caracterizaÇÃo do extrato aquoso de alpiste (phalaris · 2018-08-27 · alpiste (doses de 250,...
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i
MICHELE CHRISTINE MACHADO DE OLIVEIRA
CARACTERIZAÇÃO DO EXTRATO AQUOSO DE ALPISTE (PHALARIS
CANARIENSIS L.) E AVALIAÇÃO DOS EFEITOS ANTIOXIDANTES E
HIPOGLICEMIANTES.
CAMPINAS
2015
ii
iii
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Faculdade de Engenharia de Alimentos
MICHELE CHRISTINE MACHADO DE OLIVEIRA
CARACTERIZAÇÃO DO EXTRATO AQUOSO DE ALPISTE (PHALARIS
CANARIENSIS L.) E AVALIAÇÃO DOS EFEITOS ANTIOXIDANTES E
HIPOGLICEMIANTES.
Dissertação apresentada à Faculdade
de Engenharia de Alimentos da
Universidade Estadual de Campinas
como parte dos requisitos exigidos
para obtenção do título de Mestra em
Ciência de Alimentos.
Orientador: PROF. DOUTOR MARCELO ALEXANDRE PRADO
Co-orientadora: DOUTORA DÉBORA BARBOSA VENDRAMINI COSTA
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL
DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA
MICHELE CHRISTINE MACHADO DE OLIVEIRA E
ORIENTADA PELO PROF. DR. MARCELO ALEXANDRE PRADO
ASSINATURA DO ORIENTADOR
_________________________
CAMPINAS
2015
iv
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca da Faculdade de Engenharia de Alimentos
Claudia Aparecida Romano - CRB 8/5816
Oliveira, Michele Christine Machado de, 1984-
OL4c Caracterização do extrato aquoso de alpiste (Phalaris canariensis L.) e
avaliação dos efeitos antioxidantes e hipoglicemiantes. / Michele Christine
Machado de Oliveira. – Campinas, SP : [s.n.], 2015.
Orientador: Marcelo Alexandre Prado.
Coorientador: Débora Barbosa Vendramini Costa.
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de
Engenharia de Alimentos.
1. Phalaris canariensis L.. 2. Atividade antioxidante. 3. Diabetes. 4.
Estreptozotocina. I. Prado, Marcelo Alexandre. II. Costa, Débora Barbosa
Vendramini. III. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia de
Alimentos. IV. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Characterization of aqueous extract of canary seed (Phalaris
canariensis L.) and evaluation of antioxidant and hypoglycemic effects.
Palavras-chave em inglês:
Phalaris canariensis L.
Antioxidant activity
Diabetes
Streptozotocin
Área de concentração: Ciência de Alimentos
Titulação: Mestra em Ciência de Alimentos
Banca examinadora:
Marcelo Alexandre Prado [Orientador]
Mary Ann Foglio
Severino Matias de Alencar
Data de defesa: 02-07-2015
Programa de Pós-Graduação: Ciência de Alimentos
v
BANCA EXAMINADORA
____________________________
Prof. Dr. Marcelo Alexandre Prado
FEA/UNICAMP
Presidente
____________________________
Dra. Mary Ann Foglio
CPQBA
Membro
____________________________
Prof. Dr. Severino Matias de Alencar
ESALQ/USP
Membro
____________________________
Dra. Cínthia Baú Betim Cazarin
POSDOC- DEPAN – FEA
Membro
____________________________
Dr. João Ernesto de Carvalho
CPQBA/UNICAMP
Membro
vi
vii
ABSTRACT
Studies concerning the application of antioxidant compounds from food in the prevention
or control of non-transmissible diseases attracted attention of the scientific community and
population in general, as theses studies open new possibilities for the discovery of new
bioactive compounds. Among foods that contain natural antioxidants, the seeds are an
important source of dietary supply. Among the seeds used by the population for medicinal
purposes is the canary seed (Phalaris canariensis L.), traditionally used as an alternative
treatment of diabetes, however there are only few studies concerning the biological actions
of this specie. Thus, the aim of this study was to evaluate the chemical composition and the
antioxidant and hypoglycemic activities of the aqueous extract from canary seed. The
chemical composition of the extract and seeds was performed according to the
methodology and standards of AOAC and Adolfo Lutz Institute. The used to evaluate the
antioxidant activity were ABTS (2,2'-azino-bis-3-etilbenzotriasolina- 6-ácido sulfônico),
DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) and ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity).
For the evaluation of the hypoglycemic activity, the streptozotocin-induced diabetes model
was conducted (STZ, single dose of 60 mg/kg, intraperitoneal route) in male Wistar rats,
which were randomly divided into groups of 10 animals, such as: sham (healthy animals,
non-diabetic), negative control (diabetic, untreated), treated with aqueous extract from
canary seeds (250, 500 and 1000 mg/kg, oral route, daily) and non-diabetic treated with
1000 mg/kg of the extract. Two protocols were performed: treatments for 28 days and for
87 days. In both experiments, the animals were weekly monitored for body weight,
glycemia and consumption of food and water. In the end of the experiments, organs were
removed and weighted and blood and urine were collected for biochemical, electrolytic and
histopathological evaluations, in order to evaluate the action of the aqueous extract of
canary seeds in diabetes. Results obtained for seeds obtained from two different lots and for
the extract were: humidity and dry residue (10.31%; 9.50%; 78.21%), ash (6%; 5.30%;
1.74%), proteins content (14.88%; 15.12%; 18.26%), lipid content (5.38%; 5.17%; 2.07%),
starch content (50.54g/100g; 48.04g/100g; 3.79g/100g) and total fibers (18.88g/100g;
17.29g/100g; 0.70g/100g). Fatty acids were predominantly: palmitic acid (12%) and
polyunsaturated: linoleic (53%), oleic (28%), linolenic (3%). Total phenolic compounds
(280.15 ± 3.05 µg EAG/g) and antioxidant activity: ABTS (228.93 ± 2.25µg eqtrolox/g),
DPPH (106.17 ± 6.69 µg eqtrolox/g) and ORAC (1177.37 ± 5.32 µM/g in the hydro
fraction and 147.79 ± 0.48 µM/g in the lipidic fraction). In sum, the aqueous extract from
canary seeds showed a nutritional potential and presented intermediate antioxidant activity.
Treatments with the extract in the experimental doses did not control the glycemic levels,
as wells as had no effects in the body weight, consumption of food and water and in any of
the biochemical and hematological evaluations, thus evidencing that the aqueous extract
from canary seeds does not have antidiabetogenic effects.
Keywords: Phalaris canariensis L., Canary seed, Diabetes, Antioxidants, Phenolic
Compounds, Biological Activity.
viii
ix
RESUMO
Estudos envolvendo compostos antioxidantes presentes em alimentos e a prevenção ou
controle de algumas doenças não transmissíveis têm chamado a atenção da comunidade
científica e da população em geral, considerando que esses estudos abrem novas
possibilidades para a descoberta de novas substâncias bioativas. Entre os alimentos que
contém antioxidantes naturais, as sementes constituem uma importante fonte de suprimento
dietético. Dentre as sementes utilizadas pela população para fins medicinais está o alpiste
(Phalaris canariensis L.), tradicionalmente usado como tratamento alternativo para o
diabetes, porém são escassos os estudos científicos conduzidos com essa espécie. Dessa
forma, o objetivo desse estudo foi avaliar a composição química e a atividade antioxidante
e hipoglicemiante do extrato aquoso de alpiste. A composição das sementes e do extrato
aquoso foram realizados segundo as normas e metodologias da AOAC e Instituto Adolfo
Lutz. Os métodos empregados para a avaliação da atividade antioxidante foram o ABTS
(2,2'-azino-bis-3-etilbenzotriasolina- 6-ácido sulfônico), DPPH radical (2,2-difenil-1-
picrilhidrazil) e o ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity). A avaliação da atividade
hipoglicemiante foi realizada por meio do modelo de diabetes induzida por estreptozotocina
(STZ, dose única de 60 mg/kg, via intraperitoneal) em ratos Wistar machos, que foram
aleatoriamente distribuídos em grupos de 10 animais, sendo: sham (animais sadios não-
diabético); controle negativo (diabéticos não tratados), tratados com extrato aquoso de
alpiste (doses de 250, 500 e 1000 mg/kg, via oral) e não diabéticos tratados com a dose de
1000 mg/kg. Dois protocolos foram realizados: tratamentos por 28 dias e de longa duração
por 87 dias. Em ambos protocolos os animais foram monitorados semanalmente quanto a
massa corporal, glicemia e consumo de água e ração. No final dos experimentos os órgãos
foram removidos e pesados e sangue e urina foram coletados para avaliações bioquímicas,
hematológicas, eletrolíticas e histopatológicas, afim de constatar a ação do extrato aquoso
de alpiste no diabetes. Os resultados obtidos nas sementes de dois lotes e do extrato aquoso
foram respectivamente: umidade e resíduo seco (10,31%; 9,50%; 78,21%), cinzas (6%;
5,30%; 1,74%), proteínas (14,88%; 15,12%; 18,26%), lipídeos (5,38%; 5,17%; 2,07%),
amido (50,54g/100g; 48,04g/100g; 3,79g/100g) e fibras totais (18,88g/100g; 17,29g/100g;
0,70g/100g). Os ácidos graxos encontrados predominantes foram: ácido palmítico (12%) e
poli-insaturados: linoleico (53%), oleico (28%) e linolênico (3%). Compostos fenólicos
totais (280,15 ± 3,05 µg EAG/g) e Atividade Antioxidante: ABTS (228,93 ± 2,25µg
eqtrolox/g), DPPH (106,17 ± 6,69 µg eqtrolox/g) e ORAC (1177,37 ± 5,32 µM/g na fração
hidro e 147,79 ± 0,48 µM/g na lipo). O alpiste e seu extrato mostraram potencial nutritivo,
e o extrato apresentou atividade antioxidante intermediária. O tratamento com extrato
aquoso de alpiste nas doses experimentais não controlou os níveis glicêmicos, bem como
não apresentou efeitos sobre a massa corporal, consumo de água e ração e em nenhum dos
parâmetros bioquímicos e hematológicos avaliados, evidenciando que este extrato não
apresenta efeitos antiabetogênicos.
Palavras-chave: Phalaris canariensis L., Alpiste, Diabetes, Antioxidantes, Compostos
Fenólicos, Atividade Biológica.
x
xi
SUMÁRIO
BANCA EXAMINADORA ................................................................................................................ v
ABSTRACT ..................................................................................................................................... vii
RESUMO .......................................................................................................................................... ix
SUMÁRIO ........................................................................................................................................ xi
DEDICATÓRIA ............................................................................................................................ xvii
AGRADECIMENTOS .................................................................................................................... xix
LISTA DE ILUSTRAÇÕES ........................................................................................................... xxi
LISTA DE TABELAS .................................................................................................................... xxv
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS .................................................................................. xxvii
INTRODUÇÃO GERAL .................................................................................................................... 1
Capítulo I ............................................................................................................................................. 5
1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ........................................................................................................ 7
1.1 Alpiste (Phalaris canarienses L.) ................................................................................................... 7
1.1.1 Descrição Botânica ................................................................................................................... 11
1.1.2 Classificação Científica ............................................................................................................ 12
1.2 Alimento com Alegação Funcional ............................................................................................. 13
1.3 Radicias Livres e Estresse Oxidativo .......................................................................................... 14
1.4 Compostos Fenólicos .................................................................................................................. 17
1.5 Atividade Antioxidante ............................................................................................................... 23
1.5.1 Metodologias Antioxidantes in vitro ........................................................................................ 29
1.6 Diabetes Mellitus ........................................................................................................................ 30
1.6.1 Estresse Oxidativo e Diabetes Mellitus .................................................................................... 33
1.6.2 Estatísticas e Incidência ........................................................................................................... 35
1.6.3 Insulina ..................................................................................................................................... 38
1.6.4 Características e Estágios da Doença ....................................................................................... 39
1.6.5 Causas ...................................................................................................................................... 41
1.6.6 Sintomas e Diagnóstico ............................................................................................................ 45
1.6.7 Tratamento, Prevenção e Cura ................................................................................................. 49
2. JUSTIFICATIVA .......................................................................................................................... 55
3. OBJETIVO GERAL ..................................................................................................................... 55
3.1 Objetivos Específicos .................................................................................................................. 55
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................................... 56
xii
Capítulo II ......................................................................................................................................... 85
Resumo .............................................................................................................................................. 87
Abstract ............................................................................................................................................. 88
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................................ 89
2. MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................................................... 90
2.1 Reagentes e Equipamentos .......................................................................................................... 90
2.2 Obtenção da Matéria-Prima ........................................................................................................ 90
2.3 Preparação do Extrato de P. canariensis L. ................................................................................. 91
2.4 Caracterização das Sementes de Alpiste e Extrato Aquoso de Alpiste ....................................... 91
2.4.1 Determinação do Teor de Umidade.......................................................................................... 91
2.4.2 Determinação do Resíduo Seco ................................................................................................ 92
2.4.3 Determinação de Resíduo Mineral Fixo ................................................................................... 92
2.4.4 Determinação de Proteínas ....................................................................................................... 92
2.4.5 Determinação de Lipídeos ........................................................................................................ 93
2.4.6 Fibras ........................................................................................................................................ 94
2.4.7 Amido ....................................................................................................................................... 94
2.4.8 Determinação de Carboidratos ................................................................................................. 94
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................................. 94
4. CONCLUSÃO ............................................................................................................................ 106
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................................ 107
Capítulo III ...................................................................................................................................... 115
Resumo ............................................................................................................................................ 117
Abstract ........................................................................................................................................... 118
1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................................... 119
1.1 Mecanismos de Ação dos Antioxidantes................................................................................... 120
1.2 Métodos Utilizados na Avaliação da Capacidade Antioxidante ............................................... 121
1.2.1 Quantificação de Compostos Fenólicos Totais ...................................................................... 123
1.2.2 Método ABTS (2,2'-azino-bis (3-etilbenzotriasolina) 6-ácido sulfônico) .............................. 123
1.2.3 Método DPPH ........................................................................................................................ 125
1.2.4 Método ORAC (Capacidade de Absorção do Radical Oxigênio) .......................................... 127
2. MATERIAIS E MÉTODOS ....................................................................................................... 129
2.1 Reagentes e Equipamentos ........................................................................................................ 129
2.2 Preparo do Extrato ..................................................................................................................... 130
2.3 Determinação de Compostos Fenólicos Totais ......................................................................... 130
2.4 ABTS......................................................................................................................................... 131
xiii
2.5 DPPH......................................................................................................................................... 131
2.6 ORAC ........................................................................................................................................ 132
2.6.1 Fração Hidrofílica .................................................................................................................. 132
2.6.2 Fração Lipofílica .................................................................................................................... 133
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................................ 134
3.1 Teor de Fenólicos Totais ........................................................................................................... 134
3.2 ABTS......................................................................................................................................... 140
3.3 DPPH......................................................................................................................................... 141
3.4 ORAC ........................................................................................................................................ 141
4. CONCLUSÃO ............................................................................................................................ 148
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................................ 149
Capítulo IV ...................................................................................................................................... 163
Resumo ............................................................................................................................................ 165
Abstract ........................................................................................................................................... 166
1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................................... 167
2. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................................ 172
2.1 Reagentes e Equipamentos ........................................................................................................ 172
2.2 Preparo do Extrato Aquoso de Sementes de P. canariensis L. .................................................. 173
2.3 Animais ..................................................................................................................................... 173
2.4 Análise de Toxicidade Dose Única ........................................................................................... 174
2.5 Indução de Diabetes Experimental por Estreptozotocina .......................................................... 175
2.6 Experimento I: 28 dias - Delineamento Experimental .............................................................. 176
2.7 Tratamentos ............................................................................................................................... 177
3. AVALIAÇÕES ........................................................................................................................... 177
3.1 Glicemia .................................................................................................................................... 178
3.2 Consumo Alimentar, de Água e Controle de Massa Corporal .................................................. 178
3.3 Eutanásia dos Animais e Coleta de Sangue............................................................................... 179
3.3.1 Análises Bioquímicas ............................................................................................................. 181
3.3.2 Hemoglobina Glicada ............................................................................................................. 183
3.3.3 Análises de Eletrólitos na Urina e Sangue ............................................................................. 184
3.3.4 Avaliação Histopatológica ..................................................................................................... 185
4. EXPERIMENTO II: 87 dias ....................................................................................................... 186
4.1 Delineamento Experimental ...................................................................................................... 186
4.2 Tratamentos ............................................................................................................................... 186
4.3 Avaliações ................................................................................................................................. 186
xiv
4.3.1 Análises Bioquímicas ............................................................................................................. 187
4.3.2 Hemoglobina Glicada ............................................................................................................. 187
4.3.3 Análises de Eletrólitos na Urina e Sangue e Avaliação Histopatológica ............................... 187
4.4 Análise Estatística ..................................................................................................................... 187
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................................ 188
5.1 Análise de Toxicidade Aguda ................................................................................................... 188
5.2 Avaliação do Extrato Aquoso de Sementes de Alpiste em Modelo Experimental de Diabetes
Induzida por Estreptozotocina – Teste de 28 dias ........................................................................... 188
5.2.1 Massa Corporal ...................................................................................................................... 189
5.2.2 Glicemia ................................................................................................................................. 191
5.2.3 Consumos de Ração, Água e Poliúria .................................................................................... 193
5.2.4 Análises Bioquímicas ............................................................................................................. 196
5.2.5 Hemograma e Hemoglobina Glicada ..................................................................................... 202
5.2.6 Análise de Eletrólitos ............................................................................................................. 206
5.2.7 Peso Relativo dos Órgãos ....................................................................................................... 211
5.2.8 Histopatologia ........................................................................................................................ 212
5.3 Avaliação do Extrato Aquoso de Sementes de Alpiste em Modelo Experimental de Diabetes
Induzida por Estreptozotocina – Teste de 87 dias. .......................................................................... 217
5.3.1 Massa Corporal ...................................................................................................................... 219
5.3.2 Glicemia ................................................................................................................................. 220
5.3.3 Consumo de Ração e Água .................................................................................................... 221
5.3.4 Análises Bioquímicas ............................................................................................................. 222
5.3.5 Hemograma e Hemoglobina Glicada ..................................................................................... 224
5.3.6 Análise de Eletrólitos ............................................................................................................. 225
5.3.7 Peso Relativo dos Órgãos ....................................................................................................... 227
5.3.8 Histopatologia ........................................................................................................................ 228
6. CONCLUSÃO ............................................................................................................................ 230
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................................ 231
CONCLUSÃO GERAL .................................................................................................................. 247
SUGESTÃO PARA TRABALHOS FUTUROS ............................................................................ 249
APÊNDICE ..................................................................................................................................... 251
ANEXO 1 ........................................................................................................................................ 253
ANEXO 2 ........................................................................................................................................ 254
ANEXO 3 ........................................................................................................................................ 255
ANEXO 4 ........................................................................................................................................ 256
xv
"O futuro pertence àqueles que acreditam na beleza de seus sonhos"
Eleonor Roosevelt
"Que seu remédio seja seu alimento, e que seu alimento seja seu remédio"
Hipócrates
“Ao se propor buscar novos conhecimentos e desvendar caminhos
alternativos tem-se a certeza de descobertas reveladoras”
RIEDER; GUARIM NETO, 2012.
xvi
xvii
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho aos meus familiares em especial aos
meus pais Eliana e Marco, que sempre me incentivaram
em estudar mais e mais, minha querida mãe pelo amor,
dedicação e apoio incondicional ao longo de toda a minha
vida; ao meu namorado Matheus que soube respeitar e
entender minha ausência para conclusão desse trabalho, a
minha avó Filomena in memória que demonstrava muito
orgulho de sua netinha e deixa enormes saudades, sei que
estará sempre torcendo por mim, também dedico as
pessoas da minha família que adquiriram ao longo da
vida Diabetes, por vocês e para todos aqueles que sofrem
com ela, pequenos passos curiosos pensando na busca de
uma vida melhor...
xviii
xix
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus, por não me deixar desistir de meus objetivos nos momentos
difíceis e de desanimo, pela força, benção e principalmente pelo dom da vida.
À Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), instituição na qual, lutei muito
para fazer parte, onde tive o privilégio de cursar a pós graduação.
Agradeço ao meu orientador, Prof. Dr. Marcelo Alexandre Prado e minha co-
orientadora Dra. Débora Barbosa Vendramini Costa pela atenção, paciência e
conhecimentos transmitidos.
Ao CPQBA – Centro Pluridisciplicar de Pesquisas Químicas, Biológicas e
Agrícolas e a pessoa incrível do prof. Dr. João Ernesto de Carvalho em abrir as portas de
suas instalações e ceder materiais para desenvolvimento desse trabalho.
Ao pessoal do CPQBA da divisão de Farmacologia e Toxicologia, a qual levarei em
meu coração, pelas amizades e ajudas: Sirlene, Karin, Ana Lúcia, Vanessa, Lucas, Thais,
Janderson, principalmente à Michelle Pedroza Jorge que me ensinou e auxiliou muito neste
trabalho.
Agradeço aos professores e seus auxiliares João Ernesto de Carvalho, Juliana
Azevedo Lima Pallone, Daniel Barrera Arellano, Glaucia Maria Pastore, Sirlene Valerio
Tinti, Renato Grimaldi, Marcella Ap. Stahl, Iramaia Angelica Neri-Numa pelos auxílios
técnicos, fatores essenciais no sucesso desta dissertação.
Agradeço aos meus amigos do laboratório: Sheila, Janclei, Danilo, Pollyane,
Allisson, Gustavo, Alane e o sempre, sempre Seu Dirceu, a todos obrigada pela atenção,
carinho, pelos momentos de risadas que pude compartilhar com todos vocês e é claro a
imensa ajuda e conhecimentos transmitidos durante todo desenvolvimento deste trabalho.
Agradeço à minha família, em especial a minha mãe, meu pai e meu namorado,
Matheus, pela compreensão em momentos que precisei estar ausente para que o meu
trabalho fosse feito com sucesso e, principalmente, por me encorajar a seguir meus sonhos.
Aos membros da banca examinadora, pelas contribuições, sugestões e atenção
dedicadas ao aperfeiçoamento deste trabalho.
À FUNCAMP pelo auxílio financeiro na compra de materiais.
À CAPES pela concessão da bolsa de mestrado.
Em geral, a todos que aqui não citei, mas que de certa forma colaboraram e
estiveram presentes ao longo deste trabalho com os quais vivi momentos maravilhosos
durante o decorrer de todo o curso, em fim a todos o meu sincero, MUITO
OBRIGADA!!!!!!
xx
xxi
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Principais países exportadores de alpiste...........................................................................10
Figura 2. Principais países importadores...........................................................................................10
Figura 3. Aspectos gerais do alpiste A e B; C, D e F Phalaris canariensis. E Representação do
tamanho do grão de alpiste.................................................................................................................13
Figura 4. Processo de formação dos EROs.......................................................................................15
Figura 5. Esquema ilustrativo demonstrando os alvos das espécies reativas de oxigênio (EROs): as
proteínas, os lipídeos e o DNA...........................................................................................................16
Figura 6. Principais causas e consequências da ação dos radicais livres..........................................16
Figura 7. Ciclo biossintético dos metabólitos secundários................................................................18
Figura 8. Estruturas químicas do ácido ferúlico, cafeico e p-cumárico............................................23
Figura 9. Fontes de espécies reativas e mecanismos de defesa.........................................................24
Figura 10. Maiores vias de produção de radicais livres e defesas antioxidantes enzimáticas e não-
enzimáticas. NOS: óxido nítrico sintase; ERNs: espécies reativas de nitrogênio; SOD: superóxido
dismutase; CAT: catalase; GPx: glutationa peroxidase; GR: glutationa redutase; GSH: glutationa;
GSSH: glutationa oxidada; NADPH: nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato...........................26
Figura 11. Esquemas dos principais mecanismos de reação dos ensaios de capacidade antioxidante
total. A: Mecanismo de transferência de átomo de hidrogênio (HAT); B: Mecanismo de
transferência de um elétron (SET)......................................................................................................27
Figura 12. Eventos metabólicos que levam a hiperlgicemia, num estado pós absortivo no diabetes
mellitus não controlada.......................................................................................................................31
Figura 13. Estresse oxidativo a partir do sobrepeso e o sedentarismo..............................................35
Figura 14. Classificação Etiológica do Diabetes Melittus.................................................................41
Figura 15. Extrato aquoso de sementes de alpiste após centrifugação...........................................100
Figura 16. Cromatograma GC (perfil de ácidos graxos) do extrato aquoso de sementes (A) de
alpiste (Phalaris canariensis). Os principais picos e tempos de retenção relativos: ácido palmítico
(C16:0): 24.448 min.; ácido oleico (C18:1): 28.129 min.; ácido linoleico (C18:2): 29.090 min.....102
Figura 17. Cromatograma GC (perfil de ácidos graxos) do extrato aquoso de sementes (B) de
alpiste (Phalaris canariensis). Os principais picos e tempos de retenção relativos: ácido palmítico
(C16:0): 24.432 min.; ácido oleico (C18: 1): 28,113 min. ácido linoleico (C18:2): 29.071............102
Figura 18. Reações com cátion radical ABTS.................................................................................124
Figura 19. Reações com DPPH.......................................................................................................126
Figura 20. Reação ORAC................................................................................................................127
xxii
Figura 21. Curva padrão de ácido gálico para quantificação de compostos fenólicos totais..........135
Figura 22. Curva padrão de trolox % Desativação ABTS em 6 minutos........................................140
Figura 23. Curva padrão de trolox para quatificação da atividade antioxidante por DPPH (% de
Desativação).....................................................................................................................................141
Figura 24. Curva Trolox Hidrofilico - tampão fosfato de potássio 75mM pH 7.4......................... 142
Figura 25. Curva Trolox Lipofílico - RMCD 7%............................................................................142
Figura 26. Estrutura química da Estreptozotocina..........................................................................169
Figura 27. Esquema ilustrativo da ação da estreptozotocina na célula β do pâncreas....................170
Figura 28. Sequência do preparo do extrato aquoso de alpiste.......................................................173
Figura 29. Condições ambientais dos grupos do estudo: A. Estantes com as gaiolas experimentais.
