway.
Keywords: Bradykinin analogs. B2 receptor. Signaling. Biased Agonism.
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LISTA DE ABREVIATURAS
7TM - Sete hélices transmembranares
Akt - Proteína quinase B
AngII - Angiotensina II
AT1 - Receptor de angiotensina tipo 1
BK – Bradicinina
B1 – Receptor de bradicinina tipo 1
B2 – Receptor de bradicinina tipo 2
Ca2+ - Cálcio
cAMP - Adenosina 3',5'-monofosfato cíclico
CHO - “Chinese hamster ovary”
DABK – Des-Arg9-BK
DAG - 1,2-diacilglicerol
DNA - Ácido desoxirribonucléico
DMEN - “Dubelcco’s modifeid Eagles’s medium”
EC - Extracelular
EC50 - Concentração de agonista na qual se obtém 50% da ativação máxima
ECA - Enzima conversora de angiotensina
Emáx - Resposta máxima
ERK - Quinase regulada por sinal extracelular
Fc - do inglês “Factor of change”
F-moc - 9-fluorenilmetoxicarbonilo
GDP - Guanosina difosfato
GPCR - Receptor acoplado à proteína G
GRK - Quinase de receptores acoplados à proteína G
10
GTP - Guanosina trifosfato
HEK293T - “Human Embryonic Kidney”
HPLC - Cromatografia líquida de alta pressão
IC - Intracelular
IC50 - Concentração de ligante na qual se obtém 50% de inibição da resposta
máxima inicial
IP3 – Inositol-1,4,5-trifosfato
MAPK - Proteína quinase ativada por mitógeno
PIP2 - Fosfatidil 4,5-bisfosfato
PKA - Proteína quinase A
PKC - Proteína quinase C
RFU - Unidade relativa de fluorescência
SFB - Soro fetal bovino
SRA - Sistema renina-angiotensina
TM - Transmembrana
Tris - Tris-(hidroximetil)-aminoetano
11
SUMARIO
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................................... 13
1.1 Sinalização e regulação de GPCRs ou receptores 7TM ................................................... 13
1.2 Sistema Calicreínas-Cininas .................................................................................................. 17
1.3 Classificação farmacológica dos receptores de cininas B1 e B2 ...................................... 21
1.3.1 Agonistas peptídicos ............................................................................................................ 21
1.3.2 Antagonistas peptídicos ...................................................................................................... 24
1.3.3 Ligantes não peptídicos ....................................................................................................... 25
1.4 Aspectos estruturais dos receptores de cininas ................................................................. 26
1.4.1 Modificações pós-traducionais nos receptores de cininas ............................................. 28
1.4.2 Sítios de ligação de agonistas e antagonistas nos receptores de cininas .................. 29
1.5 Aspectos moleculares e celulares da sinalização dos receptores de cininas ................ 30
1.5.1 Mecanismos de ativação do receptor dependentes ou independentes de agonista . 30
1.5.2 Vias de sinalização celular mediadas pelos receptores B1 e B2 ................................... 31
1.5.4 Oligomerização dos receptores B1 e B2 ............................................................................ 33
1.5.5 Dessensibilização dos receptores B1 e B2 ........................................................................ 34
1.6 Agonismo tendencioso ............................................................................................................ 35
1.6.1 β-arrestinas ............................................................................................................................ 36
1.6.2. Agonismo tendencioso no receptor B2 ............................................................................. 37
2. OBJETIVOS ................................................................................................................................ 39
2.1 Objetivo geral ........................................................................................................................... 39
2.2 Objetivos específicos .............................................................................................................. 39
3. MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................................ 40
3.1 Desenho dos análogos de BK ............................................................................................... 40
3.3 Síntese química em fase sólida ............................................................................................. 44
3.4 Cromatografia liquida de alta eficiência - HPLC ................................................................. 45
3.5 Análise de Aminoácidos ......................................................................................................... 45
3.5.1 Hidrólise Ácida dos Peptídeos ............................................................................................ 45
3.5.2. Determinação da Composição de Aminoácidos ............................................................. 46
3.6 Cultura e transfeção de células HEK293T ........................................................................... 46
3.7 Ensaios de “Binding” com células inteiras ........................................................................... 47
12
3.8 Avaliação da ativação do receptor através de BRET (transferência de energia por
ressonância de bioluminescência) ............................................................................................... 48
3.8.1 Análise da ativação de proteína Gq e Gi3 através de BRET .......................................... 49
3.8.2 Análise do recrutamento de -arrestinas através de BRET ......................................... 50
3.9. Cálculo do agonismo tendencioso ....................................................................................... 52
4. RESULTADOS ........................................................................................................................... 54
4.1 Desenho e síntese dos análogos de Bradicinina ................................................................ 54
4.2 Caracterização química e purificação dos peptídeos sintetizados .................................. 54
4.3 Primeira geração de peptideos .............................................................................................. 56
4.4 Segunda geração de peptídeos ............................................................................................ 61
4.5 Terceira geração de análogos ............................................................................................... 76
4.6 Avaliação da atividade antagonística dos análogos........................................................... 84
4.6 Cálculo do fator de tendência (do Inglês, Bias Factor) ...................................................... 85
5. DISCUSSÃO ............................................................................................................................... 90
6. CONCLUSÕES .......................................................................................................................... 96
7. REFERÊNCIAS .......................................................................................................................... 97
8. ANEXOS .................................................................................................................................... 106
8.1 Cromatogramas e espectros obtidos na caracterização dos análogos sintetizados . 106
8.2 Valores de ΔLogτ/Ka e ΔΔLogτ/Ka para cada um dos análogos respeito a BK em
cada uma das vias avaliadas...................................................................................................... 117
13
1. INTRODUÇÃO
1.1 Sinalização e regulação de GPCRs ou receptores 7TM
Os receptores acoplados à proteína G são caracterizados por possuírem
sete domínios transmembranares (TM I – TM VII) com estruturas alfa-
helicoidais interligados por três alças extracelulares (EC-1, EC-2 e EC-3) e três
intracelulares (IC-1, IC-2 e IC3). Devido às sete alfa-hélices transmembranares,
são também chamados de receptores 7TM. Os GPCRs podem mediar a
resposta celular após a ligação de uma imensa diversidade de moléculas
sinalizadoras como lipídeos, neurotransmissores, peptídeos vasoativos e
muitos outros (Rosenbaum et al., 2009). Já foram identificados mais de 800
genes no genoma humano que codificam GPCRs, representando cerca de 2%
do total de genes (Foord et al., 2005). Além disso, aproximadamente 40% das
drogas comercializadas atualmente possuem como alvo GPCRs (Lagerstrom e
Schioth, 2008; Rask-Andersen et al., 2011).
Os GPCRs em vertebrados podem ser divididos em cinco famílias
baseando-se na similaridade da sequência de aminoácidos e da estrutura:
Rodopsina (Familia A), Secretina (Familia B), Glutamato (Familia C), adesão e
“Frizzled/Taste2” (Fredriksson et al., 2003). A família da rodopsina, na qual se
encontram os receptores do sistema calicreinas-cininas (SCC), é a maior e
mais diversificada dessas famílias e por isso é subdividida em grupos, de
acordo com o tipo de ligante (Joost e Methner, 2002).
A sinalização canônica mediada pelos GPCRs envolve a participação da
proteína G, uma proteína heterotrimérica composta das subunidades α, β e γ.
Esta proteína é encontrada ancorada na face citoplasmática da membrana
14
celular, e no seu estado inativo, uma molécula de guanosina difosfato (GDP)
está ligada à subunidade α. Quando um GPCR é ativado, este receptor sofre
uma mudança conformacional que então induz uma mudança de conformação
da subunidade α a qual troca GDP por guanosina trifosfato (GTP). Essa troca
ativa a subunidade α que se separa das subunidades β e γ e interage com
proteínas efetoras intracelulares (Figura 1A). A subunidade α da proteína G
possui uma atividade GTPásica intrínseca, sendo capaz de hidrolisar o GTP
formando GDP, fazendo com que as três subunidades se reassociem e
retornem ao estado inativo (Morris e Malbon, 1999; Maudsley et al., 2005).
A classificação de proteína G é realizada de acordo com o tipo de sua
subunidade α. Sendo assim, existem quatro classes principais de proteína G:
Gs (Gs, Golf), Gi (Gi1, Gi2, Gi3, Go, Gt-rod, Gt-cone, Ggust e Gz), G12/13 (G12, G13) e Gq
(Gq, G11, G14, G16) (Mccudden et al., 2005). De maneira resumida, proteínas Gs
ativam a adenilato ciclase que catalisa a formação de cAMP (adenosina 3’,5’-
monofosfato cíclico) e este, por sua vez, ativa a proteína quinase A (PKA) que
fosforila proteínas-alvo. As proteínas Gi atuam inibindo adenilato ciclase e
podem participar da ativação de canais de potássio e da inibição de canais de
cálcio (Ca2+) dependentes de voltagem. Proteinas G12/13 medeiam o estimulo
da GTPase pequenas do tipo Rho, e proteínas Gq ativam a fosfolipase C-β que
hidrolisa o fosfolipídeo de membrana fosfatidil 4,5-bisfosfato (PIP2) resultando
na formação dos segundos mensageiros inositol 1,4,5-trisfosfato (IP3) e 1,2-
diacilglicerol (DAG). O IP3 se liga a receptores de IP3 no reticulo
endoplasmático promovendo a liberação de Ca2+, o que acarreta no aumento
da concentração citosólica deste íon. O DAG é responsável pela ativação da
15
proteína quinase C (PKC) ,que também é ativada por Ca2+ e que é capaz de
fosforilar diversas proteínas-alvo importantes nas respostas fisiológicas.
Figura 1. Regulação de proteínas G, GRKs e β-arrestinas mediada por GPCRs. A) Ativação clássica de proteína G por um GPCR. A subunidade α se dissocia das subunidades β e γ e ativa efetores intracelulares. B) Fosforilação do GPCR mediada por GRKs levando ao recrutamento de β-arrestina. C) β-arrestina medeia a internalização do receptor e ancora quinases como s-Src, ERK1/2 e AKT mediando a sinalização de GPCRs de forma independente da proteína G. (Adaptado de Shukla et al., 2011).
Como um receptor ativado pode sequencialmente acoplar múltiplas
proteínas G, as células criaram mecanismos de dessensibilização para
16
desativar a sinalização dependente de proteína G, evitando efeitos deletérios
de uma sinalização sustentada (Benovic et al., 1989; Shukla et al., 2011). A
dessensibilização de GPCRs ocorre por um processo de duas etapas (Figura
1B). Na primeira etapa, receptores ligados a agonistas são fosforilados por
quinases de GPCRs (GRKs), principalmente em sítios localizados na porção C-
terminal dos receptores, mas também nas alças intracelulares (Pitcher et al.,
1999). As GRKs (GRK1 a GRK7) fazem parte de uma família de quinases que
fosforilan resíduos de serina e treonina (Benovic et al., 1989). GPCRs ativados
também são fosforilados por proteínas quinases dependentes de segundos
mensageiros como PKA e PKC que também contribuem para a
dessensibilização do receptor (Lefkowitz et al., 1990).
A segunda etapa de dessensibilização envolve o recrutamento de
proteínas chamadas de arrestinas que interagem com os receptores
fosforilados pelas GRKs e impedem estericamente o acoplamento da proteína
G com o receptor, impedindo a ativação de proteína G (Lefkowitz, 1998).
Existem quatro membros na família das arrestinas, duas expressas
exclusivamente nos bastonetes e cones da retina (arrestina 1 e arrestina 4) e
duas ubiquamente expressas (arrestina 2 e arrestina 3; também conhecidas
como β-arrestina 1 e β-arrestina 2 respectivamente) (Barki-Harrington e
Rockman, 2008; Shukla et al., 2011). As β-arrestinas atuam também na
internalização do receptor funcionando como proteína adaptadora para vários
componentes chaves da maquinaria endocitica (Mcdonald e Lefkowitz, 2001)
(Figura 1C). Entre esses componentes estão a clatrina, a proteína adaptadora
AP-2, o fator 6 de ribosilação do ADP (ARF6) e a proteína de fusão sensível à
N-etilmaleimida (NSF). Dependendo da estabilidade da interação entre o
17
receptor internalizado e a β-arrestina, os receptores podem ser classificados
como: receptores classe A, onde a interação β-arrestina-receptor é transiente e
o receptor é rapidamente reciclado; e receptores classe B onde a interação é
significativamente mais estável e a reciclagem é mais lenta. Também existe
receptores chamados classe C no qual o receptor é internalizado junto com β-
arrestina, porém sendo o complexo mais instável que os receptores classe B
(Oakley et al., 2000; Zimmerman et al., 2011). Alem do papel das β-arrestinas
na dessensibilização e internalização do receptor, durante a ultima década foi
descoberto que β-arrestinas podem ancorar proteínas como c-Src, quinase
regulada por sinal extracelular (ERK) e proteína quinase B (AKT), mediando a
sinalização de GPCRs de forma independente de proteína G (Figura 1C)
(Shukla et al., 2011).
1.2 Sistema Calicreínas-Cininas
O sistema calicreínas-cininas (SCC) tem principalmente quatro
componentes: cininogênios precursores, calicreínas (enzimas proteoliticas), as
cininas (as quais são produzidas pela clivagem de cininogenios pelas
calicreinas) e dois receptores acoplados a proteína G, nomeados B1 e B2, que
medeiam os efeitos biológicos das cininas (Figura 2).
18
Figura 2. Representação esquemática do sistema Calicreínas-Cininas. Os receptores B1 e B2 são parte do sistema calicreínas-cininas. As enzimas calicreínas clivam os cininogenios plasmático ou tecidual para gerar as correspondentes cininas, ou seja, Bradicinina e Calidina, que são os ligantes endógenos do receptor B2. As enzimas CPM e CPN clivam estas cininas gerando suas correspondentes des-Arg
9-BK e des-Arg
10-KD que são os ligantes endógenos
para o receptor B1. CA, Cininogenio de alto peso molecular; CB, Cininogenio de baixo peso molecular; CP, Calicreina plasmática; CT, Calicreina tecidual; CPM, Carboxipeptidase M; CPN, Carboxipeptidase N. (Adaptado de Marceau and Regoli, 2004).
A historia do SCC começa no ano de 1930, quando Werle e Frey
descreveram a Calicreína, uma enzima produtora de cininas descoberta no
pâncreas (Kraut et al., 1930), e identificaram as ações biológicas da Lys-
Bradicinina (Lys-BK) e depois chamada Calidina (KD) (Werle e Grunz, 1939).
Na década dos anos 40 foi identificada a Bradicinina por Rocha e Silva e seus
19
colaboradores (Rocha e Silva et al., 1949). Ao final dos anos 50, a bradicinina
foi isolada em quantidade significativa do plasma (Elliott et al., 1959) e
finalmente sua estrutura primaria foi elucidada. (Boissonnas et al., 1960, Elliott
et al., 1960). Além disso, a bradicinina foi o primeiro peptídeo biologicamente
ativo a ser sintetizado na nova metodologia de síntese de peptídeos em fase
solida (Merrifield, 1964). Nos anos 60, diversos derivados de cininas foram
sintetizados e estudados para analisar seus efeitos biológicos em ensaios in
vitro e in vivo.
Em 1970, Regoli et al. definiram os primeiros pontos de referência na
caracterização molecular dos receptores de cininas apontando à existência de
dois tipos de receptores de cininas, B1 e B2, os quais diferem em seus perfis
farmacológicos (Tabela 1) (Regoli et al., 1977; Drouin et al., 1979). A busca dos
receptores de cininas terminou em 1990 com a clonagem do cDNA do receptor
B2 de rato feito por Jarnagin e colaboradores (Mceachern et al., 1991). Já em
1994, Menke e colaboradores conseguiram a clonagem do receptor B1. (Menke
et al., 1994).
Tabela 1. Nomenclatura dos receptores B1 e B2 de humanos
Nome IUPHAR* B1 B2
Código IUPHAR 2.1:BK:1:B1:HUMAN:00 2.1:BK:2:B2:HUMAN:00
Composição
Aminoácidos 353 391
Gene/Cromossomo BDKBR1/14q32.2 BDKBR2/14q32.2
Agonista Seletivo DAKD BK
Antagonista Seletivo DALBK HOE140 (Icatibant)
Proteína G acoplada Gq/Gi Gq/Gi
Expressão Induzida Constitutiva
Sinalização Dessensibilização limitada Dessensibilização
extensiva
*União Internacional de Farmacologia.
20
Os receptores B1 e B2 desempenham um papel importante em muitos
processos fisiológicos e patológicos incluindo nocicepção, inflamação e
enfermidades cardiovasculares e renais (Mclean et al., 2000; Emanueli e
Madeddu, 2001; Calixto et al., 2004; Leeb-Lundberg et al., 2005; Riad et al.,
2007). Por exemplo, camundongos knockout para B2 sofrem de hipertensão e
aumentos exagerados de pressão arterial induzidos pela Angiotensina II (Ang
II) (Madeddu et al., 1997). Além disso, tais camundongos também desenvolvem
insuficiência cardíaca relacionada à idade e ao remodelamento do ventrículo
esquerdo (Emanueli et al., 1999) . A sinalização mediada pelo receptor B1
reduziu a pressão arterial em camundongos knockout para B2, embora os
camundongos knockout para B1 não apresentaram alterações na pressão
arterial (Kintsurashvili et al., 2001). Em camundongos knockout para B2, a
nefropatia diabética foi mostrada estar aumentada (Kakoki et al., 2004) e o
dano renal devido à isquemia/reperfusão foi mais grave em camundongos
knockout para ambos receptores, B1 e B2, em comparação aos camundongos
selvagens (Kakoki et al., 2007). Todos estes dados mostram efeitos benéficos
para os receptores B1 e B2 de cininas nos sistemas cardiovascular e renal. Em
contraste a isso, a ativação exacerbada de B1 e B2 pode levar a efeitos
prejudiciais como dor e inflamação. Os receptores B1 e B2 foram descritos
como envolvidos em nocicepção uma vez que a BK induz hiperalgésica térmica
em camundongos knockout para B1 e DABK (agonista seletivo para o receptor
B1) induz hiperalgésica em camundongo knockout para B2.
Além disso, BK injetada em tecidos humanos ou de animais gera os
quatro sinais típicos dos processos inflamatórios: rubor, calor, inchaço e dor. A
ação das cininas nas células alvo pode ser explicada assim: o rubor e o calor
21
são determinados por vasodilatação local dependente de endotélio. A
estimulação de células endoteliais também oferece um aumento da
permeabilidade vascular a qual contribui à exsudação de um fluido rico em
proteínas da circulação (inchaço). Neurônios aferentes não mielinados
possuem receptores de cininas, o que explica a habilidade deste peptídeo em
produzir dor e ativar respostas reflexas pelo sistema nervoso central (Marceau
e Regoli, 2004).
