dasar teori inokulasi
Post on 09-Dec-2014
232 Views
Preview:
TRANSCRIPT
LAPORAN SEMENTARA
PRAKTIKUM TEKNIK BIOPROSES
IDENTITAS PRAKTIKAN
NAMA : Yuliana Stevani
NIM : 03101003016
KELOMPOK : 2
I. NAMA PERCOBAAN : Inokulasi
II. TUJUAN
1. Untuk mengetahui cara pembiakan jamur pada medium padat
2. Dapat menghitung bayaknya jumlah mikroba dengan menggunakan alat
Haemacytometer.
3. Mengetahui perkembangan jamur antara medium tabung reaksi tegak dan
tabung reaksi miring.
III. DASAR TEORI
Dalam teknik biakan murni tidak saja diperlukan bagaimana
memperoleh suatu biakan yang murni, tetapi juga bagaimana memelihara
serta mencegah pencemaran dari luar.Inokulasi dimaksudkan untuk
menumbuhkan, meremajakan mikroba dan mendapatkan populasi mikroba
yang murni.
Inokulasi adalah pekerjaan memindahkan bakteri dari medium yang
lama ke medium yang baru dengan tingkat ketelitian yang sangat tinggi.
Media untuk membiakkan bakteri haruslah steril sebelum digunakan.
Pencemaran terutama berasal dari udara yang mengandung banyak
mikroorganisme.
Pemindahan biakan mikroba yang dibiakkan harus sangat hati-hati
dan mematuhi prosedur laboratorium agar tidak terjadi kontaminasi. Oleh
karena itu, diperlukan teknik-teknik dalam pembiakan mikroorganisme yang
disebut dengan teknik inokulasi biakan. Identifikasi biakan mikroorganisme
seringkali memerlukan pemindahan ke biakan segar tanpa terjadi
pencemaran. Pemindahan mikroorganisme ini dilakukan dengan teknik
aseptik untuk mempertahankan kemurnian biakan selama pemindahan
berulangkali. Mikroorganisme dapat ditumbuhkan dalam biakan cair atau
padat. Kekeruhan dalam kaldu menunjukkan terjadinya pertumbuhan
mikroorganisme. Bila mikroorganisme menumpuk pada dasar tabung maka
akan membentuk sedimen, sedangkan pada permukaan kaldu
pertumbuhannya terlihat sebagai pelikel. Pertumbuhan mikroorganisme
dalam kaldu seringkali menggambarkan aktivitas metabolismenya. Mikroba
aerob obligat berkembang biak pada lapisan permukaan karena pada bagian
ini kandungan oksigen tinggi.
Selain dalam media cair, mikroorganisme juga memperlihatkan
pertumbuhan dengan ciri tertentu dalam biakan padat seperti agar miring atau
lempengan agar. Agar miring lazimnya digunakan untuk menyimpan biakan
murni sedangkan agar lempengan lazimnya digunakan untuk memurnikan
mikroorganisme.
A. Inokulasi Bakteri
Ada beberapa tahap yang harus dilakukan sebelum melakukan teknik
penanaman bakteri (inokulasi) yaitu :
1. Menyiapkan ruangan
Ruang tempat penanaman bakteri harus bersih dan keadannya harus steril
agar tidak terjadi kesalahan dalam pengamatan atau percobaaan dalam
labotarium pembuataan serum vaksin dan sebagainya. Inokulasi dapat
dilakukan dalam sebuah kotak kaca (encast) udara yang lewat dalam kotak
tersebut dilewatkan saringan melalui suatu jalan agar tekena sinar ultraviolet.
2. Pemindahan dengan dengan pipet
Cara ini dilakukan dalam penyelidikan air minum atau pada penyelidikan
untuk diambil 1 ml contoh yang akan diencerkan oleh air murni sebanyak 99
ml.
3. Pemindahan dengan kawat inokulasi.
Ujung kawat inokulasi sebaliknya dari platina atau nikel .ujungnya boleh
lurus juga boleh berupa kolongan yang diametrnya 1-3mm. Dalam
melakukan penanaman bakteri kawat ini terlebih dahulu dipijarkan
sedangkan sisanya tungkai cukup dilewatkan nyala api saja. Setelah dingin
kembali, ujung kawat itu disentuhkan ke suatu koloni, mulut tabung tempat
pembiakan dipanasi setelah sumbatnya dibuka. Ujung kawat yang ada sampel
mikroorganisme (inokulum), digesekkan pada medium. Setelah penggesekan
selesai, mulut tabung dipanasi kembali. Kemudian disumbat seperti semula.