B. Gaiola experimental com cama de maravalha e animais em estudo............................................174
Figura 30. Análise de toxicidade aguda em ratos Wistar macho tratados com extrato aquoso de
sementes de alpiste...........................................................................................................................175
Figura 31. A. Gaiola do jejum. B. Administração intraperitoneal de estreptozotocina para indução
de diabetes........................................................................................................................................175
Figura 32. Disposição dos grupos, bebedouros e rações controlados.............................................176
Figura 33. A. Animal imobilizado. B. Gavagem do extrato aquoso de sementes de alpiste...........177
Figura 34. Coleta de sangue através da cauda do animal e leitura em glicosímetro...................... 178
Figura 35. Controle do consumo alimentar e massa corporal dos animais.....................................179
Figura 36. Analisador hematológico pocH-100 iν Diff...................................................................180
Figura 37. Centrifugação do sangue para obtenção do soro e Reflotron analisador automatizado
para análises bioquímicas.................................................................................................................180
Figura 38. Animais em jejum, necropsia e pesagem dos órgãos.....................................................181
Figura 39. Etapas para dosagem de hemoglobina glicada...............................................................184
Figura 40. Coleta de urina e o Aparelho 9180 Electrolyte Analyser...............................................185
Figura 41. Remoção do pâncreas e análise histopatológica dos órgãos (fígado, rins e pâncreas)..185
Figura 42. Variação da massa corporal durante o estudo de 28 dias...............................................190
Figura 43. Pesagem dos animais.....................................................................................................190
Figura 44. Consumo de ração durante as 4 semanas de experimento (28 dias)..............................194
Figura 45. Consumo de água durante as 4 semanas de experimento (28 dias)...............................195
Figura 46. Comparação das camas de maravalha quanto à poliúria................................................196
Figura 47. Principais alterações encontradas nas análises histopatológicas do Pâncreas, Fígado e
Rins. A: Pâncreas: hiperplasia da ilhota pancreática (400x); B: Pâncreas: microcistos (400x); C:
Pâncreas: necrose, apoptose e fibrose (200x); D: Diminuição do tamanho das ilhotas pancreáticas;
xxiii
E: Fígado: ectasia ductal (100x); F: Figado: fibrose portal leve (400x); G: Figado: infiltrado leve
sinusoidal (400x); H: Rim: leves alteraçoes degenerativas do epitélio tubular (400x)....................216
Figura 48. Comparação entre os tamanhos dos ratos diabéticos (menores) e não diabéticos
(maiores)...........................................................................................................................................217
Figura 49. Avaliação oftalmoscópica e comparação dos animais sem alterações e com cataratas.219
Figura 50. Variação de massa corporal durante o estudo de 87 dias...............................................220
Figura 51. Consumo de ração pelos animais ao longo de 12 semanas (87 dias).............................221
Figura 52. Consumo de água pelos animais ao longo de 12 semanas (87 dias)..............................222
xxiv
xxv
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Composição centesimal de sementes de Phalaris canariensis e seu extrato aquoso (%).95
Tabela 2. Perfil de ácidos graxos presente na fração lipídica do extrato aquoso de Phalaris
canariensis – semente A e B............................................................................................................101
Tabela 3. Resultados obtidos do conteúdo de fenólicos totais........................................................135
Tabela 4. Resultados do extrato aquoso de sementes de alpiste no sequestro do radical ABTS•....140
Tabela 5. Habilidade do extrato aquoso de sementes de alpiste no sequestro do radical DPPH•....141
Tabela 6. Resultados ORAC............................................................................................................142
Tabela 7. Resultados do potencial antioxidante de padrões de referência......................................143
Tabela 8. Efeito do tratamento com extrato aquoso de sementes de alpiste sobre os níveis de glicose
no sangue em animais diabéticos e controle, durante 28 dias de experimento................................192
Tabela 9. Efeito do extrato aquoso de sementes de alpiste em parâmetros bioquímicos................197
Tabela 10. Efeito do extrato aquoso de sementes de alpiste em parâmetros hematológicos...........203
Tabela 11. Avaliação dos eletrólitos no sangue e na urina dos grupos testados.............................207
Tabela 12. Efeito do extrato aquoso de sementes de alpiste sobre o peso relativo dos órgãos dos
animais induzidos ou não com STZ.................................................................................................211
Tabela 13. Avaliação das alterações nos olhos dos animais do experimento de 87 dias................219
Tabela 14. Efeito do tratamento com extrato aquoso de sementes de alpiste sobre os níveis de
glicose no sangue em animais diabéticos e controle, durante 87 dias de experimento....................221
Tabela 15. Efeito do extrato aquoso de sementes de alpiste em parâmetros bioquímicos..............222
Tabela 16. Efeito do extrato aquoso de sementes de alpiste em parâmetros hematológicos...........224
Tabela 17. Avaliação dos eletrólitos no sangue e na urina dos grupos testados.............................225
Tabela 18. Efeito do extrato de sementes de alpiste sobre o peso relativo dos órgãos dos animais do
experimento de 87 dias.....................................................................................................................227
xxvi
xxvii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AA – Atividade Antioxidante
AAPH – [2,2’-azobis(2’-metilproprionamidine) dihidrocloreto]
AAT – Atividade Antioxidante Total
Abs – Absorbância
ABTS – (2,2'-azino-bis-3-etilbenzotriasolina- 6-ácido sulfônico)
AGE – Produtos Finais de Glicação Avançada (Advanced Glycation End-
Products)
ALP – fosfatase alcalina
ALT (TGP) – alanina aminotransferase (transaminase glutâmico-pirúvica)
AOAC – Association of Official Analytical Chemists
AST (TGO) – aspartato aminotransferase (transaminase glutâmico-oxalacética)
ATP – Adenosina Trifosfato
AUC – Area Under the Fluorescence Decay Curve
B-PE – proteínas B-ficoeritrina
BU – Base Úmida
CEMIB – Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica
CG – Cromatografia Gasosa
CHCM – Concentração da Hemoglobina Corpuscular Média
COBEA – Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
CPQBA – Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas
DACNT – Doenças e Agravos Crônicos Não Transmissíveis
DCNT – Doenças Crônicas Não-Transmissíveis
DM – Diabetes Mellitus
DM1 – Diabetes Mellitus tipo 1
DM2 – Diabetes Mellitus tipo 2
DNA – Ácido Desoxirribonucleico
DPPH – radical 2,2 difenil-1-pricril-hidrazil
EA – Extrato Aquoso
EAG – Equivalente de ácido gálico
EDTA – Ácido etilenodiamina tetracético
ERNs – Espécies Reativas de Nitrogênio
EROs – Espécies Reativas de Oxigênio
FDA – Food and Drug Administration
FEA – Faculdade de Engenharia de Alimentos
FEC – Fluido Extracelular
GA – glicolaldeído
GAE – Equivalente de ácido gálico
GGT – Gama-Glutamil Transferade, Gama-Glutamil transferase
GHb – Ácido Gama hidroxibutírico
GLUT2 – Transportador de Glicose tipo 2
GSH – glutationa reduzida
HAD – Hormônio Anti Diurético
HAT – Tranferência de Átomos de Hidrogênio (Hydrogen Atom Transfer)
Hb – hemoglobina
xxviii
HbA – Hemoglobina A
HbA1 – Hemoglobina glicada
Hb-G – Hemoglobina G
Hb-rápida – Hemoglobina rápida
Hb total – Hemoglobina total
HCM – Hemoglobina Corpuscular Média
HDL – lipoproteína de alta densidade
HHA – hipotálamo-hipofisário-adrenal
HPLC – High Performance Liquid Chromatography
Ip – intraperitoneal
LDL – lipoproteína de baixa densidade
LEC – Líquido Extracelular
LIC – Líquido Intracelular
NAD – Nicotinamida Adenina Dinucleotideo
NADPH - adenina dinucleotídeo fosfato reduzida
OH· – Hidroxila
OMS – Organização Mundial de Saúde
ORAC – Capacidade de Absorção do Radical Oxigênio (Oxygen Radical Absor-
bance Capacity)
PLT- plaquetas
PTH – paratormônio
RBC – contagem de glóbulos vermelhos / hemácias
RMCD – Ciclodextrina Metilada Randomizada a 7%
R-PE – proteínas R-ficoeritrina
RPM – rotações por minuto
SBD – Sociedade Brasileira de Diabetes
SET – Transferência de Um Elétron (Single Electron Transfer)
STZ – Estreptozotocina
TE – Trolox Equivalente (Trolox Equivalent)
TEAC – Atividade Antioxidante Total Equivalente ao Trolox
TPC – Conteúdo Total de Fenólicos
UI/L – Unidades Internacionais por Litro
UNICAMP – Universidade Estadual de Campinas
UV – Ultravioleta
VCM – Volume Corpuscular Médio
VLDL - lipoproteína de muito baixa densidade
V.O. – Via Oral
ω – ômega
1
INTRODUÇÃO GERAL
Desde 1996 tem-se observou-se a ocorrência em muitos países, inclusive no Brasil,
de um processo denominado transição epidemiológica, ou seja, uma significativa redução
nas doenças infecciosas e um grande aumento nas chamadas enfermidades crônico-
degenerativas (obesidade, diabetes, cardiovasculares, entre outras) não transmissíveis. Toda
essa mudança foi atribuída, principalmente, à modificação no padrão alimentar e no estilo
de vida (FRIAS, 1996).
As Doenças Crônicas Não-Transmissíveis (DCNT) são um dos maiores problemas
de saúde pública da atualidade. Estimativas da Organização Mundial de Saúde (OMS)
mostram que as DCNT são responsáveis por 63% dos 36 milhões de óbitos ocorridas no
mundo em 2008 (WHO, 2011a; BRASIL, 2011). No Brasil, as DCNT são igualmente
importantes, sendo responsáveis, em 2007, por 72% do total de mortes, com destaque para
as doenças do aparelho circulatório (31,3% dos óbitos), neoplasias (16,3%) e diabetes
(5,2%) (SCHMIDT et al., 2011; BRASIL, 2011).
De acordo com a OMS, um pequeno conjunto de fatores de risco responde pela
grande maioria das mortes por DCNT e por fração substancial da carga de doenças devido a
essas enfermidades. Dentre esses fatores, destacam-se o tabagismo, o consumo excessivo
de bebidas alcoólicas, dietas inadequadas e a inatividade física (WHO, 2011a; BRASIL
2011).
As alterações na estrutura da dieta, associadas a mudanças econômicas, sociais e
demográficas e suas repercussões na saúde populacional, vêm sendo observadas em
diversos países em desenvolvimento (POPKIN, 2001).
Em países em que anos atrás, verificava-se o consumo de dietas ricas em cereais,
leguminosas, frutas e verduras (ricas em fibras), com a modernização e o alto grau de
urbanização, favoreceu o aumento do consumo de dietas ricas em alimentos de origem
animal, assim como alimentos processados (ricos em gorduras e pobre em fibras). Como
consequência, houve aumento de moléstias tidas como típicas de sociedades desenvolvidas,
tais como: obesidade, constipação, hemorróidas, diverticulites, síndromes isquêmicas
miocárdicas, colesterolemia, diabetes, entre outras (FRIAS, 1996).
A tendência da falta de tempo do homem tem encurtado aquele dedicado às
refeições, o que tem implicações sobre o tipo de alimento a ser consumido. O consumo de
2
alimentos in natura é cada vez menor e vem sendo substituído pelos processados, com alto
teor energético (FERREIRA, 2010). Sobretudo, percebe-se que o Brasil enfrenta uma
transição nutricional negativa: o arroz com feijão, a alimentação diária do brasileiro, vem
sendo substituída por alimentos processados, industrializados, com excesso de gorduras, e
não saudáveis (BRAUNER; FURLAN, 2014).
Ao longo dos anos, as observações populares conduziram ao acúmulo de
informações relevantes sobre a eficácia e os efeitos medicinais das plantas. Todo este
conhecimento continua sendo válido para estimular o uso dos vegetais como
medicamentos, além de despertar grande interesse por pesquisas que conduzam à
identificação de substâncias naturais bioativas. Estima-se que cerca de 75% dos compostos
puros naturais empregados na indústria farmacêutica foram isolados seguindo
recomendações da medicina popular (YUNES; PEDROSA e CECHINEL FILHO, 2001;
BERTOLDI, 2006).
Muitos destes estudos visam a extração e identificação de antioxidantes naturais de
fontes vegetais, avaliação de suas propriedades biológicas, determinação de sua atividade
antioxidante in vitro e in vivo, estudo de sua aplicabilidade em produtos processados e
determinação de como o seu conteúdo e atividade são influenciados pelo cultivar,
maturidade, sazonalidade, práticas e período de colheita, procedimentos pós-colheita,
tecnologias de processamento e condições de processamento (ARABBI; GENOVESE e
LAJOLO, 2004; ALASALVAR et al., 2005; BERTOLDI, 2006).
As vantagens do consumo de grãos integrais e a crescente demanda por alimentos
com alegações funcionais têm levado pesquisadores a estudar outros grãos que possam
conferir benefícios semelhantes, e que ainda não foram explorados. Este é o caso do alpiste,
um pequeno grão elíptico que cresce em condições semelhantes às do trigo, e que desde
1997 tem sido avaliado como alimento humano e como ingrediente funcional na indústria
de alimentos (HUCL, 2001 apud GRAJEDA, et al., 2012; ABDEL-AAL et al., 1997).
Dentre os responsáveis pelos efeitos benéficos das sementes estão os compostos
fenólicos, que tem sido amplamente estudados, quanto às suas propriedades e seu potencial
antioxidante, atuando na prevenção de doenças degenerativas (VERMA et al., 2008;
DIMBERG et al., 1993; apud GRAJEDA, et al., 2012; DYKES; ROONEY, 2006; DE LA
PARRA et al., 2007; LÓPEZ-MARTÍNEZ et al., 2011), tais como as doenças
3
cardiovasculares, doença de Alzheimer e diabetes (ZHAO & MOGHADASIAN, 2008;
GRAJEDA, et al., 2012).
Os níveis aumentados de glicose circulante no diabetes resultam no aumento da
produção de espécies reativas de oxigênio, que impõe uma situação patológica de estresse
celular, aumentando a necessidade do equilíbrio entre os componentes pró e antioxidantes
(BROWNLEE, 2005). Nesse sentido, por ser uma fonte de substâncias nutritivas e
antioxidantes as sementes de alpiste poderiam contribuir no controle desse desequilíbrio
oxidativo. De fato, existem diversos relatos informais sobre o uso do extrato aquoso de
alpiste, popularmente conhecido como “leite de alpiste” no controle da glicemia em
indivíduos diabéticos, porém não existem estudos científicos que comprovem tais efeitos.
Dessa forma, considerando a escassez de informações científicas acerca do uso do
alpiste como grão para consumo humano e a importância da busca por novas alternativas no
tratamento de moléstias incidentes não apenas na população brasileira, mas também na
maioria dos países industrializados propõem-se a realização do presente estudo, tendo por
objetivos fornecer informações científicas sobre o uso do extrato aquoso de alpiste (P.
canariensis L.) no controle da glicemia em modelo experimental de diabetes em ratos, além
da avaliação de suas propriedades antioxidantes e do conteúdo de compostos fenólicos
totais.
4
5
Capítulo I
UMA REVISÃO SOBRE ALPISTE (PHALARIS CANARIENSIS
L.), ALIMENTO COM ALEGAÇÕES FUNCIONAIS,
RADICAIS LIVRES, ESTRESSE OXIDATIVO, COMPOSTOS
FENÓLICOS, ATIVIDADE ANTIOXIDANTE E DIABETES
MELLITUS
Michele Christine Machado de Oliveira1, Débora Barbosa Vendramini Costa2,
Marcelo Alexandre Prado1
1Departamento de Ciência de Alimentos, Faculdade de Engenharia de Alimentos,
Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), CP 6121, 13083-862, Campinas,
SP, Brasil. 2Departamento de Química Orgânica, Instituto de Química, Universidade
Estadual de Campinas (UNICAMP), CP 6154, 13083-970, Campinas, SP, Brasil.
6
7
1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.1 Alpiste (Phalaris canarienses L.)
Durante séculos, as diferentes culturas do mundo têm utilizado produtos naturais
como parte do acervo da medicina tradicional. Frente a isso, o uso de plantas medicinais,
seus extratos e princípios ativos vêm crescendo na assistência à saúde (VARANDA, 2006;
COSTA, 2011) em função de sua fácil aceitabilidade e disponibilidade. Dessa forma, os
interesses neste campo de pesquisa têm aumentado afim de reconhecer os reais benefícios
que possam proporcionar à saúde (VARANDA, 2006; BALUNAS et al., 2006; COSTA,
2011).
Diversos registros da OMS revelam que aproximadamente 80% da população
mundial já fez uso de algum tipo de planta com finalidade terapêutica. Dentro desses 80%,
pelo menos 30% das pessoas utilizam plantas medicinais por indicação médica (MARTINS
et al., 1992 apud BALBI, 2008). Estudos mostraram que 50 % dos medicamentos
aprovados entre 1981 e 2006, pelo Food and Drug Administration (FDA) dos Estados
Unidos, são direta ou indiretamente derivados de produtos naturais (FERREIRA e PINTO,
2010)
O uso de substâncias naturais para curar doenças tem sido uma prática antiga.
Comparado com compostos sintéticos, produtos naturais contém de forma inerente uma
ampla diversidade estrutural e desempenham um papel chave na descoberta de compostos
para novas pesquisas de drogas (NEWMAN, 2012).
A necessidade de desenvolvimento de novos fármacos para tratamento de doenças é
urgente e demanda uma vasta investigação e exploração das possibilidades, sendo a
natureza parte fundamental neste processo de busca, no qual os produtos naturais são fonte
importante de novos agentes farmacêuticos e moléculas bioativas (CRAGG; NEWMAN,
2013).
P. canariensis, ou alpiste, é citado como agente diurético e hipotensor, havendo
relatos etnofarmacológicos do seu uso como agente redutor da pressão arterial, sendo as
sementes utilizadas na medicina popular em forma de chá como um coadjuvante no
tratamento da hipertensão, diabetes mellitus e hipercolesterolemia (NOVAS et al., 2004),
associado ou não a outras formas de terapia tradicional (MERZOUKI et al., 2003 apud
GUTIERREZ, 2014).
8
Esse efeito também foi verificado por Ribeiro et al., (1985), que observou um
aumento significativo da diurese em ratas após a administração do extrato alcoólico das
sementes de alpiste (P. canariensis), que pode estar relacionado a um possível efeito
vasodilatador (BALBI; CAMPOS; ALVES, 2008). O alpiste é considerado pelas
comunidades tradicionais como uma planta medicinal. Suas sementes têm sido utilizadas
para o tratamento e prevenção de doença renal e de hipercolesterolemia (RIBEIRO et al.,
1986; ALBUQUERQUE et al., 2007; WRIGHT et al., 2007; COGLIATTI, 2012). No
entanto, mais informações científicas são necessárias para corroborar estas propriedades.
Além disso, o consumo de grandes quantidades de alimentos com propriedades
diuréticas, como alpiste, pode resultar em redução dos níveis de sódio e de potássio no
organismo devido ao aumento da taxa de excreção desses íons. A menor quantidade de
potássio no organismo poderia causar situações como aumento da fraqueza muscular e
sensação de exaustão (ANNUAL CANARY GRASS PHALARIS-CANARIENSIS
CULTIVA, 2011 apud ORTIZ, 2012).
Popularmente usado como hipolipemiante, nas Ilhas Canárias é consumido como
aperitivo e também é considerado ótimo remédio para os males da urina, rins e bexiga, e
refrescante para as ondas de calor da menopausa (MARAVILLAS Y PROPIEDADES DEL
ALPISTE, 2011 apud ORTIZ, 2012), arteriosclerose, distúrbios do aparelho geniturinário
(cistite), hiperazotemia (abundância de substâncias nitrogenadas no sangue), hiperuricemia,
gota, hipertensão arterial, edema, excesso de massa corporal acompanhado por retenção de
líquidos, gastrites e úlcera (especialmente úlceras do estômago). Relata-se o uso externo
para tratamento de eczema (USOS MEDICINALES Y APLICACIONES CURATIVAS
DEL ALPISTE, 2011 apud ORTIZ, 2012).
Tradicionalmente, as sementes de alpiste, ou “canário” são também utilizadas como
remédio popular no tratamento do diabetes e hipertensão; no entanto, não existe nenhuma
informação científica sobre os possíveis responsáveis bioativos para tais efeitos
(CAMPBELL, 2009; ESTRADA-SALAS et al., 2014).
O alpiste é originalmente nativo do Mediterrâneo, mas é cultivado em várias partes
do mundo que possuam clima temperado, sendo predominante em campos de cultivos e
regiões de zonas ribeirinhas (PARODI, 1987 apud COGLIATTI, 2012). Esta planta é
introduzida como fornecedora de sementes para a alimentação de pássaros, sozinha ou
misturada com outros grãos, como milho, semente de girassol, linhaça e outros cereais
9
(COSCIA; CASTEDO, 1967; MIRAVALLES et al., 2002 apud COGLIATTI, 2012) além
de ornamental. Também é usada em sopas, doces, na produção de cola em indústrias têxteis
(REIZ, 1982 apud BALBI; CAMPOS; ALVES, 2008) e farinha em pão (REQUISITOS
PARA LA SOLICITUD DE INSCRIPCION, RENOVACION Y MODIFICACION EN EL
REGISTRO DE MEDICAMENTOS DE ORIGEN NATURAL DE USO HUMANO, 2012
apud ORTIZ, 2012). P. canariensis é a única espécie de seu gênero cultivado para
produção de grãos, os outros são utilizados principalmente como forrageiras. Ele é
considerado um cereal menor, com as práticas de produção e um ciclo de vida semelhante
ao de outras culturas de grãos de inverno, como o trigo de primavera (Triticum aestivum L.)
(ROBINSON, 1979 apud COGLIATTI, 2012).
O Canadá é o líder mundial na produção e exportação anual de alpiste, sendo a
semente o componente mais importante de misturas de alimentos em gaiolas e ração de
pássaros silvestres, devido a sua composição única aliado as características que fazem deste
um cereal promissor para alimentos e usos industriais (ABDEL-AAL & HUCL, 2005 apud
ABDEL-AAL et al., 2011; ABDEL-AAL; HUCL & SOSULSKI, 1997a); (ABDEL-AAL;
HUCL & SOSULSKI, 1997b apud ABDEL-AAL et al., 2011), podendo ser transformadas
em farinha e farelo, para uso humano (GRAY, 1997 apud SMALL, 1999). Grajeda et al.,
(2012) avaliou a composição química da farinha de alpiste, e constatou semelhança no teor
de proteínas entre gãos comuns, tais como a cevada, aveia e trigo e o tratamento alcalino
para grãos de alpiste, mostrou efeitos positivos sobre a farinha obtida, uma vez que mostrou
um teor mais elevado de proteína, uma baixa proporção de lisina/arginina
(hipocolesterolêmico) e uma quantidade de espículas consideravelmente menor.
Investigações nos últimos anos sobre a composição dos grãos de alpiste foram
intensificados a fim de buscar novas utilizações industriais e alimentares, proporcionando
novos mercados. Possíveis usos para o consumo humano são de substituição da semente de
gergelim, amido e macarrão vermicelli (AGRICULTURE..., 2013). A seguir as Figuras 1 e
2 mostram os principais países exportadores e importadores de alpiste.
10
Figura 1. Principais países exportadores de alpiste.
Fonte: FAO, 2011.
Figura 2. Principais países importadores.
Fonte: FAO, 2011.
Mundialmente, alpiste é considerado uma cultura menor, em comparação com
outras espécies produtoras de grãos. Por exemplo, ao longo da década 2000 - 2009, a
produção mundial foi 242.621 toneladas por ano, em comparação com 142.930.946 e
615.415.472 toneladas para cevada e de trigo, respectivamente (FAO, 2011; COGLIATTI,
2012).
11
As sementes de alpiste não podem ser consideradas inócuas, pois possuem cascos
cobertos de pequenos pêlos ou espículas siliciosas (ABDEL-AAL et al., 1997;
COGLIATTI, 2012), que podem ser muito irritantes para a pele durante a colheita e
manuseio. Além disso, suas dimensões, composição e estrutura são semelhantes ao de
fibras que foram associadas com o desenvolvimento de câncer de esôfago em humanos
durante a ingestão (O'NEILL et al., 1980; COGLIATTI, 2012) e câncer de pele em ratos de
laboratório (MATUS-CÁDIZ; HUCL & VANDENBERG, 2003 apud LI, 2011).
A razão pela qual as aves sobrevivem ao consumo de alpiste apesar da toxicidade do
seu casco, é que elas retiram as sementes antes do consumo dos grumos (ABDEL-AAL;
HUCL e SOSULSKI, 1997; LI, 2011). Portanto, são necessários mais estudos sobre os
efeitos toxicológicos de espículas de alpiste, bem como viabilizar sua remoção por técnicas
genéticas ou de processamento (HOLT, 1988; PUTNAM et al., 1996; ROBINSON, 1978
apud ABDEL-AAL et al., 1997).
De acordo com a Universidade Nacional Autônoma do México o alpiste é
considerado como uma planta introduzida, detectada sem histórico de uso medicinal e
estudos para apoiar a sua eficácia química ou farmacológica (BIBLIOTECA DIGITAL DE
MEDICINA TRADICIONAL MEXICANA. UNAM. ALPISTE, 2011 apud ORTIZ, 2012).
1.1.1 Descrição Botânica
O alpiste é um tipo de grão proveniente da Família das Graminae Poaceae, do
Gênero Phalaris e da espécie canarienses, vulgarmente conhecidos como: canaryseed,
canarygrass anual, canário grama, alpista, alpiste, capim alpista e milho alpista. É do tipo
herbáceo atinge altura de aproximadamente 1 m, cujos talos são ocos e cilíndricos e
providos de nós, semelhantes ao bambu ou cana da Índia, com vários perfilhos e hábito de
crescimento ereto (PARODI, 1987 apud COGLIATTI, 2012). Isto coloca canarygrass
anual na mesma subfamília, mas diferente tribo, de trigo, cevada (Hordeum vulgare L.) e
centeio (Secale cereale L.) da tribo Triticale, ou aveia (Avena sativa L.) da tribo Aveneae
(PUTNAM et al., 1996 apud COGLIATTI, 2012). Suas folhas, flores e frutos, dispostos em
pequenas espigas, assemelhando-se às do trigo. O fruto tem aspecto brilhoso, de várias
cores envoltas com delicada casca lisa (PERIS; STÜBING; FIGUEIROLA, 1996). Sua
semente é pequena e elíptica e tem um comprimento de cerca de 3,9 - 5,1 mm e a sua
largura média situa-se entre 1,6 e 2,0 mm (HUCL et al., 2001 apud ALVARADO, 2013).
12
Alpiste tem um casco intacto, brilhante e amarela dourada, já o alpiste descascado é
de cor marrom escuro (PARODI, 1987 apud COGLIATTI, 2012; AGRICULTURE...,
2013).
Alpiste é uma cultura bem adaptada a dias longos quentes e noites frias.
Normalmente ele é cultivado com sucesso onde o trigo é cultivado (NORTON e FORD,
2002 apud COGLIATTI, 2012). Ele amadurece em aproximadamente 105 dias, sendo
enraizado, mais sensível ao calor e menos tolerante à seca, mantendo-se melhor em solos de
umidade abundantes e fértis (AGRICULTURE..., 2013).
1.1.2 Classificação Científica
Reino: Plantae
Sub-reino: Tracheobionta
Super-divisão: Spermatophyta
Divisão: Magnoliophyta
Classe: Liliopsida
Subclasse: Commelinidae
Ordem: Cyperales
Família: Poaceae
Sexo: Phalaris L.
Espécie: Phalaris canariensis L. (REQUISITOS PARA LA SOLICITUD DE
INSCRIPCION, RENOVACION Y MODIFICACION EN EL REGISTRO DE
MEDICAMENTOS DE ORIGEN NATURAL DE USO HUMANO, 2012 apud ORTIZ,
2012).
Nomes comuns em inglês: Canarygrass Anual, canarygrass comum.
Na Figura 3 é apresentado os aspectos gerais do alpiste.
13
Figura 3. Aspectos gerais do alpiste A e B FONTE: www.sito.regione.campania.it (ADAM; DUNCAN,
1999); C, D e F Phalaris canariensis. FONTE: PERIS; STÜBING; FIGUEIROLA, (1996); ADAM;
DUNCAN, (1999); E Representação do tamanho do grão de alpiste FONTE: USDA-NRCS PLANTAS
Database; ADAM, DUNCAN, (1999).
1.2 Alimento com Alegação Funcional
Lajolo (2005); Pereira (2009) relatam que alimentos funcionais, ou alimentos com
alegações de propriedades funcionais, ou de saúde, podem ser descritos como alimento
semelhante em aparência ao alimento convencional, consumidos como parte da dieta usual,
capazes de produzir efeitos metabólicos ou fisiológicos úteis na manutenção de uma boa
saúde física e mental, podendo auxiliar na redução do risco de doenças crônico-
degenerativas, além de suas funções nutricionais básicas. Complementando a definição, o
autor salienta ainda que pode-se falar em ingrediente funcional, que seria o composto
responsável pela ação biológica contida no alimento. Para estes ingredientes ativos os
termos mais adequados são fitoquímicos ou compostos bioativos.
Alimentos antioxidantes que, além de fornecerem benefícios à saúde, auxiliam na
redução do risco de doenças, são conhecidos como alimentos com alegações funcionais
(PENNINGTON, 2002).
Grãos contêm uma série de importantes compostos fitoquímicos, entre eles
compostos fenólicos, fitatos e lignanas. A adstringência dos taninos (característica química)
14
de muitos destes compostos pode proteger as plantas dos insetos e animais, mas em
alimentos, contribue com um gosto amargo indesejável (NACZK et al., 1998; LIU, 2007;
ABDEL-AAL, 2011). Os taninos também podem complexar com proteínas e aminoácidos
essenciais reduzindo o valor nutricional dos cereais (NACZK et al., 1998; ABDEL-AAL,
2011). Muitos compostos fenólicos têm potentes propriedades antioxidantes, que protegem
as plantas contra radicais destrutivos (LIU, 2007; ABDEL-AAL, 2011). Há evidências de
que o consumo de grãos integrais reduz substancialmente os riscos para doenças
aterosclerótica, cardiovascular e diabetes, sendo tal ação atribuída não somente às fibras,
mas também aos compostos fenólicos presentes no grão (JACOBS e GALLAHER, 2004;
BETIM, 2008).