A maioria dos efeitos vasculares dos peptídeos tipo BK são
determinados pela estimulação de células endoteliais nas quais segundos
mensageiros são produzidos após ativação dos receptores de cininas que, por
serem acoplados à proteína Gq, levam ao aumento dos níveis intracelulares de
Ca2+. BK induz liberação de oxido nítrico (NO) das células endoteliais, junto
com um aumento de GMPc nas células de musculo liso vascular.
Prostaglandina I2 (Prostaciclina) é outro mediador secundário que é liberado do
endotélio como resultado da ação das cininas o qual determina a produção de
AMPc em células de musculo liso. Outro mecanismo de vasodilatação
dependente de endotélio se dá pela hiperpolarização das células de musculo
liso, sendo este o principal mecanismo envolvido na relaxação induzida por BK
de arteríolas coronárias humanas isoladas (Batenburg et al., 2004).
1.3 Classificação farmacológica dos receptores de cininas B1 e B2
1.3.1 Agonistas peptídicos
22
Centenas de análogos peptídicos de cininas têm sido sintetizados e
farmacologicamente avaliados. Cininogênios são definidos como proteínas
circulantes que contém BK (RPPGFSPFR) na sua sequência (Figura 2). Após
clivagem do cininogênio para produção de BK ou calidina (KD), e subsequente
clivagem da para remoção do resíduo Arg C-terminal (des-Arg9), os peptídeos
gerados agem respectivamente como os ligantes naturais dos dois tipos de
receptores humanos de cininas, B1 e B2 (Tabela 2). As cininas “nativas” (as que
são produzidas pelas calicreínas plasmática e tecidual), ou seja BK e Lys-BK,
possuem alta afinidade pelo receptor B2. Além disso, o determinante estrutural
mais importante para a alta afinidade de cininas nos receptores B1 de
mamíferos é a remoção do resíduo Arg do C-terminal, o qual é fundamental
para a ligação desses peptídeos no receptor B2. O receptor B1 é responsável
pela resposta a diferentes metabólitos de cininas, tais como, des-Arg9-BK ou
Lys-des-Arg9-BK, os quais são gerados por arginina-carboxipeptidases como
as Carboxipeptidase M e N. Outras cininas formadas, como des-Arg1-BK
(gerada pela aminopeptidase P) ou des(Phe8, Arg9)-BK (primeiro metabolito
formado pela cininase II ou pela enzima convertidora de angiotensina, ECA),
não mantêm atividade farmacológica significativa em nenhum dos dois tipos de
receptores de cininas (Regoli e Barabé, 1980). Em sistemas biológicos é
importante ressaltar que a presença de arginina-carboxipeptidases
frequentemente pode alterar a potência estimada da BK ou Lys-BK no receptor
B2, já que esses ligantes são transformados em seus correspondentes des-Arg9
metabolitos e levar à ativação do receptor B1 (Leeb-Lundberg et al., 2005)
Além disso, têm sido estudados muitos análogos de BK para avaliar a
importância de cada um dos resíduos presentes. Por exemplo, quando foi
23
usado L-Ala para substituir Gly4 ou Pro7 na sequência de BK, houve uma
redução drástica da atividade do ligante, sugerindo que a conformação geral
deste peptídeo é chave para a interação ligante-receptor (Regoli e Barabe,
1980). Também foi avaliada a importância do caráter aromático nas posições 5
e 8 que na BK estão ocupadas por resíduos de Phe. Testando uma série de
análogos modificados nestas posições, Regoli e colaboradores (Regoli e
Barabe, 1980) chegaram às seguintes conclusões: a) Compostos contendo
resíduos aromáticos [D-Phe, Tyr, Trp, Tyr(Me)] e alifáticos (Cha, Leu) nas
posições 5 ou 8 se comportam como agonistas totais, sendo então proposto
que Phe5 e Phe8 estão principalmente envolvidos na ligação da BK ao receptor
e que a aromaticidade destes resíduos não é fundamental para a ativação do
receptor. Além disso, todos os análogos nos quais foram modificados a posição
5 tiveram uma redução na afinidade, porém mantiveram a atividade, o que
sugere que este resíduo está principalmente envolvido na ligação com o
receptor. Na posição 8 foi visto que o receptor aceita um grupo de maior
tamanho e com uma lipofilicidade maior, como o Tyr(Me), já que o análogo
Tyr(Me)8-BK teve um aumento na afinidade pelo receptor em comparação à
BK. Além das posições 5 e 8, em 2012, Zhang e colaboradores (Zhang et al.,
2012) modificaram a BK na posição 9 colocando um resíduo de Lys, reduzindo
assim o caracter básico próprio de Arg nativa, o resultado obtido com esta
mudança foi a primeira evidência do agonismo tendencioso nos receptores de
cininas já que o análogo Lys9-BK resultou em ativação tendenciosa da proteína
Gq em relação à β-arrestina. A diferença na ativação de Lys9-BK em relação a
BK pode ser devido a diferenças nas cadeias laterais de Lys e Arg, já que Lys
24
possui uma cadeia mais flexível permitindo talvez alcançar lugares diferentes
no receptor e assim, levar a respostas diferentes.
1.3.2 Antagonistas peptídicos
Os primeiros compostos desenhados para antagonizar o receptor B1
foram des-Arg9-Leu8-BK e Lys-des-Arg9-Leu8-BK e são os peptídeos usados
até hoje com o melhor potencial antagonístico (Regoli et al., 1998) (Tabela 2).
Tabela 2. Nome, função e sequência dos principais ligantes do sistema calicreinas-cininas
Nome Função Sequência
Bradicinina – BK Agonista B2 Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg
Calidina – KD Agonista B2 Lys Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg
des-Arg9-BK Agonista B1 Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe
des-Arg9- KD Agonista B1 Lys Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe
[Leu8]des-Arg
9-BK Antagonista B1 Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Leu
Icatibant (HOE-140) Antagonista B2 D-Arg Arg Pro Hyp Gly Thi Ser D-Tic Oic Arg
O receptor B2 não foi bem caracterizado até 1985, quando a primeira
geração de antagonistas baseados em [D-Phe7-BK] foi produzida (Vavrek e
Stewart, 1985). Nestes tipos de compostos, a transição entre
antagonista/agonista parcial foi causada pela rigidez estrutural inserida no
backbone do peptídeo pela presença da conformação não natural do D-Phe7. O
análogo D-Phe7-BK é um antagonista fraco no receptor B2 de cobaia (Vavrek e
Stewart, 1985) e coelho (Rhaleb et al., 1991). A potência foi aumentada pela
adição de um resíduo de D-Arg na posição N-terminal e a substituição da Pro3
por Hyp (Vavrek e Stewart, 1985) uma vez que o análogo Hyp3-BK era um
conhecido análogo mais potente que a BK (Maier et al., 1988). Também foram
desenvolvidos os análogos D-Arg-[Hyp3, D-Phe7]BK e D-Arg-[Hyp3, Thi5,8, D-
25
Phe7]BK, no qual os dois resíduos de Phe nas posições 5 e 8 foram
substituídos por um aminoácido não natural, para conferir uma possível
resistência à degradação. No análogo D-Arg[Hyp3, D-Phe7, Leu8]BK (Rhaleb et
al., 1991) o resíduo Phe8 foi substituído por um resíduo de Leu para remover a
aromaticidade do C-Terminal, todos estes análogos desenhados foram
caracterizados como baixa potência antagonística.
A rigidez adicionada na posição 7 nos antagonistas tipo Icatibant
(HOE140, D-Arg-[Hyp3, Thi5, D-Tic7-Oic8]-BK) (Hock et al., 1991), e NPC17731
(D-Arg[Hyp3, D-HypE(trans-propyl)7, Oic8]-BK) (Trifilieff et al., 1993) mostrou que
a orientação espacial da região C-terminal do peptídeo é fundamental para a
atividade antagonística. O icatibant apresenta alta afinidade e baixíssima
atividade residual na maioria das espécies de mamíferos analisadas e, além
disso, apresenta uma grande resistência a peptidases. A combinação destas
propriedades contribui a seu prolongado tempo de ação (várias horas) em
modelos animais. Este antagonista tem sido amplamente usado para o estudo
do papel de cininas em diferentes modelos patofisiológicos animais e,
ocasionalmente em humanos (Groves et al., 1995; Akbary et al., 1996; Dear et
al., 1996; Gainer et al., 1998; Squire et al., 2000; Witherow et al., 2001; Hornig
et al., 2003)
1.3.3 Ligantes não peptídicos
O desenvolvimento de agonistas e antagonistas não peptídicos
apresenta uma grande oportunidade para produção de novos fármacos, já que
os peptídeos geralmente têm baixa biodisponibilidade oral e penetração
26
cerebral. Vários laboratórios conduzem atualmente pesquisas para desenvolver
este tipo de ligantes para os receptores B1 e B2 de cininas. Um exemplo de
agonista não-peptidico para o receptor B2 é o FR190997, o qual foi uma
molécula derivada quimicamente do ligante FR173657, o qual por sua vez é um
antagonista para o receptor B2 (Aramori et al., 1997). Outros exemplos de
ligantes para os receptores de cininas possuem ligeiras modificações tais como
adição ou remoção de grupos metilenos, que podem levar a passar de
agonistas a antagonistas ou vice-versa (Altamura et al., 1999; Heitsch, 2002;
Sharma e Al-Dhalmawi, 2003).
1.4 Aspectos estruturais dos receptores de cininas
O receptor B1 possui alta identidade sequencial com o receptor B2,
ambos possuem 3 sítios similares de N-glicosilação nos domínios
extracelulares e acilação, possuindo 36% de identidade na sequência de
aminoácidos. A principal diferença entre os receptores B1 e B2 é a cauda C-
terminal, na qual o receptor B2 posui sítios para fosforilação enquanto o
receptor B1 é carente destes sítios por possuir uma cauda muito menor (Figura
3).
27
Figura 3. Representações graficas das sequencias de aminoácidos dos receptores B1 (A) e B2 (B) de cininas. Os aminoácidos importantes para os sítios de ligação estão marcados com vermelho (agonista), azul (antagonista) e laranja (agonista e antagonista). No receptor B2 a área dentro de cuadro representa a “hélice 8” e os pontos amarelos representam o cluster de serinas e treoninas que são fosforilados por GRKs ou PKC para a dessensibilização do receptor. (Adaptado de Leeb-Lundberg 2005).
28
1.4.1 Modificações pós-traducionais nos receptores de cininas
Os receptores de cininas sofrem diferentes modificações pós-
traducionais tais como glicosilação e formação de pontes dissulfeto em seus
domínios extracelulares. A maioria destas modificações ocorrem de uma
maneira independente do ligante, embora os processos de fosforilação e
acilação (palmitoilação) pareçam ser majoritariamente mediados pela ativação
do receptor (Leeb-Lundberg et al., 2005)
Glicosilação – Todos os receptores de cininas conhecidos de
diferentes espécies apresentam sítios de glicosilação formados
pela sequência Asn-Xaa-Ser/Thr (dois a quatro por receptor) nos
seus domínios extracelulares. (Figura 3) (Hess et al., 1992).
Pontes dissulfeto – A estrutura dos receptores de cininas de
mamíferos apresenta quatro resíduos de cisteína localizados nos
domínios extracelulares EL-1, EL-2 e EL-3 (Figura 3) (Hess et al.,
1992).
Acilação (Palmitoilação) – Os receptores de cininas podem ter
resíduos de cisteína nos quais a porção C-terminal fica exposta
no citosol (Figura 3). Estas cisteinas podem ser modificadas por
palmitoilação, e devido à inserção de uma cadeia de acido graxo
na membrana, uma alça extra é criada regulando importantes
aspectos da funcionalidade destes receptores, tais como
acomplamento à proteína G, internalização, ressensibilização
e/ou tráfego intracelular destes receptores (Hess et al., 1992).
29
1.4.2 Sítios de ligação de agonistas e antagonistas nos receptores de
cininas
Vários métodos têm sido usados para elucidar os sítios de ligação de
agonistas ou antagonistas nos receptores B1 e B2, como mutações sítio-
dirigidas ou utilização de receptores quiméricos, cross-linking do complexo
receptor-ligante e utilização de anticorpos contra os domínios extracelulares.
Estes estudos realizados têm identificado vários resíduos que parecem estar
envolvidos na ligação dos ligantes com os receptores B1 e B2.
A energia de ligação da BK parece ser fornecida por interações não-
iônicas entre a maioria dos resíduos de BK e do receptor, mas também existe a
contribuição de interações iônicas provenientes da cadeia lateral dos resíduos
de Arg ou do N-terminal. (Regoli e Barabe, 1980; Tancredi et al., 1997).
Estudos computacionais, levaram à identificação dos resíduos Asp266 e Asp284
no receptor humano B2 que se encontram nas hélices 6 e 7 com as quais os
resíduos previamente descritos da BK interagem (Kyle et al., 1994).
Abaixo encontra-se uma tabela com os principais sítios de ligação
envolvidos na interação com agonista/antagonista nos receptores B1 e B2 de
cininas.
Tabela 3. Principais sitios de ligação dos receptores B1 e B2 de cininas com seus correspondentes agonistas/antagonistas.
Domínio
Receptor B2 Receptor B1
Agonista Antagonista Agonista Antagonista
BK HOE140 DAKD DALKD
N Cys20
TM – I TM – II EL – II TM – III Ser
111 Ser
111 Lys
118 Lys
118
TM – IV Lys172
EL – III Sim* TM – V TM – VI Phe
259, Thr
263
EC – IV Cys277
, Asp266
, Sim*
30
Asp284
TM - VII Gln
288 Tyr
295 Leu
294, Phe
302
*Domínio importante, mas os resíduos específicos não foram identificados.
1.5 Aspectos moleculares e celulares da sinalização dos receptores de
cininas
1.5.1 Mecanismos de ativação do receptor dependentes ou
independentes de agonista
Os receptores B1 e B2 estão em constante dinâmica entre seus estados
conformacionais ativo e inativo. É possível tornar o receptor B2
constitutivamente ativo mutando-se alguns resíduos nas hélices
transmembranares que participam da estabilização da conformação inativa do
receptor. A mutação Asp78 Asn (D78N) foi a primeira modificação que
revelou o aumento da atividade independente de agonista (Quitterer et al.,
1996). As mutações N113A e W256A Ala também levaram a um aumento
significativo na atividade independente de agonista. É importante notar que o
antagonista Icatibant (HOE140) comportou-se como agonista inverso nestes
mutantes do receptor B2 (Marie et al., 2001). No estado ativo do receptor, o
Trp256 interage com Phe259, sendo Phe259 um residuo chave para a afinidade da
BK (Nardone e Hogan, 1994).
Os epitopos chaves para o acoplamento do receptor com a proteína G, e
sua correspondente ativação, encontram-se nos domínios intracelulares dos
GPCRs. Alguns estudos têm sido feitos para se identificar tais epitopos nos
receptores B1 e B2. O truncamento do C-terminal do receptor B2 de humano, de
maneira que a Ser316 também foi removida diminuiu o acoplamento do receptor
com a proteína G, porém sem inibir completamente. Já um truncamento além
desse resíduo (Ser316) anula completamente a atividade deste receptor,
sugirindo que este resíduo é fundamental para manter a estrutura da “hélice 8”
31
que favorece o acoplamento do receptor com as proteínas sinalizadoras
intracelulares (Prado et al., 1997; Kang e Leeb-Lundberg, 2002). Muitas
mutações adicionais foram feitas e sugerem que os resíduos Tyr129 e Tyr320
interagem com o resíduo Tyr135, que por sua vez é importante para a ativação
da proteína G e internalização do receptor (Prado et al., 1997).
1.5.2 Vias de sinalização celular mediadas pelos receptores B1 e B2
O receptor B2 é descrito ativar principalmente Gαq (Gutowski et al., 1991;
Lamorte et al., 1993; Liao e Homcy, 1993; Wilk-Blaszczak et al., 1994; Jones et
al., 1995), apesar de também ser descrita sua interação com outras proteínas
G, incluindo Gαi (Ewald et al., 1989; Linder et al., 1990), Gαs (Liebmann et al.,
1996), e Gα12/13 (Gohla et al., 1999). O agonista BK ativa a fosfolipase Cβ
mediante ativação de Gαq levando à hidrólise de PI e um aumento de Ca2+
intracelular em diferentes tipos de células (Yano et al., 1985; Derian e
Moskowitz, 1986; Tilly et al., 1987; Fasolato et al., 1988). Além disso,
translocação mediada por BK da proteína quinase C (isoenzimas α, ε, e ζ) foi
mostrada em fibroblastos (Tippmer et al., 1994) e células endoteliais (Ross e
Joyner, 1997). O estímulo da fosfolipase A2 mediada pela BK parece ocorrer
mediante mecanismos de ativação da proteína G (Burch e Axelrod, 1987;
Yanaga et al., 1991), levando à ativação da isoforma citosólica da fosfolipase
A2 dependente de Ca2+ e fosforilação (Xing et al., 1997; Lal et al., 1998), onde
também a ativação da fosfolipase D pode ser mediada pelo fluxo de Ca2+,
ativação de PKC e GTPase RhoA (Pyne e Pyne, 1995; Meacci et al., 1999).
A BK é um estimulante de eNOS e da produção de NO através de
mecanismos mediados por Ca2+ em células endoteliais (Fleming e Busse,
32
1995). Neste tipo de células, BK promove a fosforilação de MAPK (Fleming et
al., 1995), fosfolipase Cγ (Fleming et al., 1996), Hsp90 (Harris et al., 2000) e do
próprio receptor B2 (Marrero et al., 1999). Além disso, BK ativa a via de
sinalização JAK/STAT associada à caveolae (Ju et al., 2000). Também,
dependendo do tipo celular, BK induz respostas proliferativas (Owen e Villereal,
1983; Goldstein e Wall, 1984) ou anti-proliferativas (Patel e Schrey, 1992; Alric
et al., 2000). O estímulo de MAPK mediado por BK, que é independente da
endocitose do receptor, parece favorecer um acoplamento sinérgico do
receptor com as proteínas Gαq e Gαi (Blaukat et al., 2000) levando à ativação
de vias dependentes de PKC e mobilização de Ca2+ incluindo trans-ativação do
receptor EGF. Em células de fibroblastos, BK também pode estimular a
fosforilação da FAK que pode levar à regulação de proliferação, adesão,
migração e apoptose (Leeb-Lundberg et al., 1994).