B. Teknik Inokulasi
Ada beberapa metode yang digunakan untuk mengisolasi biakan murni
mikroorganisme yaitu :
1. Metode gores
Teknik ini lebih menguntungkan jika ditinjau dari sudut ekonomi dan
waktu, tetapi memerlukan ketrampilan-ketrampilan yang diperoleh dengan
latihan. Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang
terpisah. Inokulum digoreskan di permukaan media agar nutrien dalam
cawaan petri dengan jarum pindah (lup inokulasi). Di antara garis-garis
goresan akan terdapat sel-sel yang cukup terpisah sehingga dapat tumbuh
menjadi koloni.
Cara penggarisan dilakukan pada medium pembiakan padat bentuk
lempeng. Bila dilakukan dengan baik teknik inilah yang paling praktis.
Dalam pengerjaannya terkadang berbeda pada masing-masing laboratorium
tapi tujuannya sama yaiitu untuk membuat goresan sebanyak mungkin pada
lempeng medium pembiakan.
Kesulitan dari metode ini, yaitu proses penggoresan yang cukup lama dan
sulit, sehingga memudahkan terjadinya kontaminasi dan kegagalan. Prinsip
metode ini, yaitu mendapatkan koloni yang benar-benar terpisah dari koloni
yang lain, sehingga mempermudah proses isolasi. Cara ini dilakukan dengan
membagi cawan petri menjadi 3-4 bagian. Ose steril yang telah disiapkan
dilekatkan pada sumber isolat, kemudian menggoreskan ose tersebut pada
cawan berisi media steril.
Goresan dapat dilakukan 3-4 kali membentuk garis horisontal di satu sisi
cawan. Ose disterilkan lagi dengan api bunsen, setelah kering ose tersebut
digunakan untuk menggores goresan sebelumnya pada sisi cawan kedua.
Langkah ini dilanjutkan hingga keempat sisi cawan tergores.
Pada metode ini, goresan di sisi pertama diharapkan koloni tumbuh padat
dan berhimpitan, sedangkan pada goresan sisi kedua, koloni mulai tampak
jarang dan begitu pula selanjutnya, sehingga didapatkan koloni yang tampak
tumbuh terpisah dengan koloni lain. Seluruh tahap hendaknya dilakukan
secara aseptik agar tak terjadi kontaminasi.
Ada beberapa teknik dalam metode goresan, yakni :
1. Goresan T
2. Goresan Kuadran
3. Goresan Radiand
4. Goresan Sinambung
2. Metode tebar
Pada metode cawan sebar, 0.1 ml suspensi bakteri yang telah
diencerkan disebar pada media penyubur steril yang telah disiapkan.
Selanjutnya, suspensi dalam cawan diratakan dengan batang drygalski agar
koloni tumbuh merata pada media dalam cawan tersebut, kemudian
diletakkan dalam inkubator (370C) selama 1-2 hari.
Metode ini cukup sulit terutama saat meratakan suspensi dengan
batang drygalski. Alih-alih koloni tumbuh merata, biakan justru
terkontaminasi. Oleh karena itu, batang drygalski harus benar-benar steril,
yaitu dengan mencelupkannya terlebih dahulu dalam alkohol kemudian
dipanaskan dengan api bunsen. Perlu diingat, batang drygalski, yang masih
panas akibat pemanasan dengan api bunsen, dapat merusak media agar,
sehingga harus didinginkan terlebih dahulu dengan meletakkannya di sekitar
api bunsen (±15 cm).
Dengan metode ini, satu sel bakteri akan tumbuh dan berkembang
menjadi satu koloni bakteri. Satu koloni bakteri yang terpisah dengan koloni
lainnya dapat diamati tipe pertumbuhan pada masing-masing media,
diantaranya dilakukan terhadap konsistensi, bentuk koloni, warna koloni dan
permukaan koloni.