Diversas pesquisas vêm sendo realizadas nos diferentes segmentos visando a
descoberta de novas fontes nutricionais. A importância funcional desses compostos na
saúde humana tem levado inúmeros pesquisadores a realizarem estudos buscando
determinar as concentrações destes compostos nos alimentos mais consumidos (PEREIRA,
2009).
1.3 Radicias Livres e Estresse Oxidativo
O termo radical livre pode ser definido como um átomo ou conjunto de moléculas
orgânicas e inorgânicas que contêm em sua estrutura um ou mais elétrons não pareados,
independentes na sua existência. Ou seja, são átomos ou moléculas altamente reativos, que
contém número ímpar de elétrons em sua camada eletrônica (HALLIWELL, 1994;
COSTA, 2011). Tal configuração eletrônica faz dos radicais livres moléculas muito
instáveis, com meia-vida muito reduzida e muito reativas quimicamente. A presença desses
radicais no organismo humano torna crítica a manutenção de muitas funções fisiológicas
normais (POMPELLA, 1997 apud COSTA, 2011). A origem desses radicais se deve à
transferência de elétrons (BRIAN et al., 2012).
Os radicais livres se formam em um gama de reações de óxido-redução, podendo
ceder o elétron solitário, oxidando-se, ou receber outro elétron, reduzindo-se, como o que
ocorre com o radical superóxido (O2), que apresenta uma baixa capacidade de oxidação.
Portanto, os radicais livres podem provocar ou serem resultados dessas reações de óxido
redução. O radical OH· apresenta uma alta capacidade de difusão e por isso, é o mais
reativo na indução de danos celulares (FERREIRA e MATSUBARA, 1997).
15
As espécies pró-oxidantes são produzidas naturalmente e exercem funções
biológicas fundamentais. As espécies reativas de oxigênio (EROs), como o próprio nome
indica, são derivadas do oxigênio molecular com atividade redox e maior reatividade
enquanto as espécies reativas de nitrogênio (ERNs) são derivadas do óxido nítrico
(GOMES et al., 2005; GOMES et al., 2006; CHISTÉ, 2011).
Figura 4. Processo de formação dos EROs.
Fonte: RENZ, 2003.
O esquema acima (Figura 4) mostra o ânion radical superóxido (O2-·), o primeiro
intermediário monovalente do oxigênio até água, a partir dele, são formados os demais
EROs (RENZ, 2003).
As EROs e ERNs respectivamente são produzidas durante o metabolismo basal das
células, sendo exemplos dessas espécies o ânion superóxido, a radical hidroxila e o
peróxido de hidrogênio. Sob condições normais, nosso organismo possui enzimas
protetoras ou antioxidantes que reparam 99% dos danos causados pelas EROs e/ou ERNs
(HALLIWELL, 2001).
No organismo, as EROs e ERNs encontram-se envolvidas na produção de energia,
regulação do crescimento celular, sinalização intercelular e síntese de substâncias
biológicas importantes. Por outro lado, se por alguma razão forem produzidas em excesso,
ou se as defesas antioxidantes endógenas funcionarem de forma deficiente, podem provocar
oxidações de macromoléculas, como os lípidos, carboidratos, proteínas ou DNA (estresse
oxidativo), (Figura 5) e as consequentes disfunções biológicas e doenças associadas
(HALLIWELL & GUTERIDGE 1999; BABIOR, 2004; QUINN et al., 2004; VALKO et
al., 2007; CHISTÉ, 2011). Isso acabará por levar a disfunção celular e, em última instância
a morte das células. Portanto o estresse oxidativo tem sido proposto para desempenhar um
importante papel na patogênese de muitas doenças (HALLIWELL & GUTTERIDGE,
1989; VALKO et al., 2007; DASTMALCHI, 2008). Vários estudos têm encontrado uma
forte ligação entre diabetes e estresse oxidativo (WEST, 2000; SINGH et al., 2005).
16
Figura 5. Esquema ilustrativo demonstrando os alvos das espécies reativas de oxigênio (EROs): as proteínas,
os lipídeos e o DNA.
Fonte: PALMA, 2013.
As EROs e ERNs são geradas dentro das células pela exposição a agentes
endógenos e exógenos. As fontes endógenas podem ser várias, tais como: (1) a cadeia
respiratória cuja redução monovalente de uma molécula de oxigênio dá origem a distintas
espécies reativas; (2) as células fagocitárias (monócitos, neutrófilos, e macrófagos) que
utilizam o sistema NADPH oxidase, resultando primeiramente na formação do radical
ânion superóxido, que é um dos principais responsáveis por desencadear a formação das
demais espécies reativas de oxigênio e de nitrogênio; (3) a autoxidação de compostos de
carbono reduzidos, como aminoácidos, proteínas, lipídeos, glicídios e ácidos nucléicos; e
(4) a ativação catalítica de diversas enzimas do metabolismo intermediário como a xantina
oxidase, aldeído oxidase, monoamino oxidase, ciclo-oxigenase ou lipoxigenase
(HALLIWELL & GUTERIDGE 1999; BABIOR, 2004; QUINN et al., 2004; CHISTÉ,
2011). As fontes exógenas de EROs e ERNs englobam a exposição a radiações
(eletromagnéticas, luz solar, ozônio), a componentes dos cigarros, entre outros (CHOE &
MIN, 2006 apud CHISTÉ, 2011), conforme Figura 6.
Figura 6. Principais causas e consequências da ação dos radicais livres.
Fonte: FERREIRA et al., 2009.
17
A formação de EROs e ERNs tem sido amplamente estudada na deterioração
oxidativa de produtos alimentícios, bem como na patogênese de várias doenças humanas,
como aterosclerose, diabetes mellitus, inflamações crônicas, doenças neurodegenerativas,
envelhecimento, isquemias e certos tipos de câncer (FRANKEL, 1996; FRANKEL &
GERMAN, 2006; SURVESWARAN, 2007; VALKO et al., 2007; CHISTÉ, 2011). Devido
ao envolvimento em diversas patologias, o interesse no estudo de espécies reativas se
intensificou nos últimos anos, com enfoque principal na busca por novas substâncias
capazes de prevenir ou minimizar os danos oxidativos às células vivas (ALVES et al.,
2010).
Para combater os radicais livres os organismos produzem substâncias que são
capazes de regenerar ou prevenir os danos oxidativos, exercendo seu papel como
antioxidante. Além destas, substâncias com habilidade de sequestrar radicais livres podem
ser obtidas de fontes externas, como alimentos e bebidas (ALVES et al., 2010).
Inúmeros estudos clínicos e epidemiológicos têm demonstrado que o consumo de
frutas e vegetais está associda a menor risco de desenvolvimento de doenças crônicas, tais
como, o câncer, doenças cardiovasculares e diabetes (DASTMALCHI, 2008), que pode ser
devido à ação dos antioxidantes (DASTMALCHI et al., 2007; DASTMALCHI, 2008).
1.4 Compostos Fenólicos
Os vegetais possuem dois tipos de metabólitos: primários e secundários. Enquanto
os metabólitos primários respondem pela sobrevivência do vegetal, exercendo função ativa
nos processos de fotossíntese, respiração e assimilação de nutrientes; os metabólitos
secundários estão intimamente associados às estratégias de defesa das plantas (NASS, 2007
apud SILVA et al., 2010). Eles variam em qualidade e quantidade de espécie para espécie,
até mesmo na quantidade do metabólito de um local de ocorrência ou ciclo de cultivo para
outro, pois muitos deles têm sua síntese desencadeada por eventuais alterações a que as
plantas estão expostas (FERREIRA et al., 2000 apud MARTÃO, 2013). Além disso,
apresentam atividade biológica contra herbívoros e microrganismos, muitos desses
metabólitos são utilizados como inseticidas, fungicidas, proteção contra os raios UV, a
atração de polinizadores ou animais dispersores de sementes (WINK, 1990 apud
MARTÃO, 2013). Os principais metabólitos secundários são distribuídos em três grupos de
18
acordo com sua rota biossintética: terpenos, compostos fenólicos e compostos contendo
nitrogênio (TAYZ; ZEIGER, 2004 apud SILVA et al., 2010).
A presença de moléculas bioativas tem sido amplamente estudada nos últimos anos,
devido à crescente popularidade dos medicamentos fitoterápicos (DINIZ et al., 2007). Os
compostos com ação bioativa de importância na farmacologia são produzidos através da
biossíntese dos metabólitos secundários (MARIOT e BARBIERI, 2007).
A origem de todos os metabólitos secundários pode ser resumida a partir do
metabolismo da glicose, via dois intermediários, o ácido chiquímico e o acetil-CoA (Figura
7) (SANTOS, 2003 apud MONTAGNER, 2007).
Figura 7. Ciclo biossintético dos metabólitos secundários.
Fonte: SANTOS, 2003 apud MONTAGNER, 2007.
Os compostos fenólicos são substâncias distribuídas no reino vegetal, sobretudo em
frutas e outros vegetais (BRAVO, 1998; SALES, 2011), que diferem em estrutura química
e reatividade (SHAHIDI e NACZK, 1995 apud BERTOLDI, 2006) e englobam desde
moléculas simples até outras com alto grau de polimerização (SALDANHA, 2005;
PORT’S, 2011). Vários estudos correlacionam propriedades antioxidantes de plantas
19
medicinais e alimentos com o alto teor de compostos fenólicos (RIBEIRO et al., 2008; SU,
2009).
Estes compostos possuem várias funções, tais como: crescimento da planta,
propriedades sensoriais tais como adstringência, cor, aroma e estabilidade oxidativa
(FARAH e DONANGELO, 2006; NACZK e SHAHIDI, 2004; COSTA, 2011), processos
germinativos da semente, defesa contra pragas/patógenos, danos oxidativos, reprodução, e
contribuem também para a pigmentação das plantas (ROBARDS et al., 1999; ÂNGELO e
JORGE, 2007). Em animais e humanos, estudos têm apontado que os compostos fenólicos
são capazes de bloquear as estruturas radicalares, devendo-se isto à estrutura química
(BRAVO, 1998; LIU, 2007; COSTA, 2011).
Compostos fenólicos são encontrados praticamente em todas as partes dos vegetais,
mas distribuídos em quantidades diferentes em cada uma delas, podendo variar em
diferentes populações de uma mesma espécie. O tipo e variedade de polifenóis variam com
o estágio de desenvolvimento da planta, grau de maturação, condições ambientais, solo,
manejo, processamento e armazenamento da matéria-prima (YEN e DUH, 1994; YEN e
DUH, 1995; SATO et al., 1996; MARKUS et al.,1999; CHAVAN; SHAHIDI e NACZK,
2001; SILVA, 2003). Caracterizam-se por terem um anel benzênico, um grupo carboxílico
e um, ou mais, grupos hidroxila e/ou metoxila na molécula, conferindo propriedades
antioxidantes, tanto para os alimentos, como para o organismo (SOARES, 2002).
Esta classe de compostos apresenta uma grande diversidade e divide-se em
flavonóides (polifenóis) e não-flavonóides (fenóis simples ou ácidos). Os átomos de
hidrogênio dos grupos hidroxila adjacentes (orto-difenóis), localizados em várias posições
dos anéis A, B e C, as duplas ligações dos anéis benzênicos e a dupla ligação da função oxo
(-C=O) de algumas moléculas de flavonóides garantem a esses compostos sua alta atividade
antioxidante (RICE-EVANS; MILLER; PAGANGA, 1996). Dentre os mais de cinco mil
fenólicos descritos destacam-se os flavonóides, cumarinas, taninos, ligninas, tocoferóis e
ácidos fenólicos (ROBARDS et al., 1999; ÂNGELO e JORGE, 2007).
O grupo de compostos fenólicos mais relevante nos alimentos é o dos flavonóides.
A este grupo pertence um número alargado de famílias de compostos como seja, os
flavanóis, os flavonóis, as flavanonas, as flavonas, as antocianinas e os taninos que diferem
no seu padrão de oxidação (GONÇALVES, 2007). Os compostos não-flavonóides são um
grupo vasto de compostos de onde se destacam os ácidos benzóicos, os ácidos cinâmicos,
20
os estilbenos e as isoflavonas. Os ácidos benzóicos e cinâmicos, frequentemente
denominados ácidos fenólicos, encontram-se nos frutos na forma livre em baixas
concentrações quando comparados com as suas formas conjugadas. Estes compostos
aparecem sobretudo sobre a forma de ésteres com ácido tartárico ou ligados a açúcares
(GONÇALVES, 2007).
Os compostos fenólicos estão disponíveis nos alimentos como ácidos fenólicos
(ácidos benzóico, cinâmico e seus derivados) (SOARES, 2002; COSTA, 2011),
flavonóides, lignanas, estilbenos, cumarinas e taninos. Podem se apresentar em cadeias de
moléculas simples (fenóis simples, ácidos fenólicos, fenil-propanóides e flavonóides) ou
compostos altamente polimerizados (ligninas, lignanas, taninos) (ESPIN et al., 2007;
VADIVEL; BIESALSKI, 2011). Os fenóis mais comuns são polímeros e ligninas
insolúveis, e dentre os flavonóides mais encontrados estão a quercetina e a rutina, presentes
em café, chá e grãos (RICE-EVANS; MILLER e PAGANGA, 1997; BENAVENTE-
GARCIA et al., 2000; BERTOLDI, 2006). Os efeitos bioquímicos e farmacológicos dos
flavonóides são muito vastos, dentre estes destacam-se as ações antioxidante, anti-
inflamatória e antiplaquetária, além de efeitos antialergênicos. Quando em alimentos, os
flavonóides agem de forma a poupar o consumo de vitamina C, evitando a formação de
radicais livres (KOO & SUHAILA, 2001).
Quimicamente, compostos fenólicos são definidos como um grupo de substâncias
bastante diversificadas, que possuem pelo menos um anel aromático ligado a um ou mais
grupos hidroxila ou a outros grupos funcionais, como ésteres e glicosídeos, entre outros, em
que os mais importantes são os ácidos fenólicos (cafeico, clorogênico, ferúlico, gálico, ρ-
cumárico), os flavonóides (antocianinas, flavanas, flavonas, flavanonas, flavonóis,
isoflavonas) e os taninos (NACZK e SHAHIDI 2004; OLIVEIRA, 2010). A maior parte
dos compostos fenólicos não é encontrada no estado livre na natureza, mas sob a forma de
ésteres ou de heterosídeos, sendo, portanto, solúveis em água e em solventes orgânicos
polares. Dentre os compostos fenólicos são encontradas estruturas tão variadas quanto as
dos ácidos fenólicos, dos derivados da cumarina, dos pigmentos hidrossolúveis das flores,
dos frutos e das folhas. Além disso, essa classe de compostos abrange as ligninas e os
taninos, polímeros com importantes funções nos vegetais (SIMÕES, 2000 apud ZICKER,
2011). São encontrados principalmente no pericarpo de grãos de cereais, assim, as frações
21
de farelo deve conter elevados níveis destes compostos (DYKES & ROONEY, 2007;
ABDEL-AAL, 2011).
A pesquisa tem mostrado que dietas ricas em frutas, legumes, grãos integrais e
outras fontes de compostos fenólicos podem levar a um aumento da quantidade de
antioxidantes no corpo humano (CAO et al., 1998; BRIAN et al., 2012). Além de fornecer
possíveis benefícios para a saúde, os ingrediente ricos em compostos fenólicos são
empregados como antioxidantes em uma variedade de sistemas alimentares (BREWER
2011; BRIAN et al., 2012).
Considerando que o hábito alimentar é um dos fatores determinantes para o estado
de saúde ou doença de um indivíduo, investigar os mecanismos de ação antioxidante pode
gerar resultados importantes para o incentivo do consumo de alimentos que propiciem a
diminuição do dano oxidativo, atuando, desse modo, na promoção da saúde humana
(SOUSA, 2013).
O mecanismo de ação dos antioxidantes é bem variado, desde a remoção do
oxigênio do meio, varredura dos EROs, sequestro dos metais catalizadores da formação de
radicais livres, aumento da geração de antioxidantes endógenos ou mesmo a interação de
mais de um mecanismo (RENZ, 2003).
Em geral os compostos fenólicos são multifuncionais como antioxidantes, pois
atuam de várias formas: combatendo os radicais livres por meio da doação de um átomo de
hidrogênio de um grupo hidroxila (OH) da sua estrutura aromática, que possui a capacidade
de suportar um elétron desemparelhado por meio do deslocamento deste ao redor de todo o
sistema de elétrons da molécula; quelando metais de transição, como o Fe2+ e o Cu+;
interrompendo a reação de propagação dos radicais livres na oxidação lipídica;
modificando o potencial redox do meio; reparando a lesão a moléculas atacadas por
radicais livres (PODSEDEK, 2007; KYUNGMI et al., 2008; SUCUPIRA et al., 2012).
Os antioxidantes atuam em diferentes níveis na proteção dos organismos: o primeiro
mecanismo de defesa contra os radicais livres é impedir a sua formação, principalmente
pela inibição das reações em cadeia com o ferro e o cobre; interceptando os radicais livres
gerados pelo metabolismo celular ou por fontes exógenas, impedindo o ataque sobre os
lipídeos, os aminoácidos das proteínas, a dupla ligação dos ácidos graxos poli-insaturados e
as bases do DNA, evitando a formação de lesões e perda da integridade celular. Os
antioxidantes obtidos da dieta, tais como as vitaminas C, E e A, os flavonóides e
22
carotenóides são extremamente importantes na intercepção dos radicais livres. Outro
mecanismo de proteção é o reparo das lesões causadas pelos radicais. Esse processo está
relacionado com a remoção de danos da molécula de DNA e a reconstituição das
membranas celulares danificadas. Em algumas situações pode ocorrer uma adaptação do
organismo em resposta a geração desses radicais com o aumento da síntese de enzimas
antioxidantes (BIANCHI & ANTUNES, 1999).
Os compostos fenólicos agem tanto na etapa de iniciação, como na de propagação
do processo oxidativo. Isto leva a produção de produtos intermediários, relativamente
estáveis devido à ressonância do anel aromático apresentada por estas substâncias (COSTA,
2011). O grau de hidroxilação e a posição dos grupos hidroxila na molécula dos compostos
fenólicos são os mais importantes fatores que determinam a atividade antioxidante nesses
compostos. O tipo de estrutura pode afetar na solubilidade e nos efeitos estéricos de cada
molécula, como ocorre nos derivados glicosilados, que podem aumentar ou diminuir a
atividade antioxidante (RICE-EVANS et al., 1996; COSTA, 2011).
Diferentes solventes podem ser utilizados para a extração dos compostos
antioxidantes, tais como: metanol, etanol, acetona, água, acetato de etila, propanol,
dimetilformaldeído e suas combinações (ANDREO & JORGE, 2006; ÂNGELO & JORGE,
2007; ZICKER, 2011). A água é comumente utilizada, pois apresenta maior abundância e
facilidade de obtenção, além de proporcionar uma extração eficiente devido à sua
polaridade (ANDREO & JORGE, 2006; ZICKER, 2011).
Sementes são fontes de compostos bioativos com atividade antioxidante e podem
conter variedades de moléculas capazes de sequestrar radicais livres, dentre estes estão os
compostos fenólicos (ácidos fenólicos, flavonóides, quinonas, cumarinas, lignanas,
estilbenos, taninos), vitaminas, terpenóides (incluindo carotenóides), e alguns outros
metabolitos endógenos (CAI et al., 2004; PORT’S, 2011). Li et al., (2011) e Cogliatti,
(2012) realizaram a quantificação e identificação dos componentes fenólicos em sementes
de alpiste, tendo sido encontrado três principais ácidos fenólicos: ferúlico, cafeico e p-
cumárico (Figura 8). Esses compostos fenólicos são amplamente estudados por suas ações
em câncer, doenças cardiovasculares, diabetes e doenças neurodegenerativas (ABDEL-
WAHAB et al., 2003; ZHAO & MOGHADASIAN, 2008; LI et al., 2011).
23
Figura 8. Estruturas químicas do ácido ferúlico, cafeico e p-cumárico.
Fonte: www.fciencias.com, (2014).
Os ácidos fenólicos em alpiste estão presentes em concentrações relativamente
elevadas, expresso em equivalente de ácido ferúlico, variou 174-209 mg/100 g para a
farinha integral de alpiste, 360-450 mg/100 g para o farelo e 124-138 mg/100 g para a
farinha, em particular a fração ligada insolúvel. Semelhante a outros grãos de cereais estão
concentrados principalmente na fração de farelo do alpiste (ABDEL-AAL et al., 2011),
dados apenas para informação, pois neste estudo foi utilizado equivalente em ácido gálico.
Os compostos fenólicos naturalmente encontrados nos alimentos são potentes
antioxidantes. Os antioxidantes da dieta e entre eles os compostos fenólicos, poderiam
prevenir os efeitos da hiperglicemia, que levam a disfunção celular e finalmente as
complicações tardias do diabetes (GIADA; MANCINI-FILHO, 2006).
1.5 Atividade Antioxidante
Os antioxidantes são substâncias que podem protelar ou impedir a oxidação de um
substrato agindo na prevenção, interceptação e/ou no reparo contra a formação de
substâncias nocivas as células ou tecidos (ROHENKOHL et al., 2011). Estas substâncias
podem reduzir os danos adversos, desintegrando os oxidantes antes que estes reajam com
os alvos biológicos, impedindo assim as reações em cadeia ou a ativação do oxigênio a
produtos altamente reativos (MALTA, 2011).
Várias reações oxidativas que ocorrem no organismo provoca a formação de
radicais livres, essas formas reativas de oxigênio causam danos às células contribuindo para
muitas doenças (SIKORA et al., 2008; SILVA et al., 2010). Por isso, as células humanas
dependem de certa capacidade antioxidante para fornecer proteção contra os efeitos
prejudiciais de radicais livres e espécies reativas do oxigênio, que são consequências
inevitáveis da vida aeróbica. Para alcançar uma proteção eficiente, os tecidos dispõem de
um sistema antioxidante integrado, que consiste de um arranjo de diversos componentes
lipossolúveis (vitamina E; carotenóides), hidrossolúveis (ácido ascórbico; glutatinona) e
24
enzimáticos (glutatinona peroxidase; superóxido dismutase; catalase) (SIES, 1993;
McLEAN et al., 2005; VALKO et al., 2007; SILVA et al., 2010; COSTA, 2011).
Outras micromoléculas antioxidantes podem ser adquiridas através da dieta, como
carotenóides e os compostos fenólicos presentes principalmente nos alimentos de origem
vegetal (BARREIROS et al., 2006; COSTA, 2011).
Observa-se que mesmo a nível fisiológico, não há uma total prevenção na
formação/atuação das EROs. A eficácia do sistema antioxidante depende da molécula
geradora do estresse oxidativo e da sua localização, intra ou extracelular (CAMINI, 2014).
Na Figura 9 demonstra os mecanimos de defesa.
Figura 9. Fontes de espécies reativas e mecanismos de defesa.
Fonte: GUARATINI; MEDEIROS; COLEPICOLO, 2007.
Evidências têm sugerido que a incidência de doenças crônico-degenerativas
causadas pelo estresse oxidativo em sistemas biológicos pode ser retardada pela ingestão de
antioxidantes naturais encontradas na dieta, principalmente compostos fenólicos (SIMÕES,
2000 apud ZICKER, 2011; MOREIRA & MANCINI-FILHO, 2004).
A definição de um bom antioxidante se dá pelas suas características químicas, como
a presença de doadores de elétrons ou de hidrogênio; capacidade de deslocamento do
radical formado em sua estrutura; potencial de quelar metais de transição envolvidos no
processo oxidativo e facilidade de acesso ao local de ação (MANACH e DONOVAN,
2004; COSTA, 2011), dependendo de sua hidrofilia ou lipofilia e de seu coeficiente de
partição (MANACH et al., 2004; SUCUPIRA et al., 2012).
25
As substâncias antioxidantes podem apresentar diferentes propriedades protetivas e
agir em diversas etapas do processo oxidativo, funcionando por diferentes mecanismos e
sendo portanto, classificadas em duas categorias principais: antioxidantes primários e
secundários. São considerados primários os compostos de ação antioxidante capazes de
inibir ou retardar a oxidação por inativação de radicais livres graças à doação de átomos de
hidrogênio ou de elétrons, o que transforma os radicais em substâncias estáveis. Os
antioxidantes secundários apresentam uma grande variedade de modos de ação: ligação de
íons metálicos (alteração de valência); inativação de EROs, conversão de hidroperóxidos
em espécies não-radicalares ou absorção de radiação UV (MAISUTHISAKUL;
SUTTAJIT; PONGSAWATMANIT, 2007; SILVA et al., 2010).
O equilíbrio entre agentes redutores e o sistema antioxidante é essencial. Portanto,
quantidades adequadas de antioxidantes no meio intracelular são de grande importância
para maior segurança contra os ataques dessas espécies reativas, prevenindo o aparecimento
de doenças e evitando suas complicações, principalmente no diabetes mellitus (VALKO, et
al., 2007; OLIVEIRA, 2010).
Os antioxidantes agem nas três linhas de defesa orgânica contra as EROs. A
primeira, é a de prevenção, caracterizando-se pela proteção contra a formação de
substâncias agressoras. A segunda, é a interceptação, os antioxidantes interceptam os
radicais livres, que uma vez formados iniciam suas atividades destrutivas. E a última, é o
reparo que ocorre quando as duas primeiras linhas não foram completamente efetivas e os
produtos de destruição pelos EROs estão sendo continuamente formados e podem se
acumular no organismo (KONG; LILLEI, 1998; ROHENKOHL et al., 2011).
Segundo Santos et al., (2010) existe uma correlação forte e positiva entre a presença
de compostos fenólicos e atividade antioxidante. Entretanto, o teor individual de cada
composto fenólico não está relacionado à presença de atividade antioxidante, e essa apenas
ocorre pelo sinergismo entre os compostos fenólicos e, provavelmente, pela presença de
outras substâncias ainda não identificadas e quantificadas (REYNERTSON et al., 2008;
ZICKER, 2011).
É fato estabelecido que além dos antioxidantes endógenos, é necessária a
participação dos antioxidantes dietéticos (Figura 10), pois são indispensáveis para a defesa
apropriada contra a oxidação e, por isso, têm importante papel na manutenção da saúde. Os
26
benefícios provenientes de frutas, hortaliças e demais vegetais deve-se em grande parte à
presença de antioxidantes nestes alimentos (LAMPE, 1999; COSTA, 2011).
Figura 10. Maiores vias de produção de radicais livres e defesas antioxidantes enzimáticas e não-enzimáticas.
NOS: óxido nítrico sintase; ERNs: espécies reativas de nitrogênio; SOD: superóxido dismutase; CAT:
catalase; GPx: glutationa peroxidase; GR: glutationa redutase; GSH: glutationa; GSSH: glutationa oxidada;
NADPH: nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato.
Fonte: HOVATTA et al., 2010.
Entre as inúmeras fontes de antioxidantes naturais estão incluídos grãos e sementes
de oleaginosas (NAGEM; ALBUQUERQUE; MIRANDA, 1992), de cereais (TIAN;
WHITE, 1994), sementes de frutas, frutas (DAWES; KEENE, 1999), legumes
(GANTHAVORN; HUGHES, 1997) e especiarias (CHIPAULT et al., 1952; MADSEN;
BERTELSEN, 1995; MELO et al., 2003 apud ÂNGELO e JORGE, 2008).
A busca por antioxidantes naturais para produtos alimentícios, cosméticos e
farmacêuticos vem representando um importante desafio para a pesquisa industrial
(LAGUERRE; LECOMTE; VILLENEUVE, 2007; SILVA et al., 2010), sendo que os
consumidores vêm apresentando rejeição pelo uso de antioxidantes sintéticos, gerando um
crescente interesse na obtenção de antioxidantes provenientes de produtos vegetais (SILVA
et al., 2010).
O efeito do sequestro de radicais é determinado não somente pela reatividade do
antioxidante com o radical, mas também pela sua concentração. Embora muitos
27
antioxidantes reajam rapidamente com o radical hidroxil, muitas moléculas biológicas, que
são mais abundantes que os antioxidantes, reagem também rapidamente com esse radical.
Por isso é praticamente impossível para algum antioxidante sequestrar o radical hidroxil
efetivamente. Outro ponto importante é saber onde os radicais livres são produzidos, e se o
antioxidante é capaz de alcançá-los (NIKI, 2002 apud ALVES et al., 2010).
Estudos epidemiológicos têm mostrado que muitos destes compostos antioxidantes
atuam como anti-inflamatórios, antiateroscleróticos, antitumorais, antimutagênicos,
anticarcinogênicos, antibacterianos ou antivirais (SALA et al., 2002; OWEN et al., 2000).