A ação de BK ativa múltiplos fatores de transcrição que regulam a
expressão de várias citocinas envolvidas nos processos de inflamação e dano
ao tecido, como pela ativação do fator NF-κB que leva à expressão do gene da
interleucina (IL)-1β. Esta ativação foi bloqueada com a toxina pertussis, o que
confirma a participação das proteínas Gαi e Gβγ. Além disso, a ativação do
fator NF-κB também pode ser mediado pela BK através de Gαq ,Gβγ e Akt (Xie
et al., 2000). Da mesma forma, BK estimula a expressão de c-fos e formação
de AP-1 em células de musculo liso, o que é dependente da ativação de ERK e
Elk-1 (El-Dahr et al., 1998).
Os receptores B1 e B2 parecem regular vias de sinalização celular
bastante parecidas, mas os padrões de sinalização são diferentes. Em células
de músculo liso vascular estímulo do receptor B2 leva a uma mobilização
33
transiente de Ca2+ intracelular, enquanto o receptor B1 apresenta uma resposta
mais sustentada (Bascands et al., 1993). Estes padrões distintos de sinalização
são consequências dos diferentes graus de regulação destes receptores,
incluindo dessensibilização e internalização.
1.5.4 Oligomerização dos receptores B1 e B2
Experimentos realizados com células PC-12, usando cross-linking entre
o agonista e o receptor, levaram à identificação de monômeros, dímeros e
outros possíveis homo-oligômeros na estrutura do receptor B2, enquanto o
antagonista HOE140 não levou à formação de tais estruturas oligoméricas
(Abdalla et al., 1999).
Receptores B1 e B2 de humano foram descritos que heterodimerizam
espontaneamente quando são co-expressos em células HEK293, utilizando-se
experimentos de co-imunoprecipitação e co-localização por imunomicroscopia
eletrônica (Kang et al., 2004). Este tipo de heterodimerização gera uma
degradação proteolítica especifica do receptor B2 envolvido no complexo. Num
processo de dano persistente, este mecanismo regulatorio participa na
conversão da sinalização de tipo B2 ao tipo B1, o que sugere que os perfis
farmacológicos da sinalização de cininas através de cada sub-tipo de receptor
mantêm uma constante comunicação entre eles (Barki-Harrington et al., 2003).
Outro importante complexo heterólogo formado pelos receptores de
cininas é o complexo formado entre B2 e o receptor de angiotensina II, AT1.
Este complexo foi encontrado em células de musculo liso vascular e HEK293
transfectadas com ambos os receptores. A formação deste complexo foi
detectada usando cross-linking nos dois receptores, cromatografia de afinidade
34
e observou-se que foi independente de agonista. Também foi observado que a
co-expressão destes receptores levou a um aumento na potência e eficácia da
AngII enquanto diminuía a potência e eficácia da BK. O aumento da sinalização
da AngII foi independente da ligação da BK no receptor B2 mas dependente do
mecanismo de acoplamento entre o B2 e a proteína G. A existência do
complexo heterodimérico B2-AT1 pode apresentar implicações no controle da
pressão arterial já que estes dois receptores estão envolvidos neste processo
de maneiras antagônicas. Além disso, as concentrações plasmáticas desses
agonistas são inversamente reguladas pela enzima conversora de angiotensina
I (ECA) (Leeb-Lundberg et al., 2005).
1.5.5 Dessensibilização dos receptores B1 e B2
O estímulo do receptor B2 mediado pela BK leva a uma rápida
dessensibilização do receptor, como mostrado em estudos que avaliaram a
hidrólise de PI e a mobilização de Ca2+ em alguns sistemas nativos como
células endoteliais vasculares (Smith et al., 1995), células de musculo liso
vascular (Mathis et al., 1996) e outros sistemas transfectados com o receptor
B2 (Blaukat et al., 1996; Fathy et al., 1999). Os mecanismos de
dessensibilização do receptor incluem a fosforilação de resíduos específicos de
serinas e treoninas na calda C-terminal, os quais estão ausentes no receptor
B1; sendo portanto este receptor não rapidamente dessensibilizado (Enquist et
al., 2014) (Figura 3). A influência de diferentes isoformas de GRKs na
fosforilação do receptor B2 foi mostra que GRK4α é provavelmente a principal
isoforma envolvida neste processo (Blaukat et al., 2001).
35
Modificações pós-traducionais como fosforilação e palmitoilação do
receptor B2 são processos dinâmicos que influenciam na eficácia de
acoplamento do agonista e subsequente comportamento do receptor após
ativação. Mutações com alanina no “cluster” de serinas e treoninas no C-
terminal do receptor, que são alvos para a fosforilação mediada por GRKs,
levaram a um aumento na atividade do receptor dependente ou independente
do agonista em células HEK293 transfectadas (Fathy et al., 1999). Estas
observações sugerem que o receptor sofra dessensibilização não somente
promovida pelo agonista, mas também em condições basais (Blaukat et al.,
2001).
1.6 Agonismo tendencioso
Os GPCRs são os principais alvos da indústria farmacêutica, sendo que
cerca de 40% das drogas no mercado agem sobre esses receptores. O fato de
que os GPCRs podem sinalizar via β-arrestinas, de maneira independente de
proteína G, aliado à descrição de ligantes que estabilizam o receptor em
conformações ativas intermediárias, ativando apenas um subgrupo das
possíveis vias que o receptor pode ativar, levou à proposição do fenômeno do
“agonismo tendencioso”, do inglês “biased agonism” (Lefkowitz, 1998). Este
fenômeno sugere que seria possível desenvolver uma nova geração de drogas
que, ao se ligar em um GPCR, leve à ativação de vias benéficas para o
tratamento de uma patologia, mas não ative vias deletérias, ou ao menos
ativando em menor grau.
Um dos primeiros agonistas tendenciosos descritos é um análogo de
AngII, conhecido como SII ([Sar1, Ile4, Ile8]-AngII). No ano 2003, Wei e
36
colaboradores mostraram que SII é um ligante tendencioso para a via
dependente de -arrestina, pois ele não levava à ativação de proteína G, mas
recrutava -arrestina2 e ativava a fosforilação de ERK1/2. Esta ativação de
ERK foi abolida pela depleção de -arrestina2, mas não foi afetada pela
inibição de PKC (Wei et al., 2003). De fato, algumas moléculas com
características tendenciosas encontram-se em fase clínica de testes. Como
exemplo, TRV130 é um ligante tendencioso para a via de proteína Gi agindo no
receptor µ-opioide, levando assim a uma resposta de diminuição de dor aguda
(Viscusi et al., 2016). O TRV130 não induz o recrutamento de β-arrestinas, o
qual como foi mostrado em estudos anteriores levar à resistência a
anestésicos, depressão respiratória e constipação induzida pela morfina (Bohn
et al., 1999). Um outro exemplo é o TRV027, um agonista tendencioso para a
via de β-arrestinas através do receptor AT1, levando a um efeito cardioprotetor
em modelos de insuficiência cardiaca (Tran et al., 2016).
1.6.1 β-arrestinas
Classicamente a classificação funcional dos ligantes para GPCRs é
baseada na sua eficácia para a ativação das proteínas G. Baseando-se neste
parâmetro, os ligantes foram classificados como agonistas totais, agonistas
parciais, antagonistas ou agonistas inversos, dependendo de sua habilidade
em mediar a resposta do receptor. Não obstante, há evidencia de que os
GPCRs podem mediar múltiplas respostas, dependentes de ligante, mas
independentes de proteína G. Assim, foi descoberto que β-arrestinas que
inicialmente foram associadas com dessensibilização do receptor, podem
37
também levar a processos de sinalização (Shenoy e Lefkowitz, 2005) (Figura
1).
Arrestinas são proteínas citosólicas descobertas originalmente no
sistema visual. São descritos quatro tipos de arrestinas: arrestina-1 (também
referida como a arrestina visual), arrestina-2 (β-arrestina1), arrestina-3 (β-
arrestina2) e arrestina-4 (arrestina do cone) (Shukla et al., 2011; Lefkowitz,
2013). Enquanto arrestinas-1 e -4 estão localizadas nos bastonetes da retina e
cones, técnicas de biologia molecular e bioquímica mostraram que as
isoformas β-arrestina1 e β-arrestina2 são amplamente expressas na maioria de
sistemas (Benovic et al., 1987; Lohse et al., 1990; Sterne-Marr et al., 1993). As
arrestinas foram nomeadas baseadas em sua habilidade de “prender” o
receptor, hoje são reconhecidos seus papéis na regulação do tráfego de
GPCRs e na sinalização independente de proteína G (Figura 1).
Recentemente, duas isoformas de arrestinas foram encontradas amplamente
expressas em eucariotos, nomeadas de α-arrestinas (ou também proteína
vacuolar tipo 26 – Vps26). Sua estrutura terciaria é parecida com as arrestinas
visuais e as β-arrestinas, embora seu papel fisiológico e na sinalização de
GPCRs não tenha sido completamente estudado (Aubry e Klein, 2013; Kang et
al., 2014).
1.6.2. Agonismo tendencioso no receptor B2
Vários peptídeos com atividade agonística ou antagonística para os
receptores B1 e B2 de cininas (Regoli e Barabe, 1980) já foram desenhados e
sintetizados. Recentemente foi produzido um agonista com ação nos dois tipos
de receptores de cininas, mas com aparente agonismo tendencioso para as
38
vias de sinalização dependentes de proteína G quando interagindo com o
receptor B2 (Zhang et al., 2012). Este comportamento é diferente dos peptídeos
endógenos BK e KD (Calidina), os quais também ativam as vias de sinalização
dependentes de β-arrestina2 quando estimulam o receptor B2.
Agonistas tendenciosos para a via de β-arrestinas têm sido
caracterizados para vários GPCRs, mas ligantes com tal característica ainda
não foram identificados para os receptores de cininas. O desenvolvimento de
agonistas tendenciosos para este sistema seria interessante, pois traria a
possibilidade do desenvolvilmento de novos fármacos talvez com menos
efeitos colaterais.
39
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Produzir e caracterizar química e farmacologicamente novos análogos
de BK com possíveis ações agonísticas tendenciosas ou antagonísticas para o
receptor B2.
2.2 Objetivos específicos
Realizar o desenho e síntese de análogos de BK;
Avaliar a afinidade dos análogos pelo receptor B2 e estudar os resíduos
de BK envolvidos na interação e manutenção de alta afinidade pelo o
receptor;
Estudar a ativação das proteínas Gq e Gi3, recrutamento de -arrestina1 e
β-arrestina2, através de BRET (transferência de energia por ressonância
de bioluminescência) após a ativação do receptor com os análogos de
interesse, selecionados a partir das análises anteriores;
Analisar quantitativamente o fator de tendência (“biased factor”) para os
análogos que apresentaram este fenômeno.
40
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Desenho dos análogos de BK
Para o desenho racional de análogos de BK com potencial agonismo
tendencioso, inicialmente foi realizada uma busca na literatura das
características importantes para a interação agonista-receptor e suas principais
consequências farmacológicas.
Encontrou-se principalmente: i) O caráter positivo do C-terminal da BK é
requerido para ligação e talvez para ativação do receptor B2, já que na
ausência de este aminoácido os peptídeos comportam-se como agonistas para
o receptor B1; ii) Phe5 parece estar envolvida principalmente no processo de
ligação ao receptor porque sua substituição com resíduos aromáticos [Tyr ou
Tyr(Me)] ou alifáticos (Leu, Cha) leva a uma diminuição na afinidade sem
mudanças na atividade; iii) O núcleo aromático da Phe8 é um grupo ativador já
que ele pode ser substituído por resíduos aromáticos [Tyr ou Tyr(Me), D-Phe]
sem mudar sua atividade (Regoli e Barabe, 1980). Além disso, já como
exemplos de ligantes com agonismo tendencioso, Zhang et al. (Zhang et al.,
2012) reportou que o peptideo Lys9-BK antes descrito como agonista total
(Regoli e Barabe, 1980) não tinha esse comportamento, mas foi um peptídeo
que comportou-se com caráter tendencioso na ativação da proteína Gq em
relação ao recrutamento de β-arrestina. Dessa forma, foram desenhados uma
série de análogos que possuem inserções nas regiões de maior interesse,
como descrito acima (Tabela 4).
41
Sabendo que a aromaticidade na posição 8 favorece a afinidade e a
potência, foi substituído o resíduo Phe por outros resíduos aromáticos tais
como Trp, Thi e Tyr(Me); também modificou-se por um resíduo alifático (Leu)
(Escher et al.) para avaliar a possível ação antagonista tanto nos análogos
tendo a Arg no C-terminal como nos análogos que contem o resíduo His no C-
terminal. Inseriou-se também na posição 8 um resíduo de Ser para avaliar o
comportamento do peptídeo com um resíduo alifático e hidrofílico nesta
posição. Alem da posição 8 na BK, foram também desenhados análogos com
modificações na posição 5, que segundo a literatura (Regoli, 1980), possuem
um papel relevante pa ara afinidade do ligante pelo receptor. Finalmente, foi
substituído o C-terminal por resíduos Orn e Glu para se avaliar a importância
da carga nesta posição. Por frim, foram também sintetizados uma serie de
análogos baseados em HOE140, o principal antagonista de receptor B2.
42
Tabela 4. Gerações de análogos de BK.
Código Peptídeo Sequência
BK Bradicinina Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg
HOE140 HOE140 D-Arg Arg Pro Hyp Gly Thi Ser D-Tic Oic Arg
PRIMEIRA GERAÇÃO DE ANÁLOGOS
BK01 Met0-BK Met Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg
BK02 His9-BK Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe His
BK03 Met0-His9-BK Met Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe His
BK04 D-Ala8-BK Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro D-Ala Arg
BK05 Met0-D-Ala8-BK Met Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro D-Ala Arg
SEGUNDA GERAÇÃO DE ANÁLOGOS
BK06 Thi5,8-His9-BK Arg Pro Pro Gly Thi Ser Pro Thi His
BK07 Trp8-His9-BK Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Trp His
BK08 Orn9-BK Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Orn
BK09 Glu9-BK Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Glu
BK10 Trp8-BK Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Trp Arg
BK11 Leu8-BK Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Leu Arg
BK12 Thi5,8-BK Arg Pro Pro Gly Thi Ser Pro Thi Arg
BK13 Tyr(Me)8-BK Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Tyr(Me) Arg
BK14 D-Arg-Thi5-Leu8-BK D-Arg Arg Pro Pro Gly Thi Ser Pro Leu Arg
BK15 D-Arg-Hyp3-Thi5,8-D-Phe7-BK D-Arg Arg Pro Hyp Gly Thi Ser D-Phe Thi Arg
BK16 D-Arg-Hyp3-D-Phe7-BK D-Arg Arg Pro Hyp Gly Phe Ser D-Phe Phe Arg
BK17 D-Arg-Hyp3-D-Phe7-Leu8-BK D-Arg Arg Pro Hyp Gly Phe Ser D-Phe Leu Arg
BK18 D-Phe7-BK Arg Pro Pro Gly Phe Ser D-Phe Phe Arg
43
Peptídeos Sintetizados. Na primeira coluna encontra-se o código dado a cada um dos peptídeos sintetizados. Na segunda coluna é indicado o nome de
cada um, e na terceira encontra-se a sequência de aminoácidos.
TERCEIRA GERAÇÃO DE ANÁLOGOS
BK19 Thi8-BK Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Thi Arg BK20 Thi5-BK Arg Pro Pro Gly Thi Ser Pro Phe Arg
BK21 Ser8-BK Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Ser Arg
44
3.3 Síntese química em fase sólida
A síntese dos peptídeos análogos de BK foi realizada sob a supervisão
do Prof. Dr. Eduardo Brandt de Oliveira (Departamento de Bioquímica e
Imunologia da FMRP/USP). A síntese dos peptídeos em fase sólida (Merrifield,
1963a; Fields e Noble, 1990a) utilizando a estratégia Fmoc (9-
fluorenilmetiloxicarbonil) foi iniciada com a resina Wang-Fmoc-AA, onde AA é o
aminoácido C-terminal do peptídeo. Em seguida, foi feito o desbloqueio desse
aminoácido com solução de piperidina 20%, solução de DBU/piperidina e
exposição à microondas. A eficiência do desbloqueio foi monitorada pelo teste
de TNBS (Ácido 2,4,6-Trinitrobenceno sulfônico) e 2-cloroanil no caso do
desbloqueio da Prolina. Os aminoácidos subsequentes bloqueados com Fmoc
(Fmoc-AA) foram adicionados em excesso sempre depois do desbloqueio do
aminoácido anterior. Inicialmente, dissolvia-se esses aminoácidos em
DMSO/NMP (dimetilsulfóxido/N-metil pirrolidona), adicionava-se HOBt/HBTU
(N-hidroxibenzotriazol/ hexafluorofosfato de O-(Benzotriazol-1-ila)-1,1,3,3-
tetrametilurônio) 0,45M para ativação, agitava-se por aproximadamente 2
minutos. A mistura era transferida para o reator onde era adicionado DIPEA
(N,N-diisopropiletilamina) 1,2M para acoplamento e aplicado 6 pulsos de
microondas de 2 minutos sem N2. Para o acoplamento de alguns aminoácidos
dissolvidos em DMSO/NMP foi adicionado HOBt e após agitação manual foi
adicionado DIC (1,3-diisopropilcarbodiimida) seguido de 6 pulsos de
microondas de 2 minutos sem N2. Para clivagem do peptídeo da resina, a
mesma foi lavada com metanol, seca a vácuo e tratada com 1mL de 90% de
TFA (ácido trifluoroacético), 4% de H2O, 4% de TIS (trialquil silano) e 2% de
45
DTT (ditiotreitol) por duas horas. A solução do peptídeo foi coletada e filtrada
em coluna de 1mL com filtro poroso e lavada três vezes com éter para
precipitação. A cada lavagem o éter era removido após centrifugação a
500rpm, 0 oC por 5 minutos. O material precipitado foi seco ao ar e em seguida,
o peptídeo foi dissolvido em H2O. Os peptídeos foram purificados por
cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), caracterizados por
espectrometria de massas (MS) e a eficiência da síntese foi avaliada através
da análise da composição de aminoácidos.
3.4 Cromatografia liquida de alta eficiência - HPLC
Os peptídeos foram purificados por Cromatografia liquida de alta
eficiência (HPLC) usando uma coluna de fase reversa C4. As corridas foram
feitas com um fluxo de 1.0 mL/min em um gradiente de concentração de
acetonitrila de 15-45% (v/v) por 36 minutos em 0.1% (v/v) de TFA (ácido
trifluoroacético).