Koloni yang tumbuh terpisah ditumbuhkan kembali untuk
mendapatkan isolat murni. Isolasi murni dilakukan dengan mengoleskan ose
steril pada koloni dalam kultur campuran yang benar-benar terpisah satu
sama lain. Olesan tersebut digores pada media padat agar miring dalam
tabung reaksi.
3. Metode tuang
Isolasi menggunakan media cair dengan cara pengenceran. Dasar
melakukan pengenceran adalah penurunan jumlah mikroorganisme sehingga
pada suatu saat hanya ditemukan satu sel di dalam tabung (Winarni, 1997).
Penuangan dilakukan secara aseptik atau dalam kondisi steril agar
tidak terjdi kontaminasi atau tumbuh atau masuknya organisme yang tidak
diinginkan (di laboratorium, kontaminasi biasanya terjadi akibat tumbuhnya
kapang, seperti Penicilium dalam biakan). Media yang dituang hendaknya
tidak terlalu panas, karena selain mengganggu proses penuangan (media
panas sebabkan tangan jadi panas juga), media panas masih mengeluarkan
uap yang akan menempel pada cawan penutup, sehingga mengganggu proses
pengamatan. pada metode ini, koloni akan tumbuh di dalam media agar.
Kultur diletakkan terbalik, dimasukkan di dalam plastik dengan diikat kuat
kemudian diletakkan dalam inkubator
4. Metode tusuk
Metode tusuk yaitu dengan dengan cara meneteskan atau menusukan
ujung jarum ose yang didalamnya terdapat inokolum, kemudian dimasukkan
ke dalam media. Metode Tusuk ini termasuk kedalam media agar tegak dan
media cair. (Winarni, 1997).
C. Macam-Macam Media Untuk Inokulasi
Ada beberapa macam media yang digunakan untuk inokulasi yaitu :
1) Mixed culture : berisi dua atau lebih spesies mikroorganisme.
2) Plate culture: media padat dalam petridish.
3) Slant culture : media padat dalam tabung reaksi.
4) Stap culture : media padat dalam tabung reaksi, tetapi penanamannya
dengan cara penusukan.
5) Liquid culture : media cair dalam tabung reaksi.
6) Shake culture: media cair dalam tabung reaksi yang penanamannya
dikocok.
D. Perhitungan Mikroba
Penentuan atau pengukuran jumlah sel biasanya dilakukan untuk
organisme bersel tunggal (misalnya bakteri), sedangkan penentuan massa sel
dapat dilakukan bukan hanya untuk organisme bersel tunggal, tetapi juga
untuk organisme berfilamen (misalnya kapang). Ada berbagai cara untuk
mengukur jumlah sel antara lain:
1. Hitungan Cawan (Pengenceran)
Dengan pengenceran, disiapkan beberapa buah tabung berisi aquadest
steril sebanyak 9 ml. Masing-masing tabung kemudian ditambahkan 1 ml
sampel yang akan diperiksa secara bertahap, yaitu :
a. 1 ml sampel ke dalam tabung pertama, sehingga konsentrasi larutan di
dalam tabung pertama menjadi 10-1.
b. 1 ml dari tabung pertama ke tabung kedua, sehingga konsentrasi tabung
kedua menjadi 10-2.
c. Dan seterusnya sampai mencapai larutan dengan konsentrasi terendah.
Dari tiap-tiap tabung kemudian diambil 1 ml larutan dan ditanamkan ke
dalam cawan petri berisi media padat. Pertumbuhan koloni yang kemudian
timbul pada tiap-tiap cawan dihitung. Cara perhitungan ini harus
memperhitungkan faktor kerapatan pertumbuhan koloni, karena jika
pertumbuhan koloni terlalu rapat biasanya sulit untuk
dipertanggungjawabkan hasilnya. Juga untuk pertumbuhan yang terlalu
jarang sehingga diperlukan adanya pemilihan cawan yang ditumbuhi koloni
yang paling tinggi kemurniannya untuk dihitung.
2. Hitungan Mikroskopis Langsung
Pada metode mikroskopis langsung, sampel diletakkan di ruang hitung
(seperti hemasiotomeyer) dan jumlah sel dapat ditentukan secara langsung
dengan bantuan mikroskop.