Os mecanismos por meio dos quais os antioxidantes em alimentos exercem sua ação
podem ser divididos em duas possíveis vias: reações de transferência de um átomo de
hidrogênio ou de transferência de um elétron. O conhecimento destas duas reações é muito
importante para a compreensão e seleção dos métodos utilizados para medir a capacidade
antioxidante de compostos bioativos, observado na Figura 11 (PRIOR et al., 2005).
Figura 11. Esquemas dos principais mecanismos de reação dos ensaios de capacidade antioxidante total. A:
Mecanismo de transferência de átomo de hidrogênio (HAT); B: Mecanismo de transferência de um elétron
(SET).
Fonte: CASTELO-BRANCO; TORRES, 2011.
Métodos baseados no mecanismo de HAT investigam a capacidade dos
antioxidantes em bloquear a ação dos radicais peroxila (ROO) através da doação de
hidrogênio. Esses ensaios são compostos por um gerador sintético de radicais, responsável
pela manutenção do fluxo constante de ROO, pelos antioxidantes (da amostra ou do
padrão) e por uma sonda molecular (substrato oxidável) que, quando oxidada pela espécie
reativa, apresenta sinal mensurável. O antioxidante inibe, por competição, a oxidação do
28
substrato pela espécie reativa de oxigênio. Consequentemente ocorrerá uma mudança no
sinal medido, e a capacidade antioxidante da amostra pode ser quantificada. A presença dos
ROO no sistema como iniciadores da oxidação e a reação de competição, ocorrida
naturalmente nos alimentos, tornam os ensaios com mecanismo de HAT representativos de
um sistema alimentar em condições reais. Nesses ensaios a concentração do substrato
oxidável (sonda molecular) é frequentemente menor do que a do antioxidante (HUANG et
al.; PRIOR et al., 2005).
Os métodos baseados no mecanismo de SET envolvem apenas dois componentes:
os antioxidantes e o agente oxidante, que também será a sonda molecular, responsável pelo
sinal mensurável da reação. A sonda oxidante abstrai um elétron do antioxidante, causando
uma mudança na sua própria absorbância, permitindo o acompanhamento da reação e a
determinação da capacidade antioxidante da amostra. Dessa forma, os ensaios com
mecanismo de SET detectam a capacidade da amostra em reduzir o oxidante, que não
precisa ser estritamente um radical livre, ao contrário dos ensaios com mecanismo de HAT.
Os ensaios de SET apresentam mecanismos não competitivos e não se utilizam de espécies
reativas de oxigênio e, por isso, são considerados menos representativos das condições reais
em um alimento, quando comparados aos ensaios com mecanismo de HAT (HUANG et
al.; PRIOR et al., 2005).
Os mecanismos de SET e HAT, na maioria das vezes, ocorrem simultaneamente nos
alimentos, e seu equilíbrio é determinado principalmente pelas propriedades químicas dos
antioxidantes e pelas características físico-químicas do alimento. Portanto, para que a
determinação da capacidade antioxidante seja mais completa e representativa, recomenda-
se o uso de mais de um ensaio, de modo a contemplar ambos os mecanismos de reação
(CASTELO-BRANCO; TORRES, 2011).
Devido aos diferentes tipos de radicais livres e as suas diferentes formas de atuação
nos organismos vivos, dificilmente existirá um método simples e universal pelo qual a
atividade antioxidante possa ser medida precisa e quantitativamente. Assim, a busca por
testes mais rápidos e eficientes tem gerado um grande número de métodos para avaliar a
atividade de antioxidantes naturais pelo uso de uma grande variedade de sistemas geradores
de radicais livres (ALVES et al., 2010).
29
1.5.1 Metodologias Antioxidantes in vitro
O problema em se determinar a atividade antioxidante dos compostos envolve dois
lados. Primeiro, em avaliar o potencial antioxidante, que é determinado pela composição de
antioxidantes e propriedades oxidativas de seus constituintes. Segundo, determinar seus
efeitos biológicos, que dependem, dentre outros, da biodisponibilidade dos antioxidantes
(ROGINSKY e LISSI, 2004; BERTOLDI, 2006).
Os métodos in vitro são avaliações potenciais da atividade antioxidante de um
determinado composto puro ou extrato, já que a interação fisiológica entre o organismo e o
antioxidante não é estudada, como ocorre nos métodos in vivo. Para a utilização de
antioxidantes em alimentos, para fins tecnológicos, a avaliação in vitro, se bem conduzida,
fornece uma estimativa importante do potencial antioxidativo do composto em análise
(BERTOLDI, 2006).
Não existe um único método que consiga avaliar satisfatoriamente a atividade
antioxidante de uma amostra, visto que ela depende da técnica utilizada, do tipo e
concentração do substrato, dos constituintes presentes no extrato avaliado, parâmetros
metodológicos como tempo e temperatura do ensaio, fenômeno de partição, fatores
interferentes, dentre outros. Os métodos utilizados para avaliação da ação antioxidante
deveriam ser baseados na identificação dos diferentes mecanismos antioxidativos sob
condições variadas, refletindo as propriedades multifuncionais dos antioxidantes nos
processos oxidativos encontrados nos alimentos e nos processos fisiológicos (BECKER;
NISSEN e SKIBSTED, 2004; BERTOLDI, 2006). Atualmente preconiza-se a utilização de
duas ou mais técnicas, já que nenhum ensaio usado isoladamente para determinar a
capacidade antioxidante irá refletir exatamente a “capacidade antioxidante total” de uma
amostra (PRIOR; CAO, 1999; SUCUPIRA et al., 2012).
Diversos métodos têm sido utilizados para determinar a atividade antioxidante in
vitro, de forma a permitir uma rápida seleção de substâncias e/ou misturas potencialmente
interessantes, na prevenção de doenças crônico-degenerativas (DUARTE-ALMEIDA et al.,
2006 apud SILVEIRA, 2008). Estes ensaios envolvem diferentes mecanismos do sistema
de defesa antioxidante, desde a quelação de íons metálicos até a medida da prevenção do
dano oxidativo a biomoléculas (GIADA; MANCINI-FILHO, 2004 apud SILVEIRA, 2008).
Estes métodos podem ser baseados na captura do radical peroxila (ORAC - oxygen
radical absorbance capacity, TRAP - total reactive antioxidant potential), poder de redução
30
do metal (FRAP - ferric reducing antioxidant power, CUPRAC - cupric ion reducing
antioxidant capacity), captura do radical hidroxila (método de desoxirribose), captura do
radical orgânico (ABTS - 2,20-azino-bis (ácido 3-ethylbenzthiazoline-6-sulfônico, DPPH -
peroxidação do 2,2-difenil-1-picrylhydrazil), quantificação de produtos formados durante a
peroxidação de lipídeos (TBARS, oxidação do LDL, co-oxidação do -caroteno)
(FRANKEL e MEYER, 2000; SÁNCHEZ-MORENO, 2002; ARUOMA, 2003), etc.
Dentre estes métodos, ABTS, FRAP, DPPH e ORAC são alguns dos mais usados
atualmente para determinar a capacidade antioxidante in vitro (PÉREZ-JIMÉNEZ e
SAURA-CALIXTO, 2006; BENZIE & STRAIN, 1996; CAO; ALESSIO e BUETTNER,
1993; SURVESWARAN, 2007). O método de branqueamento de β-caroteno, que avalia o
nível de inibição dos radicais livres gerados durante a peroxidação do ácido linoleico,
também é bastante conhecido (DUARTE-ALMEIDA et al., 2006 apud SUCUPIRA et al.,
2012).
1.6 Diabetes Mellitus
O conhecimento sobre diabetes mellitus já existia no antigo Egito e na Grécia. A
palavra “diabetes” é derivado da palavra grega “Diab” (ou seja, a passagem, referindo-se ao
ciclo de sede pesado e micção frequente, ou sifão), “mellitus” é a palavra latina para “leite e
mel” (refere-se à presença do açúcar na urina) (WARJEET, 2011 apud PATEL et al.,
2012). A denominação mellitus deriva do latim que significa como se fosse mel ou com
sabor de mel (RIEDER; GUARIM NETO, 2012).
A primeira descrição do diabetes foi encontrada no papiro do médico egípcio
EBERS (1500 a.C.). Mas a poliúria (anomalia que se caracteriza pelo aumento da produção
de urina), típica de diabéticos, já aparece descrita 3000 a.C. pelo também egípicio
IMHOTEP (destacado personagem ligado ao Faraó ZOSSER). Dados históricos posteriores
indicam que dois médicos gregos, faziam seus acometidos beberem líquidos com bastante
frequência por terem intermitente sede e, por outro lado, urinarem também como muita
frequência. A ideia era então caracterizar esta anomalia como “um entra e sai” de líquido
no organismo (RIEDER; GUARIM NETO, 2012).
Acreditava que a doença também liquefazia a carne e os ossos em urina, em face do
emagrecimento. A urina dos acometidos pela síndrome diabética apresentava sabor de mel.
31
Expelindo açúcar na urina, que ao ser evaporada fica um resíduo cristalino, assemelhado ao
sabor açúcar mascavo (RIEDER; GUARIM NETO, 2012).
O diabetes mellitus é uma doença metabólica, lenta, progressiva e crônica (altera a
homeostase do organismo) que ocorre quando o pâncreas não produz níveis suficiente do
hormônio insulina ou quando o organismo não pode utilizar de forma eficaz a insulina que
produz (GROSS et al., 2002; ALMEIDA, 2011), resultando em um aumento da
concentração de glicose no sangue. A falta desse hormônio atinge, sobretudo, o
metabolismo de carboidratos, proteínas e lipídeos, e é diagnosticada pela ocorrência de
hiperglicemia Figura 12 (NAZIROGLU; BUTTERWORTH, 2005; FERNANDES et al.,
2010). A hiperglicemia é característica comum da complicação, em que ocorre dificuldade
na utilização da glicose em consequência da resposta defeituosa ou deficiente à secreção de
insulina, havendo, portanto, aumento dos níveis de glicose no sangue (NEGRI, 2005).
A hiperglicemia sustentada leva a uma maior diminuição da produção de insulina
pela células-β das ilhotas de Langerhans, a chamada de toxicidade da glicose
(PALANISAMY et al., 2011; SUBRAMANI et al., 2014). Hiperglicemia crônica é o
iniciador de uma série de reações em cascata que culminam no desenvolvimento de
complicações diabéticas, tais como a cegueira, doenças cardíaca e renal, podendo atingir
nervos e vasos sanguíneos (BÓRTOLI et al., 1997; PARI; SATHEESH, 2006).
Figura 12. Eventos metabólicos que levam a hiperglicemia, num estado pós absortivo no diabetes mellitus
não controlada.
Fonte: McCOWEN; SMITH, 2005 apud BETTENCOURT, 2010.
32
Em condições fisiológicas a regulação da glicemia é mantida através de um delicado
balanço entre a secreção de insulina e a sensibilidade à insulina. Assim, um sinal inicial de
intolerância à glicose e/ou uma diminuição na sensibilidade da insulina nos tecidos
periféricos resulta no aumento compensatório da secreção da insulina para a manutenção da
normoglicemia (TFAYLI; ARSLANIAN, 2009; SALES, 2011). Por outro lado, em alguns
indivíduos, a relação hiperbólica que governa esse balanço está prejudicada e tem reflexos
diretos nas células β-pancreáticas, as quais não respondem às elevadas concentrações de
insulina com uma diminuição da secreção desse hormônio, aumentando assim a resistência
insulínica (TFAYLI; ARSLANIAN, 2009; SALES, 2011).
A resistência à insulina é definida como uma alteração em que uma quantidade
normal de insulina excretada produz uma resposta anormal, não só prejudica a absorção da
glicose por parte das células sensíveis à insulina, mas também provoca a mudança da
glicólise para a gliconeogênese nas células hepáticas, aumentando, assim, ainda mais os
níveis de glicose no sangue. Esta resistência é inicialmente compensada por um aumento da
secreção da insulina. Contudo, uma exposição prolongada a níveis elevados de glicose no
sangue causa exaustão das células-β e toxicidade da glicose. Quando o pâncreas não
consegue segregar insulina suficiente para se atingir um nível de normal, atinge-se um
estado de hiperglicemia persistente que leva a DM (RIOS & WARD, 2008 apud RAMOS,
2011), acarretando também hipertrigliceridemia e elevações das frações do colesterol
(FERREIRA; OLIVEIRA; FRANCA, 2007).
Se, por um lado, a descoberta da insulina e de seu uso terapêutico possibilitaram
uma diminuição significativa das complicações agudas do diabetes, particularmente a
cetoacidose, por outro, a evolução crônica do diabetes tem se apresentado com uma
prevalência crescente de complicações macro e microvasculares. Estas complicações
degenerativas na síndrome diabética, notadamente a retinopatia, a nefropatia e a neuropatia,
vêm se colocando como um sério problema, pois compromete a qualidade de vida do
diabético, incapacitando e diminuindo sua sobrevida (FOSS, 1989).
Mudanças no estilo de vida, como hábitos alimentares mais saudáveis e prática de
atividade física, são determinantes para melhora da doença (SILVA; MURA, 2007).
Alguns estudos demonstram que o controle de massa corporal e aumento da
atividade física diminuem a resistência à insulina, diminuindo as chances de se desenvolver
o diabetes mellitus (PAN et al., 1997). A prática de atividades físicas regulares promove
33
um aumento do turnover da insulina por maior captação hepática e melhor sensibilidade
dos receptores periféricos (OSHIDA et al., 1989 apud SARTORELLI; FRANCO, 2003),
diminuindo a glicose sanguínea aumentando a captação de glicose pelos músculos do corpo
(LUCENA, 2007), associada à dieta, melhora o perfil lipídico de indivíduos em risco de
desenvolvimento de doenças cardiovasculares (STEFANICK et al., 1998).
Em contrapartida, um padrão alimentar mais saudável, rico em frutas, verduras,
legumes e peixes, demonstrou ser um fator protetor para o desenvolvimento de tolerância à
glicose diminuída e da síndrome metabólica (WILLIAMS et al., 2000).
1.6.1 Estresse Oxidativo e Diabetes Mellitus
Nos organismos vivos, o estresse oxidativo leva à formação de compostos
potencialmente tóxicos e danosos ao organismo, como os radicais livres, que podem
prejudicar a saúde humana, aumentando o risco de doenças cardíacas e degenerativas, além
de contribuir para o envelhecimento (BERTOLDI, 2006).
Radicais livres de oxigênio e estresse oxidativo parece ser um elemento importante
da produção de complicações secundárias em diabetes (THOMSON e MCNEIL, 1993;
THORNALLEY et al., 1996 apud KAMALAKKANNAN; PRINCE, 2003).
Diabetes mellitus, é uma doença metabólica crônica que tem efeito profundo na
qualidade de vida em termos de saúde física, bem como o bem-estar social e psicológico.
Os efeitos prejudiciais das complicações do diabetes são principalmente mediados pelo
estresse oxidativo (KOYA; KING, 1998; DUTTA, 2013). O diabetes está associado com o
aumento da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) (PITOZZI et al., 2003;
CERIELLO, 2000; BAYNES, 1991; BAYNES; THORPE, 1999 apud DUTTA, 2013) e a
hiperglicemia é o fator central na geração do estresse oxidativo, pois nessas condições há
desequilíbrio no balanço entre produção de EROs e o sistema antioxidante intracelular, que
envolve diminuição da disponibilidade da nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato
reduzida (NADPH) e da glutationa reduzida (WOLFF; DEAN, 1987 apud Research
Communications, 1999; DÍAZ-FLORES et al., 2004 apud SALES, 2011). Tal condição é
desencadeada pela reação não enzimática da glicose com os grupos amino terminais de
proteínas por meio de uma reação denominada glicação. A glicação das proteínas, seguida
da formação de radicais livres, tem sido proposta como um dos mais importantes processos
na patogênese do diabetes (NOVELLI, 2005 apud OLIVEIRA, 2010). Como consequência
34
há também peroxidação lipídica e danos em membranas (HUNT et al., 1988;
KAMALAKKANNAN; PRINCE, 2003).
O papel do estresse oxidativo como determinante principal no início e progressão
das complicações do diabetes mellitus (DM) tem despertado grande interesse em razão de
que o desequilíbrio entre a produção de EROs e a capacidade antioxidante endógena
ocasiona o aumento da atividade da aldose redutase, formando produtos avançados da
glicosilação não-enzimática e promovendo a via das hexosaminas (TANIYAMA;
GRIENDLING, 2003; REIS et al., 2008; SALES, 2011).
Um dos principais mecanismos patogênicos responsáveis pelos danos celulares e
teciduais relacionados ao estresse oxidativo no diabetes envolve a formação de produtos
finais de glicação avançada, os quais são lipídeos ou proteínas que se tornam glicados após
a exposição a açúcares oxidados e que atuam modificando proteínas intracelulares
relacionadas com a regulação gênica, interferindo na sinalização celular e ainda
estimulando a produção de citocinas inflamatórias (BARBOSA; OLIVEIRA; SEARA,
2009; SALES, 2011). Além disso, o estresse oxidativo induzido por hiperglicemia crônica
tem sido associados com a disfunção e a apoptose de vários tipos de células, incluindo as
células pancreáticas (WU et al., 2004; DE et al., 2010), neurônios e células gliais (RUSSEL
et al., 2002, VINCENT et al., 2004; DE et al., 2010).
Níveis elevados de peróxidos lipídicos circulantes têm sido registrado em pacientes
diabéticos e animais experimentalmente diabéticos (SRINIVASAN et al., 1997; STANELY
e MENON, 1998; KAMALAKKANNAN; PRINCE, 2003). Peróxidos lipídicos circulantes
são capazes de iniciar a aterosclerose e também estão relacionados com as doenças
coronarianas (HESSLER et al., 1983 apud KAMALAKKANNAN; PRINCE, 2003).
Considerando o envolvimento do estresse oxidativo (Figura 13) na patogênese do
DM e de outras Doenças e Agravos Crônicos Não Transmissíveis (DACNT), a busca por
agentes antioxidantes naturais tem fundamental importância (HUBER; RODRIGUEZ-
AMAYA, 2008; SALES, 2011).
35
Figura 13. Estresse oxidativo a partir do sobrepeso e o sedentarismo.
Fonte: McLELLAN et al., 2007.
1.6.2 Estatísticas e Incidência
Segundo estimativas da OMS, mais de 60% dos óbitos mundiais são devidos às
DCNT (WHO, 2005). O aumento da carga dessas doenças é consequência direta dos
processos de transição demográfica, da urbanização acelerada, progressiva expectativa de
vida, mudança no padrão alimentar, crescimento econômico e social, tabagismo e
sedentarismo, entre outros fatores (WHO, 2011b; SCHMIDT et al., 2011). Dentre as
doenças, o diabetes mostra-se como umas das mais importantes e diretamente relacionada
com a industrialização e as subsequentes mudanças nos hábitos das sociedades modernas
(AREAS, 1994). A incidência de diabetes mellitus está em ascensão em todo o mundo
(GUPTA et al., 2005).
Diabetes mellitus é uma doença tão antiga quanto a humanidade e sua inicidência é
considerada alta (4-5%) em todo o mundo (PICKUP; WILLIAMS, 1997 apud
KAMALAKKANNAN; PRINCE, 2003).
De acordo com Foss (1989) a síndrome diabética é uma importante causa de
morbidade e mortalidade em diferentes grupos etários da população. Tal situação é
36
concordante com os mais importantes problemas de saúde a nível mundial, quando se
verifica que o diabetes, juntamente com as doenças cardiovasculares, tumores malignos e
traumatismos são as mais prevalentes doenças não-transmissíveis das populações de países
em diferentes estágios de desenvolvimento.
Afetando o corpo humano, em termos de saúde física, psicológica e social. Está se
tornando o terceiro "assassino" da saúde da humanidade, juntamente com o câncer, doenças
cardiovasculares e cerebrovasculares (CHAUHAN et al., 2010 apud PATEL et al., 2012).
Segundo a Federação Internacional do Diabetes, 2012; Hwang et al., 2012;
Subramani et al., 2014 estima-se que existam mais de 371 milhões de pessoas portadoras de
DM, mais ainda, esse número passaria para 552 milhões de pessoas até o ano de 2030.
Desses 371 milhões de pessoas com DM, apenas 185 milhões de pessoas são
diagnosticadas e tratadas. De acordo com Zhang et al., (2010), o DM gera altos custos para
o sistema de saúde devido as suas complicações micro e macrovasculares, tais como:
nefropatias, retinopatias, cardiopatias entre outras complicações crônicas e serevas como a
demência e transtornos do humor (depressão).
Os países líderes de prevalência de DM são a Índia, a China e os Estados Unidos.
No Brasil quatro milhões de casos foram notificados em 2000 (OMS, 2009). De acordo
com projeções da OMS, a prevalência de diabetes é susceptível de aumentar em 35%.
Atualmente, existem mais de 150 milhões de diabéticos em todo o mundo e outros 314
milhões com intolerância à glicose, um estado pré-diabético (EL-HILALY et al., 2006;
BERA et al., 2012).
A Organização Mundial de Saúde assinala sinais de prevalência aumentada de casos
de diabetes em todo o mundo, principalmente nas áreas de população com maior poder
aquisitivo, devido a maior capacidade de aquisição de alimentos industrializados,
principalmente os ricos em carboidratos simples. Esse aumento deve-se também à atuação
de diversos fatores que intervêm em sua gênese como a hereditariedade, a obesidade em
pessoas acima de 40 anos, vida sedentária, estados patológicos crônicos, condições
estressantes, certos medicamentos que podem fazer com que o diabete surja em indivíduos
predispostos (FRANCO; CHALOUB, 1985).
Na América Latina, o diabetes apresenta uma incidência que chega a ser um desafio
para a saúde pública afetando uma entre quarenta e até mesmo uma entre vinte pessoas da
população adulta, segundo dados da OMS (JOHNSON, 1991 apud AREAS 1994).
37
Em relação a América do Sul e a América Central, o Brasil possui cerca de 12,4
milhões de pessoas com a doença, seguido por Colombia, Venezuela e Argentina
(FEDERAÇÃO INTERNACIONAL DO DIABETES, 2012).
No Brasil, o estudo Multicêntrico Sobre Prevalência de Diabetes Mellitus encontrou
uma prevalência geral da doença de 7,6% em pessoas de 30 aos 69 anos. Destas, metade
não sabem que possuem a doença e, das já diagnosticadas, 22% não fazem tratamento
(SOCIEDADE BRASILEIRA DE DIABETES, 2003 apud GARCÍA et al., 2009;
MALERBI; FRANCO, 1992; ANDRADES, 2010). A maior prevalência de diabetes no
país está nas regiões mais desenvolvidas, o sul e o sudeste (SARTORELLI; FRANCO,
2003; ALMEIDA, 2011), sendo o DM tipo 2 o mais prevalente, englobando cerca de 90 a
95% dos casos (WILD et al., 2004; SILVA; MURA, 2007; BALARAMAN et al., 2010;
PATEL et al., 2012). Esse número vem crescendo devido ao aumento da expectativa de
vida, ao crescimento populacional, aos hábitos de vida menos saudáveis e a maior
sobrevida desses pacientes (LYRA; CAVALCANTI, 2006 apud ALMEIDA, 2011;
DABLA, 2010; KAMBLE; BODHANKAR, 2013).
O diabetes ocorre em todas as faixas etárias, indo desde a infância até a velhice,
assinalando-se a grande maioria tendo atingido os 40 anos de idade ou mais (FRANCO;
CHALOUB, 1985). A idade constitui fator a ser considerado, pois com o aumento da idade
a tolerância à glicose sofre redução, ocasionada pela perda da sensibilidade dos tecidos à
insulina e não à insuficiência de sua secreção (FRANCO; CHALOUB, 1985).
Quanto ao sexo, ocorre maior incidência entre as mulheres, sendo ainda maior em
mulheres acima dos 45 anos que tiveram filhos, o que pode, em parte, refletir a ação de
fatores ligados à gravidez (FRANCO; CHALOUB, 1985).
O grau de tolerância à glicose sofre a influência de diversos fatores como: idade,
vida sedentária, obesidade, regime alimentar, ação de diversos fármacos e substâncias,
certas afecções endócrinas, insuficiência renal, acidente vascular encefálico, infarto do
miocárdio e gravidez (FRANCO; CHALOUB, 1985).
Os cálculos aproximados afirmam a existência de grande número de diabéticos a
serem diagnosticados, por pertencerem às classes denominadas de pré-diabete, diabete
subclínico e diabete latente ou químico (FRANCO; CHALOUB, 1985).
38
1.6.3 Insulina
Insulina é um hormônio polipeptídico formado a partir de 52 aminoácidos,
produzido e secretado pelas células β das ilhotas de Langerhans do pâncreas (KATZUNG,
2007; PANCREAS ENDOCRINO, 2012 apud ORTIZ, 2012), controlando o
armazenamento e o metabolismo dos carboidratos, proteínas e lipídeos dos alimentos
ingeridos. O indivíduo normal, quando da ingestão de dieta com carboidratos ou mista,
secreta insulina no sangue em teor necessário para promover a captação, utilização e
armazenamento de glicose e gorduras para as diversas funções que esses elementos
nutritivos exercem (FRANCO; CHALOUB, 1985).
As funções da insulina são variadas. Embora a mais conhecida esteja relacionada
com o metabolismo de carboidratos, tem efeito também sobre o metabolismo de lípideos ou
de proteínas. Em geral, a insulina é um hormônio anabólico que estimula e inibe os
processos catabólicos. A curto prazo aumenta o fornecimento de substratos dentro da célula
e os resultados a médio prazo resultam em um aumento na atividade das enzimas
relacionadas com a formação de reservas energéticas (ORTIZ, 2012).
Sua ação mais imediata envolve a captação de glicose no sangue e seu metabolismo,
nos tecidos muscular e adiposo, e a inibição da neoglicogênese no tecido hepático (WHITE
& KAHN, 1994; BEZERRA, 1999). Além de seus efeitos primários no controle da
homeostase de glicose, a insulina participa em numerosos outros eventos celulares
incluindo controle da expressão gênica, além de mudanças na taxa de tradução, síntese de
DNA, síntese e degradação de proteínas e regulação do transporte de íons e aminoácidos
em praticamente todas as células (CHEATHAM & KAHN, 1995 apud BEZERRA, 1999).
Os efeitos específicos da insulina se desenvolvem em três órgãos-alvo: o fígado, o
tecido adiposo e os músculos esqueléticos através de efeitos anticatabólicos nesses três
alvos (FRANCO; CHALOUB, 1985).
No fígado, a insulina estimula o armazenamento de glicogênio ou inibe a
gliconeogênese e a glicogenólise. Nos tecidos periféricos (muscular e adiposo), a insulina
estimula a captação, armazenamento e utilização da glicose (FELIG & BERGMAN, 1990
apud UENO, 1998). Somando-se a estes efeitos principais, a insulina também estimula o
metabolismo de glicose em outros tecidos que têm pequeno ou nenhum papel na
homeostase da glicose como um todo. A insulina modifica ou aumenta a função de outros
reguladores do metabolismo destas células (KAHN et al., 1993 apud UENO, 1998). Por
39
conseguinte, é um hormônio hipoglicemiante (HOMEOSTASIS ENERGETICA, 2012;
PANCREAS ENDOCRINO, 2012 apud ORTIZ, 2012).
Como consequência à produção insuficiente de insulina ocorre produção excessiva
de glicose pelo fígado, diminuição da captação da glicose pelos músculos e células adiposas
(FRANCO; CHALOUB, 1985). A diminuição no conteúdo de glicogênio hepático e
muscular em ratos diabéticos é relatada em diferentes estudos (GROVER et al., 2002 apud
MAITI, 2004).
A importância do entendimento da ação da insulina justifica-se pelos quadros de
menor efeito biológico do hormônio, isto é, resistência à insulina, que tem importante papel
na patogênese de muitas doenças, incluindo diabetes mellitus, obesidade, hipertensão, e na
intolerância a glicose associada a muitas outras doenças endócrinas (DeFRONZO, 1988;
REAVEN, 1988; MOLLER & FLIER, 1991; UENO, 1998).
