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Coliformes Coliformes totales, totales, termotolerantes termotolerantes y y Escherichia coli Escherichia coli por el método por el método
de filtración de membrana ( FM )de filtración de membrana ( FM )Bióloga: Carmen Vargas G.
OPS / CEPIS
Curso sobre métodos bacteriológicosCurso sobre métodos bacteriológicospara el análisis de Agua Potablepara el análisis de Agua Potable
23- 27 de octubre del 200023- 27 de octubre del 2000Lima - PerúLima - Perú
Centro Panamericano de Ingeniería Sanitaria y Ciencias del Ambiente Enviromental Protection Agency
Coliformes totales
Coliformestermotolerantes
RELACIÓN ENTRE COLIFORMESRELACIÓN ENTRE COLIFORMESTOTALES, TERMOTOLERANTES Y TOTALES, TERMOTOLERANTES Y E. E. colicoli
EscherichiaEscherichia coli coli
ORGANISMOS COLIFORMES
3 Bacterias Gram-negativas, forma de bastoncillos
3Se desarrollan en presencia de sales biliares u otros
agentes tensoactivos
3Tienen propiedades de inhibición.
3Fermentan la lactosa a 35-37°C, produciendo gas,
ácido y aldehído en 24-48 horas.
3Son oxidasa negativa y no forman esporas.
3Presentan actividad a la ββ-galactosidasa
DEFINICIÓN
GRUPO COLIFORME ( FM )
Bacterias aerobias y anaerobias facultativas,
gram negativas, no esporuladas y de forma alargada
que desarrollan una colonia roja con brillo metálico
en un medio tipo Endo que contiene lactosa a
inoculación de 35 ± 0,5°C - 24 hrs.
GRUPO COLIFORMEGRUPO COLIFORME
GÉNEROSGÉNEROS FUENTEFUENTE
EscherichiaEscherichia HECES (HECES (humanos y animaleshumanos y animales))
KlebsiellaKlebsiella HECES, AMBIENTEHECES, AMBIENTE
EnterobacterEnterobacter HECES, AMBIENTE HECES, AMBIENTE
CitrobacterCitrobacter AMBIENTEAMBIENTE
SerratiaSerratia AMBIENTEAMBIENTE
ORGANISMOS PATÓGENOS EN EL AGUAORGANISMOS PATÓGENOS EN EL AGUA
MÉTODOS PARA COLIFORMESMÉTODOS PARA COLIFORMESTOTALESTOTALES
Método de filtración por membrana (FM)Método de filtración por membrana (FM)
Un total de 100 ml de muestra en uno o más filtros; por ejemplo,1 filtro con 100 ml ó 4 filtros con 25 ml cada uno.
Preparación de diluciones decimales
Muestra de agua
cruda
Dilución
10-1
Dilución
10-3
Dilución
10-2
10 ml
Agua de dilución
amortiguada
10 ml 10 ml
90 ± 2 ml 90 ± 2 ml90 ± 2 ml
10 ml 10 ml 10 ml
1 ml 0,1 ml 0.01 ml
100 ml 25 ml50 ml
100 ml 50 ml 10 ml
Volumen filtrado
Placas con AGAR m-FC ó ALMOHADILLAEMBEBIDA ENCALDO m-FC
VOLUMEN DE MUESTRA
ORIGINAL FILTRADA
COLIFORMES TOTALES - VERIFICACIÓN DEL FMMuestra
Agar mEndo 35° ± 0.5°C, 24 h
Crecimiento+, Gas+
Caldo lactosado verde brillantebilis 35 ± 0.5° C, 24 - 48 h
Coliformes totales verificados
Crecimiento+, Gas+
a) Seleccionar ≤≤ 5 colonias con brillo metálico, ob) Trasladar las colonias con un hisopo del filtro a
Caldo lauril triptosa 35° ± 0.5°C, 24 - 48 h
DEFINICIÓN
Bacterias que forman parte del grupo Coliforme, bacilos gram – negativos, no esporulados que fermentan la lactosa con producción de ácido y gas a 44.5 ± 0,2 °Cdentro de las 24 ± 2 hrs.
La mayor especie en el grupo de coliformes termotolerantes es la E. Coli.
COLIFORMES TERMOTOLERANTES(fecales)
MÉTODO PARA COLIFORMES TERMOTOLERANTES
Se realiza a partir de coloniaspositivas de coliformes totales enplacas con medio m – Endo, lascuales son transferidas en tubosconteniendo medio EC, durante 24hrs.
