caratteristiche del dna macromolecola, polimero di deossi- ribonucleotidi 4 nucleotidi: adenosina,...

Caratteristiche del DNA

• Macromolecola, polimero di deossi-ribonucleotidi

• 4 nucleotidi: adenosina, citosina, guanosina, timidina

• Appaiamento A-T e G-C (Regola della complementarietà o di Chargaff)

• Struttura a doppia elica

Appaiamento G-C ed A-T

il “CROMOSOMA BATTERICO” (nucleoide)

• Il DNA di un microrganismo è concentrato in un’unica molecola, il cromosoma batterico (alcuni batteri possono avere 2 cromosomi)- dimensioni tipiche: da 3 a 5.000.000 bp, (1.7 mm)

• il cromosoma è circolare (ma alcuni importanti gruppi hanno un cromosoma lineare)

• Il DNA è sempre associato a proteine, ma non è altamente organizzato come negli eucarioti

DNA batterico – domini superavvolti

La replicazione del DNA è detta semiconservativa

La duplicazione del DNA da parte del suo specifico macchinario enzimatico è detta replicazione

Nel microrganismo, la replicazione del DNA è associata alla sua riproduzione, che avviene per scissione binaria.

La replicazione del DNA è semiconservativa: cioè ognuna delle due eliche complementari di una molecola di DNA servirà da “stampo” per una nuova elica.

La replicazione del DNA dipende dalle DNA polimerasi

La sintesi della nuova elica di DNA procede in direzione 5‘-3‘

Viene catalizzata dalle DNA polimerasi (almeno 3 enzimi differenti con questa funzione in E. coli)

Le DNA polimerasi sono solo parte di un macchinario replicativo molto complesso che coinvolge numerosi altri enzimi e proteine (DNA girasi, elicasi, SSB protein, etc.)

Richiedono dNTP‘s come precursori della sintesi della macromolecola, un‘elica di DNA „stampo“ e un „primer“ (RNA) da cui può partire la sintesi della nuova elica

Problemi legati alla replicazione in direzione 5‘-3‘

„Frammenti di Okazaki“

I PLASMIDI

• Molti batteri oltre al cromosoma contengono molecole di DNA più piccole (da 1-2,000 a 100-500,000 pdb), dette plasmidi.

• Queste molecole non sono indispensabili per le funzioni fondamentali del batterio (ceppi della stessa specie possono esserne privi).

• I plasmidi sono generalmente molecole di DNA circolare e superavvolto.

• I plasmidi replicano indipendentemente dal cromosoma del batterio, anche se necessitano del medesimo “macchinario enzimatico” del cromosoma perché avvenga la loro replicazione.

Funzioni codificate dai plasmidi

• I plasmidi possono codificare per diverse funzioni che conferiscono al batterio nuove proprietà:

• RESISTENZA AD ANTIBIOTICI E, SOSTANZE TOSSICHE, RADIAZIONI…

• CAPACITA’ DI PRODURRE ANTIBIOTICI, TOSSINE, FATTORI DI VIRULENZA…

• NUOVE CAPACITA’ METABOLICHE

• …

Ma tornando al cromosoma batterico……..

Perché è così importante il DNA?Perché contiene l’informazione genetica…..

Un gene da un punto di vista “genetico”:GENE= unità fondamentale dell’informazione geneticaTipicamente un gene corrisponde ad una proteina (o ad un RNA con funzione specifica)

Un gene da un punto di vista “biochimico”:Sequenze di DNA che, una volta trascritte e tradotte contengono l’informazione minima necessaria per la produzione di una proteina specifica

Il genoma batterico medio

Genoma=insieme dei geni di un organismo

Un batterio come Escherichia coli possiede un genoma di 4.300.000 bp circa che codifica per circa 4300 geni

1 gene medio=1000 nucleotidi (regioni non-codificanti escluse)

Sequenziamento genomico

• Il DNA contiene l’informazione genica di un organismo, contenuta nelle sue specifiche sequenze nucleotidiche.

• Conoscere la sequenza di un genoma (l’insieme dei geni di un organismo) ci permette di avere importanti informazioni sulla sua biologia.

• A tutt’oggi sono state rese disponibili le sequenze di circa 500 microrganismi.

Interpretazione delle sequenze di DNA

AATAAAAATTTAACTCAATTTGTATCAAAAAATAACAGAAATCTAGCAGTTTTTGTAT TTTATTTTTAAATTGAGTTAAACATAGTTTTTTATTGTCTTTAGATCGTCAAAAACATA

TTGCTGCTGGTGCTGCAATGGCTGATGAAGCTGTTGTTCATGACAGTTATGCATTCG AACGACGACCACGACGTTACCGACTACTTCGACAACAAGTACTGTCAATACGTAAGC

5’

5’3’

3’

5’ 3’

3’

3’

3’

3’5’

5’

Sequenze codificanti e non-codificanti nel genoma batterico

Geni:CDS= Coding SequencesORF= Open Reading Frames

= 1000 bp

N.B.: nei microrganismi le sequenze geniche non presentano interruzioni (es. da sequenze introniche)

Che cosa ci permette di identificare le sequenze codificanti (cioè i geni) da una sequenza di DNA?