1.6.4 Características e Estágios da Doença
O DM1 representa cerca de 5 a 10% de todos os casos de DM e é caracterizada por
uma deficiência na produção de insulina. Esta deficiência resulta de um processo complexo
em que fatores genéticos e ambientais conduzem a uma resposta autoimune levando a
destruição das células β-pancreáticas produtoras de insulina (DAVIES et al., 1994;
BEARDSALL et al., 2006). Em relação ainda ao DM1, há aquele tipo no qual a causa da
destruição das células β não é conhecida, sendo denominada como forma idiopática do
DM1 (GROOP et al., 1986; IMAGAWA et al., 2000). Geralmente o DM1 inicia antes dos
30 anos de idade, mas pode acometer indivíduos de qualquer faixa etaria (VEHIK et al.,
2007; BARAT et al., 2008).
O diabetes tipo II aparece em geral em idades mais avançadas. Suas causas ainda
não foram esclarecidas em detalhes, porém é o tipo mais frequente na população,
representando cerca de 90% dos casos (ROSAK, 2002; KOOLMAN; RÖHM, 2005;
BEARDSALL et al., 2006; CAMPBELL et al., 2011; KARAGIANNIS et al., 2012). Esse
tipo de DM está altamente relacionado com um estilo de vida sedentário e com um alto
consumo calórico, motivo pelo qual é mais encontrado em adultos com sobrepeso e
obesidade. O aumento da gordura corporal causa um impacto negativo sobre a sensibilidade
à insulina. Em longo prazo, o DM2 aumenta os riscos do desenvolvimento de complicações
que são causa substancial de morbidade e mortalidade: doença macrovascular, nefropatia,
40
retinopatia e neuropatia (CALCUTT et al., 2009; MARIGLIANI, 2012). As complicações
do diabetes ainda incluem isquemia de membros levando a amputações, problemas
dentários e distúrbios da gravidez (CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND
PREVENTION, 2011). A hiperglicemia nesses pacientes não só agrava a resistência, como
compromete a secreção da insulina (LYRA; CAVALCANTI, 2006 apud ALMEIDA,
2011). Diante disso, os tecidos perdem a sensibilidade a ação da insulina e,
consequentemente, a concentração de glicose sanguinea aumenta (CAMPBELL et al.,
2011; KARAGIANNIS et al., 2012; BEARDSALL et al., 2006; ROSAK, 2002).
O diabetes costuma ser dividido em quatro estágios, segundo a Associação de
Diabetes:
1 – Pré-diabetes ou diabetes potencial: desde a concepção até o aparecimento de
qualquer anormalia no metabolismo dos carboidratos.
2 – Diabetes subclínico, suspeito ou latente: as provas usuais de laboratório para
caracterizar a perturbação do metabolismo dos carboidratos são normais. As provas de
tolerância à glicose sensibilizada pela cortisona são positivas. Esta fase seria reversível,
uma vez que deixasse de atuar o fator diabetogênico desencadeante.
3 – Diabetes latente ou químico ou assintomático: sem apresentar os clássicos
sintomas do diabetes, apenas evidenciável pelas provas usuais de laboratório.
4 – Diabetes manifesto ou clínico: com o aparecimento dos sintomas típicos do
diabetes (FRANCO; CHALOUB, 1985).
De acordo com a Sociedade Brasileira de Diabetes, (2009), a classificação do DM é
baseada na etiologia da doença e não mais no tratamento do DM. Assim, sugere-se que os
termos insulinoindependente e insulinodependentes não sejam mais utilizados. O DM é
classificado em três tipos básicos: DM Tipo 1 (DM1), DM Tipo 2 (DM2) e DM
Gestacional (MARASCHIN et al., 2010; DIRETRIZES SBD, 2009).
Segundo Report os the Expert Commitee on the Diagnosis and Classification of
Diabetes melito, (2008), segue a Classificação Etiológica do Diabetes Melito, Figura 14.
41
Figura 14. Classificação Etiológica do Diabetes Melittus.
Fonte: ADA, 2008.
1.6.5 Causas
O processo de transição demográfica e epidemiológica, marcado pelo aumento da
prevalência de Doenças e Agravos Crônicos Não Transmissíveis (DACNT), traz consigo
implicações para o perfil nutricional e alimentar da população brasileira. Ao mesmo tempo,
como resultado da adoção do estilo de vida sedentário e do consumo de dietas
desbalanceadas houve redução da prevalência de desnutrição e aumento da prevalência de
sobrepeso e obesidade (BATISTA FILHO; RISSIN, 2003). Como consequência das
alterações metabólicas decorrentes dos hábitos de vida inadequados, as DACNT são
atualmente problemas de saúde pública que atingem proporções epidêmicas (AMERICAN
DIABETES ASSOCIATION, 2004). Dentre as DACNT, o diabetes mellitus, merece
destaque (WILD et al., 2004).
42
Durante o processo de digestão normal, o organismo transforma os carboidratos em
glicose, que é utilizada pelo tecido na presença de insulina (WARJEET, 2011 apud PATEL
et al., 2012). Conforme os níveis de glicose sobem, o pâncreas responde pela liberação do
hormônio insulina, que permite que a glicose deixe a corrente sanguínea e entre nas várias
células onde ela é um combustível para as atividades corporais. A glicose também é
capturada pelo fígado e é armazenada como glicogênio para o uso posterior. Quando as
concentrações de glicose da última refeição diminuem, o organismo vai de um estado de
alimentado para o de jejum. Os níveis de insulina reduzem, o que impede que os níveis de
glicose sanguínea diminuam. Além disso, a glicose armazenada é liberada do fígado de
volta para a corrente sanguínea com a ajuda do glucagon, um hormônio que também é
liberado pelo pâncreas. Normalmente, a capacidade do organismo de equilibrar a glicose, a
insulina e o glucagon (e outros hormônios contra-reguladores) mantêm os níveis
circulatórios de glicose dentro da variação normal.
O glucagon é um hormônio polipeptídico constituído por 29 aminoácidos
(HOMEOSTASIS ENERGETICA, 2012; PANCREAS ENDOCRINO, 2012 apud ORTIZ,
2012), produzido e secretado pelas células α das ilhotas de Langerhans no pâncreas. Ele
estimula a glicogenólise nos hepatócitos e gliconeogênese, sendo, portanto, um hormônio
hiperglicemiante (HOMEOSTASIS ENERGETICA, 2012; PANCREAS ENDOCRINO,
2012 apud ORTIZ, 2012). A insulina sérica varia diretamente com o teor de carboidrato na
dieta enquanto o glucagon sérico tende a decrescer quando o conteúdo de carboidrato
aumenta (UNGER & ORCI, 1976 apud JONG, 1996). A atividade simpática é mais
influenciada pela quantidade de proteína da dieta do que pelo lipídeo ou carboidrato (VAN
DER TUIG & ROMSOS, 1984; JONG, 1996).
A insulina promove baixa taxa de glicose no sangue e aumenta a utilização e o
armazenamento do glicogênio hepático e muscular. O excesso de carboidratos é
armazenado como gordura, para prevenir períodos de deficiência calórica e para fornecer
energia. A lipogênese converte o excesso de glicose e de intermediários, tais como o
piruvato, o lactato e a acetil-CoA à gordura, participando da fase anabólica do ciclo
alimentar (MURRAY et al., 2006). As fontes de ácidos graxos de cadeia longa são os
lipídeos da dieta a partir do acetil-CoA proveniente de carboidratos. Quase todos os
processos da digestão de carboidratos, proteínas e lipídeos são metabolizados, produzindo
43
um metabólito comum a acetilCoA, que é então oxidada no ciclo do ácido cítrico
(MURRAY et al., 2006).
Os ácidos graxos podem ser oxidados a acetil-CoA (β-oxidação) ou esterificados
com o glicerol, dando triacilgliceróis que são as principais reservas calóricas do organismo.
Embora os ácidos graxos sejam tanto oxidados quanto sintetizados a partir de acetil-CoA, a
oxidação dos ácidos graxos não é uma simples reversão da sua biossíntese. A separação
entre a oxidação e a biossíntese permite que cada processo seja individualmente controlado
e integrado às necessidades do tecido. O aumento da oxidação dos ácidos graxos é
característico dos estados de inanição e do diabetes, conduzindo a produção de corpos
cetônicos pelo fígado (MURRAY et al., 2006).
A acetil-CoA formada na β-oxidação tem vários destinos, um destes destinos é no
fígado, formando os corpos cetônicos (acetona, acetoacetato e 3-hidroxibutirato) que são
importantes combustíveis no jejum prolongado (MURRAY et al., 2006). Há perda de
corpos cetônicos pela urina, mas é apenas uma parcela do total de corpos cetônicos
produzidos e utilizados pelo organismo. Excreções contínuas e em grandes quantidades
esgotam a reserva alcalina provocando cetoacidose. Esse padrão geral do metabolismo pode
estar exagerado, determinando os estados patológicos encontrados na doença (MURRAY et
al., 2006).
No fígado a gliconeogênese está aumentada, entre outros, através da proteólise. Se a
capacidade dos rins de reabsorver a glicose é ultrapassada, ocorre a remoção crescente de
glicose pela urina (KOOLMAN; RÖHM, 2005). No fígado, os efeitos anticatabólicos
constituem na redução da glicogenólise (transformação do glicogênio em glicose), na
neoglicogênese (formação de glicose a partir de outras substâncias que não os carboidratos:
proteínas e lipídeos), havendo diminuição da cetogênese (formação de corpos cetônicos),
enquanto os efeitos catabólicos referem-se ao aumento da síntese do glicogênio e dos
ácidos graxos. No músculo, os efeitos anticatabólicos são representados pela redução do
catabolismo protéico e na redução da mobilização dos aminoácidos, e os efeitos anabólicos
residem na captação aumentada de aminoácidos, aumento da síntese protéica e do
glicogênio (FRANCO; CHALOUB, 1985).
Durante o diabetes a hiperglicemia é considerada a principal fonte de geração de
Produtos Finais de Glicação Avançada (AGE), mas a participação de outros aldeídos
reativos, como o metilglioxal e o glicolaldeído (GA) também são de grande importância. O
44
processo de glicação pode levar a duas situações no organismo: a) alteração na estrutura da
proteína com consequente alteração da sua função; b) a geração de moléculas sinalizadoras
(AGE) com potencial pró-inflamatório e pró-trombótico (ANDRADES, 2010).
A geração de Produtos Finais de Glicação Avançada (do inglês Advanced Glycation
End-Products – AGE) nesses indivíduos tem sido frequentemente relatada como importante
fator de complicação da doença devido a hiperglicemia e estresse oxidativo. Os AGE são
modificações pós traducionais encontradas em proteínas e têm origem em uma reação não
enzimática entre uma proteína e um açúcar redutor, ou com um aldeído reativo
(ANDRADES, 2010).
Devido ao elevado nível glicêmico, proteínas são modificadas e convertidas em
glicoproteínas. Modificações de proteínas presentes nas lentes, na parede vascular e as
membranas basais são associadas com o desenvolvimento de complicações do diabetes, tais
como cataratas, microangiopatia, aterosclerose e nefropatia. No diabetes mellitus, há
também várias anormalidades na lipoproteína de muito baixa densidade (VLDL),
lipoproteína de baixa densidade (LDL) e lipoproteína de alta densidade (HDL). A
peroxidação lipídica e os AGEs são formados por glicosilação não-enzimática de proteínas
(PATEL et al., 2012).
Em alguns pacientes portadores de diabetes, principalmente do tipo 1, as proteínas
podem ser convertidas em glicose muito facilmente, gerando efeitos negativos sobre o
índice glicêmico, especialmente quando este consumo é elevado. Em pessoas com o
diabetes controlado, tanto do tipo 1 quanto do 2, com adequado consumo alimentar, esses
efeitos adversos da proteína dificilmente são apresentados (SEYFFARTH, 2007).
As proteínas e os lipídeos não elevam a glicemia tanto quanto os carboidratos, seu
efeito vai depender das quantidades consumidas e do equilibro entre os nutrientes. Contudo,
muitos alimentos essencialmente referidos como fontes de proteína ou lipídeos também
contêm carboidrato (SEYFFARTH, 2007).
O nível de lipídeos séricos é geralmente elevado em diabetes mellitus e tal elevação
representa um fator de risco para doença cardíaca coronária. Este nível anormalmente
elevado de lipídeos se deve principalmente às ações desinibidas de hormônios lipolíticos
sobre os depósitos de gordura, principalmente devido à ação da insulina. Sob circunstâncias
normais, a insulina ativa a enzima lipase lipoproteíca, que hidrolisa triglicérides. No
entanto, no estado diabético, a lipase lipoproteíca não é ativada devido a deficiência de
45
insulina, resultando em hipertrigliceridemia (PUSHPARAJ et al., 2007; SAH, et al., 2011).
A deficiência de insulina está também associada a hipercolesterolemia devido às
anormalidades metabólicas (MURALI et al., 2002; SAH, et al., 2011). Os ácidos graxos
aumentados causam diminuição adicional na sensibilidade à insulina no nível celular,
prejudicando a secreção pancreática de insulina e aumentando a produção de glicose
hepática (lipotoxicidade) (BERGMAN e ADLER, 2000 apud MAHAN e ESCOTT-
STUMP, 2005).
1.6.6 Sintomas e Diagnóstico
Diabetes mellitus é uma síndrome, associada com hiperglicemia, hiperlipidemia,
estresse oxidativo, poliúria, podipsia, polifagia, cetose, neuropatia, nefropatia e desordens
cardiovasculares (GEORG; LUDVIK, 2000 apud BERA et al., 2012; SOUZA; MBATCHI;
HERCHUELZ, 2011). O organismo perde, parcialmente, a capacidade de utilizar os
açúcares dos alimentos ingeridos, ocasionando o acúmulo de glicose no sangue que não se
transforma em energia, tendo como consequência fraqueza, perda de massa corporal e
hiperglicemia, a qual é uma complicação gerada pela resposta defeituosa ou deficiente da
secreção do hormônio insulina (NEGRI, 2005).
A poliúria (aumento exagerado da diurese) é, talvez, a manifestação clínica mais
frequente e precoce. Quando o limiar renal para a glicose (≈ 180 mg/dL) é excedido
(glicosúria), a glicose é perdida através da urina (CARRILLO, 2011 apud ORTIZ, 2012),
havendo diurese osmótica, o que acarreta em polidipsia (FRANCO; CHALOUB, 1985). A
polidipsia é o aumento da sede, sendo um mecanismo para combater e prevenir a poliúria e
a desidratação. Pode ser que a intensidade da poliúria e polidipsia varie a relação com o
nível de glicose no sangue resultante de variações no limiar renal para a glicose, o que
tende a aumentar com a idade. Isso contribui para que estes sintomas passem despercebidos
(CARRILLO, 2011; SINTOMAS DE LA DIABETES, 2012 apud ORTIZ, 2012).
A polifagia é o apetite excessivo em indivíduos diabéticos, já que há penetração
insuficiente de glicose em diferentes tecidos. Além disso, a glicosúria implica uma perda de
glicose na urina, contribuindo para a redução da captação intracelular de glicose
(CARRILLO, 2011; SINTOMAS DE LA DIABETES, 2012 apud ORTIZ, 2012). Dessa
forma, no estado diabético há predileção para alimentos ricos em açúcar (FRANCO;
CHALOUB, 1985).
46
A fadiga é um resultado da alteração do metabolismo da glicose, a nível da célula
muscular. Em adição a este déficit de "energia de glicose" no tecido muscular há a má
utilização de proteínas e de lipídeos, bem como a diminuição de glicogênio no fígado e
músculo, o que contribui progressivamente para a exaustão e sonolência do indivíduo
(SINTOMAS DE LA DIABETES, 2012 apud ORTIZ, 2012; FRANCO; CHALOUB,
1985).
O emagrecimento, característico do diabetes tipo I é também um resultado da
glicosúria. Mas também a falta de outras manifestações de efeito anabólico da insulina nos
tecidos, tais como a diminuição da lipogênese e aumento da lipólise no tecido adiposo,
também o aumento da proteólise e diminuição da síntese de proteínas, colaboram
significativamente para a perda de massa corporal no diabético (CARRILLO, 2011;
SINTOMAS DE LA DIABETES, 2012 apud ORTIZ, 2012). O paciente constata o
paradoxo: come muito e emagrece (FRANCO; CHALOUB, 1985). Consequência do
emagrecimento e da desidratação pode ocasionar a pele seca e áspera do diabético
(FRANCO; CHALOUB, 1985). Também pode ser queixar de visão enfraquecida ao
realizar algumas atividades (FRANCO; CHALOUB, 1985) e dores principalmente nos
membros inferiores, além de cãibras em repouso ou pelo esforço (FRANCO; CHALOUB,
1985).
De acordo com a Organização Mundial de Saúde, os danos causados pelo DM
incluem danos a longo prazo como disfunção de vários órgãos (LYRA; CAVALCANTI,
2006 apud ALMEIDA, 2011; GROSS et al., 2002).
Essas alterações podem ser: de origem microvascular (devido a danos aos pequenos
vasos sanguíneos) e macrovascular (devido a danos em vasos de grande calibre). As
principais complicações microvasculares incluem a nefropatia, a retinopatia, a neuropatia,
os efeitos mais evidentes são: na retina, rins e nervos periféricos (NOBRE; SERRANO,
2005 apud SALES, 2011). As complicações macrovasculares incluem doenças
cardiovasculares, acidente encefálico vascular, doença vascular periférica (MELENDEZ-
RAMIREZ et al., 2010), aterosclerose grave e acelerada, anormalidades do metabolismo
lipídico, elevados níveis de lipídeos e lipoproteínas (KEENOY; VERTOMMEN; LEEUW,
2005 apud FERNANDES et al., 2010; RAANAN et al., 2008), aumento no risco de infarto
do miocárdio, acidente vascular cerebral (NOBRE; SERRANO, 2005 apud SALES, 2011),
hipertensão arterial, alterações no sistema nervoso periférico, disfunções sexuais e
47
artropatias, dentre outras complicações que podem evoluir para cegueira, falência renal,
doenças coronarianas e vasculares cerebrais de forma sucessiva (FRANCO, 2004;
AMERICAN DIABETES ASSOCIATION, 2006; SOCIEDADE BRASILEIRA DE
DIABETES, 2006 apud SALES, 2011), amputação de membros, perda de função e
comprometimento da qualidade de vida sendo responsáveis por expressiva morbidade e
mortalidade (SCHAAN; HARZHEIM; GUS, 2004; BRASIL, 2006; SALES, 2011).
Diversas são as repercussões sistêmicas causadas pelo diabetes, podemos citar ainda
fragilidade capilar, alterações osteomioarticulares, além da susceptibilidade as lesões
cutâneas por fungos e aos problemas cardiovasculares (BOELTER, et al., 2003; SCHAAN;
HARZHEIM; GUS, 2004; HALFOUN, et al., 2003; GONÇALVES; SALGADO, 2003).
Deve-se salientar que nem todos os portadores de diabetes podem apresentar os
clássicos sintomas da doença, sendo muitas vezes diagnosticados após exame laboratorial
(FRANCO; CHALOUB, 1985). Além disso, nem todas as pessoas com diabetes têm os
mesmos sintomas de hiperglicemia. Em algumas pessoas os sintomas podem não ser tão
óbvio. Geralmente, os sintomas não aparecem no início da doença e, portanto, o diabetes
somente é diagnosticado quando exames de rotina mostram níveis glicêmicos (acima de
200 mg/dL) (hiperglicemia) (AREAS, 1994) resultando em excreção da glicose pela urina
(glicosúria) (NEGRI, 2005).
Três métodos podem ser utilizados para diagnosticar o diabetes: sintomas clínicos,
valores de glicemia de jejum, e valores de glicemia pós-prandial (ADA, 2007 apud
ALMEIDA, 2011). Para glicemia de jejum, valores acima de 126mg/dl podem ser
indicativos de DM, sendo necessário realizar novo exame para a confirmação. Enquanto a
glicemia pós-prandial acima de 200mg/dl medida 2 horas após a ingestão de 75g de
carboidrato é considerado diagnóstico para DM (SBD, 2011 apud ALMEIDA, 2011;
GROSS et al., 2002).
No diagnóstico, as pessoas com diabetes tipo 1 são normalmente magras e têm sede
excessiva, micção frequente e perda de massa corporal significante. O defeito primário é a
destruição de célula β-pancreática, normalmente levando à deficiência absoluta de insulina
e resultando em hiperglicemia, poliúria (micção excessiva), polidipsia (sede excessiva),
perda de massa corporal, desidratação, distúrbio de eletrólitos e cetoacidose. A taxa de
destruição de células β é bastante variável, ocorrendo rapidamente em algumas pessoas
48
(lactentes e crianças) e lentamente em outras (adultos) (MAHAN e ESCOTT-STUMP,
2005).
O diabetes tipo 2 pode ser responsável por 90 a 95% de todos os casos de diabetes
diagnosticados e é uma doença progressiva que, na maioria dos casos, está presente muito
antes de ser diagnosticada. A hiperglicemia se desenvolve gradualmente e com frequência
não é grave o suficiente nos estados iniciais para o paciente observar qualquer um dos
sintomas clássicos do diabetes. Apesar de não diagnosticados, estes indivíduos estão em
risco maior de desenvolver complicações macro e microvasculares (MAHAN e ESCOTT-
STUMP, 2005).
Na prática, a anamnese do paciente sobre a existência de diabéticos na família e os
sintomas apresentados, constituem dados importantes para a possibilidade de ocorrência de
diabetes (FRANCO; CHALOUB, 1985).
Outro parâmetro importante a ser avaliado é a hemoglobina glicada (HbA1)
utilizada como parâmetro de referência para avaliar o grau de hiperglicemia crônica entre
os pacientes diabéticos (SACKS, 2003; SAUDEK et al., 2006; CAVAGNOLLI, 2011).
Hemoglobina glicada (HbA1) tem servido como um indicador do controle
glicêmico, há relato do aumento do nível de HbA1 em pacientes internados com diabetes
mellitus (BASHA; SUBRAMANIAN, 2011 apud KAMBLE e BODHANKAR, 2013). O
excesso de glicose presente no sangue reage com a hemoglobina formando a HbA1. Assim,
estimativa de hemoglobina glicada é um parâmetro bioquímico bem aceito e útil para o
diagnóstico e tratamento da doença (ADARAMOYE, 2012 apud KAMBLE e
BODHANKAR, 2013). As dosagens de glicose e HbA1 são complementares para avaliação
do controle do DM, pois fornecem informações distintas e complementares acerca dos
níveis de glicemia sanguínea. Enquanto que os resultados de HbA1 refletem a glicemia
média no intervalo de dois a três meses antecedentes a coleta, complementando as
medições mais tradicionais de controle glicêmico como medição da glicose em plasma ou
urina (INFOTEC LABTEST), os resultados de glicemia refletem a avaliação pontual, ou
seja, no momento da coleta da amostra de sangue (SBD, 2002 e 2006 apud SUMITA e
ANDRIOLO, 2008; SACKS, 2003; SAUDEK et al., 2006).
Os valores de HbA1 entre 4% e 6% são considerados normais e níveis acima de 7%
estão associados a um risco maior de complicações crônicas (CAVAGNOLLI, 2011). Por
esta propriedade, a determinação da HbA1 para avaliação da glicemia nos diabéticos é de
49
grande utilidade porque avalia o real quadro glicêmico dos últimos meses. Em pacientes
diabéticos, quando o controle glicêmico não é feito de forma rigorosa, a porcentagem de
Hb1A glicada aumenta e sua determinação laboratorial é usada para avaliar o controle
glicêmico retroativo nestes pacientes (ORTIZ, 2004; GARCÍA et al., 2009). O aumento
exponencial no desenvolvimento de complicações da doença está relacionado com o
aumento dos níveis de HbA1 (CAMARGO e GROSS, 2004).
1.6.7 Tratamento, Prevenção e Cura
O diabetes mellitus contribui para um aumento considerável nas taxas de morbidade
e mortalidade, que podem ser reduzidas por diagnóstico e tratamentos precoces (MAHAN e
ESCOTT-STUMP, 2005).
O objetivo do tratamento do diabetes consiste em reduzir o nível de glicose no
sangue, utilizando drogas anti-diabéticas que podem agir de maneiras diferentes, tais como
a estimulação de células β das ilhotas do pâncreas para libertar insulina, aumento do
número e sensibilidade de receptores de insulina, aumento do conteúdo de glicogênio,
promoção da utilização de glicose no tecido, eliminação dos radicais livres, resistência a
peroxidação lipídica, combate ao distúrbio metabólico de lípideos e proteínas (LI et al.,
2004; PATEL et al., 2012).
No diabetes mellitus, a dieta constitui um elemento fundamental no controle dessa
afecção, além de outras medidas como exercício adequado, hábitos higiênicos e do
emprego de reguladores do açúcar sanguíneo, como as insulinas e os hipoglicemiantes
orais, quando necessário (FRANCO; CHALOUB, 1985).
O regime alimentar é necessário para manter o paciente com DM2 compensado
metabolicamente, com peso adequado e com boa disposição física e mental, livre de
complicações (FRANCO; CHALOUB, 1985). A elaboração da dieta do diabético deve ser
feita para cada paciente isoladamente e determinada pelo médico ou nutricionista.
Infelizmente, é comum ver-se diabéticos seguirem conselhos de leigos, abandonando os
alimentos prescritos na dieta e substituindo ou incluindo outros que não foram
determinados, sob a alegação de que aqueles são “quentes”, “ácidos”, “que fazem mal ao
fígado” etc (FRANCO; CHALOUB, 1985).
A inclusão na dieta de grãos integrais, fibras, frutas e hortaliças são fatores que
podem retardar ou prevenir o diabetes tipo 2 (WING, 1999 apud MAHAN e ESCOTT-
50
STUMP, 2005). As fibras são classificadas em solúveis e insolúveis, tendo as primeiras
importante função no controle glicêmico (especialmente as pectinas e as β-glucanas) e as
insolúveis atuam na fisiologia intestinal (SEYFFARTH, 2007). As fibras solúveis
representadas pela pectina (frutas) e pelas gomas (aveia, cevada e leguminosas: feijão,
grão-de-bico, lentilha e ervilha) reduzem o tempo de trânsito intestinal e ajudam na
eliminação do colesterol. As fibras insolúveis são representadas pela celulose (trigo),
hemicelulose (grãos) e lignina (hortaliças).
O consumo de fibras na dieta está envolvido com melhorias no perfil lipídico, na
pressão arterial e na sensibilidade à insulina (BURTON, 2000; ALMEIDA, 2011). As
fibras reduzem a taxa de esvaziamento gástrico, digestão e absorção da glicose
(ALMEIDA, 2011). Estudos mostram que as fibras alimentares têm uma boa resposta na
prevenção do DM, porém apenas as solúveis teriam um papel positivo sobre a glicemia e a
resposta insulínica pós-prandial (MELLO; LAAKSONEN, 2009; ALMEIDA, 2011), pois
podem interferir na absorção da glicose alimentar, sendo os picos glicêmicos diminuídos
após as refeições contendo elevados teores de fibras (SBD, 2009 apud ALMEIDA, 2011).
A atuação da fibra solúvel na resposta glicêmica resulta do aumento da resposta da
colecistoquinina durante a refeição, o que provoca o retardo do esvaziamento gástrico que
associado à viscosidade que as fibras conferem ao bolo alimentar diminui a superfície de
contato com a mucosa do intestino delgado, levando a uma menor absorção dos nutrientes
(SACHS, 2006 apud SALES, 2011). Outros mecanismos que podem explicar o efeito da
fibra solúvel na redução dos níveis séricos de glicose e insulina incluem a complexação da
glicose com a fibra solúvel, reduzindo sua absorção, bem como a inibição da alfa-amilase
diminuindo a digestão do amido (SACHS, 2006 apud SALES, 2011; LLANO; FERRER,
2006; WÜRSCH; PI-SUNYER, 1987).
O consumo de gorduras saturadas, encontradas principalmente em alimentos de
origem animal, deve ser realizado com moderação, pois pode causar elevação dos níveis de
colesterol e triglicérides. Uma dieta com menor teor de gordura (até 25% das calorias) pode
auxiliar na melhora dos lipídeos sanguíneos, como o colesterol total e a lipoproteína LDL-
colesterol. Resultados ainda melhores podem ser conquistados se a gordura adicionada for
monoinsaturada, como o azeite de oliva, canola, girassol ou amendoim. As gorduras poli-
insaturadas encontradas em peixes, semente de linhaça e óleo de soja são importantes
51
componentes alimentares que também auxiliam na manutenção de um adequado perfil
lipídico sanguíneo (SEYFFARTH, 2007).