CONFIRMACIÓN DE COLIFORMES TERMOTOLERANTES
MUESTRA
AGAR m-ENDO ó m-ENDO LES
35°C ± 0,5 °C / 24 HRS
SELECCINAR 5 COLONIAS VERDE DORADO Y CONBRILLO METÁLICO
COLIFORMES TERMOTOLERANTES ( fecales)
CALDO EC 44,5 °C ± 0,2 °C / GAS (+) 24 HRS
PRUEBA PARA COLIFORMESTERMOTOLERANTES POR MF SOLO CON
AGUA DE LA FUENTE
MUESTRA
COLIFORMES TERMOTOLERANTES( fecales )
Medio m - FC
44,5 °C ± 0,2 °C / 24 hrs.
COLONIAS AZULES
DEFINICIÓN
Escherichia coli
Bacteria Coliforme que posee la enzima ββ- dGlucoronidasa y es capaz de romper el sustrato4-metil umbeliferil glucorónido ( MUG) con la producción de fluorescencia cuando crece enlos medios EC – MUG a 44.5 ± 0,2 °C en 24 ± 0,2 horas en Agar nutritivo con MUG a 35°C ± 0,5 en4 horas
E. coli MÉTODO DE FILTRACIÓN DE MEMBRANA
MUESTRA
AGAR m-ENDO ó m-ENDO LES 35°C ± 0,5 °C / 24HRS
FLUORESCENCIA LUZ UV 366 nm
CALDO EC + MUG 44,5 °C ± 0,2 °C/ gas (+) 24 hrs
SELECCINAR 5 COLONIAS VERDE DORADO YCON BRILLO METÁLICO
E. coli
E. coliFILTRACIÓN DE MEMBRANA – MEMBRANA FILTRANTE
( MÉTODO DE MATES SHAFFER)
MUESTRA
AGAR m-ENDO ó m-ENDO LES 35°C, 24 Hrs
E. coli
AGAR NUTRITIVO + MUG 35,5 °C ± 0,2 °C / 4 hrs
a) Seleccionar ≤≤ 5 colonias con brillo metálico.b) Trasladar el filtro al
FLUORESCENCIA LUZ UV 366 nm
VENTAJAS DEL MÉTODO DE
FILTRACIÓN POR MEMBRANA
• Proporciona recuentos directos.
• Es más preciso ( se obtienenresultados más reproducibles) quela prueba de FTM o NMP.
• Rápido y fácil de realizar.
• Analiza mayores volúmenes demuestras con bajas concentracionesde organismo.
Calculo de la densidad de coliformes porel método de filtración de membrana
Colonias de coliformes/100 ml = Colonias de coliformes contados x 100
ml de muestra filtrada
Se expresa en UFC / 100 µµl
DESVENTAJAS DEL MÉTODO DE
FILTRACIÓN POR MEMBRANA
• Intervienen los altos niveles deturbiedad.
• Los coliformes debilitados puedensobrevivir mejor en la prueba de FTMo NMP.
• Las altas concentraciones de nocoliformes interfieren en el recuento.
• Efecto del tipo de filtro de membrana.
VERIFICACIÓN• VERIFICAR TODAS LAS COLONIAS DE
COLIFORMES TOTALES SI HAYIGUALDAD O MENOR A 5 COLONIAS ENEL FILTRO.
• VERIFICAR 5 COLONIAS ELEGIDASALEATORIAMENTE DEL FILTRO CONMÁS DE 5 COLONIAS EN EL FILTRO.
TASA DE VERIFICACIÓNTASA DE VERIFICACIÓNmétodo de filtración por membranamétodo de filtración por membrana
1. Porcentaje de verificación =
(Número total de tubos positivos)
(Número total de tubos inoculados)
X 100
2. Recuento de coliformes totales verificados =
Fracción % de verificación x (Coliformes/100 ml)*
* Recuento en membrana
RECOMENDACIONES
Analizar 100 ml de muestra, independientedel método elegido.
*
La muestra debe analizarse dentro de las 30 horasde recolección.
*
Usar etanol al 95% en medio m-Endo (alcohol nodesnaturalizado)
*
RECOMENDACIONES(CONTINUACIÓN)
Realizar el control apropiado de esterilidad: agar, caldo, amortiguador de fosfato y filtros.
*
Probar los nuevos lotes de filtros para la recuperacióny efectos en la morfología de las colonias.
*
No guardar el agar por más de 2 semanas; desecharlas almohadillas humedecidas con el medio de cultivodespués de 96 horas.
*
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