3.5 Análise de Aminoácidos
3.5.1 Hidrólise Ácida dos Peptídeos
As amostras dos peptídeos secos e livres de sal foram hidrolisados em
50µL de ácido metanossulfonico 4N contendo 0.2% de triptamina (livre de
cloretos) a 115°C durante 20 horas em microcapilares devidamente selados, de
acordo com o método descrito por Liu e Boykins (Liu e Boykins, 1989). Após a
remoção dos hidrolisados dos microcapilares eles foram parcialmente
neutralizados com 40µL de NaOH 4N, diluídos com tampão citrato de sódio
46
0.2M, pH=2.2 contendo 15% (v/v) de glicerol e alíquotas de volume adequado
foram cromatografadas segundo Moore (Moore et al., 1958), com modificações,
em analisador automático equipado com uma coluna (22x0.6cm) empacotada
com resina Beckman W-3, sistema de coluna única. A sensibilidade do método
é de 1-20nmol/resíduo.
3.5.2. Determinação da Composição de Aminoácidos
A quantidade em nmol de cada aminoácido nos hidrolisados foi
determinada pela relação entre as alturas dos picos dos aminoácidos
correspondentes (mesmo tempo de retenção pela coluna) em um
cromatograma obtido a partir de uma mistura padrão contendo 20nmol de cada
aminoácido. A composição em aminoácidos dos peptídeos foi calculada pela
relação molar entre os resíduos encontrados nos hidrolisados.
3.6 Cultura e transfeção de células HEK293T
As células HEK293T (Human Embrionary Kidney) foram mantidas em
meio DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) suplementado com 10% de
soro fetal bovino (SFB), penicilina 100 U/mL e estreptomicina 100µM e
mantidas a 37ºC e 5% de CO2.
As transfeções de HEK293T com o vetor do receptor humano B2 foram
realizados em placas de cultura de 10cm2 para células aderentes estando em
aproximadamente 70% de confluência. 10µg de DNA plasmidial foram
transfectados usando Polietilendiimino (PEI) como agente transfectante
(Hamdan et al., 2007). As células foram incubadas por 48 horas em DMEM
suplementado com SFB, penicilina e estreptomicina a 37ºC com 5% de CO2,
47
depois disto as células foram removidas, contadas e utilizadas para os ensaios
de binding ou ensaios funcionais.(Lefkowitz, 1991)
3.7 Ensaios de “Binding” com células inteiras
O primeiro ensaio realizado com os peptídeos sintetizados foi o ensaio
de “binding” em células HEK293 expressando de forma transiente o receptor
humano B2 para assim pudéssemos fazer um “screening” e avaliar a afinidade
dos análogos por esse receptor.
Os ensaios de “binding” em células HEK293T foram realizados 48h após
a transfecção com o receptor B2. As células transfectadas foram transferidas
para placas de 24 poços, 24 horas após a transfecção na quantidade de 5 x
104 cels/poço. As placas foram previamente tratadas com uma solução de poli-
lisina (0,1 mg/mL em PBS) e enxaguadas com PBS antes de receberem as
células. As placas já contendo as células foram incubadas na estufa até o dia
seguinte, e imediatamente antes de ser iniciado o ensaio de “binding” foram
lavadas brevemente com tampão de lavagem gelado (Tris-HCl 25mM, pH 7.4,
NaCl 140mM, MgCl2 5mM, 0.1% (p/v) albumina de soro bovino.)
Os ensaios de “binding” foram realizados em tampão de “binding” gelado
(Tris-HCl 25mM, pH 7.4, MgCl2 5mM, 0.1% (p/v) albumina de soro bovino e
bacitracina 100 µg/mL (Sigma) e iniciados com a adição de 25µL do ligante frio
(BK ou análogos) em concentrações gradativamente maiores (10-12 até 10-6M),
logo depois foi adicionado o ligante marcado (3H-BK) diluído no tampão de
“binding” para se chegar a um volume final de reação de 525µL. Após a adição
de todos os componentes do ensaio, as placas foram deixadas por pelo menos
16 horas a 4ºC, depois da incubação os poços foram lavados duas vezes com
48
o tampão de lavagem gelado, finalmente foi adicionado 200µL de tampão de
lise (ureia 48%, NONIDET P-40 2%, diluído em ácido acético 3M), 190µL desta
solução foram transferidos aos tubos plásticos de cintilação e 3mL de liquido de
cintilição (Fisher Scientific) foram adicionados a cada tubo, e após agitação
vigorosa dos mesmos procedeu-se à contagem da radiação em contador β
(Packard Tri-Carb 2100TR Liquid Scintillation Analyser).
Os resultados foram normalizados e plotados como porcentagem da
ligação máxima da 3H-BK e a traves de cálculos de regressão não-linear
realizados com o software GraphPad Prism foram calculados os
correspondentes valores de IC50. Os valores de Ki serão calculados utilizando a
equação de Cheng-Prussoff (Equação 1) (Cheng e Prusoff, 1973; Deblasi et al.,
1989):
𝑲𝒊 =𝑰𝑪𝟓𝟎
[𝟏 + ([𝑹𝒂𝒅𝒊𝒐𝒍𝒊𝒈𝒂𝒏𝒕𝒆]
𝑲𝑫)]
Equação 1. Equação de Cheng-Prusoff para o calculo do Ki.
3.8 Avaliação da ativação do receptor através de BRET (transferência de
energia por ressonância de bioluminescência)
Nesse trabalho foram utilizadas as configurações BRET480-EGFP e
BRET400-GFP10. Para o BRET480-EGFP (chamado de BRET1), as proteínas estão
fusionadas a RlucII (Renilla luciferase com as mutações C124A/M185V) que
atua como doador, e a EYFP que atua como aceptor de energia. Para o
BRET400-GFP10 (chamado de BRET2), as proteínas estão fusionadas a RlucII e
GFP10, que atuam como doador e aceptor de energia respectivamente. As
construções Gαq-RlucII, Gi3-RlucII, G1, G1-GFP10, -arrestina1-RlucII, -
arrestina2-RlucII foram realizadas pelo grupo do Prof. Michel Bouvier da
49
Universidade de Montreal e gentilmente cedidas (Gales et al., 2006; Quoyer et
al., 2013; Zimmerman et al., 2012). A construção do receptor B2-EYFP foi
realizada pelo grupo do Prof. João Bosco Pesquero da UNIFESP e gentilmente
cedido.
3.8.1 Análise da ativação de proteína Gq e Gi3 através de BRET
Foram utilizados biossensores baseados na técnica de BRET
desenvolvidos pelo grupo do Prof. Michel Bouvier para avaliar a ativação de
proteína Gq e Gi3. Neste caso, a subunidade alfa da proteína Gq/Gi3 encontra-se
fusionada a luciferase II de Renilla (RlucII) e a subunidade gama fusionada a
GFP10. No estado basal, onde a proteína G se encontra no estado trimérico,
existe transferência de energia da luciferase para GFP devido à proximidade
entre as subunidades em presença do substrato da luciferase (Figura 4A).
Quando o receptor é ativado, ocorre a dissociação entre as subunidades alfa e
o dímero beta/gama da proteína G, diminuindo o sinal de BRET (Figura 4B).
Figura 4. Princípio da avaliação da ativação de proteína Gq/Gi3 através de BRET. Células HEK293T são cotransfectadas com vetores que codificam para o receptor B2 e as 3 subunidades da proteína Gq/Gi3, sendo que a subunidade alfa é fusionada à Renilla Luciferase II (RlucII) e a subunidade gama é fusionada à GFP10. Quando o substrato da luciferase,
50
coelenterazina 400a, é adicionado ao meio, a enzima o oxida com consequente emissão de luz no comprimento de 480 nm. Este é o comprimento de onda de excitação da GFP10, que subsequentemente emite fluorescência a 510 nm. No estado basal (A), o trímero da proteína G está formado e a luciferase se encontra próxima à GFP10, ocorrendo BRET. Quando o receptor é ativado (B), ocorre a dissociação das subunidades alfa e beta/gama, impedindo a ocorrência de BRET. São então quantificadas as intensidades em 480 e 510 nm, e a razão de BRET é calculada dividindo-se os valores de 510 nm por 480 nm
A ativação da proteína Gq/Gi3 pelo receptor foi avaliada em células
HEK293T cotransfectadas com Gαq-RlucII / Gαi3-RlucII , G1, G1-GFP10 e
receptor B2 (BRET2). Dois dias depois da transfecção, as células foram
lavadas, soltas e ressuspensas em 6mL de PBS em temperatura ambiente. Em
seguida, 80µL da suspensão foram distribuídos por poço em placas brancas de
96 poços (Optiplate; PerkinElmer) e tratados com diferentes concentrações de
BK ou análogos por 5 min. A coelenterazina 400a foi utilizada como substrato
de luciferase gerando luz com pico de emissão máximo em 400nm. As leituras
de BRET foram realizadas pelo leitor de placas VICTOR™ X Light
Luminescence (PerkinElmer). Os sinais foram calculados pela razão da
intensidade da luz emitida pelo aceptor pela intensidade da luz emitida pelo
doador (RlucII). Os dados obtidos foram apresentados em curvas
concentração-resposta e o EC50 de cada ligante foi calculado a partir da
regressão não-linear pelo Programa GraphPad Prism (San Diego, CA).
3.8.2 Análise do recrutamento de -arrestinas através de BRET
Além de avaliar a capacidade dos análogos de ativar vias de sinalização
independentes de proteína Gq/Gi, também foi analisada a ativação de vias
dependentes de β-arrestina através da estratégia de BRET, que avalia o
recrutamento de β-arrestinas para o receptor ativado. Para tal, a β-arrestina é
fusionada a RlucII e o receptor B2 a YFP (Figura 5A). Quando o receptor é
51
ativado, ocorre a interação da β-arrestina com a porção citoplasmática do
receptor e consequentemente a aproximação da RlucII e da YFP (Figura 5B).
Dessa forma, na presença do substrato da luciferase o sinal de BRET aumenta.
Figura 5. Princípio da avaliação do recrutamento de β-arrestina através de BRET. Células HEK293T são cotransfectadas com plasmídeos que codificam para o receptor B2 fusionado a YFP e para β-arrestina fusionada à Renilla Luciferase II (RlucII). Quando o substrato da luciferase, celenterazina H, é fornecido, a enzima o oxida gerando a emissão de luz no comprimento de 480 nm. Este é o comprimento de onda de excitação da GFP, que emite fluorescência a 535 nm. No estado basal (A), a β-arrestina se encontra no citoplasma e não interage com o receptor, impedindo a aproximação da luciferase e da YFP e consequente ocorrência de BRET. Quando o receptor é ativado (B), existe a interação entre receptor e β-arrestina e consequente ocorrência de BRET. São então avaliadas as intensidades em 480 e 535 nm, e a razão de BRET é calculada dividindo-se os valores de 535 nm por 480 nm.
Células HEK293T expressando -arrestina1-RlucII ou -arrestina2-RlucII
e o receptor B2-EYFP (BRET1) foram utilizadas para estudar o recrutamento de
-arrestinas. O estímulo com diferentes concentrações de BK e dos análogos
foi realizado por 15 min e a coelenterazina h foi utilizada como substrato de
luciferase gerando luz com um pico de emissão máximo em 480nm. Os dados
obtidos foram apresentados em curvas concentração-resposta e o EC50 de
cada ligante foi calculado a partir da regressão não-linear pelo Programa
GraphPad Prism (San Diego, CA).
52
3.9. Cálculo do agonismo tendencioso
Para quantificar o agonismo tendencioso, os efeitos dos agonistas no
BRET para ativação das proteínas Gq e Gi e recrutamento de β-arrestina1 e β-
arrestina2, serão ajustados ao Modelo Operacional de Agonismo de Black e
Leff (Black e Leff, 1983), de acordo com a Equação 2:
𝑅𝑒𝑠𝑝𝑜𝑠𝑡𝑎 =𝐸𝑚𝑎𝑥 × 𝜏𝑛 × [𝐴]𝑛
(𝐾𝐴 + [𝐴]𝑛) + 𝜏𝑛 × 𝐾𝐴𝑛
Equação 2. Modelo operacional de agonismo
onde, Emax representa a resposta máxima possível do sistema, KA é a
constante de dissociação no equilíbrio do complexo agonista-receptor, n é a
inclinação de transdução, e representa a eficácia operacional do agonista. Foi
utilizado o método proposto por Kenakin e colaboradores (Kenakin et al., 2012)
que é baseado em comparações de razões /KA entre agonistas. Os valores de
log(/KA), também denominados de coeficientes de transdução, representam a
“força” de um dado agonista em ativar uma via de sinalização em um sistema
definido. Esses valores serão calculados através de uma reparametrização da
equação (Equação 3) do modelo operacional (Evans et al., 2011):
𝑅𝑒𝑠𝑝𝑜𝑠𝑡𝑎 = 𝑏𝑎𝑠𝑎𝑙 +(𝐸𝑚𝑎𝑥 − 𝑏𝑎𝑠𝑎𝑙) × 𝑇𝑅𝑛 × [𝐴]𝑛
[𝐴]𝑛 × 𝑇𝑅𝑛 × (1 +[𝐴]𝐾𝐴
)𝑛
Equação 3. Modelo operacional de Evans
53
onde TR (do inglês - “transduction ratio”) é a razão /KA. O valor de Δlog(/KA)
representa a eficiência do agonista em ativar uma via comparado ao agonista
de referência e será calculado de acordo com a Equação 4:
∆𝑙𝑜𝑔(𝜏 𝐾𝐴⁄ )𝑎𝑔𝑜𝑛𝑖𝑠𝑡𝑎 𝑟𝑒𝑓𝑒𝑟ê𝑛𝑐𝑖𝑎⁄ = 𝑙𝑜𝑔(𝜏 𝐾𝐴⁄ )𝑎𝑔𝑜𝑛𝑖𝑠𝑡𝑎 − 𝑙𝑜𝑔(𝜏 𝐾𝐴⁄ )𝑟𝑒𝑓𝑒𝑟ê𝑛𝑐𝑖𝑎
Equação 4. Cálculo da tendência de um ligante em comparação ao ligante de referência
A partir da subtração dos Δlog(/KA) será obtido o fator de tendência
ΔΔlog(/KA) pela Equação 5:
∆∆𝑙𝑜𝑔(𝜏 𝐾𝐴⁄ ) = ∆𝑙𝑜𝑔(𝜏 𝐾𝐴⁄ )𝑣𝑖𝑎 𝑑𝑒 𝑠𝑖𝑛𝑎𝑙𝑖𝑧𝑎çã𝑜 1 − ∆𝑙𝑜𝑔(𝜏 𝐾𝐴⁄ )𝑣𝑖𝑎 𝑑𝑒 𝑠𝑖𝑛𝑎𝑙𝑖𝑧𝑎çã𝑜 2
Equação 5. Cálculo da tendência de um ligante comparando-se duas vías de sinalização
54
4. RESULTADOS
4.1 Desenho e síntese dos análogos de Bradicinina
Na Tabela 4 estão mostrados os análogos desenhados e sintetizados
(ver materiais e métodos item 3.1). A síntese foi feita pelo método de fase
sólida (Merrifield, 1963b; Fields e Noble, 1990b) (ver materiais e métodos item
3.3).
4.2 Caracterização química e purificação dos peptídeos sintetizados
Os peptídeos sintetizados da primeira geração foram purificados e
caracterizados quimicamente mediante Cromatografia liquida de alta eficiência
(HPLC), Espectrometria de massas (MS) e análise de composição de
aminoácidos. Tais análises mostraram que a síntese foi bem sucedida e que os
peptídeos encontravam-se com alto grau de pureza. (ver Anexo 1). Os
peptídeos da segunda, e terceira gerações foram caracterizados, purificados e
quantificados por HPLC. Nas figuras 6, 7 e 8, encontram-se exemplos de
cromatogramas e espectros de MS obtidos, nesse caso para a síntese do
peptídeo His9-BK.
55
Figura 6. Perfil cromatográfico do peptídeo His9-BK. 1) Pico correspondente ao peptídeo
sintetizado.
Figura 7. Perfil de análise de aminoácidos do peptídeo His9-BK. Cromatograma usado para
realizar a quanticicação do peptídeo sintetizado e purificado.
Figura 8. Espectro de massas do peptídeo His9-BK. O espectro analisado mostrou a
fragmentação correta para o peptídeo sintetizado e purificado.
1
56
4.3 Primeira geração de peptideos
Para a primeira geração de análogos foram feitas as seguintes
modificações na estrutura da BK:
De acordo com a literatura (Regoli e Barabe, 1980), o análogo Met0-KD
foi um potente peptídeo na ativação do receptor B2, apresentando uma
potência oito vezes maior que a KD, portanto, decidiu-se adicionar o
resíduo Met na posição inicial da BK, buscando obter este aumento na
potência do análogo Met0-BK.
Tendo como base o caracter básico da Arg e o caracter aromático da
Phe do C-terminal da BK, Arg9 foi substituída por um resíduo de His, já
que este resíduo mantem as duas propriedades anteriormente
mencionadas. Ficando o análogo His9-BK. Além disso, tentamos aliar as
duas considerações anteriores, gerando-se o análogo Met0-His9-BK.
O sitio de clivagem da BK para ECA é entre os resíduos Pro7-Phe8,
portanto foi trocado o resíduo Phe8 por D-Ala8 para dar uma resistência à
degradação enzimática, obtendo-se o análogo D-Ala8-BK, e também
somando-se este racional com as informações da Metionina na posição
zero foi gerado o análogo Met0-D-Ala8-BK.
57
4.3.1 Ensaio de “Binding” e cálculo de afinidade para os análogos da
primeira geração
Foram realizados ensaios de “binding” para os análogos em células
HEK293T expressando transientemente o receptor B2. As concentrações
testadas dos peptídeos foram desde 10-5M até 10-12M e cada ponto foi
realizado em duplicata.
Apresentam-se os gráficos individuais de perfil de afinidade de cada um
dos análogos tendo a BK como ligante de referência (Figura 9).
L o g [L ig a n te ]M
Lig
aç
ão
de
3H
-BK
(%
)
-1 3 -1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
1 2 5
B K
M et0
-B K
L o g [L ig a n te ]M
Lig
aç
ão
de
3H
-BK
(%
)
-1 3 -1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
1 2 5
B K
H is9
-B K
L o g [L ig a n te ]M
Lig
aç
ão
de
3H
-BK
(%
)
-1 3 -1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
1 2 5
B K
M et0
-H is9
-B K
L o g [L ig a n te ]M
Lig
aç
ão
de
3H
-BK
(%
)
-1 3 -1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
1 2 5
B K
D -A la8
-B K
L o g [L ig a n te ]M
Lig
aç
ão
de
3H
-B
K (
%)
-1 3 -1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
1 2 5
B K
M et0
-D -A la8
-B K
Figura 9. Curvas de “binding” em ensaios de competição em células HEK293T transfetadas com o receptor B2. Os resultados foram normalizados e plotados como porcentagem da ligação máxima da BK radioativa. O radioligante utilizado foi
3H-BK. A) BK e
Met0-BK. B) BK e His
9-BK. C) BK e Met
0-His
9-BK. D) BK e D-Ala
8-BK. E) BK e Met
0-D-Ala
8-BK.