Risposta:

Dalla nostra conoscenza del codice genetico!

AUG o GUG (ATG e GTG nel DNA) sono il codone di inizio per la sintesi proteicaUAA (TAA), UAG (TAG) e UGA (TGA) sono i codoni di stop

Una “Open Reading Frame”, cioè una “lunga” sequenza di codoni in frame rappresenta un potenziale gene

GTG CGA ATA AAT TTC GCA CAA……………………........GGC TAC TAA

Met Arg Ile Asn Phe Ala Gln……………………………Gly Tyr STOP

921 paia di basi

307 amino acidi

Operoni: gruppi di geni parte di una unica unità trascrizionale

L’organizzazione di geni in operoni è tipica dei Bacteria.

Il numero di geni presente in un operone è variabile (2-15 geni)

Generalmente i geni di un operone codificano per proteine con funzioni correlate tra loro (es. enzimi di una stessa via metabolica)

Il flusso dell’informazione: l’espressione genica

La trascrizione

L’espressione genica: la “messa in atto” dell’informazione contenuta nel DNA

Quali sequenze di DNA vengono trascritte?

• A) tutto il DNA

• B) le sequenze codificanti geni

• C) le sequenze codificanti ed una parte delle sequenze non codificanti(quali? Dove comincia e dove finisce la trascrizione?)

I „confini“ di un gene (coding sequence) sono molto chiari…

• Un gene è identificabile dalla presenza di un codone di inizio (ATG, più raramente GTG) che dà inizio ad una sequenza codificante più o meno lunga, che termina con un segnale di stop (TAA, TAG o TGA).

• Il gene fa parte di un „trascritto“ (una molecola di RNA) che parte da un promotore e finisce ad un terminatore (il trascritto può comprendere più geni che appartengono allo stesso operone)

• L‘enzima responsabile del processo di trascrizione prende il nome di RNA polimerasi

L‘RNA polimerasi è un enzima complesso e composto da diverse subunità

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L‘RNA polimerasi è un enzima complesso e composto da diverse subunità

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Il complesso 2‘() possiede l‘attività catalitica per la sintesi dell‘RNA da una molecola stampo di DNA e viene definito „core enzyme“

Non è però in grado di legare i promotori (siti di inizio della trascrizione) in assenza della subunità (o fattore) .

L‘assemblaggio di questa subunità porta alla formazione del cosiddetto oloenzima

I tre momenti base del processo di trascrizione

1: Denaturazione locale del DNA

2: Inizio della trascrizione (pol. di 20 nt di RNA circa)

3: Allungamento della molecola di RNA nascente

La trascrizione è un processo „asimmetrico“

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Template strand/elica stampo

Coding strand

Il core enzyme è in grado di legare il DNA ma non di iniziare la trascrizione

‘

‘

Complesso chiuso

Complesso aperto

A sua volta, l‘inizio della trascrizione si compone di diverse reazioni

Core Enzyme

Fattore

Alcuni antibiotici inibiscono l‘RNA polimerasi (es. Rifampicina)

Antibiotico scoperto in Italia negli anni 60

Fondamentale per capire meccanismo di trascrizione (ne inibisce l‘inizio)

Utilizzato per gran parte delle infezioni batteriche („Rifocin“) fino a metà anni 70

Abbandonato per alta frequenza di batteri resistenti

A tutt‘oggi principale antibiotico nella cura della tubercolosi

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Il sito di inizio della trascrizione: il promotore

Il „mappaggio“ dei promotori

Il “Promotore perfetto” (?)Il “Promotore perfetto” (?)

AAATAAAATTTTTAAn..nTTGACAnnn…nnnTGnTATAATnnattAAn

Riconosciuto dalla subunità Riconosciuti dalla subunità

4-6nt14nt

17nt4-6nt

+1-10Ext.-35UP element

Come si ferma una macchina in corsa? Il terminatore

Terminazione “intrinseca” (rho-indipendente)

Terminazione dipendente dal fattore Rho (

Operoni: gruppi di geni parte di una unica unità trascrizionale

L’organizzazione di geni in operoni è tipica dei Bacteria.

Il numero di geni presente in un operone è variabile (2-15 geni)

Generalmente i geni di un operone codificano per proteine con funzioni correlate tra loro (es. enzimi di una stessa via metabolica)

Operoni: gruppi di geni parte di una unica unità trascrizionale e controllati da un

unico promotore

= presenza di un promotore

La trascrizione negli Archaea

• Somiglianze con eucarioti • Maggiore complessità dell’RNA polimerasi

(circa 12 subunità assemblate in modi alternativi)– introni presenti in alcuni geni– Insensibilità a rifampicina e ad altri antibiotici che

inibiscono la trascrizione dei batteri

• Ma anche…..somiglianze con i procarioti – mRNA policistronico