A ingestão de gordura é inversamente associada à sensibilidade insulínica, visto que
o consumo exagerado aumenta o risco de desenvolvimento de problemas cardíacos, além
de serem marcadores inflamatórios, bem como diminuírem a sensibilidade à insulina
(ALMEIDA, 2011). Tendo em vista que os carboidratos estão diretamente ligados com o
aumento da glicemia, é importante considerar, principalmente, o tipo de carboidrato que
está sendo ingerido, sendo preferível o consumo de açúcares complexos aos açúcares
simples, já que estes apresentam alto índice glicêmico (ADA, 2008 apud ALMEIDA,
2011).
A redução de triglicérides e do colesterol LDL, o aumento do colesterol HDL, a
diminuição da frequência cardíaca em repouso e em atividade, a redução da pressão arterial
são algumas das melhoras nas medidas fisiológicas decorrentes de um estilo de vida
fisicamente ativo que é ainda mais importante nos portadores de diabetes mellitus, já que o
risco de mortalidade por doenças coronarianas é quatro a cinco vezes maiores nesses
indivíduos quando comparados com aqueles que não apresentam diabetes mellitus
(FECHIO; MALERBI, 2004).
Indivíduos com DM1 encontra-se em situação diferente no que se relaciona ao
metabolismo dos alimentos ingeridos, pois quando tratado com insulina recebe uma dose
fixa, devendo adequar a ingestão de alimentos, principalmente dos carboidratos, à atividade
da insulina, que por sua vez também varia quando do início de sua atuação e a duração de
sua ação (FRANCO; CHALOUB, 1985).
No caso dos indivíduos com DM2, se a dieta e o exercício não funcionam
corretamente, então a medicação anti-diabética oral deve ser prescrita. Com base no
mecanismo de ação, as drogas anti-diabéticas podem ser essencialmente divididas em
insulina, secretagogos da insulina (sulfoniluréias e meglitinidas), promotores do aumento
da sensibilidade à insulina (tiazolidinedionas, biguanidas), fator de crescimento semelhante
à insulina, inibidores da aldose redutase, inibidores da alfa-glicosidase e inibidor da
glicação de proteínas (LI et al., 2004; PATEL et al., 2012). Eles podem ser usados sob a
forma de monoterapia ou em combinação com outras drogas para obter melhores resultados
(LI et al., 2004; PATEL et al., 2012).
52
Embora estas drogas sejam eficazes na redução da glicemia, eles podem causar
efeitos secundários indesejáveis e graves (tais como o ganho de massa corporal e
hipoglicemia, edema, disturbios gastrointestinais e resistência à insulina) o que pode
desencorajar a adesão do paciente (VASCONCELOS, 2011), anorexia nervosa, atrofia do
cérebro e do fígado gorduroso após tratamento (PIEDROLA et al., 2001 apud MAITI,
2004), estresse oxidativo, resultante da superprodução de espécies reativas de oxigênio
juntamente com a insuficiente capacidade antioxidante, induzido pela crônica hiperglicemia
tem sido associada com a disfunção e apoptose de vários tipos de células, incluindo as
células pancreáticas e neurônios (JANA et al., 2010 apud BERA et al., 2010; VINCENT et
al., 2004).
Um tratamento ideal para o diabetes seria uma droga que não somente controlasse o
nível de açúcar no sangue, mas também impedisse o desenvolvimento de arteriosclerose e
outras complicações de diabetes (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1985 apud SAH, et al.,
2011). O controle efetivo de glicose no sangue é a chave para a prevenção ou inversão de
complicações diabéticas e melhora da qualidade de vida de pacientes com diabetes. Assim,
redução sustentada na hiperglicemia vai diminuir o risco de desenvolver complicações
microvasculares e provavelmente reduzir o risco de complicações macrovasculares
(LATHA et al., 2004 apud SAH, et al., 2011).
Apesar de progressos consideráveis no tratamento do diabetes com a insulina e
hipoglicemiantes orais, a busca de novas drogas continua devido as várias limitações das
drogas sintéticas existentes (KNOWLER et al., 2002 apud DUTTA, 2013; FONTEBONNE
et al., 1996). Portanto, procurar agentes seguros e mais eficazes continua sendo uma
importante área ativa da pesquisa, pois até o momento nenhum dos fármacos antidiabéticos
é capaz de produzir controle glicêmico a longo prazo, sem causar quaisquer efeitos
secundários adversos (SINGH et al., 2007; OYEDEMI et al., 2011).
O diabetes não possui tratamento curativo definitivo e, em geral, quando detectado e
controlado tardiamente, causa danos orgânicos e funcionais importantes. Entre os danos
derivados ou intensificados pelo diabetes está a progressão para a cegueira, aparecimento
de doenças cardiovasculares, comprometimento funcional dos rins, da circulação periférica
e microcirculação, induzindo casos de amputação de membros e podendo levar até a morte
(RIEDER; GUARIM NETO, 2012). Assim, o tratamento e a cura do diabetes sem qualquer
efeito colateral ainda é um desafio (NEERAJ VERMA et al., 2012). Nesse contexto,
53
informações do uso de plantas medicinais e no controle dessa patologia têm grande valor
(RIEDER; GUARIM NETO, 2012).
Avanços para o tratamento do diabetes podem ser encontrados em recursos do reino
vegetal, e o saber popular é importante para dar indícios (RIEDER; GUARIM NETO,
2012). Plantas medicinais, desde tempos imemoriais, têm sido utilizados em praticamente
todas as culturas como uma fonte de medicamento. Os efeitos hipoglicemiantes de alguns
extratos de plantas medicinais foram confirmados em modelos humanos e animais de
diabetes tipo 2 (PATEL et al., 2012). A maioria das plantas/produtos naturais contêm
glicosídios, alcalóides, terpenos, flavonóides, carotenóides, terpenóides, compostos
fenólicos, e algumas outras categorias que têm mostrado potencial anti-diabético
(MALVIYA; JAIN; MALVIYA, 2010 apud PATEL et al., 2012).
Quantidades adequadas de antioxidantes no meio intracelular são de grande
importância para maior segurança contra os ataques dessas espécies reativas, prevenindo o
aparecimento de complicações no diabetes (VALKO, et al., 2007; OLIVEIRA, 2010).
Dessa forma, extratos de plantas que possuam um perfil antioxidante podem ter papel
importante na redução da oxidação lipídica em tecidos (ÂNGELO & JORGE, 2007).
O etnoconhecimento ou o saber popular jamais pode ser desprezado, não só pelo seu
valor próprio, mas pelos caminhos que pode indicar e encurtar para o desenvolvimento da
ciência; de descobertas promissoras e inovação, estimulando o desenvolvimento
tecnológico (RIEDER; GUARIM NETO, 2012). Se há ou não eficácia no controle das
enfermidades é uma questão que deve ser respondida pela comunidade científica (RIEDER;
GUARIM NETO, 2012).
O potencial para novas descobertas de componentes terapêuticos é grande diante de
muitas ainda insuficientemente estudadas. Estas podem propiciar grandes avanços em
tratamentos mais eficazes e até cura de enfermidades que desafiam a competência das
sociedades atuais e futuras (RIEDER; GUARIM NETO, 2012).
Nesse sentido, relatos informais encontrados em sites de buscas da internet apontam
o “leite de alpiste” como um potencial hipoglicemiante. O “leite de alpiste” é um produto
derivado, conforme algumas descrições contêm substâncias anti-inflamatórias, que é rico
em vitaminas E, complexo B e em antioxidantes que evitam o envelhecimento precoce das
células, mostrando eficácia no tratamento de várias patologias (GALVÃO, 2013). Por
possuir uma alta quantidade de enzimas, proteína vegetal, antioxidantes e aminoácidos,
54
ajuda a reduzir inflamações de órgãos internos como fígado, rins e pâncreas, o que pode ser
de grande ajuda para pessoas com diabetes e cirrose (BITTAR, 2013). Também utilizado
no tratamento do colesterol, auxiliando o emagrecimento e o ganho de massa muscular.
Age eliminando o excesso de líquidos no organismo, recarregando os rins com enzimas
importantes ao seu correto funcionamento. Em algumas partes do mundo, ele é usado para
tratar pedras nos rins, vesículas, infecções urinárias e bexiga (BENEFÍCIOS DO
ALPISTE..., 2013), funciona como diurético, elimina toxinas ingeridas durante o dia
(GALVÃO, 2013).
A grande quantidade de fibras contidas nas sementes ajuda também no processo de
digestão, combatendo a prisão de ventre (BITTAR, 2013). O consumo do “leite de alpiste”
é recomendado para auxiliar nos tratamentos de combate a várias doenças, entre elas,
úlceras, hiperuricemia, edema, gota, gastrite, hipertensão e cirrose (GALVÃO, 2013).
É indicado para quem tem diabetes, pois suas propriedades também incluem aliviar
ou sanar edemas e tratar a retenção de líquidos. Alguns estudos ainda trazem informações
de que o alpiste pode ajudar no controle da pressão arterial, da acne e ainda promove o
crescimento de unhas e cabelos (ALPISTE..., 2013).
O alpiste passou por profunda pesquisa na Universidade Nacional do México em
função do alto valor protéico e dos seus aminoácidos. O resultado da pesquisa revelou que
o alpiste tem a capacidade de recarregar e curar o organismo humano. Por ser emoliente
relaxa e abranda as partes inflamadas, além de refrescante se usado externamente em
eczemas (LEITE DE ALPISTE..., 2013). Com base em inúmeros benefícios relatados, as
pessoas estão se deixando levar pelas dietas da moda, onde preparam o “leite de alpiste”.
Contudo, não existe qualquer registro na literatura científica sobre o assunto até o
momento.
Nesse contexto este estudo foi desenvolvido para avaliar os efeitos desse suposto
alimento.
55
2. JUSTIFICATIVA
O alpiste apresenta importância econômica para o país em termos de alimentação de
pássaros, porém apesar dos relatos acerca de seu uso pelo homem como componente
dietético e até mesmo como hipoglicemiante, estudos científicos que comprovem seus
efeitos biológicos e que o caracterizem quimicamente são escassos ou ausentes. Dessa
forma, a análise dos compostos químicos e fenólicos totais e da possível atividade
antioxidante e hipogliceminate de sementes de alpiste e de seu respectivo extrato aquoso
poderão fornecer informações importantes a respeito dos benefícios à saúde decorrentes da
sua ingestão, já que o seu consumo vem sendo registrado no dia a dia de pessoas diabéticas.
3. OBJETIVO GERAL
Realizar a caracterização físico-química de sementes de alpiste (Phalaris
canariensis L.) e de seu extrato aquoso, avaliar seu potencial antioxidante e atividade
hipoglicemiante do extrato aquoso de sementes de alpiste em modelo experimental de
diabetes induzida por estreptozotocina em ratos Wistar machos.
3.1 Objetivos Específicos
Identificar e caracterizar físico-quimicamente a semente e o extrato aquoso
de sementes de alpiste (Phalaris canariensis L.);
Quantificar o teor de compostos fenólicos totais;
Determinar e comparar a atividade antioxidante in vitro do extrato aquoso de
sementes de alpiste utilizando diferentes métodos (ABTS, DPPH e ORAC);
Avaliar a toxicidade aguda in vivo do extrato aquoso de sementes de alpiste
em ratos Wistar machos;
Analisar os efeitos do extrato aquoso de sementes de alpiste sobre a
glicemia, parâmetros hematológicos, bioquímicos e histopatológicos em modelo
experimental de diabetes em ratos Wistar machos;
Avaliar a relação da composição do alpiste, atividade antioxidante e
evolução do diabetes.
56
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Disponível em: <http://www.fciencias.com> Acesso:03/05/2015.
85
Capítulo II
COMPOSIÇÃO CENTESIMAL E ÁCIDOS GRAXOS D
SEMENTES DE PHALARIS CANARIENSIS L. E SEU
EXTRATO AQUOSO.
Michele Christine Machado de Oliveira1, Marcelo Alexandre Prado1, Daniel Barrera2
Arellano, Renato Grimaldi2, Marcella Ap. Stahl2
1Departamento de Ciência de Alimentos, Faculdade de Engenharia de Alimentos,
Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), CP 6121, 13083-862, Campinas,
SP, Brasil. 2Departamento de Tecnologia de Alimentos, Faculdade de Engenharia de
Alimentos, Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), CP 6121, 13083-862,
Campinas, SP, Brasil.
Manuscrito em preparo a ser submetido ao periódico Food Research International
86
87
Resumo
O alpiste (Phalaris canariensis L.), predominantemente usado como alimento para aves,
tem sido consumido pela população por ser um produto natural, de fácil aquisição e por ter
diferentes propriedades medicinais relatadas, tais como controle do diabetes e “melhora do
fluxo sanguíneo” em pessoas, porém existe pouca informação científica disponível sobre a
composição e estrutura do alpiste e seu potencial biológico para aplicações alimentares. O
interesse nesse alimento tem aumentado devido às propriedades atribuídas à sua
composição, como proteínas e fibras, que podem facilitar o processo digestivo. Este estudo
teve como objetivo determinar a composição química da semente de alpiste (Phalaris
canariensis L.) assim como a composição centesimal e perfil de ácidos graxos do extrato
aquoso de sementes de alpiste, visando a análise de seu potencial nutritivo. Dois lotes
foram utilizados e os extratos de semente de alpiste foram preparados diariamente de forma
padronizada e posteriormente analisados quanto aos teores de umidade, resíduo seco,
cinzas, proteínas, lipídeos totais, fibras totais, amido e determinação de carboidratos,
utilizando metodologias reconhecidas. Os resultados obtidos nas sementes dos lotes 1, 2 e
do extrato aquoso foram respectivamente: umidade e resíduo seco (10,31%; 9,50%;
78,21%), cinzas (6%; 5,30%; 1,74%), proteínas (14,88%; 15,12%; 18,26%), lipídeos
(5,38%; 5,17%; 2,07%), amido (50,54g/100g; 48,04g/100g; 3,79g/100g) e fibras totais
(18,88g/100g; 17,29g/100g; 0,70g/100g). Foram detectadas 16 variedades de ácidos graxos
no extrato aquoso de semente de alpiste, sendo o mais frequente o ácido palmítico-16:0
(12%). Entre os ácidos graxos poli-insaturados, os mais encontrados foram linoleico (53%),
oleico (28%) e linolênico (3%), ou seja 84% de ácidos graxos benéficos a saúde. Os valores
dos lotes 1 e 2 não apresentaram diferença significativa. Todos os parâmetros observados
indicaram que a semente de alpiste apresenta potencial nutritivo, sugerindo uma possível
aplicação nutricional.
Palavras-chave: Composição Centesimal, Ácidos Graxos, Alpiste, Extrato Aquoso de
sementes de alpiste, Phalaris canariensis L.
88
Abstract
The canary seeds (Phalaris canariensis L.), predominantly used as a nutritional source to
feed birds, have been consumed by the population because it is a natural product of easy
access and for the reported medicinal benefits, such as control of diabetes and improvement
of blood flow, but there are still few scientific studies concerning its composition, structure
and its biological potential for dietary applications. The interest in the canary seeds has
increased, due to the properties attributed to its composition, such as protein and fiber,
which may improve the digestive process. This study aimed to determine the chemical
composition of canary seed (Phalaris canariensis L.) as well as the proximate composition
and fatty acid profile of the aqueous extract of canary seed, aiming to evaluate its
nutritional potential. Two lots were used and canary seed extracts were prepared daily in a
standardized manner and subsequently analyzed for moisture content, dry matter, ash,
protein, total lipid, total fiber, starch and determination of carbohydrates using recognized
methodologies. The results in seed lots 1, 2 and aqueous extract were, respectively: dry and
moisture (10.31%; 9.50%; 78.21%), fly ash (6%, 5.30%, 1 74%) and protein (14.88%;
15.12%; 18.26%), lipids (5.38%; 5.17%; 2.07%), starch (50,54g / 100g; 48 04G / 100g;
3,79g / 100g) and total fiber (18,88g / 100g; 17,29g / 100g; 0.70g / 100g). Sixteen varieties
of fatty acids were detected in the aqueous extract of canary seed, the most frequent being
palmitic acid-16: 0 (12%). Among the polyunsaturated fatty acids, the most frequent were
linoleic (53%), oleic (28%) and linolenic (3%), which means 84% of the fatty acids are
beneficial to health. No significant differences were found between lots 1 and 2. All of the
parameters evaluated indicated that the aqueous extract of canary seeds have a nutritional
potential, suggesting a possible nutritional application.
Keywords: Proximate composition, Fatty Acids, Canary seed, Aqueous Extract of canary
seeds, Phalaris canariensis L.
89
1. INTRODUÇÃO
Alpiste é um verdadeiro cereal com uma composição única que sugere seu potencial
para utilização na alimentação humana (COGLIATTI, 2012). Devido ao seu valor nutritivo,
o interesse pelo alpiste tem aumentado (BOYE et al., 2013; ESTRADA-SALAS et al.,
2014).
Segundo Portaria nº 65 do MAPA (1993), o alpiste é definido como um grão
proveniente da espécie Phalaris canariensis L.
Putnam et al., (1996) apud Abdel-Aal et al., (1997) revisaram as características
agronômicas, genéticas e nutricionais de alpiste e novos potenciais de usos para a cultura. O
alpiste é um cereal que contém 61% de amido na semente e 67% na farinha. A umidade
deve ser controlada até 12% em peso, para garantir as suas propriedades (PORTARIA Nº
65 DO MAPA).
Abdel-Aal et al., (2011a); Cogliatti (2012), mostraram que, através da microscopia
de luz e de fluorescência nas sementes de alpiste, a sua microestrutura é semelhante à de
outras gramíneas (trigo, aveia, a cevada e o arroz). O alpiste tem uma média de 55,8g/100g
de amido, 23,7g/100g de proteína, 7,9g/100g de gordura bruta, 7,3g/100g de fibra dietética
total, 1,8g/100g de açúcar solúvel e 2,3g/100g de cinzas totais em todo o grão. As
investigações sobre o alpiste como cultura para o consumo humano, concordam em defini-
lo como um cereal que tem vantagens sobre outros grãos, com base na sua composição
química (GRAJEDA et. al., 2012).
O alpiste (Phalaris canariensis) contém níveis relativamente elevados de proteína
(até 18,7%) e óleo (até 8,7%) em comparação com outros cereais (GÁMEZ et al., 2010
apud ALVARADO, 2013), sendo altamente insaturado, contendo 55% linoleico ou ω-6,
29% oleico ou ω-9, 11% de ácido palmítico e 2,5% de ácido linolênico ou ômega ω-3
(MALIK; WILLIAMS, 1966 apud ESTRADA-SALAS et al., 2014, GÁMEZ et al., 2010
apud ALVARADO, 2013; ABDEL-AAL et al., 1997; LI et al., 2011). O óleo bruto de
alpiste também mostrou excelente atividade antioxidante (TAKAGI & IIDA, 1980; LI et
al., 2011).
Estudos sobre a composição química dos grãos feitos por Robinson (1979) apud
Cogliatti (2012) sugerem que ele tem alto valor nutritivo, propriedades funcionais e
nutricionais únicas (ABDEL-AAL et al., 1997; COGLIATTI, 2012). O perfil de
90
aminoácidos que possui este grão destaca a estrutura única de suas proteínas,
principalmente por causa de seu alto teor de triptofano (ROBINSON, 1978 apud
GRAJEDA, et al., 2012; ABDEL-AAL, et al.,1997).
O alpiste tem funções metabólicas importantes, e pode ajudar na perda de massa
corporal (outro benefício muito importante para os diabéticos), redução dos níveis de
açúcar no sangue e o controle glicêmico (ANDRADE e VACA, 2012).
2. MATERIAL E MÉTODOS
A elaboração do extrato aquoso de alpiste, bem como as análises físico-químicas
foram realizadas no laboratório de Análise de Alimentos do Departamento de Ciência de
Alimentos da Faculdade de Engenharia de Alimentos (FEA) da Universidade Estadual de
Campinas (UNICAMP).
2.1 Reagentes e Equipamentos
Os reagentes ácido clorídrico e metanol foram adquiridos da Chemco, ácido
sulfúrico concentrado, mistura catalítica, hidróxido de sódio da Dinâmica, ácido bórico,
carbonato de sódio, clorofórmio da Synth, sulfato de potássio anidro, sulfato de cobre II,
sulfato de sódio anidro são da Êxodo Científica.
Os equipamentos utilizados foram: balança analítica (Marca – UHT HR-200 máx
210g), estufa (Marca – UHT Nova Técnica NT513 sem circulação de ar), mufla (Marca –
Quimis), digestor de nitrogênio (Marca - Marconi, modelo MA4025), destilador (Marca -
Quimis, modelo Q341-25), agitador de tubos (Marca - Labnet, modelo S0200),
cromatógrafo gasoso capilar (Marca - CGC AGILENT 68650 SERIES GC SYSTEM, com
detector de ionização de chama), banho-maria (Marca – Marconi BTC-9090 Digimec) e
pHmetro (Marca – Mettler Toledo 320).
2.2 Obtenção da Matéria-Prima
As amostras de sementes de alpiste (Phalaris canariensis L.), foram obtidas no
período de safra 2012/2013, oriundas do comércio da cidade de Campinas/SP. Após a
aquisição das amostras as mesmas foram enviadas para o Laboratório de Análises de
91
Alimentos do Departamento de Ciência de Alimentos da Faculdade de Engenharia de
Alimentos – UNICAMP.
2.3 Preparação do Extrato de P. canariensis L.
O preparo do extrato aquoso de sementes de alpiste, Phalaris canariensis L. foi
realizado conforme dados descritos popularmente. Para a obtenção do extrato, foram
utilizados uma proporção de 150 g de alpiste em 200 mL de água destilada. Após deixar de
molho em água por 12 horas, a água do molho foi desprezada, e as sementes trituradas com
200 mL de água destilada por 5 minutos em liquidificador comercial com potência de
350W até a obtenção de um “leite”. Em seguida, este extrato foi peneirado para a separação
dos sólidos insolúveis (resíduo) e filtrado em filtro de nylon para separação das cascas do
alpiste. Este preparo foi realizado diariamente para realização das análises.
2.4 Caracterização das Sementes de Alpiste e Extrato Aquoso de
Alpiste
As análises das sementes e do extrato aquoso de sementes de alpiste foram
realizadas em triplicata, segundo as normas e metodologias da Association of Official
Analytical Chemists (AOAC, 2010) e Instituto Adolfo Lutz (2008).
Foram realizadas as seguintes análises:
2.4.1 Determinação do Teor de Umidade
A percentagem de umidade foi determinada pelo método de aquecimento direto em
estufa (UHT Nova Técnica, modelo NT513 sem circulação de ar) a 105ºC, conforme
descrito pelo manual do Instituto Adolfo Lutz, (2008). Baseando-se na determinação da
perda de peso do produto submetido ao aquecimento até peso constante.
Para isto, amostras de aproximadamente 3 g foram homogeneizadas, trituradas e
submetidas à secagem em estufa a 105ºC seguida de resfriamento. A operação de
aquecimento e resfriamento foi repetida até obtenção de peso constante. O teor de umidade
(%) foi obtido pela fórmula:
Teor de umidade = 100 x N/ P, onde:
N = n° de gramas de umidade
92
P = n° de gramas de amostra
2.4.2 Determinação do Resíduo Seco
Para o extrato aquoso de sementes de alpiste, produto de alto teor de umidade, foi
determinado o resíduo seco (sólidos totais), onde pipetou-se 10 ml da amostra em uma
cápsula previamente tarada, a qual foi aquecido em estufa a 70ºC até peso constante. O teor
de resíduo seco (%) foi obtido pela fórmula:
Resíduo seco por cento m/v = 100 x N/A, onde:
N = nº de g de resíduo seco
A = nº de ml da amostra
2.4.3 Determinação de Resíduo Mineral Fixo
A determinação de cinzas foi realizada pela incineração da amostra em método
gravimétrico. O material (2 a 5 g) foi submetido a aquecimento em mufla (Quimis) a 650°C
até a formação de um resíduo branco ou cinza, segundo metodologia descrita pelo manual
do Instituto Adolfo Lutz (2008) com adaptações.
O teor de cinzas (%) foi obtido pela fórmula:
Teor de cinzas = 100 x N/ P, onde:
N = n° de gramas de cinzas
P = n° de gramas de amostra
2.4.4 Determinação de Proteínas
O teor de proteínas foi determinado segundo o método de semimicro Kjeldahl, para
a quantificação de nitrogênio total. O qual se baseia na destruição da matéria orgânica
seguida de destilação, sendo o nitrogênio dosado por volumetria (AOAC, 2010). No cálculo
da conversão de nitrogênio em proteínas, foram utilizadas as constantes 6,25 e 5,7 (definida
como padrão para cereais). O digestor de nitrogênio utilizado foi Marconi, modelo
MA4025, destilador Quimis, modelo Q341-25.
O processo de digestão foi realizado com algumas modificações. A digestão de
aproximadamente 1 g de amostra foi realizada em bloco com aquecimento controlado até
temperatura máxima de 300ºC, elevando gradativamente a temperatura, para evitar perdas
93
das amostras, após adição de 5 mL de ácido sulfúrico concentrado e mistura catalítica. Em
seguida, as amostras foram destiladas e tituladas para determinação de nitrogênio e
posterior cálculo do conteúdo de proteínas, utilizando a fórmula apresentada a seguir. Teor
de proteína bruta (%) = v x fc x 0,00028 x f / P x (100), onde:
v = nº de ml da solução de HCl 0,02 M gasto na titulação
fc = fator de correção da solução de HCl 0,02 M
f = fator de conversão = 6,25 ou 5,7
P = peso da amostra (g)
2.4.5 Determinação de Lipídeos
A extração lipídica foi realizada segundo método de BLIGH & DYER (1959) à frio,
utilizando agitador de tubos Labnet, modelo S0200.
A composição dos ácidos graxos presentes na fração lipídica foram determinados
por cromatografia gasosa. Para determinação da composição em ácidos graxos, seguiu-se
AOCS/2009. Inicialmente realizou-se a esterificação convertendo óleos e gorduras em
ésteres metílicos de ácidos graxos de acordo com o método proposto por AOCS Official
Method, (1973) para posterior análise em cromatografia gasosa (CG).
2.4.5.1 Análise Cromatográfica
Os ésteres metílicos foram analisados em cromatógrafo gasoso capilar, marca CGC
AGILENT 68650 SERIES GC SYSTEM, com detector de ionização de chama. Os
componentes foram separados em coluna capilar de sílica fundida DB-23 AGILENT (50%
cyanopropil) – methylpolysiloxane, com dimensões de 60 m com diâmetro interno de 0,25
mm e espessura do filme de 0,25 µm. As condições de operação foram: fluxo da coluna de
1,00 mL/min, temperatura programada do detector: 280ºC, temperatura do injetor: 250ºC,
temperatura do forno: 110ºC - 5 min.; 110 - 215ºC (5ºC/min), 215ºC - 24 min., gás de
arraste: hélio; velocidade linear do gás de arraste de 24 cm/s, volume injetado: 1,0 µL.
A identificação dos ácidos graxos foi realizada através da comparação do tempo de
retenção dos ácidos graxos da amostra e dos padrões.
94
2.4.6 Fibras
O teor de fibra alimentar total foi determinada segundo o método descrito por
Horwitz; Latimer; George, (2005), (AOAC, 2010).
2.4.7 Amido
A determinação de amido foi feita seguindo Diemair, (1963).
2.4.8 Determinação de Carboidratos
O teor de carboidratos foi determinado por meio do cálculo da diferença, subtraindo
de 100% do valor de proteínas, lipídeos, fibra alimentar, cinzas e umidade. Este
procedimento está previsto pela Resolução da Diretoria Colegiada (RDC) nº 360, de 23 de
dezembro de 2003 (BRASIL, 2003).
Também foi realizado através de métodos de redução, glicídios redutores e totais,
segundo Instituto Adolfo Lutz (2008). Este método baseia-se na oxirredução da solução de
Fehling, através da utilização de glicose para a padronização dessa solução.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
O alpiste tem em sua composição amido, proteína e lipídeo, sendo que cada
componente possue características únicas (ABDEL-AAL; HUCL, 2005 apud ABDEL-AAL
et al., 2010).
Os resultados são apresentados com média ± desvio padrão (SD), na Tabela 1.
95
Tabela 1. Composição centesimal de sementes de Phalaris canariensis L. e seu extrato
aquoso (%).