N=3 experimentos independentes.
A B
C D
E
58
Nossos resultados mostraram que o análogo Met0-BK apresentou
afinidade menor do que a da BK. Os análogos His9-BK, Met0-His9-BK, D-Ala8-
BK, Met0-D-Ala8-BK praticamente não ligaram no receptor B2. Na Tabela 5 são
apresentados os valores de afinidades (Ki e pKi) para os análogos que ligaram.
Tabela 5. Constantes de afinidade (Ki e pKi) da BK e análogos, obtidas em ensaios de competição pela ligação específica do radioligante
3H-BK. N=2 ou 3 experimentos
independentes.
Peptídeo Ki (nM) ± E.P.M.
Fc pKi ± E.P.M.
BK 0,86 ± 0,16 1,0 9,09 ± 0,08
Met0-BK 28 ± 4,4 36,8 7,6 ± 0,06
His9-BK NQ NQ NQ
Met0-His9-BK NQ NQ NQ
D-Ala8-BK NQ NQ NQ
Met0-D-Ala8-BK NQ NQ NQ
Os valores de Ki foram calculados através de cálculos de regressão não linear realizados com o programa GraphPad Prism e são apresentados como média ± erro padrão da média (E.P.M.) de 2 ou 3 experimentos independentes. O Fc é a razão do valor de Ki para os análogos em relação ao valor de Ki obtido para BK. NQ. Não Quantificável.
4.3.2 Ativação da proteína Gq pelos análogos da primeira geração
Além de investigarmos a capacidade dos análogos Met0-BK, His9-BK e
Met0-His9-BK de se ligar ao receptor B2, foi estudada a capacidade destes
ligantes em ativar Gq. Os análogos D-Ala8-BK e Met0-D-Ala8-BK não
apresentaram afinidade pelo receptor B2, fato pelo qual experimentos
funcionais não foram realizados com estes análogos. A Figura 10 apresenta os
perfis de ativação de cada um dos análogos testados. O análogo Met0-BK
apresentou um perfil de ativação com um EC50 de 10.1nM, sendo o da BK de
3.1nM. Dessa forma o análogo foi cerca de 3 vezes menos potente que a BK.
Os análogos His9-BK e Met0-His9-BK apresentaram potencias muito baixas na
ativação da proteína Gq, compatível com as baixas afinidades observadas.
59
L o g [A g o n is ta ]MInib
içã
o d
o B
RE
T p
elo
lig
an
te
-1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .8
-0 .6
-0 .4
-0 .2
0 .0
0 .2
B K
M et0
-B K
L o g [A g o n is ta ]MInib
içã
o d
o B
RE
T p
elo
lig
an
te
-1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .8
-0 .6
-0 .4
-0 .2
0 .0
0 .2
B K
H is9
-B K
L o g [A g o n is ta ]MInib
içã
o d
o B
RE
T p
elo
lig
an
te
-1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .8
-0 .6
-0 .4
-0 .2
0 .0
0 .2
B K
M et0
-H is9
-B K
Figura 10. Análise da ativação de proteína Gq através de BRET após a ativação com BK e análogos. Curvas concentração-resposta para ativação de Gq após 5 min de estímulo com os ligantes. A) BK e Met
0-BK. B) BK e His
9-BK. C) BK e Met
0-His
9-BK. N= 3 experimentos
independentes.
4.3.3 Análise do recrutamento de -arrestina2 pelos análogos da primeira
geração.
Além de avaliar a capacidade dos análogos de ativar vias de sinalização
dependentes de proteína Gq, também foi avaliada a possível ativação de vias
dependentes de β-arrestina2 através da análise do recrutamento de β-arrestina
para o receptor.
L o g [A g o n is ta ]MBR
ET
pro
mo
vid
o p
elo
lig
an
te
- 1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5
-0 .1
0 .0
0 .1
0 .2
0 .3
0 .4 B K
M et0
-B K
L o g [A g o n is ta ]MBR
ET
pro
mo
vid
o p
elo
lig
an
te
- 1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5
-0 .1
0 .0
0 .1
0 .2
0 .3
0 .4 B K
H is9
-B K
A B
C
B A
60
L o g [A g o n is ta ]MBR
ET
pro
mo
vid
o p
elo
lig
an
te
- 1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5
-0 .1
0 .0
0 .1
0 .2
0 .3
0 .4 B K
M et0
-H is9
-B K
Figura 11. Análise do recrutamento de β-arrestina2 através de BRET após a ativação com BK e análogos. Curvas concentração-resposta para recrutamento de β-arrestina2 após 15 min de estímulo com os ligantes. A) BK e Met
0-BK. B) BK e His
9-BK. C) BK e Met
0-His
9-BK. N=3
experimentos independentes
No recrutamento de β-arrestina2 o análogo Met0-BK apresentou uma
baixa potência de ativação quando comparada àquela obtida na ativação da
proteína Gq, sendo no caso do recrutamento de β-arrestina2 a potência cerca
de 400 vezes menor que a BK. Os análogos His9-BK e Met0-His9-BK não
apresentaram atividade significativa.
A Tabela 6 apresenta os valores obtidos de EC50, pEC50 e Emáx para os
análogos da primeira geração na ativação de Gq e para o recrutamento de β-
arrestina2.
Tabela 6. Potência da BK e dos análogos na ativação da proteína Gq e recrutamento de β-arrestina2
Peptídeo EC50 (nM) ± E.P.M.
Fc pEC50 ± E.P.M.
Emáx(%)
Ativação Gq
BK 3,1 ± 0,9 1,0 8,6 ± 0,12 100
Met0-BK 10,1 ± 1,7 3,5 8,0 ± 0,07 106,8 ± 3,0
His9-BK NQ NQ NQ NQ
Met0-His9-BK NQ NQ NQ NQ
Recrutamento β-Arrestina2
BK 0,31 ± 0,04 1,0 9,5 ± 0,06 100
Met0-BK 120 ± 6 387,7 6,9 ± 0,03 151,5 ± 1,27
His9-BK NQ NQ NQ NQ
Met0-His9-BK NQ NQ NQ NQ
C
61
Os valores de EC50 e pEC50 são apresentados como média ± erro padrão da média (E.P.M.) de 3 experimentos. O Fc é a razão dos valores de EC50 para os análogos em relação ao valor de EC50 obtido para BK. O Emáx. Foi representado em percentagem, sendo a refêrencia (BK) o 100%. NQ, Não quantificável.
4.4 Segunda geração de peptídeos
Baseados nos resultados obtidos com os análogos da primeira geração
e em dados da literatura, foram desenhados e sintetizados uma serie de 13
análogos de BK com o seguinte racional:
Foi descrito por Dunn e Stewart (Dunn e Stewart, 1971) que o análogo
Thi5,8-BK foi o mais potente em contração do útero de rato. Dessa forma
foi desenhado o análogo Thi5,8-His9-BK tentando aumentar a potência
do análogo His9-BK. O análogo Thi5,8-BK também foi sintetizado para
analisar sua funcionalidade em paralelo aos novos análogos.
O análogo Trp8-BK foi descrito apresentar altíssima afinidade pelo
receptor B2 (para revisão (Regoli e Barabe, 1980). Portanto, foi
sintetizado o análogo Trp8-His9-BK, tentando aumentar a afinidade do
análogo His9-BK.
Ainda com o objetivo de analisar o papel do resíduo C-terminal da BK na
sua afinidade e função, foram desenhados dois novos análogos
alterando-se a carga do ultimo aminoácido. Para tanto, foram
sintetizados os análogos Orn9-BK e Glu9-BK. O aminoácido Ornitina é
um análogo de Lys, e apresenta uma carga positiva ao igual à da
Arginina, mas sendo menos volumoso, e o aminoácido Glu possui carga
negativa.
62
Para avaliar o caráter aromático da posição 8, foram sintetizados dois
análogos mudando-se esta característica. Baseados no análogo
Tyr(Me)8-BK, que possui um caráter altamente hidrofobico e que já foi
descrito possuir uma potência maior que a BK, sintetizamos o peptídeo
Leu8-BK, no qual o resíduo Phe8 foi substituído por um aminoácido
alifático, para assim avaliar a importância da aromaticidade nesta
posição.
No ano de 1998, Regoli e colaboradores (Regoli et al., 1998)
descreveram uma serie de análogos com uma modificação especifica, a
qual era substituir a Pro7, por um resíduo D-Phe a qual gerava análogos
com propriedades antagonísticas. Eles descreveram os análogos D-
Phe7-BK, D-Arg0-Hyp3-Thi5,8-D-Phe7-BK, D-Arg0-Hyp3-D-Phe7-BK, e D-
Arg0-Hyp3-D-Phe7-Leu8-BK como antagonistas fracos. Estes peptídeos
foram sintetizados e testados funcionalmente para avaliarmos se ainda
poderiam possuir alguma atividade quanto a via de β-arrestinas, como já
foi mostrado para outros compostos que foram originalmente descritos
como antagonistas.
Por fim, foi desenhado um peptídeo onde a Pro7 foi restaurada no lugar
da modificação por D-Phe para testar-se a hipótese de que esta poderia
ser a substituição crítica para se gerar o caráter de antagonista sugerida
por Regoli (Regoli et al., 1998). Foi sintetizado o análogo D-Arg0-Thi5-
Leu8-BK.
4.4.1 Ensaio de “binding” e cálculo de afinidade para os análogos da
segunda geração
63
Da mesma maneira que para os análogos da primeira geração, foram
realizados ensaios de “binding” para os análogos da segunda geração. Os
perfis de afinidade de cada um deles são apresentados na Figura 12.
L o g [L ig a n te ]M
Lig
aç
ão
de
3H
-BK
(%
)
-1 3 -1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
1 2 5
T h i5 ,8
-H is9
-B K
B K
L o g [L ig a n te ]M
Lig
aç
ão
de
3H
-BK
(%
)
-1 3 -1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
1 2 5T rp
8-H is
9-B K
B K
L o g [L ig a n te ]M
Lig
aç
ão
de
3H
-BK
(%
)
-1 3 -1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
1 2 5O rn
9-B K
B K
L o g [L ig a n te ]M
Lig
aç
ão
de
3H
-BK
(%
)
-1 3 -1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
1 2 5
G lu9
-B K
B K
L o g [L ig a n te ]M
Lig
aç
ão
de
3H
-BK
(%
)
-1 3 -1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
1 2 5
T rp8
-B K
B K
L o g [L ig a n te ]M
Lig
aç
ão
de
3H
-BK
(%
)
-1 3 -1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
1 2 5L e u
8-B K
B K
.
L o g [L ig a n te ]M
Lig
aç
ão
de
3H
-BK
(%
)
-1 3 -1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
1 2 5
T h i5 ,8
-B K
B K
L o g [L ig a n te ]M
Lig
aç
ão
de
3H
-BK
(%
)
-1 5 -1 4 -1 3 -1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
1 2 5T y r(M e )
8-B K
B K
F E
D C
B A
G H
64
L o g [L ig a n te ]M
Lig
aç
ão
de
3H
-BK
(%
)
-1 3 -1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
1 2 5
D -A rg0
-T h i5
-L e u8
-B K
B K
L o g [L ig a n te ]M
Lig
aç
ão
de
3H
-B
K (
%)
-1 3 -1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
1 2 5 D -A rg0-H y p
3-T h i
5,8-D -P h e
7- B K
B K
L o g [L ig a n te ]M
Lig
aç
ão
de
3H
-BK
(%
)
-1 3 -1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
1 2 5D -A rg
0-H yp
3-D -P h e
7-B K
B K
L o g [L ig a n te ]M
Lig
aç
ão
de
3H
-B
K (
%)
-1 3 -1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
1 2 5D -A rg
0-H y p
3-D -P h e
7- L e u
8-B K
B K
L o g [L ig a n te ]M
Lig
aç
ão
de
3H
-BK
(%
)
-1 3 -1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
1 2 5D -P h e
7-B K
B K
Figura 12. Curvas de “binding” em ensaios de competição em células HEK293T transfetadas com o receptor B2. Os resultados foram normalizados e plotados como porcentagem da ligação máxima da BK radioativa. O radioligante utilizado foi
3H-BK. A) BK e
Thi5,8
-His9-BK. B) BK e Trp
8-His
9-BK. C) BK e Orn
9-BK. D) BK e Glu
9-BK. E) BK e Trp
8-BK. F)
BK e Leu8-BK. G) BK e Thi
5,8-BK. H) BK e Tyr(Me)
8-BK. I) BK e D-Arg
0-Thi
5-Leu
8-BK. J) BK e D-
Arg0-Hyp
3-Thi
5,8-D-Phe
7-BK. K) BK e D-Arg
0-Hyp
3-D-Phe
7-BK. L) BK e D-Arg
0-Hyp
3-D-Phe
7-Leu
8-
BK. M) BK e D-Phe7-BK. N=2 ou 3 experimentos.
Os análogos contendo Histidina na posição 9 mantiveram seus perfis de
baixa afinidade como pode ser observado nas figuras 12A e 12B. Os análogos
Orn9-BK e Glu9-BK apresentaram uma baixíssima afinidade, quase nula pelo
receptor B2 (Figuras 12C e 12D). Os análogos Trp8-BK e Leu8-BK, D-Arg0-Thi5-
Leu8-BK, D-Arg0-Thi5-Leu8-BK, D-Arg0-Hyp3-Thi5,8-D-Phe7-BK, D-Arg0-Hyp3-D-
Phe7-BK, D-Arg0-Hyp3-D-Phe7-Leu8-BK e D-Phe7-BK apresentaram perfis de
baixa afinidade, sendo cerca de 400 vezes menores que a da BK (Tabela 7). Já
o análogos Thi5,8-BK apresentou afinidade semelhante a BK, e o análogo
I J
K L
M
65
Tyr(Me)8-BK apresentou um aumento significativo de afinidade pelo receptor,
sendo cerca de 150 vezes maior que a da BK.
A tabela 7 apresenta os valores de Ki e pKi obtidos para os análogos
desta geração.
Tabela 7. Constantes de afinidade (Ki e pKi) da BK e análogos, obtidas em ensaios de competição pela ligação especifica do radioligante
3H-BK. N=2 ou 3 experimentos
independentes.
Peptídeo Ki (nM) ± E.P.M.
Fc pKi ± E.P.M.
BK 0,86 ± 0,16 1,0 9,09 ± 0,08
Thi5,8-His9-BK NQ NQ NQ
Trp8-His9-BK NQ NQ NQ
Orn9-BK NQ NQ NQ
Glu9-BK NQ NQ NQ
Trp8-BK 262,5 ± 133 344,2 6,64 ± 0,24
Leu8-BK 387,1 ± 272 507,6 6,56 ± 0,38
Thi5,8-BK 0,26 ± 0,02 0,3 9,57 ± 0,04
Tyr(Me)8-BK 0,006±0,001 0,007 11,23 ± 0,13
D-Arg0-Thi5-Leu8-BK 278,5 ± 178 365,3 6,67 ± 0,33
D-Arg0-Hyp3-Thi5,8-D-Phe7-BK 196,3 ± 61 257,4 6,72 ± 0,14
D-Arg0-Hyp3-D-Phe7-BK 179,6 ± 61 235,62 6,77 ± 0,15
D-Arg0-Hyp3-D-Phe7-Leu8-BK 137,9 ± 61 180,9 6,90 ± 0,20
D-Phe7-BK 555,9 ± 179 729,1 6,27 ± 0,14
Os valores de Ki foram calculados através de cálculos de regressão não linear realizados com o programa GraphPad Prism e são apresentados como média ± erro padrão da média (E.P.M.) de 2 ou 3 experimentos independentes. O Fc é a razão do valor de Ki para os análogos em relação ao valor de Ki obtido para BK.
4.4.2 Análise da ativação de Gq e Gi3 pelos análogos da segunda geração
Além de investigar a capacidade dos análogos de se ligarem ao receptor
B2, foi estudada a capacidade de ativarem Gq e Gi3.
66
Ativação da proteína Gq mediada pelos análogos da segunda geração
A figura 13 mostra os perfis de cada um dos análogos da segunda geração
na ativação da proteína Gq.
L o g [A g o n is ta ]MInib
içã
o d
o B
RE
T p
elo
lig
an
te
-1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .8
-0 .6
-0 .4
-0 .2
0 .0
0 .2B K
T rp8
-B K
L o g [A g o n is ta ]M
Inib
içã
o d
o B
RE
T p
elo
lig
an
te
-1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .8
-0 .6
-0 .4
-0 .2
0 .0
0 .2
B K
L e u8
-B K
L o g [A g o n is ta ]MInib
içã
o d
o B
RE
T p
elo
lig
an
te
-1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .8
-0 .6
-0 .4
-0 .2
0 .0
0 .2
B K
T h i5 ,8
-B K
L o g [A g o n is ta ]MInib
içã
o d
o B
RE
T p
elo
lig
an
te
-1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .8
-0 .6
-0 .4
-0 .2
0 .0
0 .2
B K
T y r(M e )8
-B K
L o g [A g o n is ta ]M
Inib
içã
o d
o B
RE
T p
elo
lig
an
te
-1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .8
-0 .6
-0 .4
-0 .2
0 .0
0 .2
B K
D -A rg0-T h i
5-L eu
8-B K
L o g [A g o n is ta ]MInib
içã
o d
o B
RE
T p
elo
lig
an
te
-1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .8
-0 .6
-0 .4
-0 .2
0 .0
0 .2
B K
D -A rg0
-H y p3
-T h i5 , 8
-D -P h e7
-B K
L o g [A g o n is ta ]MInib
içã
o d
o B
RE
T p
elo
lig
an
te
-1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .8
-0 .6
-0 .4
-0 .2
0 .0
0 .2
B K
D -A rg0
-H y p3
-D -P h e7
-B K
L o g [A g o n is ta ]MInib
içã
o d
o B
RE
T p
elo
lig
an
te
-1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .8
-0 .6
-0 .4
-0 .2
0 .0
0 .2
B K
D -A rg0
-H y p3
-D -P h e7
- L e u8
-B K
A B
C D
E F
G H
67
L o g [A g o n is ta ]MInib
içã
o d
o B
RE
T p
elo
lig
an
te
-1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .8
-0 .6
-0 .4
-0 .2
0 .0
0 .2
B K
D -P h e7-B K
Figura 13. Análise da ativação de proteína Gq através de BRET após a ativação com BK e análogos. Curvas concentração-resposta para ativação de Gq após 5 min de estímulo com os ligantes. A) BK e Trp
8-BK. B) BK e Leu
8-BK. C) BK e Thi
5,8-BK. D) BK e Tyr(Me)
8-BK. E) BK e
D-Arg0-Thi
5-Leu
8-BK. F) BK e D-Arg
0-Hyp
3-Thi
5,8-D-Phe
7-BK. G) BK e D-Arg
0-Hyp
3-D-Phe
7-BK. H)
BK e D-Arg0-Hyp
3-D-Phe
7-Leu
8-BK. I) BK e D-Phe
7-BK. N=3 experimentos independentes.