Pada metode ini, hasil pengenceran tidak ditanamkan pada media, tetapi
diteteskan ke dalam ruang hitung. Selanjutnya diperiksa di bawah mikroskop
terhadap mikroba yang terdapat pada kolom perhitungan. Misalnya
didapatkan jumlah yang terhitung 12 sel, maka perhitungan jumlah sel
adalah:
Jumlah Sel = 12 x 25 x 50 x 103
= 1,5 x 107 sel/ ml
Dimana: 12 = Jumlah sel yang terhitung.
25 = Jumlah kotak pada ruang perhitungan.
50 = Volume tiap-tiap kotak.
103 = Pengenceran sampel.
Keuntungan metode ini adalah pelaksanannya yang cepat dan tidak
memerlukan banyak peralatan. Namun kelemahannya adalah tidak dapat
membedakan sel-sel yang hidup dan yang mati. Dengan kata lain hasil yang
diperoleh adalah jumlah total sel yang ada dalam populasi. Sel mati akan
menyerap warna biru, sedangkan sel hidup mereduksi zat warna tersebut
secara enzimatif menjadi tidak berwarna, jadi sel-sel akan tampak biru.
Kelemahan lain dari metode hitungan mikroskopis langsung adalah
sulitnya menghitung sel yang berukuran kecil seperti bakteri, karena
ketebalan hemasitometer tidak memungkinkan. Hal ini biasanya dapat diatasi
dengan mewarnai sel sehingga mudah dilihat. Kelemahan lainnya adalah
kadang-kadang sel cenderung bergumpal, sehingga sukar untuk membedakan
sel-sel individu. Cara mengatasinya adalah dengan menceraiberaikan
gumpalan sel tersebut dengan menambahkan bahan anti gumpal, seperti
Dinatrium etilamina tetra asetat dan tween sebanyak 0,1 %.
3. Penggunaan Nefelometer / Turbidometer
Cara ini merupakan perhitungan kerapatan materi (sel) di dalam larutan,
yang diberi cahaya. Kualitas bias cahaya yang dilkakukan identik dengan
kerapatan materi sel yang berada dalam larutan.
4. Menggunakan Ruang Hitung Haemacytometer
Haemacytometer adalah alat khusus yang digunakan untuk menghitung
mikroorganisme. Pada alat ini terdapat kotak-kotak kecil dengan luas 1 / 400
mm2 dan kedalaman 0,1 mm. Penggunaannya adalah dengan meletakkan kaca
preparat yang di atasnya dan ditutup dengan deck glass. Pengamatan ini
dilakukan dengan menggunakan mikroskop agar dapat mengamati sel-sel
mikroba baik yang kecil maupun yang besar, yang dibatasi oleh kotak-kotak
haemacytometer.
Perhitungan dengan haemacytometer ini merupakan perhitungan langsung
karena sample langsung diambil dan diteteskan pada alat haemacytometer
dan diamati di bawah mikroskop. Perhitungan dengan metode ini mempunyai
beberapa keuntungan, yaitu semua sel mikroba baik yang masih hidup atau
pun sudah mati dapat dihitung. Sedangkan kelemahannya yakni apabila
pengenceran tidak homogen lagi, maka akan terjadi kesalahan dalam
perhitungan.
Perhitungan dengan haemacytometer ini merupakan perhitungan
langsung karena sample langsung diambil dan diteteskan pada alat
haemacytometer dan diamati di bawah mikroskop.
Perhitungan dengan metode ini mempunyai beberapa keuntungan,
yaitu semua sel mikroba baik yang masih hidup atau pun sudah mati dapat
dihitung. Sedangkan kelemahannya yakni apabila pengenceran tidak
homogen lagi, maka akan terjadi kesalahan dalam perhitungan.
E. Perbedaan Inokulasi Jamur dan Bakteri
Perbedaan Inokulasi Jamur dan Bakteri adalah :
1) Inokulasi jamur menggunakan jarum ose bentuk batang. Hifa yang
berbentuk seperti benang mudah diambil dengan jarum ose batang dan
mudah sekali tumbuh di dalam suatu media.
2) Inokulasi bakteri menggunakan jarum ose bentuk bulat. Pada ujung jarum
ose yang berbentuk bulat, bakteri akan dapat terambil dalam jumlah yang
relatif banyak (Rohimat, 2002).
