cromatografía de líquidos de alto...

Cromatografía de Líquidos de Alto y Ultra Alto Rendimiento

De los orígenes a la actualidad

http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/CROMATOFRAFIADELIQUIDOSDEULTRAALTORENDIMIENTO_9441.pdf

Gas Líquido

Columna Plano

CLS CLL CFE CII CE

CPG CFG

CCF CP

Cromatografía

Elución

• La muestra se aplica al principio de la

columna como una banda fina

• El eluyente tiene menor afinidad por la fase

estacionaria que los solutos

• Los solutos avanzan por el sistema a

velocidades diferentes, menores a la de la

fase móvil

• Los solutos se separan en bandas que eluyen

al final de la columna

Requisitos de la muestra

• Soluble en la fase móvil

• “Limpia”

HPLC ideal para muestras con:

• Presión de vapor baja

• Compuestos iónicos

• Compuestos de peso molecular elevado

• Compuestos Termolábiles

• SOBRE TODO: MEZCLAS DE COMPUESTOS

Técnica Instrumental

La herramienta analíticade mayor importancia

Componentes básicos

Control

de flujo

Fase

móvilIntroducción

de muestraColumna Detección

Registro

y proceso

Horno

C

Instrumentación

Fase móvil Bomba de alta presión

Inyector

Columna

Detector

Muestra

Control de temperatura

Gradientede elución

Registro

Columna

Van Deemter

Efecto del diámetro de partícula

3

2 5

1

p

i t m

p

LH a d

N

Bp f D

d C

Digestión de enolasa.Efecto del tamaño de partícula

en N y P

COLUMNAS EN HPLC

Columnas

• Tubo de acero inoxidable, vidrio o capilar de sílice

fundida

• Dimensiones

–Longitud: 25 a 300 mm

–Diámetro: 75 mm a 1000 mm (0.075 a 4.6 mm)

–Tamaño de partícula: 1.2 a 10 mm

Empaques de UHPLC

• Images of current 1.9um particles

Tipos de fases estacionarias

• Cromatografía de intercambio iónico

• Cromatografía en fase normal

• Cromatografía en fase inversa

• Cromatografía de exclusión por tamaño

¿¿¿ Ab o Ad ???

Cromatografía

• Fase Normal

–FE polar

–FM No-polar

• Fase Inversa

–FE No-polar

–FM polar

Cromatografía

de fase inversa

• FE

–Sílica químicamente modificada con

grupos no-polares: hidrocarburos

saturados: C18 octadecil, C8 octil,

C4 tetrametil, C2 dimetl

• FM

–Mezclas: agua/disolventes orgánicos

H2O +(CH3OH, THF, CH3CN)

Tipos de CL

• Cromatografía de intercambio iónico

• Adsorción: líquido-sólido

• Partición: líquido-líquido

–Cromatografia en fase normal

–Cromatografia en fase inversa

• Cromatografia de exclusión por tamaño

Cromatografía de fase inversa

• Retención por solvofobicidad

• Habrá mayor retención conforme:

– Parte apolar de la molécula del soluto es mayor

– % C en la FE es mayor

– Polaridad de la FM es alta (mayor % de H2O)

Fase móvil

• Disolventes grado cromatográfico

• Agua de 18 m

• Baja viscosidad

• No vólatil

• Miscibilidad

• Filtrada

• Sin oxígeno disuelto (degasificada)

Fuerza del eluyente

Viscosidad del eluyente

H = f (v)

GRADIENTE DE ELUCIÓN

Análisis Isocrático

Fase inversa, 10% CH3CN

Análisis Isocrático

Fase inversa, 80% CH3CN

Análisis Isocrático

Fase inversa, 50% CH3CN

Análisis por gradiente

Gradiente de acetonitrilo

T t

Elución por gradiente

Detectores

• Indice de refracción

• Ultravioleta-Visible

• Fluorescencia

• Electroquímico

• Dispersión de luz, viscosímetro

• Radioactividad

• Infrarrojo

• Espectrómetro de masas

Proteínas por 2D nano UPLC

Cromatogramas de digestión de E. Coli

Fabricantes de Equipo HPLC

• Agilent Technologies • Beckman Coulter• Cecil Instruments • Dionex Corp• Hitachi • PerkinElmer, Inc. • Shimadzu Scientific Instruments • Thermo Fisher Scientific• Waters Corporation

Columnas para HPLC

• Agilent Technologies • AkzoNobel• Beckman Coulter• Dionex Corp• Merck KGaA• Micro-Tech• Phenomenex• SGE Analytical Science• Shimadzu Scientific Instruments • Shodex• Sigma-Aldrich • Thermo Fisher Scientific• Tosoh Corporation• Waters Corporation• W. R. Grace and Company (Vydac)