Os análogos Thi5,8-His9-BK, Trp8-His9-BK, Orn9-BK e Glu9-BK não foram
avaliados na ativação de proteínas G (Gq e Gi3) devido a sua baixíssima
afinidade pelo receptor. Com relação à ativação de Gq pelos análogos testados,
o análogo Leu8-BK apresentou uma potência semelhante à BK. Os análogos
Thi5,8-BK e Tyr(Me)8-BK, apresentaram potências maiores em comparação com
a BK. O análogo D-Arg0-Thi5-Leu8-BK apresentou uma potência menor, mas
sua eficácia (Emáx) foi igual à da BK. Os análogos D-Arg0-Hyp3-Thi5,8-D-Phe7-
BK, D-Arg0-Hyp3-D-Phe7-BK, D-Arg0-Hyp3-D-Phe7-Leu8-BK e D-Phe7-BK
apresentaram atividades muito baixas (Tabela 8).
Ativação da proteína Gi3 mediada pelos análogos da segunda geração
A figura 14 mostra os perfis dos análogos da segunda geração na ativação da
proteína Gi3.
I
68
L o g [A g o n is ta ]M
Inib
içã
o d
o B
RE
T p
elo
lig
an
te
-1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .3
-0 .2
-0 .1
0 .0
0 .1B K
T rp8
-B K
L o g [A g o n is ta ]M
Inib
içã
o d
o B
RE
T p
elo
lig
an
te
-1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .3
-0 .2
-0 .1
0 .0
0 .1B K
L e u8
-B K
L o g [A g o n is ta ]M
Inib
içã
o d
o B
RE
T p
elo
lig
an
te
-1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .3
-0 .2
-0 .1
0 .0
0 .1 B K
T h i5 ,8
-B K
L o g [A g o n is ta ]M
Inib
içã
o d
o B
RE
T p
elo
lig
an
te
-1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .3
-0 .2
-0 .1
0 .0
0 .1 B K
T y r(M e )8
-B K
L o g [A g o n is ta ]M
Inib
içã
o d
o B
RE
T p
elo
lig
an
te
-1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .3
-0 .2
-0 .1
0 .0
0 .1 B K
D -A rg0-T h i
5-L eu
8-B K
L o g [A g o n is ta ]M
Inib
içã
o d
o B
RE
T p
elo
lig
an
te
-1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .3
-0 .2
-0 .1
0 .0
0 .1B K
D -A rg0-H yp
3-T h i
5 ,8-D -P h e
7-B K
L o g [A g o n is ta ]M
Inib
içã
o d
o B
RE
T p
elo
lig
an
te
-1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .3
-0 .2
-0 .1
0 .0
0 .1B K
D -A rg0-H yp
3-D -P h e
7-B K
L o g [A g o n is ta ]M
Inib
içã
o d
o B
RE
T p
elo
lig
an
te
-1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .3
-0 .2
-0 .1
0 .0
0 .1
B K
D -A rg0-H yp
3-D -P h e
7-L eu
8-B K
A B
C D
E F
G H
69
L o g [A g o n is ta ]M
Inib
içã
o d
o B
RE
T p
elo
lig
an
te
-1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .3
-0 .2
-0 .1
0 .0
0 .1B K
D -P h e7
-B K
Figura 14. Análise da ativação de proteína Gi3 através de BRET após a ativação com BK e análogos. Curvas concentração-resposta para ativação de Gq após 5 min de estímulo com os ligantes. A) BK e Trp
8-BK. B) BK e Leu
8-BK. C) BK e Thi
5,8-BK. D) BK e Tyr(Me)
8-BK. E) BK e
D-Arg0-Thi
5-Leu
8-BK. F) BK e D-Arg
0-Hyp
3-Thi
5,8-D-Phe
7-BK. G) BK e D-Arg
0-Hyp
3-D-Phe
7-BK. H)
BK e D-Arg0-Hyp
3-D-Phe
7-Leu
8-BK. I) BK e D-Phe
7-BK. N= 2 ou 3 experimentos independentes.
O comportamento dos análogos na ativação de proteína Gi3 foi similar ao
observado na ativação de Gq, com exceção do análogo Trp8-BK o qual
apresentou ativação de Gq em altas concentrações, porém não levou à
ativação de Gi3 em nenhuma concentração testada (Figura 14A).
Na Tabela 8 se apresentam os valores de EC50, pEC50 e Emáx como
medidas da potência e eficçcia dos análogos testados da segunda geração na
ativação de proteína Gq e Gi3.
I
70
Tabela 8. Potência e eficácia dos análogos na ativação de proteína Gq e Gi3.
Ativação Gq Ativação Gi3
Peptídeo EC50 (nM) ± E.P.M.
Fc pEC50 (nM) ± E.P.M.
Emáx(%) EC50 (nM) ±
E.P.M. Fc pEC50 (nM) ±
E.P.M. Emáx(%)
BK 3,1 ± 0,9 1,0 3,1 ± 0,9 100 19,1 ± 3,6 1,0 7,7 ± 0,09 100
Trp8-BK 165,6 ± 25,1 56,8 165,6 ± 25,1 100 ± 4,0 NQ NQ NQ NQ
Leu8-BK 10,4 ± 4,5 3,56 10,4 ± 4,5 86,9 ± 7,0 NQ NQ NQ NQ
Thi5,8-BK 0,8 ± 0,1 0,26 0,8 ± 0,1 102,9 ± 4,7 957 ± 221,3 50,2 6,0 ± 0,10 156,4 ± 18,0
Tyr(Me)8-BK 0,3 ± 0,1 0,11 0,3 ± 0,1 95,4 ± 3,8 329 ± 175,5 17,3 6,6 ± 0,26 73,4 ± 4,8
D-Arg0-Thi5-Leu8-BK 88,2 ± 23,9 30,24 88,2 ± 23,9 89,9 ± 8,9 415 ± 34,5 21,8 6,4 ± 0,03 75,3 ± 2,6
D-Arg0-Hyp3-Thi5,8-D-Phe7-BK NQ NQ NQ NQ NQ NQ NQ NQ
D-Arg0-Hyp3-D-Phe7-BK NQ NQ NQ NQ NQ NQ NQ NQ
D-Arg0-Hyp3-D-Phe7-Leu8-BK NQ NQ NQ NQ NQ NQ NQ NQ
D-Phe7-BK NQ NQ NQ NQ NQ NQ NQ NQ
Os valores de EC50 e pEC50 são apresentados como média ± erro padrão da média (E.P.M.) de 3 experimentos independentes. O Fc é a razão dos valores de
EC50 para os análogos em relação ao valor de EC50 obtido para BK. O Emáx. Foi representado em percentagem, sendo a refêrencia (BK) o 100%. NQ. Não
Quantificável.
71
4.4.3 Análise do recrutamento β-arrestinas para o receptor B2 pelos análogos da segunda geração
Tambem foi avaliada a capacidade dos análogos de ativar vias de
sinalização dependentes de proteína Gq e proteína Gi3. Foi analisado o
recrutamento de β-arrestinas para o receptor através da estratégia de BRET.
Foram avaliadas as proteínas β-arrestina1 e β-arrestina2.
Análise do recrutamento de β-arrestina1 pelos análogos da
segunda geração
A figura 15 mostra os perfis individuais dos análogos da segunda geração
para recrutamento de β-arrestina1.
L o g [A g o n is ta ]M
BR
ET
pro
mo
vid
o p
elo
lig
an
te
- 1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .1
0 .0
0 .1
0 .2 B K
T rp8
-B K
L o g [A g o n is ta ]M
BR
ET
pro
mo
vid
o p
elo
lig
an
te
- 1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .1
0 .0
0 .1
0 .2 B K
L e u8
-B K
L o g [A g o n is ta ]M
BR
ET
pro
mo
vid
o p
elo
lig
an
te
- 1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .1
0 .0
0 .1
0 .2 B K
T h i5 ,8
-B K
L o g [A g o n is ta ]M
BR
ET
pro
mo
vid
o p
elo
lig
an
te
- 1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .1
0 .0
0 .1
0 .2B K
T y r(M e )8
-B K
A B
C D
72
L o g [A g o n is ta ]M
BR
ET
p
ro
mo
vid
o p
elo
lig
an
te
- 1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .1
0 .0
0 .1
0 .2 B K
D -A rg0
-T h i5
-L e u8
-B K
L o g [A g o n is ta ]M
BR
ET
p
ro
mo
vid
o p
elo
lig
an
te
- 1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .1
0 .0
0 .1
0 .2 B K
D -A rg0-H yp
3-T h i
5 ,8-D -P h e
7-B K
L o g [A g o n is ta ]M
BR
ET
p
ro
mo
vid
o p
elo
lig
an
te
- 1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .1
0 .0
0 .1
0 .2 B K
D -A rg0-H yp
3-D -P h e
7-B K
L o g [A g o n is ta ]MB
RE
T p
ro
mo
vid
o p
elo
lig
an
te
- 1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .1
0 .0
0 .1
0 .2 B K
D -A rg0-H yp
3-D -P h e
7-L eu
8-B K
L o g [A g o n is ta ]M
BR
ET
pro
mo
vid
o p
elo
lig
an
te
- 1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .1
0 .0
0 .1
0 .2 B K
D -P h e7
-B K
Figura 15. Análise do recrutamento de β-arrestina1 através de BRET após a ativação com BK e análogos. Curvas concentração-resposta para recrutamento de β-arrestina1 após 15 min de estímulo com os ligantes. A) BK e Trp
8-BK. B) BK e Leu
8-BK. C) BK e Thi
5,8-BK. D) BK e
Tyr(Me)8-BK. E) BK e D-Arg
0-Thi
5-Leu
8-BK. F) BK e D-Arg
0-Hyp
3-Thi
5,8-D-Phe
7-BK. G) BK e D-
Arg0-Hyp
3-D-Phe
7-BK. H) BK e D-Arg
0-Hyp
3-D-Phe
7-Leu
8-BK. I) BK e D-Phe
7-BK. N= 2 ou 3
experimentos independentes.
Quanto ao recrutamento de β-arrestina1, os análogos Thi5,8-BK, Tyr(Me)8-
BK, e D-Arg0-Thi5-Leu8-BK apresentaram potências e eficácias semelhantes às
da BK. O análogo Trp8-BK apresentou perfil de recrutamento baixo, já que
apresentou uma potência de 913,5nM e uma eficácia de um 46.4% em relação
à BK (Figure 15A). O análogo Leu8-BK apresentou um valor de potência (EC50)
de 95,2nM, sendo 10 vezes menor que a BK, e sua eficácia (Emáx.) foi de
62,9%. Os análogos D-Arg0-Hyp3-Thi5,8-D-Phe7-BK e D-Arg0-Hyp3-D-Phe7-BK
E F
G H
I
73
apresentaram atividade nula no recrutamento de β-arrestina1, já os análogos D-
Arg0-Hyp3-D-Phe7-Leu8-BK e D-Phe7-BK apresentaram leve recrutamento,
apenas observado em altas concentrações (10-5M).
Análise do recrutamento de β-arrestina2 para o receptor B2 pelos
análogos da segunda geração
A figura 16 mostra os perfis individuais dos análogos da segunda geração
para recrutamento de β-arrestina2.
L o g [A g o n is ta ]M
BR
ET
pro
mo
vid
o p
elo
lig
an
te
- 1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .1
0 .0
0 .1
0 .2
0 .3 B K
T rp8
-B K
L o g [A g o n is ta ]M
BR
ET
pro
mo
vid
o p
elo
lig
an
te
- 1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .1
0 .0
0 .1
0 .2
0 .3 B K
L e u8
-B K
L o g [A g o n is ta ]M
BR
ET
pro
mo
vid
o p
elo
lig
an
te
- 1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .1
0 .0
0 .1
0 .2
0 .3B K
T h i5 ,8
-B K
L o g [A g o n is ta ]M
BR
ET
pro
mo
vid
o p
elo
lig
an
te
- 1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .1
0 .0
0 .1
0 .2
0 .3 B K
T y r(M e )8
-B K
L o g [A g o n is ta ]M
BR
ET
pro
mo
vid
o p
elo
lig
an
te
- 1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .1
0 .0
0 .1
0 .2
0 .3 B K
D -A rg -T h i5-L eu
8-B K
L o g [A g o n is ta ]M
BR
ET
p
ro
mo
vid
o p
elo
lig
an
te
- 1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .1
0 .0
0 .1
0 .2
0 .3B K
D -A rg -H y p3
-T h i5 , 8
-D -P h e7
-B K
A
A
B
A
C
A
D
A
F
A
E
A
74
L o g [A g o n is ta ]M
BR
ET
pro
mo
vid
o p
elo
lig
an
te
- 1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .1
0 .0
0 .1
0 .2
0 .3 B K
D -A rg -H yp3-D -P h e
7-B K
L o g [A g o n is ta ]M
BR
ET
p
ro
mo
vid
o p
elo
lig
an
te
- 1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .1
0 .0
0 .1
0 .2
0 .3B K
D -A rg -H y p3
-D -P h e7
- L e u8
-B K
L o g [A g o n is ta ]M
BR
ET
pro
mo
vid
o p
elo
lig
an
te
- 1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .1
0 .0
0 .1
0 .2
0 .3B K
D -P h e7
-B K
Figura 16. Análise do recrutamento de β-arrestina2 através de BRET após a ativação com BK e análogos. Curvas concentração-resposta para recrutamento de β-arrestina2 após 15 min de estímulo com os ligantes. A) BK e Trp
8-BK. B) BK e Leu
8-BK. C) BK e Thi
5,8-BK. D) BK e
Tyr(Me)8-BK.E) BK e D-Arg
0-Thi
5-Leu
8-BK. F) BK e D-Arg
0-Hyp
3-Thi
5,8-D-Phe
7-BK. G) BK e D-
Arg0-Hyp
3-D-Phe
7-BK. H) BK e D-Arg
0-Hyp
3-D-Phe
7-Leu
8-BK. I) BK e D-Phe
7-BK. N=3
experimentos independentes.
O comportamento observado dos análogos da segunda geração no
recrutamento de β-arrestina2 foi similar ao observado em β-arrestina1, com
exceção do peptídeo Trp8-BK. O análogo Trp8-BK apresentou uma baixa
potência, mas conseguiu igualar o efeito máximo da BK. Na Tabela 9 são
apresentados os valores de EC50, pEC50 e Emáx dos análogos para o
recrutamento de β-arrestinas.
G
A
H
A
I
A
75
Tabela 9. Potência e eficácia dos análogos no recrutamento de β-arrestinas.
Recrutamento β-arrestina1 Recrutamento β-arrestina2
Peptídeo EC50 (nM) ± E.P.M.
Fc pEC50 (nM) ± E.P.M.
Emáx(%) EC50 (nM) ±
E.P.M. Fc pEC50 (nM) ±
E.P.M. Emáx(%)
BK 10,3 ± 0,7 1,0 7,9 ± 0,03 100 0,31 ± 0,04 1,0 9,5 ± 0,06 100
Trp8-BK 913,5 ± 519,7 88,5 6,2 ± 0,30 46,4 ± 7,0 NQ NQ NQ NQ
Leu8-BK 95,2 ± 30,9 9,2 6,6 ± 0,50 62,9 ± 4,1 338 ± 92,8 1092,1 6,5 ± 0,11 108,1 ± 3,1
Thi5,8-BK 31,9 ± 2,1 3,1 7,5 ± 0,02 113,3 ± 3,5 0,13 ± 0,05 0,4 9,9 ± 0,20 99,7 ± 2,3
Tyr(Me)8-BK 17,0 ± 13,8 1,7 8,1 ± 0,40 111,9 ± 8,6 0,65 ± 0,12 2,1 9,2 ± 0,08 122,8 ± 3,2
D-Arg0-Thi5-Leu8-BK 320 ± 43,27 31,0 6,5 ± 0,06 117,9 ± 16,1 885 ± 107 2861,6 6,1 ± 0,05 112,2 ± 1,2
D-Arg0-Hyp3-Thi5,8-D-Phe7-BK NQ NQ NQ NQ NQ NQ NQ NQ
D-Arg0-Hyp3-D-Phe7-BK NQ NQ NQ NQ NQ NQ NQ NQ
D-Arg0-Hyp3-D-Phe7-Leu8-BK NQ NQ NQ NQ NQ NQ NQ NQ
D-Phe7-BK NQ NQ NQ NQ NQ NQ NQ NQ
Os valores de EC50 e pEC50 são apresentados como média ± erro padrão da média (E.P.M.) de 3 experimentos independentes. O Fc é a razão dos valores de
EC50 para os análogos em relação ao valor de EC50 obtido para BK. O Emáx. Foi representado em porcentagem, sendo a referência (BK) equivalente a 100%.
NQ. Não Quantificável.
76
4.5 Terceira geração de análogos
Após avaliação dos resultados obtidos com a segunda geração de
análogos, foi desenhada e sintetizada uma nova geração com os seguintes
aspectos de racional:
Na BK, as posições 5 e 8 são ocupadas por um resíduo aromático e
hidrofóbico (Phe); no análogo Thi5,8-BK estas posições foram ocupadas
por resíduos aromáticos e hidrofílicos. Portanto, decidiu-se testar a
combinação destas propriedades, voltando-se o resíduo Phe para a
posição 5 e mandendo-se o resíduo aromático e hidrofílico Thi na
posição 8, sendo este o análogo Thi8-BK.
O análogo Thi8-BK possui na posição 5 um aminoacido hidrofóbico
(Phe), e na posição 8 um hidrofílico. Foi então desenhado o análogo
Thi5-BK, resultando em um análogo com características opostas nas
posições mencionadas, com o intuito de avaliar a ordem especifica
destas características dentro da sequência da BK.
Em todas as posições modificadas para os análogos de BK, foi sempre
substituído a posição 8 com aminoácidos aromático-hidrofóbicos,
aromático-hidrofílico, alifático-hidrofóbico, faltando assim uma
modificação com um resíduo alifático-hidrofílico para se completar os
estudos de estrutura e função. Por tanto, foi desenhado o análogo Ser8-
BK para ser analisado o efeito desta alteração na afinidade e
funcionalidade.
77
4.5.1 Ensaios de “binding” e cálculo de afinidade para os análogos da
terceira geração
Foram realizados experimentos de “binding” para os três novos análogos
sintetizados. Na Figura 17 são apresentados os perfis de afinidade de cada um
destes análogos.