F. Fermentasi
Fermentasi merupakan suatu cara pengolahan melalui proses
memanfaatkan penguraian senyawa dari bahan-bahan protein kompleks.
Protein kompleks tersebut terdapat dalam tubuh ikan yang diubah menjadi
senyawasenyawa lebih sederhana dengan bantuan enzim yang berasal dari
tubuh ikan atau mikroorganisme serta berlangsung dalam keadaan yang
terkontrol (Adawyah 2007).
Fermentasi secara teknik dapat didefinisikan sebagai suatu proses
oksidasi anaerobik atau partial anaerobik karbohidrat yang menghasilkan
alkohol serta beberapa asam, namun banyak proses fermentasi yang
menggunakan substrat protein dan lemak (Muchtadi dan Ayustaningwarno
2010).
Fermentasi terbagi menjadi dua, yaitu fermentasi spontan dan tidak
spontan (membutuhkan starter). Fermentasi spontan adalah fermentasi yang
biasa dilakukan menggunakan media penyeleksi, seperti garam, asam
organik, asam mineral, nasi atau pati. Media penyeleksi tersebut akan
menyeleksi bakteri patogen dan menjadi media yang baik bagi tumbuh
kembang bakteri selektif yang membantu jalannya fermentasi.
Fermentasi tidak spontan adalah fermentasi yang dilakukan dengan
penambahan kultur organisme bersama media penyeleksi sehingga proses
fermentasi dapat berlangsung lebih cepat (Rahayu et al. 1992). Hasil
fermentasi diperoleh sebagai akibat metabolisme mikroba-mikroba pada
suatu bahan pangan dalam keadaan anaerob. Mikroba yang melakukan
fermentasi membutuhkan energi yang umumnya diperoleh dari glukosa.
Dalam keadaan aerob, mikroba mengubah glukosa menjadi air, CO2 dan
energi (ATP). Beberapa mikroba hanya dapat melangsungkan metabolisme
dalam keadaan anaerob dan hasilnya adalah substrat yang setengah terurai.
Hasil penguraiannya adalah air, CO2, energi dansejumlah asam organik
lainnya, seperti asam laktat, asam asetat, etanol serta bahan-bahan organik
yang mudah menguap. Perkembangan mikroba-mikroba dalam keadaan
anaerob biasanya dicirikan sebagai proses fermentasi (Muchtadi dan
Ayustaningwarno 2010). Sebagai suatu proses fermentasi memerlukan:
1. Mikroba sebagai inokulum
2. Tempat (wadah) untuk menjamin proses fermentasi berlangsung dengan
optimal.
3. Substrat sebagai tempat tumbuh (medium) dan sumber nutrisi bagi
mikroba.
G. Desain Media Fermentasi
Medium untuk fermentasi biasa disebut substrat. Biasanya pada teknologi
fermentasi digunakan bahan dasar yang mengandung karbon. Oleh karena
itu, kebanyakan berasal dari tumbuhan dan sedikit dari produk hewani.
Sebagai contoh; biji-bijian (grain), susu (milk). Natural raw material berasal
dari hasil pertanian dan hutan. Karbohidrat; gula, pati (tepung), selulosa,
hemiselulosa, dan lignin.
1. Gula, bahan makanan yang mengandung gula mudah dan relatif mudah
didapatkan untuk proses biotek.
2. Pati, jagung, padi, ganum, kentang, dan pohong (kassava) didegradasi
menjadi gula sederhana (monosakarida) dengan hidrolisis sebelum
fermentasi. Pati juga dapat digunakan sebagai bahan bakar non minyak
(etanol).
3. Selulosa
4. Substrat dari limbah industri: Molase (tetes tebu), mengandung 50 % gula
5. sebagai substrat untuk produksi antibiotik, asam organik. Whey (air
dadih), Damen dan ampas tahu, bahkan urine hewan ternak.
Berdasarkan bentuknya substrat dapat dibedakan menjadi:
1. Substrat cair (air anggur)
2. Substrat semi cair (yoghurt)
3. Substrat padat digunakan untuk produksi tempe, oncom, kecap, kompos
dsb.