Componentes Semente A a
Semente B a
Extrato Aquoso (BU) a
Umidade 10,31 ± 0,03 9,50 ± 0,06 78,21 ± 0,07
Cinzas 6,00 ± 0,28 5,30 ± 0,08 1,74 ± 0,03
Proteínas (N=6,25)c 16,98 ± 0,59 17,24 ± 0,72 16,28 ± 0,05
Proteínas (N=5,7)c 14,88 ± 0,52 15,12 ± 0,63 18,26 ± 0,06
Lipídeos 5,38 ± 0,09 5,17 ± 0,13 2,07 ± 0,03
Fibras (g/100g) 18,88 ± 0,01 17,29 ± 0,25 0,70 ± 0,02
Amido (g/100 g) 50,54 ± 0,60 48,04 ± 0,00 3,79 ± 0,08
Carboidratos b 61,33 62,8 58,13
a Os dados são expressos como valores médios ± desvio padrão (N=3). b Por diferença. cFator de conversão N=6,25 (uso geral); N=5,7 (específico- cereais)
A tabela 1 mostra que as porcentagens de umidade presente nas sementes de alpiste,
entre os dois lotes, variaram de 9,50 a 10,31%, estando dentro dos limites estabelecidos
pela Embrapa (2011) (<14%), segundo Pimentel e Fonseca, evitando assim a ação
enzimática, e proliferação de microrganismos durante o processo de armazenamento. De
acordo com estudos de Alvarado (2013) os resultados de percentagem de umidade
apresentados em diferentes marcas foram 7,33% e a mais elevada foi a com 9,10%.
A semente de alpiste contém um pouco mais de cinzas, mas substancialmente
menos açúcar, fibras alimentar solúvel e insolúvel em relação ao trigo (ABDEL-AAL et al.,
1997). Segundo dados de Alvarado (2013), a percentagem de cinzas encontrado em
sementes de alpiste (Phalaris canariensis), variou de 5,60% a 3,91%. Os valores obtidos
neste estudo foram próximos nos dois lotes, conforme tabela 1. Os valores encontrados
estão dentro do esperado para estas sementes, conforme visto na literatura.
Para determinação de proteínas foram utilizados dois fatores de conversão de
nitrogênio de 5,7 e 6,25 onde obteve-se 14,88 e 15,12% e 16,98 e 17,24% respectivamente,
em alguns estudos à maioria ainda é calculada com o fator de 6,25 considerado padrão, no
entanto geralmente em cereais, o fator de 6,25 não é usado, uma vez que foi relatado que o
96
fator de conversão de nitrogênio para proteína de cereais variou 5,61 a 5,93 e o fator de 5,7
é o recomendado (SOSULSKI; IMAFIDON, 1990; ABDEL-AAL et al., 2010).
Em comparação com os cereais comuns, o alpiste contêm altos níveis de proteína,
cerca de 21% (ABDEL-AAL; HUCL; SOSULSKI, 1997; ABDEL-AAL et al., 2010;
ESTRADA-SALAS et al., 2014).
Os dados de Alvarado (2013), mostraram variação entre 12,82% e 19,84% no teor
de proteínas.
Quando analisou-se lipídeos os lotes apresentaram valores muito próximos de 5,38 e
5,17%. Abdell-Aal et al., (1997) encontraram níveis de lipídeos entre 8,4-8,9%,
considerados muito elevados para um grão de cereal.
Os resultados em relação ao amido e fibras foram de 48,04–50,54g/100g e 17,29 –
18,88g/100g respectivamente. Quando comparado com a literatura a relação de fibras está
dentro do esperado em relação aos outros cereais em comum tais como: aveia 11-25%,
trigo 13-21% e cevada com 16-27% (WARD et al., 2008; SILVA; CIOCCA, 2005;
ABDEL-AAL et al., 2010).
O alpiste apresenta em média cerca de 60% de amido, 20% de proteína, e 8% de
lipídeos (ABDEL-AAL; HUCL, 2005 apud ABDEL-AAL et al., 2010), 7% de fibra
dietética total (ABDEL-AAL; HUCL; SOSULSKI, 1997; ABDEL-AAL et al., 2010). De
acordo com alguns estudos a proteína de alpiste tem 18,7% comparado com 15,0% no trigo
(MALIK; WILLIAMS, 1966 apud ESTRADA-SALAS et al., 2014; ABDEL-AAL et al.,
1997; LI, 2011). De acordo com Abdell-Aal et al., (1997) a média da concentração de
proteína no alpiste é de 18,7% (N=5.7) ou 20,5% (N= 6,25), que é superior à do trigo em
25%. Os níveis de gordura bruta foram quase quatro vezes maiores do que o trigo. O amido
foi o principal constituinte das sementes de alpiste, com média de 61,0% da matéria seca,
bastante comparável ao trigo.
No trigo o teor de proteínas é 12,3%, 1,8% lipídeos e 2,3% fibras (EARLY e
EARLY, 1987 apud BOTELHO, 2006). Segundo pesquisas de Fujita e Figueroa (2003),
variedades de trigo apresentaram 12,02 a 12,67 de umidade, 1,47 a 1,60 de cinzas, 10,60 a
14,67 de proteínas, 1,56 a 2,15 de lipídeos, 13,94 a 15,03 de fibra alimentar total e 54,28 a
58,72 de carboidratos.
Comparação da composição de nutrientes de farinhas produzidas de alpiste glabro,
alpiste cabeludo e trigo, os resultados foram os seguintes: 65,5%, 67,5% e 73,9% para
97
amido, 21,5%, 20,8% e 17,0% para proteínas, e 6,3%, 6,0% e 1,3% para gordura bruta,
respectivamente (ABDEL-AAL et al., 2011).
A composição da aveia com casca foi 14,92% de proteínas, 6,82% de lipídeos,
2,23% de cinzas, 13,52% de umidade e 62,51% de carboidratos. O teor de proteínas foi
similar ao encontrado por Pedó & Sgarbieri (1997); Rupollo et al., (2006), ao caracterizar
quatro cultivares de aveia. A proteína bruta em grãos de aveia variou consideravelmente
entre cultivares e quando exposta a diferentes locais de cultivo (RUPOLLO et al., 2006).
Grãos de aveia de 25 genótipos cultivados em diferentes ambientes no sul do Brasil
apresentaram teores de proteínas entre 12,7% e 16,9% (MILACH et al., 2000 apud
RUPOLLO et al., 2006). O teor de lipídeos da aveia foi de 6,82%, estando abaixo dos
resultados obtidos por Pedó & Sgarbieri (1997); Rupollo et al., (2006), que obtiveram
valores entre 7,18% e 7,50%, provavelmente por ter sido determinada a composição
centesimal em grãos de aveia com casca. O teor de cinzas encontrado ficou acima dos 2,0%
verificados por Pedó & Sgarbieri (1997); Rupollo et al., (2006), pelo fato da aveia ter sido
analisada com casca (EARLY e EARLY, 1987 apud BOTELHO, 2006). A concentração de
proteínas nos grãos de aveia descascados variou entre 13,95 e 16,52%, bem próximo aos
15,9% obtidos por Asp et al., (1992) apud Pedó e Sgarbieri, (1997). O teor de lipídeos
variou entre 6,33 e 7,5%, estando de acordo com os encontrados por Pedó e Sgarbieri,
(1997). Variedades de aveia apresentaram também 10,88 a 11,15% de umidade, 1,62 a
2,06% de cinzas, 13,29 a 14,55% de proteínas, 4,97 a 5,57% de lipídeos, 13,12 a 15,02% de
fibra alimentar total e 52,25 a 55,52% de carboidratos (FUJITA; FIGUEROA, 2003).
Segundo Morrison (1978) apud Pedó e Sgarbieri, (1997), a aveia apresenta alta
concentração de lipídeo quando comparada aos demais cereais, com teores variando entre
5,0 e 9,0%. Em trigo, arroz, milho, cevada e centeio os valores encontrados foram 2,1-
3,8%, 1,0-2,5%, 3,9 – 5,8%, 3,3-4,6% e 2,0-3,5% respectivamente.
Quanto aos açúcares totais observa-se que variaram entre 0,9 e 1,37%. A
concentração de açúcares totais livres na aveia foi relativamente inferior ao verificado em
cevada, trigo e centeio, mas similar ao milho. Contudo, foi maior que os teores encontrados
no arroz (HENRY, 1985 apud PEDÓ e SGARBIERI, 1997).
Frutose e glicose estão presentes em pequenas concentrações em alimentos
(ASOCIACION ORNITOLOGICA NATURALISTA CULTURAL DE GRANADA.
ALIMENTACION, 2012 apud ORTIZ, 2012). As concentrações de frutose e glicose nas
98
amostras de alpiste apresentaram-se baixas, impossibilitando sua quantificação pelo método
de oxirredução de Fehling.
Na aveia, assim como nos demais cereais, o amido é o componente químico
presente em maior quantidade, com teores médios entre 43,7 e 61,0% (PATON, 1977 apud
PEDÓ e SGARBIERI, 1997). Porém, esses teores estão abaixo das concentrações
encontradas nos grãos de centeio, cevada e trigo, cujos valores estão entre 63,2 e 69,0%
(AMAN & HESSELMAN, 1984 apud PEDÓ e SGARBIERI, 1997).
Segundo Barroso (2014), as sementes de linhaça marrom e dourada apresentam na
sua composição centesimal respectivamente: umidade: 7,06 ± 0,41, 7,77 ± 0,37; cinzas:
2,89 ± 0,14, 3,01 ± 0,11; lipídeos: 33,7 ± 0,56, 34,8 ± 0,07; proteínas: 19,1 ± 1,15, 21,6 ±
0,12; fibras: 28,0 ± 4,24, 22,5 ± 4,95 e carboidratos: 9,22 ±4,75, 10,4 ±4,55. A composição
centesimal do grão de linhaça se estabelece em 4-8% de umidade, 30-40% de lipídeos, 20-
25% de proteínas, 20-28% de fibra alimentar, 3-4% de cinzas (OOMAH; MAZZA, 1998;
AGRICULTURAL RESEARCH SERVICE, 1999; MORRIS, 2007) e 43,3 e 9,8 de
carboidratos (ALVARENGA, 2012). A linhaça por apresentar de 28-33,5% de fibra
alimentar pode ser considerada uma fonte de fibra alimentar (MORRIS, 2001; HUTCHINS
et al., 2001; TACO, 2006 apud CUPERSMID et al.,2012).
Podemos observar a composição centesimal do grão de amaranto feita por
Kalinowski (1982) apud Botelho (2006), onde o conteúdo de proteínas é de 14,5%, lipídeos
7,2% e fibras 8,4%. O amido representa 50% a 60% do total do grão (SAUNDERS e
BECKER, 1984 apud BOTELHO, 2006).
Variedades de cevada apresentam 10,28 a 14,02% de umidade, 1,42 a 1,85% de
cinzas, 7,48 a 10,75% de proteínas, 1,84 a 2,71% de lipídeos, 10,72 a 17,94% de fibra
alimentar total e 56,56 a 65,60% de carboidratos (FUJITA; FIGUEROA, 2003).
Os teores médios de proteína bruta, nos grãos integrais e nos grãos sem casca de
cevada, foram de 13,01 e 12,21%, respectivamente. Os valores médios de matéria mineral
(cinzas), nos grãos integral e descascado, foram 2,45 e 1,44%, respectivamente (EVERS et
al.,1999 apud MAYER et al., 2007). Os valores de fibra alimentar variaram de 24,58 a
19,81%, com média de 22,06%, nos grãos integrais. Entretanto, nos grãos sem casca, o
valor máximo foi de 13,73% e o mínimo de 8,25%, com média de 11,10%. Teores
semelhantes foram observados por Xue et al., (1997) apud Mayer et al., (2007), em grãos
na forma integral e sem casca, e por Fujita & Figueroa (2003) e Yalçin et al., (2007);
99
Mayer et al., (2007), em grãos descascados. O amido é o principal componente dessa
fração, o qual representa de 40 a 80% do valor energético total da alimentação diária dos
seres humanos (FREITAS, 2002 apud MAYER et al., 2007). Xue et al., (1997) apud Mayer
et al., (2007) e Molina-Cano et al., (1997) verificaram valores de amido, em grãos de
cevada, entre 52,7 e 59,6%.
A chia apresenta resultados de 32,25% de lipídeos, 5,89% de umidade e 4,40% de
cinzas (CUNNIFF, 1997). Namiki (1995) observou teor de proteínas de 17,7%. Na Tabela
brasileira de composição de alimentos (TACO) (LIMA et al., 2006), está disponível apenas
o valor de fibra alimentar total 11,9% (SILVA et al., 2011).
A composição química de grãos integrais de gergelim creme e preto, são: proteínas:
18,83±0,25, 19,46±1,73; lipídeos: 56,45±1,07, 48,92±0,58; carboidratos: 7,06±0,68, 0,0;
umidade: 3,03±0,68, 3,24±0,74; cinzas: 3,76±0,31, 4,28±0,49 e fibra alimetar total:
10,87±0,58, 24,10±1,02 (SILVA et al., 2011).
Composição centesimal média (% na matéria seca) de arroz integral, branco polido
e parboilizado polido é respectivamente: amido total: 74,12; 87,58; 85,08; proteínas (N x
5,95): 10,46; 8,94; 9,44; lipídeos: 2,52; 0,36; 0,69; cinzas: 1,15; 0,30; 0,67 e fibra total:
11,76; 2,87; 4,15 (STORCK, 2004; WALTER, 2009). O arroz, assim como outros cereais,
é rico em carboidratos, principalmente amido, sendo por isso utilizado como fonte de
energia na alimentação (WALTER, 2009).
A comparação do alpiste com alguns grãos se deu a partir de sua semelhança em
relação a microestrutura de outras gramíneas (trigo, aveia, cevada e o arroz) e também
pelos usos potenciais de outros tipos de grãos.
Quando comparamos o alpiste com o trigo pode-se dizer que é nutricionalmente
superior em cinzas, proteínas, lipídeos e fibras totais, já o amido pode ser similar ou menor
que o trigo. Em relação ao alpiste e a linhaça apresentam conteúdo similar de proteínas, o
alpiste possue menor quantidade de lipídeos e fibras que a linhaça, sendo maior em cinzas e
carboidratos. O alpiste possue maior quantidade de proteínas e fibras que o amaranto,
menor quantidade de lipídeos e amido semelhantes. A cevada apresenta menor quantidade
de cinzas, proteínas e lipídeos comparado ao alpiste, já fibras totais, carboidratos e amido
estão próximos ente si dos valores encontrados. Quando compara-se com a chia são
similares nas proteínas, no entanto possue menos lipídeos e maior cinzas e fibras totais. Já o
gergelim é parecido com alpiste em relação ao teor de proteínas e fibras totais, possue mais
100
lipídeos e menos carboidratos e cinzas. Em comparação ao arroz o alpiste apresenta menor
quantidade de amido, no entanto maiores quantidades em proteínas, lipídeos, cinzas e
fibras.
De acordo com Putnam et al., (1990) apud Cogliatti, (2012) as sementes de alpiste
são semelhantes a aveia na composição, sendo apenas maior em cinzas, mas inferior em
fibras. A aveia é nutricionalmente superior quando comparada com os demais cereais, não
só pela composição química, ou seja, apresenta superiores teores de proteínas, lipídeos e
fibra alimentar total, e também pela sua forma de consumo (COCHRAN & COX, 1964
apud PEDÓ e SGARBIERI, 1997) utilizada em diversas preparações.
Segundo o Ministério da Saúde (2001), um alimento sólido pode ser considerado
fonte de fibra, quando possui um mínimo de fibras 3,0 g/100 g, e como de alto teor de
fibras, quando contém, no mínimo, 6 g/100 g. E para alimentos líquidos é considerado fonte
de fibras possuindo 1,5 g/100 mL e alto teor de fibras de 3 g/ 100mL.
A elevada quantidade de cinzas e fibras no alpiste se deve à presença de cascas na
amostra. Já quando ocorre a retirada das mesmas, no caso do extrato aquoso de sementes de
alpiste as quantidades de cinzas e fibras caem consideravelmente. E a diminuição de
lipídeos e amido ocorre por serem moléculas maiores, ficando muitas vezes retidas nas
sucessivas peneiradas e filtrações. Diferentes lotes de sementes de Phalaris canariensis não
apresentaram diferenças nos teores de umidade, cinzas, lipídeos, fibras, amido e proteína.
É importante dizer que durante a realização das análises para determinação da
composição centesimal e também atividade antioxidante notou-se algumas dificuldades na
preparação da amostra (elevada turbidez), devido a alta concentração de amido no extrato
de alpiste, como pode ser visto na Figura 15.
Figura 15. Extrato aquoso de sementes de alpiste após centrifugação.
Fonte: Laboratório DCA – UNICAMP (OLIVEIRA, 2014).
101
Os ácidos graxos, ésteres metílicos dos ácidos graxos e as suas proporções
encontradas na análise dos cromatogramas encontram-se (resultados apresentados como %
da soma das áreas dos picos), nas Tabela 2 e Figuras 16 e 17. Os ácidos graxos que se
apresentaram em maiores quantidades no extrato aquoso foram: linoleico, oleico e
palmítico respectivamente.
Tabela 2. Perfil de ácidos graxos presente na fração lipídica do extrato aquoso de Phalaris
canariensis – semente A e B.
Ácidos Graxos% Amostra Extrato de Alpiste
(Semente A)
% Amostra Extrato de Alpiste
(Semente B)
- C12:0 láurico 0,05653 0,05565
- C14:0 mirístico 0,18266 0,18334
- C15:0 pentadecanóico 0,03228 0,03975
- C16:0 palmítico 11,91668 11,92208
- C16:1 palmitoléico 0,11778 0,11668
- C17:0 margárico 0,08237 0,06005
- C17:1 cis-10-heptadecenóico 0,04224 0,06007
- C18:0 esteárico 1,43942 1,41523
- C18:1 oléico 29,41601 29,28222
- C18:2 linoléico 52,8178 52,9786
- C18:3 linolênico 2,61031 2,60776
- C20:0 araquídico 0,23478 0,20223
- C20:1 eicosenóico 0,838 0,83982
- C22:0 behênico 0,13107 0,14609
- C24:0 lignocérico 0,08209 0,09042
102
Figura 16. Cromatograma GC (perfil de ácidos graxos) do extrato aquoso de sementes (A) de alpiste
(Phalaris canariensis). Os principais picos e tempos de retenção relativos: ácido palmítico (C16:0): 24.448
min.; ácido oleico (C18:1): 28.129 min.; ácido linoleico (C18:2): 29.090 min.
Figura 17. Cromatograma GC (perfil de ácidos graxos) do extrato aquoso de sementes (B) de alpiste
(Phalaris canariensis). Os principais picos e tempos de retenção relativos: ácido palmítico (C16:0): 24.432
min.; ácido oleico (C18: 1): 28,113 min. ácido linoleico (C18:2): 29.071.
103
Abdel-Aal; Hucl; Sosulski, (1997); Abdel-Aal et al., (2010) ao analisar sementes de
alpiste observou conteúdo de 9% de óleo. O alpiste possue ácidos graxos insaturados
(ASOCIACION ORNITOLOGICA NATURALISTA CULTURAL DE GRANADA.
ALIMENTACION, 2012 apud ORTIZ, 2012), contendo 55% de ácido linoleico, 29% de
ácido oleico, 11% de ácido palmítico e 2,5% de ácido linolênico (MALIK; WILLIAMS,
1966 apud ESTRADA-SALAS et al., 2014; ABDEL-AAL et al., 1997; LI, 2011) e 1%
esteárico (ABDEL-AAL; HUCL; SOSULSKI, 1997; ABDEL-AAL et al., 2010);
corroborando com os resultados obtidos neste estudo (53% de ácido linoleico, 28% de
ácido oleico, 12% de ácido palmítico e 2,6% de ácido linolênico).
Comparando com outros grãos, o conteúdo de óleo no grão de linhaça se apresenta
entre 35 e 45% sendo que desse total, 73% tratam-se de ácidos graxos poli-insaturados,
destes 45 a 60% de α- linolênico e 15 a 18% de linoleico e 18% de monoinsaturados e 9%
saturados (TARPILA; WENNBERG; TARPILA, 2005 apud ALVARENGA, 2012). O teor
de ácido α-linolênico no óleo de canola é de 9,1% e no de soja 6,8% e teores menores são
encontrados nos óleos de milho, algodão e de girassol, porém, esses óleos citados têm
conteúdos de ácido linoleico variando entre 35 e 37% (TARPILA; WENNBERG;
TARPILA, 2005 apud ALVARENGA, 2012).
O ácido graxo ω-6 (ácido linoleico) atua auxiliando na prevenção e no controle do
diabetes mellitus tipo 2 e na modulação do sistema imunológico, prevenindo uma série de
doenças (BRAGA e MENDONÇA, 2010).
Segundo Barroso (2014), as sementes de linhaça marrom e dourada apresenta
respectivamente teores de ácidos graxos: (saturados) ácido mirístico 0,03 ± 0,08; 0,03 ±
0,08; ácido palmítico 4,90 ± 0,12; 4,28 ± 0,14; ácido esteárico 2,61 ± 0,09; 0,91 ± 0,14;
ácido miristoleico 0,01 ± 0,02; 0,01 ± 0,09; ácido palmitoleico n.d.; 0,02 ± 0,01; ácido
erúcico 0,09 ± 0,01; n.d e (insaturados) ácido oleico 20,4 ± 0,22; 23,0 ± 0,30; ácido
linoleico 13,3 ± 0,17; 13,4 ± 0,26 e ácido linolênico 58,4 ± 0,14; 58,3 ± 0,10.
Composição em ácidos graxos dos lipídeos da aveia: palmítico (13,3%); esteárico
(1,70%); araquídico (1,30%); oleico (43,8%); linoleico (37,5%); linolênico (2,3%)
(RUPOLLO et al., 2006). Os valores médios, encontrados para os ácidos graxos totais,
insaturados e saturados, nos óleos de aveia foram de 81,05 e 18,96% respectivamente. Os
ácidos graxos: palmítico (17,61%), oleico (39,66%) e linoleico (43,13%) foram
encontrados em maiores quantidades, somando cerca de 96% do total, enquanto que
104
mirístico (0,23%), esteárico (2,45%) e linolênico (2,31%) contribuíram com o restante
(cerca de 4%) (PEDÓ e SGARBIERI, 1997). A composição de lipídeos na aveia é
favorecida pelo alto teor de ácidos graxos insaturados, dentre eles o linoleico que é
considerado essencial para a nutrição humana, sendo também o mais abundante
(ZADERNOWSKI et al., 1999; RUPOLLO et al., 2006).
Em relação a fração lipídica do grão de amaranto variou entre 6% a 8%,
considerando 70% de ácido oleico (C18:1) e linoleico (C18:2) e 20% de ácido esteárico
(C18:0). (TEUTONICO e KNORR, 1985 apud BOTELHO, 2006). De acordo com Botelho
(2006) a composição de ácidos graxos do óleo de amaranto foi: ác. mirístico - 0,19; ác.
palmítico - 4,31; ác. esteárico - 18,06; ác. oleico 29,04; ác. linoleico - 45,27; ác. linolênico -
0,82; ác. araquidônico - 0,88; ác. araquídico - 0,23; ác. dodecanoato - 0,31.
Os lipídeos do sorgo correspondem a cerca de 3% do cereal (USDA, 2010).
Mehmood et al., (2008) identificaram teor de lipídeo de 5 a 8,4%, em dez cultivares. A
maioria das cultivares apresentou maior teor de ácidos graxos poli-insaturados do que
monoinsaturados. As concentrações dos principais ácidos graxos variaram de 31,1 a 48,9%,
para o ácido oleico; 0,4 a 0,6% de palmitoleico; 27,6 a 50,7% de linoleico; 1,7 a 3,9% de
linolênico; 1,0 a 2,6% de esteárico e 11,7 a 20,2% de palmítico (QUEIROZ et al., 2011).
O conteúdo total dos ácidos graxos do farelo de arroz corresponde a cerca de 18%
de ácidos graxos saturados, 45% de ácidos graxos monoinsaturados e 37% de ácidos graxos
poli-insaturados. Os principais ácidos graxos saturados são os ácidos palmítico (14-17%) e
esteárico (2,0-2,5%) e os principais insaturados são os ácidos oleico (40-45%), linoleico
(35-37%) e linolênico (1-2%) (ZAMBIAZI, 1997).
De acordo com Yermanos et al., (1972) a composição do óleo de gergelim constitui-
se de 45,3-49,4 de ácido oleico, 37,7-41,2 de ácido linoleico, 7,8-9,1 de ácido palmítico,
3,6-4,7 de ácido esteárico, 0,4-1,1 de ácido araquídico, 0,5 de ácido hexadecenóico e 0,1 de
ácido mirístico.
Os ácidos graxos majoritários encontrados em diferentes lotes da semente de Salvia
hispânica (chia), foram o ácido palmítico 68,76 mg/g e 63,30 mg/g respectivamente, oleico
59,44 mg/g e 51,38 mg/g, linoleico 175,74 mg/g e 165,83mg/g e o α-linolênico 564,77mg/g
e 595,39mg/g. As sementes de chia são ricas em ácidos graxos poli-insaturados,
particularmente ácido linolênico (54-67%) e ácido linoleico (12-21%) (GANZAROLI et
al., 2014). Segundo Martínez et al., (2012) o perfil de ácidos graxos da semente da chia é
105
de 7,3% de ácido palmítico, 2,8% de ácido esteárico, 7,4% de ácido oleico, 22% de ácido
linoleico e 60,5% de ácido linolênico. Os teores de ácidos graxos determinados para ω-3 e
ω-6 da chia de acordo com Picinin (2014) foram de 565,08 mg/g e 175,14 mg/g
respectivamente.
A composição de ácidos graxos da aveia também é muito similar ao do alpiste em
ácido palmítico e no linolênico, no entanto apresenta maiores quantidades em ácido
esteárico, araquídico, oleico e mirístico. Com relação ao linoleico o alpiste possue maiores
proporções. Enquanto o alpiste apresenta aproximadamente 14% de ácidos graxos
saturados e 85% de insaturados, a aveia possue 16-20% saturados e 85% de insaturados.
Comparando com a linhaça, o alpiste possue menor quantidade do linolênico e
esteárico, mas apresenta maiores concentrações em linoleico, oleico, palmítico, mirístico e
palmitoleico. Sendo a linhaça cerca de 7% saturados e 92% insaturados. A canola e a soja
apresentam maiores quantidades em linolênico, mas o alpiste possue mais linoleico. Já
comparando com o amaranto são similares no ácido mirístico, araquídico e oleico, no
entanto o alpiste se destaca no palmítico, linoleico e linolênico, o amaranto possue maior
quantidade do esteárico, sendo no total aproximado 24% de saturados e 75% insaturados.
No sorgo a quantidade de ácido oleico é próximo ao alpiste que possue quantidades
de linoleico maiores. Com relação aos demais ácidos graxos o alpiste encontra-se dentro da
faixa definida pelo grão de sorgo, sendo 23% de saturados e 60% insaturados
aproximadamente.
Quando faz-se o mesmo comparativo com o arroz, este se mostra em porcentagens
superiores no alpiste de ácido palmítico e oleico, e inferiores de linoleico e dos demais em
quantidades próximas. Ácidos graxos saturados 16 -19,5% e 76-84% insaturados.
Ao se comparar o alpiste com o gergelim, este é superior em ácido oleico, esteárico
e araquídico e inferior em linoleico. Portanto 12% de saturados e 83% insaturados. Já com
relação a chia valores inferiores são encontrados em todos os ácidos graxos com exceção do
linolênico e esteárico. E muito semelhante o linoléico. Correspondendo 10% saturados e
90% insaturados.
Baseado em todas estas informações pode-se dizer que o alpiste é quantitativamente
e qualitativamente superior em porcentagem de ácidos graxos benéficos ao amaranto e ao
sorgo, sendo inferior em relação a linhaça e a chia e semelhantes com relação à aveia,
gergelim e arroz.
106
4. CONCLUSÃO
As sementes de alpiste são importantes fontes de proteínas, lipídeos, fibras e amido,
apresentando composição semelhantes a alguns grãos como a aveia e o trigo. O alpiste
destaca-se entre os grãos em relação a alta carga proteica, fonte de energia, devido alta
proporção de amido, possuindo na sua composição fibras e ácidos graxos poli-insaturados
extremamente benéficos à saúde e principalmente a grande quantidade de ácido linoleico
(ω-6), importante na prevenção do diabetes. No extrato aquoso as proporções foram
menores devido a forma de extração aplicada.