L o g [L ig a n te ]M
Lig
aç
ão
de
3H
-BK
(%
)
-1 3 -1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
1 2 5
T h i8
-B K
B K
L o g [L ig a n te ]M
Lig
aç
ão
de
3H
-BK
(%
)
-1 3 -1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
1 2 5
T h i5
-B K
B K
L o g [L ig a n te ]M
Lig
aç
ão
de
3H
-BK
(%
)
-1 3 -1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
1 2 5S e r
8-B K
B K
Figura 17. Curvas de “binding” em ensaios de competição em células HEK293T transfetadas com o receptor B2. Os resultados foram normalizados e plotados como porcentagem da ligação máxima da BK radioativa. O radioligante utilizado foi
3H-BK. A) BK e
Thi8-BK. B) BK e Thi
5-BK. C) Ser
8-BK. n=2 ou 3 experimentos independentes.
O análogo Thi8-BK apresentou comportamento similar a BK. A
modificação feita no análogo Thi5-BK, onde foi avaliado ter um aminoácido
hidrofílico na posição 5 sem modificar o aminoácido endógeno hidrofóbico
(Phe) na estrutura da BK, gerou um composto de afinidade similar à BK. Por
outro lado, a modificação Ser8-BK, a qual possui a troca de caráter aromático e
hidrofóbico da BK por uma caracterisitca alifática e hidrofílica, resultou na perda
de afinidade pelo receptor de cerca de 60 vezes.
Tabela 10. Constantes de afinidade (Ki e pKi) para BK e análogos, obtidas em ensaios de competição com uso do radioligante
3H-BK. N=2 ou 3 experimentos independentes.
G
A B
C
78
Peptideo Ki (nM) ± E.P.M.
Fc pKi ± E.P.M.
BK 0,86 ± 0,16 1,0 9,09 ± 0,08
Thi8-BK 1,3 ± 0,30 1,5 8,91 ± 0,11
Thi5-BK 0,42 ± 0,02 0,5 9,37 ± 0,02
Ser8-BK 49,6 ± 5,45 57,7 7,32 ± 0,06
Os valores de Ki foram calculados através de cálculos de regressão não linear realizados com o programa GraphPad Prism e são apresentados como média ± erro padrão da média (E.P.M.) de 2 ou 3 experimentos independentes. O Fc é a razão do valor de Ki para os análogos em relação ao valor de Ki obtido para BK
4.4.2 Análise da ativação de Gq e Gi3 pelos análogos da terceira geração
Com os análogos da terceira geração, também foi avaliada a ativação
das proteínas Gq e Gi3, para assim permitir uma análise comparativa sobre a
relação estrutura-atividade.
Ativação da proteína Gq mediada pelos análogos da terceira geração
A Figura 18 mostra os perfis de cada um dos análogos da terceira geração na
ativação da proteína Gq.
L o g [A g o n is ta ]M
Inib
içã
o d
o B
RE
T p
elo
lig
an
te
-1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .8
-0 .6
-0 .4
-0 .2
0 .0
0 .2
B K
T h i8
-B K
L o g [A g o n is ta ]MInib
içã
o d
o B
RE
T p
elo
lig
an
te
-1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .8
-0 .6
-0 .4
-0 .2
0 .0
0 .2
B K
T h i5
-B K
L o g [A g o n is ta ]MInib
içã
o d
o B
RE
T p
elo
lig
an
te
-1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .8
-0 .6
-0 .4
-0 .2
0 .0
0 .2
B K
S e r8
-B K
Figura 18. Análise da ativação de proteína Gq através de BRET após a ativação com BK e análogos. Curvas concentração-resposta para ativação de Gq após 5 min de estímulo com BK
A B
C
79
e os analogos. A) BK e Thi8-BK. B) BK e Thi
5-BK. C) BK e Ser
8-BK. N=3 experimentos
independentes
O análogo Thi8-BK apresentou um perfil de ativação de proteína Gq similar à
BK. O análogo Thi5-BK apresentou uma potência similar à BK, mas sua eficácia
diminuiu um 30%. Por outro lado, o peptídeo Ser8-BK apresentou uma baixa
potência e eficácia próxima a 100% (Tabela 11).
Ativação da proteína Gi3 mediada pelos análogos da terceira geração
A figura 19 mostra os perfis dos análogos da terceira geração para a
ativação da proteína Gi3.
L o g [A g o n is ta ]M
Inib
içã
o d
o B
RE
T p
elo
lig
an
te
-1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .3
-0 .2
-0 .1
0 .0
0 .1B K
T h i8
-B K
L o g [A g o n is ta ]M
Inib
içã
o d
o B
RE
T p
elo
lig
an
te
-1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .3
-0 .2
-0 .1
0 .0
0 .1
B K
T h i5
-B K
L o g [A g o n is ta ]M
Inib
içã
o d
o B
RE
T p
elo
lig
an
te
-1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .3
-0 .2
-0 .1
0 .0
0 .1B K
S e r8
-B K
Figura 19. Análise da ativação de proteína Gi3 através de BRET após a ativação com BK e análogos. Curvas concentração-resposta para ativação de Gq após 5 min de estímulo com os ligantes. A) BK e Thi
8-BK. B) BK e Thi
5-BK. C) BK e Ser
8-BK. N= 3 experimentos
independentes.
A B
C
80
A figura 19 apresenta os perfis de ativação dos análogos da terceira
geração na ativação da proteína Gi3. Foi observado que os três análogos
sintetizados apresentaram perfis de ativação baixos tanto para potência quanto
em eficácia (ver Tabela 11).
4.4.3 Análise de recrutamento de β-arrestinas para o receptor B2 pelos
análogos da terceira geração
Análise do recrutamento de β-arrestina1 pelos análogos da terceira
geração
A figura 20 mostra os perfis individuais dos análogos da terceira geração para
recrutamento de β-arrestina1.
L o g [A g o n is ta ]M
BR
ET
pro
mo
vid
o p
elo
lig
an
te
- 1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .1
0 .0
0 .1
0 .2 B K
T h i8
-B K
L o g [A g o n is ta ]M
BR
ET
pro
mo
vid
o p
elo
lig
an
te
- 1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .1
0 .0
0 .1
0 .2 B K
T h i5
-B K
L o g [A g o n is ta ]M
BR
ET
pro
mo
vid
o p
elo
lig
an
te
- 1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .1
0 .0
0 .1
0 .2 B K
S e r8
-B K
Figura 20. Análise do recrutamento de β-arrestina1 através de BRET após a ativação com BK e análogos. Curvas concentração-resposta para recrutamento de β-arrestina1 após 15 min de estímulo com os ligantes. A) BK e Thi
8-BK. B) BK e Thi
5-BK. C) BK e Ser
8-BK. N= 3
experimentos independentes.
A B
C
81
No recrutamento de β-arrestina1, o análogo Thi8-BK apresentou um
comportamento similiar ao da BK. A potência obtida pelo análogo Thi5-BK (14.2
nM) foi similar à de BK (10.3 nM), tendo sido sua eficácia um pouco maior
(aprox. 20% maior). O análogo Ser8-BK apresentou uma potência baixa
(1040.5 nM) mas uma eficácia que superou cerca de 15% a ativação máxima
da BK.
Análise do recrutamento de β-arrestina2 pelos análogos da terceira
geração
Na figura 21 estão apresentados os perfis de recrutamento de β-arrestina2
pelos análogos sintetizados nesta geração.
L o g [A g o n is ta ]M
BR
ET
pro
mo
vid
o p
elo
lig
an
te
- 1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .1
0 .0
0 .1
0 .2
0 .3B K
T h i8
-B K
L o g [A g o n is ta ]M
BR
ET
pro
mo
vid
o p
elo
lig
an
te
- 1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .1
0 .0
0 .1
0 .2
0 .3
B K
T h i5
-B K
L o g [A g o n is ta ]M
BR
ET
pro
mo
vid
o p
elo
lig
an
te
- 1 2 -1 1 -1 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-0 .1
0 .0
0 .1
0 .2
0 .3
B K
S e r8
-B K
Figura 21. Análise do recrutamento de β-arrestina2 através de BRET após a ativação com BK e análogos. Curvas concentração-resposta para recrutamento de β-arrestina2 após 15 min de estímulo com os ligantes. A) BK e Thi
8-BK. B) BK e Thi
5-BK. C) BK e Ser
8-BK. N=3
experimentos independentes
A
A
B
A
C
A
82
Os análogos apresentaram perfis de recrutamento de β-arrestina2
similares aos perfis obtidos no recrutamento de β-arrestina1. Ou seja, os
análogos Thi8-BK e Thi5-BK apresentaram perfis de recrutamento de β-
arrestinas semelhantes à BK. As respostas obtidas pelos análogos da terceira
geração no recrutamento de β-arrestina2 foram similares às obtidas no
recrutamento de β-arrestina1, sendo o análogo Thi5-BK similar à BK, e o
análogo Ser8-BK com baixa potência.
Nas tabelas 11 e 12 são apresentados os valores de potência e eficácia
de cada um dos análogos desta geração na ativação de proteínas G e
recrutamento de β-arrestinas.
83
Tabela 11. Potência e eficácia dos análogos na ativação da proteína Gq e Gi3.
Ativação Gq Ativação Gi3
Peptídeo EC50 (nM) ± E.P.M.
Fc pEC50 (nM) ± E.P.M.
Emáx(%) EC50 (nM) ± E.P.M.
Fc pEC50 (nM) ± E.P.M.
Emáx(%)
BK 3,1 ± 0,9 1,0 3,1 ± 0,9 100 19,1 ± 3,6 1,0 7,7 ± 0,09 100
Thi8-BK 0,4 ± 0,1 0,12 9,5 ± 0,14 86,7 ± 0,8 71,9 ± 20,1 3,7 6,8 ± 0,34 59,6 ± 11,1
Thi5-BK 0,6 ± 0,2 0,21 9,3 ± 0,15 71,1 ±1,5 78,5 ± 10,7 4,1 7,1 ± 0,05 46,8 ± 2,4
Ser8-BK 391 ± 56,7 2,91 6,4 ± 0,06 145,3 ± 4,4 NQ NQ NQ NQ
Os valores de EC50 e pEC50 são apresentados como média ± erro padrão da média (E.P.M.) de 3 experimentos independentes. O Fc é a razão dos valores de
EC50 para os análogos em relação ao valor de EC50 obtido para BK. O Emáx. Foi representado em porcentagem, sendo a referência (BK) normalizada para
100%. NQ. Não Quantificável.
Tabela 12. Potência e eficácia dos análogos no recrutamento de β-arrestinas.
Recrutamento β-arrestina1 Recrutamento β-arrestina2
Pepíideo EC50 (nM) ± E.P.M.
Fc pEC50 (nM) ± E.P.M.
Emáx(%) EC50 (nM) ±
E.P.M. Fc pEC50 (nM) ±
E.P.M. Emáx(%)
BK 10,3 ± 0,7 1,0 7,9 ± 0,03 100 0,31 ± 0,04 1,0 9,5 ± 0,06 100
Thi8-BK 26,9 ± 13,4 2,6 7,7 ± 0,19 96,9 ± 5,4 0,84 ± 0,15 2,7 9,1 ± 0,09 113 ± 1,9
Thi5-BK 14,2 ± 2,4 0,9 7,9 ± 0,03 119,6 ± 8,5 0,67 ± 0,06 2,2 9,2 ± 0,04 111,3 ± 1,1
Ser8-BK 1040,5 ± 244,5 100,8 6,0 ± 0,10 114,7± 9,4 1231 ± 158 3979,5 5,9 ± 0,05 90,6 ± 3,3
Os valores de EC50 e pEC50 são apresentados como média ± erro padrão da média (E.P.M.) de 3 experimentos independentes. O Fc é a razão dos valores de
EC50 para os análogos em relação ao valor de EC50 obtido para BK. O Emáx. Foi representado em percentagem, sendo a referência (BK) normalizada para
100%. NQ. Não Quantificável.
84
4.6 Avaliação da atividade antagonística dos análogos
Uma vez que os análogos D-Arg0-Hyp3-Thi5,8-D-Phe7-BK, D-Arg0-Hyp3-D-
Phe7-BK, D-Arg0-Hyp3-D-Phe7-Leu8-BK, D-Phe7-BK não apresentaram atividade
agonística significativa no receptor B2 nos ensaios feitos anteriormente,
sugerindo que eles possam estabilizar o estado inativo do receptor, decidiu-se
avaliar a possível atividade antagonística desses análogos. Para isto, foram
realizados experimentos de BRET para a ativação da proteína Gq e
recrutamento de β-arrestina2 induzidos por BK em uma condição onde
diferentes análogos foram pré-incubados na concentração de 1*10-4M (Figura
22).
Ativação da proteína Gq
Inib
içã
o d
o B
RE
T p
elo
lig
an
te
-0 .8
-0 .6
-0 .4
-0 .2
0 .0
0 .2 V e íc u lo
H O E 1 4 0
D -A rg0
-H y p3
-T h i5 , 8
-D -P h e7
-B K
D -A rg0
-H y p3
-D -P h e7
-B K
D -A rg0
-H y p3
-D -P h e7
- L e u8
-B K
B K + + - + - + - + - + -
D -P h e7
-B K
A
A
85
Recrutamento de β-arrestina2
B
RE
T p
ro
mo
vid
o p
elo
lig
an
te
- 0 .1
0 .0
0 .1
0 .2
0 .3
V e íc u lo
H O E 1 4 0
D -A rg0
-H y p3
-T h i5 , 8
-D -P h e7
-B K
D -A rg0
-H y p3
-D -P h e7
-B K
D -A rg0
-H y p3
-D -P h e7
- L e u8
-B K
B K + + - + - + - + - + -
D -P h e7
-B K
Figura 22. Avaliação da atividade antagonística dos análogos D-Arg0-Hyp
3-Thi
5,8-D-Phe
7-
BK, D-Arg0-Hyp
3-D-Phe
7-BK, D-Arg
0-Hyp
3-D-Phe
7-Leu
8-BK, D-Phe
7-BK. A) Ativação de
proteína Gq e B) Recrutamento de β-arrestina2, em condição de estímulo ou não com BK após de 30 minutos de pré-incubação com os análogos indicados. O HOE140 foi usado como o controle.
Nossos resultados mostraram que os análogos previamente descritos
por Regoli (Regoli et al., 1998) como antagonistas fracos conseguiram bloquear
moderadamente o efeito da BK, mas não totalmente como foi o caso do
antagonista de referencia (HOE140). Portanto pode-se classificar estes
análogos como agonistas parciais.
4.6 Cálculo do fator de tendência (do Inglês, Bias Factor)
Para quantitativamente avaliarmos o agonismo tendencioso, utilizamos o
método proposto por Kenakin e colaboradores (Kenakin et al., 2012). Os
análogos que apresentaram curvas de concentração-resposta favoraveis,
foram avaliados em seis grupos de comparação diferentes, como descritos
abaixo, e os resultados são apresentados graficamente na Figura 23.
B
A
86
Via β-arrestina2 vs. Via Gq
Via β-arrestina1 vs. Via Gq
Via Gi vs. Via Gq
Via β-arrestina2 vs. Via Gi
Via β-arrestina1 vs. Via Gi
Via β-arrestina2 vs. Via β-arrestina1
Lo
g(
/KA
)
BK
Me
t0-B
K
His
9-B
K
Me
t0-H
is9-B
K
Th
i5,8
-BK
Th
i5-B
K
Th
i8-B
K
Trp
8-B
K
Ty
r(M
e)8
-BK
Le
u8-B
K
Se
r8-B
K
D-A
rg0-T
hi5
-Le
u8-B
K
- 5 .0
-2 .5
0 .0
2 .5
5 .0
M a is a t iv o n o re c ru ta m e n to d e
-a rre s t in a 2
M a is a tiv o n a a t iv a ç ã o d e G q
F a to r d e te n d e n c ia
-a r re s t in a 2 - G q
A
A
87
Lo
g(
/KA
)
BK
Th
i5,8
-BK
Th
i5-B
K
Th
i8-B
K
Trp
8-B
K
Ty
r(M
e)8
-BK
Le
u8-B
K
Se
r8-B
K
D-A
rg0-T
hi5
-Le
u8-B
K
- 5 .0
-2 .5
0 .0
2 .5
5 .0
M a is a t iv o n o re c ru ta m e n to d e
-a rre s t in a 1
M a is a tiv o n a a t iv a ç ã o d e G q
F a to r d e te n d e n c ia
-a r re s t in a 1 - G q
Lo
g(
/KA
)
BK
Th
i5,8
-BK
Th
i5-B
K
Th
i8-B
K
Trp
8-B
K
Ty
r(M
e)8
-BK
Le
u8-B
K
Se
r8-B
K
D-A
rg0-T
hi5
-Le
u8-B
K
- 5 .0
-2 .5
0 .0
2 .5
5 .0
F a to r d e te n d e n c ia
G i - G q
M a is a tiv o n a a t iv a ç ã o d e G i
M a is a tiv o n a a t iv a ç ã o d e G q
B
A
C
A
88
Lo
g(
/KA
)
BK
Th
i5,8
-BK
Th
i5-B
K
Th
i8-B
K
Trp
8-B
K
Ty
r(M
e)8
-BK
Le
u8-B
K
Se
r8-B
K
D-A
rg
0-T
hi5
-Le
u8-B
K
- 5 .0
-2 .5
0 .0
2 .5
5 .0
F a to r d e te n d e n c ia
-a r re s t in a 2 - G i
M a is a t iv o n o re c ru ta m e n to d e
-a rre s t in a 2
M a is a tiv o n a a t iv a ç ã o d e G i
Lo
g(
/KA
)
BK
Th
i5,8
-BK
Th
i5-B
K
Th
i8-B
K
Trp
8-B
K
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r(M
e)8
-BK
Le
u8-B
K
Se
r8-B
K
D-A
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hi5
-Le
u8-B
K
- 5 .0
-2 .5
0 .0
2 .5
5 .0
F a to r d e te n d e n c ia
-a r re s t in a 1 - G i
M a is a t iv o n o re c ru ta m e n to d e
-a rre s t in a 1
M a is a tiv o n a a t iv a ç ã o d e G i
D
A
E
A
89
F a to r d e te n d e n c ia
-a r re s t in a 2 - a rre s t in a 1
Lo
g(
/KA
)
BK
Th
i5,8
-BK
Th
i5-B
K
Th
i8-B
K
Trp
8-B
K
Ty
r(M
e)
8-B
K
Le
u8-B
K
Se
r8-B
K
D-A
rg
0-T
hi5
-Le
u8-B
K
- 5 .0
-2 .5
0 .0
2 .5
5 .0
M a is a t iv o n o re c ru ta m e n to d e
-a rre s t in a 2
M a is a t iv o n o re c ru ta m e n to d e
-a rre s t in a 1
Figura 23. Análise do agonismo tendencioso dos análogos sintetizados que apresentaram atividade relevante. Os análogos foram comparados com o seu valor do ΔLog τ/Ka em comparação ao peptídeo de referência (BK). Ao final na comparação dos análogos em duas vias diferentes foi obtido o valor de ΔΔLog τ/Ka. A) Via β-arrestina2 vs. Via Gq B) β-arrestina1 vs. Via Gq C) Via Gi vs. Via Gq D) Via β-arrestina2 vs. Via Gi E) Via β-arrestina1 vs. Via Gi F) Via β-arrestina2 vs. Via β-arrestina1. Os dados obtidos estão nas tabelas 1 e 2 no
material anexo (ANEXO 2).