4. Solid substrate fermentation (SSF), melibatkan jamur berfilamen, yeast
atau streptomyces.
H. Inokulum
Tujuan utama pembuatan inokulum untuk fermentasi menggunakan
bakteri ialah menyediakan inokulum yang berada dalam keadaan aktif
sehingga dapat mempersingkat fase adaptasi pada waktu fermentasi.
Lamanya fase adaptasi dipengaruhi oleh volume inokulum dan kondisi
fisiologinya. Untuk bakteri pembentuk spora, inokulum juga dipengaruhi
oleh lamanya fase adaptasi. Karena itu, inokulum bakteri sebaiknya
diinokulasikan ke dalam medium fermentasi pada saat sel aktif melakukan
metabolisme. Fase adaptasi dapat dikurangi sampai serendah-rendahnya jika
komposisi medium inokulum yang digunakan sama dengan komposisi
medium fermentasi. Fase adaptasi dalam proses fermentasi untuk
memproduksi enzim yang dihasilkan oleh bakteri juga perlu dikurangi
sampai serendah mungkin.
Inokulum merupakan campuran antara kultur mikroba dan media
pertumbuhannya yang digunakan untuk memfermentasikan suatu produk.
Inokulum yang digunakan harus berada dalam fasa aktif untuk memberikan
fase lag yang pendek. Fase lag dipengaruhi oleh jumlah inokulum dan
kondisi fisiologis mikroba itu sendiri. Jika dalam proses fermentasi diawali
dengan jumlah inokulum yang terlalu minim, pertumbuhan akan lambat dan
kecepatan pembentukan produk tidak memuaskan.
Komposisi kultur media, konsentrasi biomassa, dan konsentrasi metabolit
umumnya akan mengalami perubahan secara konstan sebagai hasil
metabolisme sel. Umumnya konsentrasi inokulum yang dibutuhkan adalah
sebagai berikut:
Bakteri 0,1 – 3 %
Aktinomiset 5 – 10 %
Fungi 5 – 10%
Suspensi spora 1 – 5 x 105/L
Berikut jenis-jenis inokulum :
1. Bakteri : Bacillus sp., Lactobacillus sp., Streptococcus sp.
Eschericia sp.
2. Jamur : Aspergillus sp. Penicillium sp.
3. Jamur filamentous
4. Kahmir (yeast) : Saccharomyces sp.
Jenis Inokulum Substrat Produk
JamurRhizopus oligoporus Kedelai, Ampas
Kacang
Tempe,
Oncom
Khamir (Yeast) Saccharomyces
cerevisiae
Bahan roti, tetes
tebu
Roti
Saccharomyces
cerevisiae
Bahan dasar
karbohidrat:
Tape
beras,
ketan, ketela
Saccharomyces
cerevisiae
Air anggur, bir,
brem
anggur, bir,
brem
Bakteri
Acetobacter xylinum Air kelapa Nata de
coco
Streptococcus
thermophillus
Lactobacillus
bulgaricus
Air susu Yoghurt
Tabel 1. Berbagai jenis inokulum dan produknya
IV. ALAT DAN BAHAN
a. Alat :
1. Tabung reaksi
2. Cawan Petri
3. Jarum Oase
4. Burner
b. Bahan :
1. Medium yang telah jadi
2. Kultur murni
3. Jarum/kawat
4. Alcohol
V. PROSEDUR PERCOBAAN
Untuk percobaan Inokulasi :
1. Siapkan tabung yang berisi jamur atau bakteri dan tabung medium.
2. Panaskan jarum inokulasi sampai berpijar dan diamkan sebentar.
3. Buka sumbat tabung jamur atau bakteri lewatkan dekat nyala Bunsen.
4. Ambil jamur dengan menggunakan jarum Oase.
5. Buka sumbat tabung medium, mulut tabung dilewatkan ke nyala Bunsen.
6. Masukkan ujung kawat oase tadi yang membawa jamur dengan
menggesekkan pada permukaan medium dari kiri ke kanan dengan arah
dari bawah ke atas medium.
7. Tabung medium kemudian disumbat lagi.
8. Simpan tabung yang telah ditanami jamur tadi + 7 hari.
9. Amati bentuk jamur atau bakteri melalui mikroskop dan jelaskan.
top related