F
A
90
5. DISCUSSÃO
A seletividade funcional é relativamente um novo conceito, e seu grande
potencial terapêutico está a cada dia tendo mais relevância (Rominger et al.,
2014). Agonismo tendencioso é a capacidade de determinados ligantes de
estabilizar distintas conformações do receptor, que por sua vez irá permitir a
interação com diferentes efetores ou interações diferenciadas, refletindo-se em
um dado padrão de ativação de vias de sinalização. O objetivo deste estudo foi,
a partir do desenho raconal, identificar ligantes tendenciosos para o receptor B2
e associar às características estruturais da BK que levaram a esta
funcionalidade seletiva. Um melhor entendimento dos mecanismos que levam
ao reconhecimento de diferentes estados receptor-efector por ligantes
tendenciosos pode levar ao desenvolvimento de melhores terapias com
menores efeitos secundários.
A ativação do sistema calicreina-cinina leva a uma sinalização é
mediada pelos receptores B1 e B2, GPCRs que regulam uma grande variedade
de processos fisiológicos e patológicos como vasodilatação, função renal,
inflamação e dor (Zhang et al., 2012). Neste estudo, 21 análogos de BK foram
sintetizados e avaliados quanto à sua funcionalidade no receptor B2 em 4 vias
de sinalização diferentes. As vias de sinalização avaliadas foram ativação de
Gq, ativação de Gi3, recrutamento de β-arrestina1, e recrutamento de β-
arrestina2.
Antes de avaliarmos a funcionalidade dos análogos, a primeira
propriedade farmacológica caracterizada foi a afinidade pelo receptor B2, que
foi calculada através de experimentos de “binding”. A energia de ligação da BK
e peptídeos similares no receptor B2 parece ser formecida por interações não-
91
ionicas que ocorrem pelos resíduos localizados na estrutura do peptídeo.
Também se apresentam interações iônicas pela cadeia lateral dos resíduos de
Arginina, localizados nos extremos da seuência de BK.
Corroborando o modelo mais atual para explicar a ligação da BK ao
receptor B2, o qual propõe que o resíduo C-terminal da BK (Arg) interage com
as alças extracelulares do receptor (Leeb-Lundberg et al., 2005), os peptídeos
com modificações que mantiveram certas características da Arg9 apresentaram
afinidades similares à de BK e análogos com modificações que mudaram tais
propriedades apresentaram perdas de afinidade, sendo que alguns deles
apresentaram perda total de afinindade como foi o caso do análogo Glu9-BK
(Figura 12).
Além disso, baseados nos dados mostrados por Kyle e colaboradores
(Kyle et al., 1994), que sugerem que os resíduos Ser111(TM-III), Thr263(TM-VI),
Asp266(EC-IV) e Asp284(EC-IV) do receptor humano B2 são os principais
resíduos para interação com o C-terminal do ligante, concluímos que manter a
carga positiva no C-terminal do ligante é importante para a ligação com o
receptor, já que os análogos Thi5,8-His9-BK, Trp8-His9-BK e Glu9-BK, nos quais
foi substituído o resíduo de Arg por um aminoacido sem carga ou carga
negativa, apresentaram grandes perdas de afinidade em relação a BK. Embora
Orn9-BK tenha mantido a carga positiva no C-terminal, este análogo também
apresentou baixa afinindade, o que pode ser devido ao seu menor tamanho em
relação à arginina, uma vez que o resíduo Ornitina possui apenas 3 carbonos
na cadeia lateral e uma única amina primária, não permitindo alcançar os
devidos sítios para interação com as quais a Arginina interage. Além da
importância da posição 9 da BK para a afinidade pelo receptor B2, foi
92
observado que alterações na Phe8 também influenciam a ligação de BK com o
receptor. É possível que seu caráter aromático tenha papel importante, já que
os análogos apresentando um resíduo alifático na posição 8, como Leu8-BK e
Ser8-BK (Figura 12 e Figura 17), apresentaram baixa afinidade; e os análogos
D-Ala8-BK e Met0-D-Ala8-BK não tem afinidade pelo receptor (Figura 9). Além da
aromaticidade, a flexibilidade na cadeia lateral da posição 8 também parece ser
importante para uma ligação favorável com o receptor, já que o análogo
Tyr(Me)8-BK, o qual é aromático e flexível, resultou em uma afinidade 100
vezes maior quando comparado com a BK (Tabela 7). Esta hipótese é
corroborada quando observamos que o análogo Trp8-BK, pois esse apresenta
menor afinidade e um anel duplo e rígido na sua cadeia lateral. É possível que
tal rigidez impeça a aproximação do ligante com os resíduos do receptor
envolvidos no processo de ligação. Também foi observado que, além de
manter a flexibilidade na posição 8, manter a rigidez na posição 7 (Pro)
também é importante para a ligação, uma vez que os análogos que possuem o
resíduo D-Phe7, que por sua vez é mais flexível do que Pro , apresentaram
perdas de afinidades significativas. São eles: D-Arg0-Hyp3-Thi5,8-D-Phe7-BK, D-
Arg0-Hyp3-D-Phe7-BK, D-Arg0-Hyp3-D-Phe7-Leu8-BK, e D-Phe7-BK.
Na primeira geração de peptídeos sintetizados, foi mostrado que a
adição do resíduo Met0 na estrutura da BK não interferiu na ativação de Gq mas
levou a uma diminuição no recrutamento de β-arrestina2 (Figura 10 e Figura
11), dessa forma resultando em análogos com agonismo tendencioso para a
via de Gq (Figura 28A). Os análogos His9-BK e Met0-His9-BK apresentaram
comportamento de agonistas parciais, já que em comparação a BK eles
apresentaram potências e eficácias baixas em todas as vias avaliadas
93
(ativação Gq e recrutamento β-arrestina2), o que pode ser observado nas
figuras 10 e 11. Como foi discutido anteriormente, a troca de Arg da BK no C-
terminal por um resíduo His levou a uma baixa afinidade pelo receptor, também
resultando em uma baixa ativação do receptor quando estimulado por estes
análogos.
Já nos análogos da segunda geração, o análogo Trp8-BK apresentou
menor potência e eficácia similar à de BK na ativação da proteína Gq, um
resultado interessante quando somado àquele que mostra a não ativação de
proteína Gi3, sugerindo que Trp8-BK estabilize uma conformação do receptor B2
capaz de discriminar entre diferentes isoformas de proteína G. Também é
interessante notar que este análogo é capaz de recrutar eficientemente β-
arrestina1 (EC50 0,9µM) enquanto que fracamente β-arrestina2. Esses dados
mostram que este ligante estabiliza o receptor em conformações diferentes,
que por sua vez permitem o reconhecimento de efetores diferentes. Os
análogos Leu8-BK e D-Arg0-Thi5-Leu8-BK apresentaram de maneira geral baixa
atividade em todas as vias de sinalização avaliadas, o que pode ser explicado
pela baixa afinidade apresentada por eles,em decorrência da ausência de um
resíduo aromático na posição 8, que como discutido anteriormente é uma
característica fundamental para a interação com o receptor. O análogo Thi5,8-
BK apresentou um perfil bastante similar ao da BK nas vias avaliadas, o que foi
confirmado com o cálculo do fator de tendência onde este análogo foi
classificado como um agonista balanceado. Já o análogo Tyr(Me)8-BK, que
apresentou altíssima afinidade pelo receptor B2 (Ki = 0.006nM), apresentou
potências na ativação de proteínas G e de recrutamento de β-arrestinas
similares à BK, sugerindo que mesmo com altisima afinidade, este análogo
94
estabiliza conformações do receptor semelhantes àquelas estabilizadas pela
BK.
Os últimos análogos avaliados na segunda geração foram D-Arg0-Hyp3-
Thi5,8-D-Phe7-BK, D-Arg0-Hyp3-D-Phe7-BK, D-Arg0-Hyp3-D-Phe7-Leu8-BK, D-
Phe7-BK, descritos anteriormente por Regoli e colaboradores (Regoli et al.,
1998) como antagonistas fracos. Nossos experimentos permitiram observar
que eles se comportam na verdade como agonistas parciais, uma vez que em
altas concentrações eles conseguem levar à ativação de proteína Gq e ao
recrutamento de β-arrestina2.
Na terceira geração de peptídeos foi avaliada a importância da
hidrofobicidade/hidrofilicidade nas posições 5 e 8 da BK, uma vez que os
resultados com os análogos Trp8-BK e Tyr(Me)8-BK sugeriram que tais
características devam ser importantes para a funcionalidade de BK. Mostramos
que o análogo Thi8-BK, que apresenta na posição 5 um resíduo hidrofóbico e
na posição 8 um residuo hidrofílico, apresentou um comportamento de agonista
balanceado, já que sua atividade nas vias avaliadas foi similar à BK.
O análogo Thi5-BK, apresentou diminuição na ativação da proteína Gq e
aumento no recrutamento de β-arrestina2, mostrando que ao ter um
aminoácido hidrofílico na posição 5 posivelmente é favorecido um perfil
funcional tendencioso ao recrutamento de β-arrestinas (Figura 18 e Figura 21).
Provavelmente, a diminuição da ativação de Gq não tenha sido tão pronunciada
neste caso, devido à baixa hidrofobicidade do resíduo Phe em comparação aos
resíduos Trp e Tyr(Me) na posição 8. Além disso, o análogo Ser8-BK reforçou
essa hipótese, já que sem ter o resíduo aromático na posição 8 (o que diminuiu
sua afinidade pelo receptor), não levou a um maior de recrutamento de β-
95
arrestinas, apresentando comportamento de agonista balanceado com baixa
potência. (Figura 18 e Figura 21)
Os resultados qualitativos discutidos acima foram confirmados
quantitativamente com o cálculo do fator de tendência pelo modelo proposto
por Kenakin e colaboradores (Kenakin et al., 2012), o qual utiliza o ΔΔLogτ/KA
para as vias de interesse. Estes cálculos evidenciam que o análogo Thi5,8-BK
apresentou um perfil de agonista balanceado, os análogos Met0-BK, His9-BK,
Met0-His9-BK, Thi5-BK, Thi8-BK, Trp8-BK, Tyr(Me)8-BK, Leu8-BK, Ser8-BK, D-
Arg0-Thi5-Leu8-BK como agonistas tendenciosos para a via de Gq. (Figura 23).
Resumindo, o objetivo de nosso trabalho foi avaliar a contribuição das
posições 0, 5, 7, 8 e 9 na estrutura da BK para a ativação das diferentes vias
de sinalização do receptor B2, e observar se tais diferenças moleculares
poderiam gerar algum tipo de seletividade funcional com impacto em alterações
fisiológicas. Este objetivo foi plenamente alcançado, uma vez que obtivemos
ligantes que ativam preferencialmente algumas vias de sinalização em
detrimento de outras. Acreditamos que o desenvolvimento e estudo de ligantes
tendenciosos, como os apresentados neste estudo, tanto para as vias de
proteínas G como para as vias de β-arrestinas, contribuem para a melhor
compreensão da contribuição de diferentes vias de sinalização em situações
fisiopatológicos, e assim contribuem para o futuro desenvolvimento de
medicamentos “inteligentes” e com menos efeitos colaterais.
96
6. CONCLUSÕES
Em resumo, foram identificadas diferentes propriedades importantes
para a ligação dos diferentes peptídeos ao receptor B2 do sistema calicreina-
cinina e os resíduos importantes e suas características para o favorecimento de
diferentes vias de sinalização. As principais conclusões obtidas neste trabalho
foram:
Na posição 9 dos ligantes de B2, é importante manter o seguinte
conjunto de propriedades para se aumentar a afinidade dos compostos:
caráter básico, carga positiva e o correspondente tamanho para a
interação com os resíduos do receptor.
Extenções no N-terminal não influenciam de manera geral a ligação dos
análogos ao receptor.
Na posição 8 do peptídeo devem-se posicionar resíduos aromáticos e
hidrofóbicos para se obter maiores respostas na ativação do receptor ,
tanto para proteínas G quanto para o recrutamento de β-arrestinas.
O resíduo Pro7 é fundamental tanto para a ligação dos peptídeos ao
receptor, assim como para sua funcionalidade sobre diferentes vias de
sinalização, já que todos os peptídeos onde este resíduo foi modificado
apresentaram baixa afinidade e atividade.
Os dados gerados durante o presente estudo servirão de base para o
processo de desenvolvimento de novos fármacos direcionados à
modulação dos receptores do sistema calicreínas-cininas.
97
7. REFERÊNCIAS
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106
8. ANEXOS
8.1 Cromatogramas e espectros obtidos na caracterização dos análogos sintetizados
Met0-BK
Perfil cromatográfico do análogo.
Perfil obtido do analise de aminoácidos do análogo.
107
His9-BK
Perfil cromatográfico do análogo.
Perfil obtido no analise de aminoácidos do análogo.
Espectro de masas do análogo
108
Met0-His9-BK
Perfil cormatografico do análogo.
Perfil obtido do analise de aminoácidos do análogo.
Espectro de masas do análogo.
109
D-Ala8-BK
Perfil cromatográfico do análogo.
Perfil obtido do analise de aminoácidos do análogo.
110
Met0-D-Ala8-BK
Perfil Cromatografico do análogo.
Perfil obtido do analise de aminoácidos do análogo.
Espectro de masas do análogo.
111
Thi5,8-His9-BK
Perfil cromatográfico do análogo.
Trp8-His9-BK
Perfil cromatográfico do análogo.
Orn9-BK
Perfil cromatográfico do análogo.
112
Glu9-BK
Perfil cromatográfico do análogo.
Trp8-BK
Perfil cromatográfico do análogo.
Leu8-BK
Perfil cromatográfico do análogo.
113
Thi5,8-BK
Perfil cromatográfico do análogo.
Tyr(Me)8-BK
Perfil cromatográfico do análogo.
D-Arg-Thi5-Leu8-BK
Perfil cromatográfico do análogo.
114
D-Arg-Hyp3-Thi5,8-D-Phe7-BK
D-Arg-Hyp3-D-Phe7-BK
Perfil cromatografico do analogo.
D-Arg-Hyp3-D-Phe7-Leu8-BK
Perfil cromatografico do analogo.
115
D-Phe7-BK
Perfil cromatografico do analogo.
Thi8-BK
Perfil cromatografico do peptideo purificado.
Thi5-BK
Perfil cromatografico do peptideo purificado.
116
Ser8-BK
Perfil cromatografico do peptideo purificado.
117
8.2 Valores de ΔLogτ/Ka e ΔΔLogτ/Ka para cada um dos análogos respeito a BK em cada uma das vias avaliadas. Tabela 1. Valores de ΔLogτ/Ka de cada um dos análogos respeito a BK em cada uma das vias avaliadas.
Análogo ΔLogτ/Ka
Proteína Gq Proteína Gi3 β-arrestina1 β-arrestina2
Met0-BK -0.72 ± 0.22 - - -2.17 ± 0.18
Trp8-BK -2.01 ± 0.27 * -2.14 ± 0.25 *
Leu8-BK -0.9 ± 0.21 * -1.17 ± 0.19 *
Thi5,8-BK 0.86 ± 0.2 -1.02 ± 0.2 -0.32 ± 0.13 0.47 ± 0.16
Tyr(Me)8-BK 0.79 ± 0.19 -1.04 ± 0.25 0.61 ± 0.51 -0.08 ± 0.16
D-Arg0-Thi5-Leu8-BK -1.71 ± 0.33 -1.23 ± 0.25 -1.32 ± 0.14 -3.31 ± 0.14
Thi8-BK 0.98 ± 0.22 -1.3 ± 0.26 -0.34 ± 0.14 -0.33 ± 0.15
Thi5-BK 0.58 ± 0.25 -1.09 ± 0.27 0.04 ± 0.15 -0.27 ± 0.14
Ser8-BK -1.85 ± 0.2 * -1.67 ± 0.14 *
Os análogos foram comparados com o seu valor do ΔLog τ/Ka em comparação ao peptídeo de referência (BK). * Análogos donde não foi quantificável o valor de ΔLog τ/Ka.
118
Tabela 2. Valores de ΔΔLogτ/Ka de cada um dos análogos respeito a BK e em comparação em duas vias diferentes.
Análogo ΔΔLogτ/Ka
β-arr2 vs. Gq β-arr1 vs. Gq Gi3 vs. Gq β-arr2 vs. Gi3 β-arr1 vs. Gi3 β-arr2 vs. β-arr1
Met0-BK -1.45 ± 0.28 - - - - -
Trp8-BK -2.01 ± 0.50 -0.13 ± 0.37 * * * -1.88 ± 0.49
Leu8-BK -2.23 ± 0.29 -0.27 ± 0.28 * * * -1.96 ± 0.28
Thi5,8-BK -0.39 ± 0.28 -1.18 ± 0.24 -1.88 ± 0.28 1.49 ± 0.27 0.7 ± 0.24 0.79 ± 0.21
Tyr(Me)8-BK -0.87 ± 0.25 -0.18 ± 0.54 -1.83 ± 0.31 0.96 ± 0.29 1.65 ± 0.57 -0.69 ± 0.53
D-Arg0-Thi5-Leu8-BK -1.6 ± 0.35 0.39 ± 0.36 0.48 ± 0.41 -2.08 ± 0.28 -0.09 ± 0.28 -1.99 ± 0.19
Thi8-BK -1.31 ± 0.26 -1.32 ± 0.25 -2.28 ± 0.33 0.97 ± 0.29 0.96 ± 0.29 0.01 ± 0.20
Thi5-BK -0.85 ± 0.28 -0.54 ± 0.29 -1.67 ± 0.37 0.82 ± 0.31 1.13 ± 0.31 -0.31± 0.21
Ser8-BK -1.08 ± 0.25 0.18 ± 0.25 * * * -1.26 ± 0.20
Os análogos foram comparados com o seu valor do ΔLog τ/Ka em comparação ao peptídeo de referência (BK). * Análogos donde não foi quantificável o valor de ΔLog τ/Ka.
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