107
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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114
115
Capítulo III
COMPOSTOS FENÓLICOS E ATIVIDADE ANTIOXIDANTE
DO EXTRATO AQUOSO DE SEMENTES DE PHALARIS
CANARIENSIS L.
Michele Christine Machado de Oliveira1, Marcelo Alexandre Prado1, Glaucia Maria
Pastore1, Iramaia Angelica Neri-Numa1
1Departamento de Ciência de Alimentos, Faculdade de Engenharia de Alimentos,
Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), CP 6121, 13083-862, Campinas,
SP, Brasil.
Manuscrito em preparo a ser submetido ao periódico Journal of Food Science and
Tecnology
116
117
Resumo
Os mecanismos fisiopatológicos que relacionam o diabetes à síndrome metabólica não
estão completamente elucidados, embora evidências apontem que o estresse oxidativo e
aumento da produção de radicais livres sejam mecanismos importantes nessa relação.
Alguns relatos apontam o uso popular do alpiste no controle do diabetes, devido ao seu
potencial antioxidante, com efeitos benéficos à saúde. No entanto, ainda são escassos os
estudos científicos sobre o teor de compostos fenólicos e a comprovação da atividade
antioxidante do alpiste. A fim de identificar novas fontes de antioxidantes naturais e de
esclarecer lacunas acerca das reais propriedades benéficas atribuídas ao alpiste (Phalaris
canarienses L.), o objetivo deste trabalho foi realizar a caracterização química e avaliação
da atividade antioxidante do extrato aquoso de sementes de alpiste. Os compostos bioativos
(fenólicos totais) e a atividade in vitro foram avaliados pelos métodos de captura de radicais
ABTS, DPPH e ORAC por espectrofotometria. Foram obtidos os seguintes resultados:
compostos fenólicos totais (280,15 ± 3,05 µg EAG/g) e Atividade Antioxidante ABTS
(228,93 ± 2,25µg TE/g), DPPH (106,17 ± 6,69 µg TE/g) e ORAC (1177,37 ± 5,32 µM/g na
fração hidro e 147,79 ± 0,48 µM/g na lipo). Observou-se que as frações hidrofílicas
apresentaram valores superiores às lipofílicas. Apesar dos relatos anteriores da literatura
destacar o elevado poder antioxidante e de compostos fenólicos, neste estudo o extrato
aquoso de alpiste mostrou-se inferior quando comparado com outros alimentos e também
com compostos fenólicos de sementes. Os resultados obtidos nesta pesquisa contribuem
significativamente com novos dados para a literatura atual sobre o potencial biológico do
alpiste.
Palavras-chave: Alpiste, Compostos Bioativos, Atividade Antioxidante, Compostos
Fenólicos.
118
Abstract
The pathophysiological mechanisms linking diabetes to the metabolic syndrome are not
fully elucidated, although evidences show that oxidative stress and increased production of
free radicals are important mechanisms in this connection. Some reports indicate the
popular use of canary seeds in the control of diabetes due to its antioxidant potential, with
beneficial effects to the health. However, there are still few scientific studies on the content
of phenolic compounds and the comproved antioxidant activity of canary seeds. In order to
identifying new sources of natural antioxidants and clarify gaps about the real beneficial
properties attributed to the canary seed (Phalaris canarienses L.), the objective of this work
was to perform the chemical characterization and evaluation of the antioxidant activity the
aqueous extract of canary seeds. The bioactive compounds (phenolics) and the in vitro
activity were evaluated by spectrophotometer through capture methods such as ABTS
radical, DPPH and ORAC. The following results were obtained: total phenolic compounds
(280.15 ± 3.05 μg GAE / g) and Antioxidant Activity ABTS (228.93 ± 2,25μg eqtrolox / g),
DPPH (106.17 ± 6.69 μg eqtrolox / g ) and ORAC (1177.37 ± 5.32 uM / g in the fraction
hydro and 147.79 ± 0.48 uM / g in lipo). It was observed that the hydrophilic fractions
showed values higher than the lipophilic ones. Despite previous reports in the literature
highlight the high antioxidant power and phenolic compounds, in this study the aqueous
extract of canary seed proved to be less eficient when compared to other foods and also
with phenolic compounds from other seeds. The results obtained in this research
significantly contribute to new data to the current literature on the biological potential of
canary seed.
Keywords: Canary seed, Bioactive Compounds, Antioxidant Activity, Phenolic
Compounds.
119
1. INTRODUÇÃO
Pesquisas demostram que todo grão consumido ajuda a diminuir o risco de doença
cardiovascular, acidente vascular cerebral isquêmico, diabetes tipo II, síndrome metabólica
e cânceres gastrointestinais (JONES, 2006; JONES et al., 2002 apud DYKES, ROONEY,
2007). Além da fibra dietética, os cereais integrais contêm muitos componentes
responsáveis pela promoção da saúde, tais como vitaminas, minerais e fitoquímicos, que
incluem os compostos fenólicos.
Os compostos fenólicos apresentam propriedades antioxidantes e proteção contra
doenças degenerativas em que as espécies reativas de oxigênio (ou seja, ânion superóxido,
radicais hidroxila, e radicais peróxidos) estão envolvidos (RHODES; PRICE, 1997 apud
DYKES; ROONEY, 2007; HARBORNE; WILLIAMS, 2000). A definição geral de um
composto fenólico é um composto que contenha um anel de benzeno com um ou mais
grupos hidroxilas. Dentre eles podemos citar os ácidos fenólicos, flavonóides, taninos e
cumarinas, por exemplo (DYKES; ROONEY, 2007).
Os ácidos fenólicos constituem um grupo importante de compostos caracterizado
por um amplo espectro de atividade farmacológica. Eles são responsáveis pela eliminação
de radicais livres, quelação de íons metálicos e alteração da atividade enzimática (WANG,
2001; ROBBINS; BEAN, 2004; ATOUI et al., 2005; ZHENG; ARCEUSZ et al., 2013). Os
ácidos fenólicos participam na regeneração e processos de adaptação em humanos e são
usados na prevenção contra muitas doenças (SLAVIN; MARQUART; JACOBS, 2000
apud ARCEUSZ et al., 2013; WENG; YEN, 2012). Eles impedem o desenvolvimento de
doenças coronárias, a inflamação observada no diabetes tipo 2, bem como auxiliam no
tratamento de câncer (ARCEUSZ et al., 2013).
Os principais ácidos fenólicos em cereais são: os ácidos ferúlico e p-cumárico,
podendo variar seus níveis entre os cereais (SOSULSKI; KRZYSZTOF; HOGGE, 1982;
HAHN; FAUBION; ROONEY, 1983; ZHOU et al., 2004; MATTILA; PIHLAVA;
HELLSTRÖM, 2005; HOLTEKJOLEN; KINITZ; KNUTSEN, 2006; DYKES, ROONEY,
2007). Muita atenção tem sido dada ao ácido gálico, vanílico, salicílico, caféico e p-
cumárico, que são componentes ativos de muitas plantas (KAEFER; MILNER, 2008;
INBARAJ, et al., 2010; ARCEUSZ et al., 2013).
120
Existem vários métodos para a quantificação de compostos fenólicos. Essas
substâncias possuem, em geral, características ácidas, podendo ser isoladas em razão de sua
solubilidade em soluções fracamente básicas como, por exemplo, em solução de carbonato
de sódio. Os métodos utilizados para a quantificação dos compostos fenólicos, em geral,
utilizam reações de oxi-redução entre o reagente e as hidroxilas fenólicas gerando
complexos coloridos, que são quantificados por espectrofotometria. Nesses métodos todas
as substâncias fenólicas presentes na amostra são quantificadas (SIMÕES, 2000 apud
ZICKER, 2011).
1.1 Mecanismos de Ação dos Antioxidantes
Os antioxidantes podem atuar sobre diferentes níveis na proteção dos organismos.
Podem agir como captadores de radicais e supressores de estados excitados, como sistemas
catalíticos que neutralizam ou eliminam EROs/ ERNs ou fazendo a ligação de íons
metálicos às proteínas, tornando-os indisponíveis para a produção de espécies oxidantes
(HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1999 apud COSTA, 2011).
O primeiro mecanismo de proteção contra os radicais livres é impedir sua formação,
inibindo principalmente reações em cadeia com o ferro e o cobre. Outro mecanismo
importante de defesa é o fato dos antioxidantes serem capazes de interceptar os radicais
gerados pelo metabolismo das células ou por fontes exógenas, evitando o prejuízo aos
lipídeos, aos aminoácidos, às duplas ligações dos ácidos graxos poli-insaturados e às bases
de DNA, impedindo a lesão e perda de integridade celular (BIANCHI e ANTUNES, 1999;
COSTA, 2011).
As pesquisas em relação aos antioxidantes têm focado principalmente, o uso de
nutrientes isolados no tratamento e prevenção de doenças, além do que, nos alimentos são
encontrados uma variedade de substâncias que podem atuar em sinergismo na proteção das
células e tecidos (HERCBERG et al., 1998 apud COSTA, 2011; JACOB, 1995; NIKI et al.,
1995).
O consumo de alimentos contendo uma significativa quantidade de antioxidantes
pode ajudar o organismo a reduzir os danos oxidativos relacionados ao envelhecimento e
doenças como arteriosclerose, diabetes, úlcera e câncer (REPETTO; LLESUY, 2002;
SACHIDANANDAM; FAGAN; ERGUL, 2005; HALLIWELL, 2007; SHAH et al., 2007;
BIERHALS et al., 2009).
121
Quanto ao desempenho dos antioxidantes in vivo, este depende de fatores como:
tipo de radical formado, local e como são gerados, análise e métodos para a identificação
dos danos e as doses ideais para se obter proteção. Nesse sentido, é possível que um
determinado antioxidante atue como protetor em determinado sistema mas falhe na
proteção de outro, ou então, aumente as lesões induzida em outros sistemas ou tecidos
(HALLIWELL et al., 1995 apud COSTA, 2011).
Há várias lacunas no que se refere aos antioxidantes, como por exemplo, a
inexistência de uma recomendação específica para cada antioxidante, a falta de
padronização dos valores de antioxidantes nos alimentos e os efeitos tóxicos que venham a
existir pela administração de doses excessivas de antioxidantes (LIMA, 2008; COSTA,
2011).
1.2 Métodos Utilizados na Avaliação da Capacidade Antioxidante
Os testes in vitro têm se tornado importantes ferramentas que auxiliam na busca por
substâncias bioativas, bem como na seleção de matéria-prima para estudo. Estes testes têm
demonstrado a importância de dietas ricas em frutas e vegetais, alimentos ricos em
substâncias antioxidantes, as quais auxiliam no combate aos radicais livres. Devido à
crescente busca por substâncias bioativas que substituam os produtos sintéticos e diminuam
os efeitos colaterais, um grande número de testes in vitro tem sido desenvolvido para
avaliar a atividade antioxidante, porém muitos desses métodos não têm demonstrado
correlação com a habilidade dos compostos em inibir a deterioração oxidativa in vivo. Isto
se deve ao fato de que a atividade antioxidante depende não somente da reatividade
química do antioxidante, mas também de fatores como localização física, interação com
outros componentes e condições ambientais. Devido aos diversos tipos de radicais e aos
diferentes alvos de oxidação, dificilmente haverá um único método capaz de representar de
forma segura e precisa a real atividade antioxidante de um composto. Para uma avaliação
correta desta atividade em alimentos e sistemas biológicos, modelos individuais devem ser
desenvolvidos desde que representem as mesmas condições químicas, físicas e ambientais
esperadas para o sistema em análise (ALVES et al., 2010).
Entre os métodos disponíveis para avaliação da atividade antioxidante estão os
métodos baseados na captura do radical peroxila (ORAC, TRAP), poder de redução do
metal (FRAP, CUPRAC), captura da radical hidroxila (método de desoxirribose), captura
122
do radical orgânico (ABTS, DPPH) e quantificação de produtos formados durante a
peroxidação de lipídeos (TBARS, oxidação do LDL, co-oxidação do β-caroteno)
(ARUOMA, 2003 apud COSTA, 2011; FRANKEL e MEYER, 2000; SÁNCHEZ-
MORENO, 2002;) e etc.
Dentre estes métodos, ABTS, FRAP, DPPH e ORAC são alguns dos mais usados
atualmente (PÉREZ-JIMÉNEZ e SAURA-CALIXTO, 2006; COSTA, 2011).
Embora existam várias metodologias para a determinação da capacidade
antioxidante, deve-se observar os possíveis interferentes e adequação da matriz à
metodologia. Dessa forma, levando-se em conta os pontos fortes, pontos fracos e
aplicabilidade de cada tipo de ensaio (SUCUPIRA et al., 2012), atualmente preconiza-se a
utilização de duas ou mais técnicas, já que nenhum ensaio usado isoladamente para
determinar a capacidade antioxidante irá refletir exatamente a “capacidade antioxidante
total” de uma amostra (PRIOR; CAO, 1999; SUCUPIRA et al., 2012). Esses métodos são
necessários, pois existe uma grande dificuldade em medir cada composto que tenha ação
antioxidante, separadamente, além das interações existentes entre os diferentes
antioxidantes do sistema. Todos os métodos utilizados na mensuração da capacidade
antioxidante têm em comum a presença de um agente antioxidante e um substrato
específico. Esses métodos possuem duas classificações: os que agem na captura de radicais
livres e os que atuam na determinação de uma molécula alvo (LIMA, 2008; COSTA,
2011).
Os métodos in vitro são avaliações potenciais da atividade antioxidante de um
determinado composto puro ou extrato. Porém, estes métodos não fornecem informações
sobre a biodisponibilidade ou metabolismo destes compostos em sistemas biológicos, mas
são úteis para comparar os níveis de atividade antioxidante entre uma larga variedade de
amostras (DYKES; ROONEY, 2007). Para a utilização de antioxidantes em alimentos, para
fins tecnológicos, a avaliação in vitro, se bem conduzida, fornece uma estimativa
importante do potencial antioxidativo do composto em análise (BERTOLDI, 2006). É
comumente compreendido que para combater a oxidação é preciso aumentar as defesas
naturais do organismo com antioxidantes provenientes de outras fontes. Assim, medir a
capacidade antioxidante de várias fontes torna-se importante (BANK e SCHAUSS, 2004).
A capacidade antioxidante é definida como a habilidade de um componente em
reduzir os pró-oxidantes. Os radicias livres são produzidos in situ (no organismo) e são
123
úteis para importantes funções biológicas. Os alimentos ingeridos fornecem um diverso e
complexo estoque de antioxidantes para combater a atividade excessiva de radicais livres.
Aparentemente existem combinações ilimitadas de antioxidantes internos e externos, e de
radicais que eles combatem. Isto explicaria porque nenhum status de medida de
antioxidantes fornece uma quantidade suficiente de dados para avaliar em um único
experimento a atividade de eliminação dos radicais livres de um alimento ou o potencial de
sua atividade antioxidante in vitro (BANK e SCHAUSS, 2004).
1.2.1 Quantificação de Compostos Fenólicos Totais
Conteúdo Total de Fenólicos ou ensaio TPC com o Folin Ciocalteu, é um ensaio de
relevância pois, quantifica o conteúdo fenólico total de uma amostra. Além de fornecer o
óbvio benefício da avaliação das quantidades dentro de fontes de alimentos, este método
também pode ser usado em conjunto com a avaliação antioxidante, ensaios para determinar
potencial relativo antioxidante à quantidade e/ou concentração.
Esse método foi descrito por Singleton e Rossi, em 1965 (LIMA, 2008; SUCUPIRA
et al., 2012). O método que usa o reagente de Folin-Ciocalteu utiliza a redução pelos
fenóis, ou outras substâncias redutoras, na presença do catalisador cobre (II), e produz um
composto com absorção máxima de 760 nm (SINGLETON et al., 1999), em meio alcalino,
do fosfomolibdato-fosfotungstato, a molibdênio, cuja coloração é azul determinada
espectrofotometricamente.
A determinação dos compostos fenólicos totais pode ser avaliada pelo método
colorimétrico de Folin-Ciocalteau, utilizando ácido gálico como padrão (SINGLETON et
al., 1999). A utilização do método de Folin-Ciocalteau permite quantificar o teor de
flavonóides, antocianinas e compostos fenólicos presentes nas amostras.
1.2.2 Método ABTS (2,2'-azino-bis (3-etilbenzotriasolina) 6-ácido
sulfônico)
O ensaio da Atividade Antioxidante Total Equivalente ao Trolox (TEAC) foi
originalmente desenvolvido por Miller et al., (1993) apud Costa, (2011) para a medição da
capacidade antioxidante do plasma humano em crianças. Re et al., (1999) modificaram o
ensaio para a direta geração de ABTS•+ sem radicais intermediários.
124
A metodologia que tem sido bastante aplicada pelos pesquisadores e utiliza o radical
ABTS•+, que apresenta com principais vantagens em relação aos demais, ser capaz de reagir
com extratos hidrofílicos e lipofílicos, além da forma de expressão dos resultados como
valor TEAC, facilitando assim comparações entre diversos alimentos. O radical ABTS•+ é
produzido a partir de um precursor, o ácido 2,2-azino-bis (3-etilbenzotiazolin)-6-sulfônico,
pode ser gerado por meio de uma reação química, eletroquímica ou enzimática,
normalmente se utiliza o persulfato de potássio (Figura 18). O radical formado é um
cromóforo estável quimicamente (MILLER et al., 1993 apud COSTA, 2011; RE et al.,
1999), podendo ser solubilizado em meios orgânicos e aquosos nos quais a atividade
antioxidante pode ser determinada, dependendo da natureza dos compostos antioxidantes
(ARNAO, 2000; SUCUPIRA et al., 2012).
Figura 18. Reações com cátion radical ABTS
•+.
Fonte: PANNALA et al., 2001.
O método do ABTS avalia espectrofotometricamente a habilidade relativa das
substâncias antioxidantes em capturar a longo prazo o cátion radical ABTS•+, quando
comparada com uma quantidade padrão do antioxidante sintético Trolox (ácido 2-
carboxílico-6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano), um análogo da vitamina E (PEREIRA,
2009). Esta captura provoca um decréscimo na absorbância, que é lida a partir da mistura
do radical com o antioxidante em diferentes tempos, sendo representadas graficamente
(PÉREZ-JIMÉNEZ; SAURA-CALIXTO, 2006; SUCUPIRA et al., 2012). Consiste em
verificar como os antioxidantes são capazes de degradar os radicais livres presentes no
meio. Por esse método, inicialmente, gera-se o radical colorido; em seguida, adiciona-se o
antioxidante para posteriormente, medir o decréscimo na absorbância. Sendo que, quanto
maior a atividade antioxidante do composto testado, maior será o decréscimo na
125
absorbância. Inicialmente apresenta cor azul esverdeado, por meio da reação do ABTS com
persulfato de potássio que possui absorção máxima em 645, 734 e 815 nm. Com a adição
de um antioxidante, ocorre a redução do ABTS•+ promovendo a perda da coloração do meio
reacional. Com a perda de cor, a porcentagem de inibição do ABTS•+ é determinada em
função do Trolox, um padrão submetido às mesmas condições de análise do antioxidante. A
curva gerada pela inibição da absorbância é calculada, sendo que os resultados são
interpolados na curva de calibração e expressos em capacidade antioxidante equivalente de
Trolox expressos como TEAC (ALVES; BRITO; RUFINO, 2006 apud SILVEIRA, 2008).
Dentre as vantagens apresentadas pelo método ABTS destaca-se a alta sensibilidade
(ABREU, 2007; SILVEIRA, 2008), avaliando compostos puros e extratos vegetais
(SUCUPIRA et al., 2012). É um método bastante rápido, no qual o tempo de reação é de
apenas seis minutos, quando comparados com métodos que também têm sido
frequentemente utilizados, como o DPPH, que necessita de 30 minutos para que a reação
seja totalmente realizada, e que oferece resultados reprodutíveis, além de oferecer vários
máximos de absorção e uma boa solubilidade e estabilidade (KUSKOSKI et al., 2005 apud
SUCUPIRA et al., 2012). Sendo assim, o ABTS pode ser usado também em grande escala,
devido a essa rapidez de execução (ABREU, 2007; SILVEIRA, 2008).
1.2.3 Método DPPH
O DPPH é um método químico, aplicado para determinar a capacidade antioxidante
de um composto em sequestrar radicais livres (SUCUPIRA et al., 2012). O DPPH (2,2-
difenil-1-picrilidrazil) é um radical de nitrogênio orgânico, estável, de cor violeta, que
possui absorção na faixa de 515-520 nm (PRADO, 2009; SUCUPIRA et al., 2012).
Essa metodologia foi realizada segundo Blois (1958) adaptado por Brand-Willians;
Cuvelier; Berset (1995) apud Silveira, (2008) e Lima (2008), a qual se baseia na captura do
radical DPPH por antioxidantes, ou seja, na redução do radical [2,2 difenil-1-pricril-hidrazil
(DPPH)], que ao fixar um H+ (removido do antioxidante em estudo), leva a uma
diminuição da absorbância a 515 nm, permitindo calcular, após o estabelecimento do
equilíbrio da reação, a quantidade de antioxidante gasta para reduzir 50% do radical DPPH.
Na presença de um doador de hidrogênio ou elétron a intensidade de absorção
diminui e a solução com o radical perde cor, tornando-se amarela, de acordo com o número
de elétrons capturados, ou seja, quando o elétron desemparelhado do átomo de nitrogênio
126
no DPPH recebe um átomo de hidrogênio proveniente de compostos antioxidantes, ocorre a
mudança de cor (PRADO, 2009; SUCUPIRA et al., 2012). Quando uma solução de DPPH
é misturada com uma substância que pode doar um átomo de hidrogênio, a forma reduzida
do radical gerado é acompanhada de perda de cor (BERNARDES et al., 2011), conforme
Figura 19.
Figura 19. Reações com DPPH.
Fonte: CHENG et al., 2003.
O radical estável (DPPH•) (BRAND-WILLIAMS; CUVELIER e BERSET, 1995
apud SILVEIRA, 2008) tem sido amplamente utilizado para avaliar a capacidade de
antioxidantes naturais em sequestrar radicais livres (ROESLER et al., 2007; SILVEIRA,
2008). A atividade do antiradical expressa pelo parâmetro EC50 é definida como a
quantidade do antioxidante necessário para diminuir 50% da concentração do DPPH• inicial
(ALVES; BRITO; RUFINO, 2006 apud SILVEIRA, 2008). Também utilizado para avaliar
a atividade antioxidante de compostos específicos ou de um extrato em curto período de
tempo (PRADO, 2009; SUCUPIRA et al., 2012).
O ensaio do DPPH é um teste rápido e simples, com boa reprodutibilidade dos
resultados, que não envolve condições drásticas de temperatura e oxigenação. Entretanto,
algumas precauções devem ser tomadas quanto à utilização do método e interpretação dos
resultados, dentre eles, o tipo e concentração do composto analisado (composto puro ou
mistura de compostos), cinética de reação do antioxidante, características do meio reacional
(pH, tipo de solvente), presença de interferentes, sinergismo, afinidade solvente-substrato e
maneira de expressar os resultados (BRAND-WILLIAMS, CUVELIER e BERSET, 1995
apud SILVEIRA, 2008; BONDET; BRAND-WILLIAMS e BERSET, 1997; ARNAO,
127
2000; LLESUY et al., 2001; MOLYNEUX, 2004; BERTOLDI, 2006), é considerado um
método prático e com boa estabilidade (SUCUPIRA et al., 2012).
O método DPPH tem sido muito utilizado pela facilidade de execução e baixo custo,
além de obtenção de resultados confiáveis. O DPPH é um radical livre que pode ser obtido
diretamente por dissolução do reagente em meio orgânico. A vantagem desse método se dá
pela disponibilidade em se obter comercialmente o radical DPPH, o que evita sua geração
por formas distintas, facilitando seu uso, porém, por ser um método que utiliza metanol
para gerar a reação, seu uso se torna inapropriado para amostras biológicas, devido à
ocorrência de precipitação das proteínas em meio alcoólico (BRAND-WILLIAMS et al.,
1995 apud SILVEIRA, 2008).
1.2.4 Método ORAC (Capacidade de Absorção do Radical Oxigênio)
O ensaio ORAC foi desenvolvido pelo Dr. Alexander N. Glazer no início da década
de 1990 para a determinação de EROs em sistemas biológicos, através de degradação
térmica de AAPH seguido por uma reação de tranferência de átomos de hidrogênio (HAT)
competitiva entre as amostras antioxidantes (ou padrão Trolox) e os radicais peroxil
gerados com o fluorescente. Fluorescência emite um sinal em tempo real registrado pelo
leitor de placas a um par de comprimento de onda de excitação/emissão de 493/515 nm e
diminui rapidamente, uma vez que sofre uma reação HAT com os radicais peroxil gerados
por nitrogênio (Figura 20).
Figura 20. Reação ORAC.
Fonte: DÁVALOS et al., 2004.
O método Oxygen radical absorbance capacity (ORAC) é um método que se baseia
na propriedade fluorescente das proteínas B-ficoeritrina (B-PE) e R-ficoeritrina (R-PE),
128
sendo medida a partir do seu decréscimo, como consequência da perda de sua
conformidade ao sofrer dano oxidativo (PRIOR; CAO, 1999; SUCUPIRA et al., 2012). O
radical peroxil é um oxidante comumente encontrado em substratos biológicos. É menos
reativo que o •OH possuindo um tempo de meia-vida de segundos a nanossegundos
(HALLIWELL et al., 1995 apud ALVES et al., 2010). Estas proteínas são usadas como
indicador fluorescente e foram primeiramente isoladas de Porphyridium cruentum e algas
vermelhas, respectivamente (ALVES et al., 2010).
Neste ensaio a oxidação ocorre pela exposição do flouróforo à presença de radicais.
Com a oxidação, ocorre à diminuição da emissão de fluorescência, a capacidade
antioxidante é então medida com o passar do tempo, sendo que, quando o ensaio é
realizado na presença de algum composto antioxidante, a fluorescência leva um tempo
maior para diminuir. É baseado no ataque de radicais livres, usa-se a peroxila, espécie
reativa de oxigênio biologicamente mais importante, por sua abundância e por ser
responsável pelo dano oxidativo (ANTOLOVICH et al., 2002; PEREIRA, 2009). Como
fonte desses radicais utiliza-se o AAPH, que os gera depois de sofrer decomposição
térmica. Os radicais livres vão degradar a estrutura química da fluoresceína sódica, levando
a perda de sua conformação inicial com o consequente decréscimo da emissão de
fluorescência (OU et al., 2001; PEREIRA, 2009). O antioxidante adicionado reage
rapidamente com os radicais, doando átomos de hidrogênio e inibindo a perda da
intensidade da fluorescência. Essa inibição é proporcional a atividade antioxidante (WU et
al., 2004; PEREIRA, 2009). Permitindo uma medição direta da capacidade antioxidante de
compostos hidrofílicos e lipofílicos versus radicais peroxila (OU et al., 2001).
A reação é medida por espectrofotometria com máxima emissão de fluorescência
em 575 nm (B-PE) e 578 nm (R-PE) (ALVES et al., 2010). Este ensaio avalia a atividade
antioxidante por meio da inibição da oxidação, induzida pelo radical peroxil, por
transferência de átomos de hidrogênio. A atividade antioxidante de uma dada substância é
determinada por meio da diferença entre a área da amostra subtraída pela área do branco,
medida pelo decaimento da fluorescência com a adição da substância antioxidante no
decorrer do tempo (ALVES et al., 2010).
O teste hidro-ORAC reflete a capacidade antioxidante de compostos com
solubilidade na água, enquanto o teste lipo-ORAC mede a capacidade antioxidante de
compostos com solubilidade em lipídeos. A importância destes dois testes é aditiva. Trolox
129
um tipo de vitamina E solúvel em água é utilizada como parâmetro de calibração, a partir
de concentrações conhecidas de Trolox, uma curva padrão é gerada e a atividade ORAC da
amostra é calculada (CAO et al., 1993; ALVES et al., 2010). Embora o teste não mensure a
capacidade de eliminação dos radicais livres, pode ser uma representação válida e
significativa da capacidade antioxidante (BANK e SCHAUSS, 2004).
O método ORAC possui uma vantagem muito importante com relação aos outros
métodos de determinação da capacidade antioxidante que usam a absorbância, que é o uso
da fluorescência como medida do dano oxidativo, pois, assim, ocorre menor interferência
dos compostos coloridos presentes nas amostras. Fator importante a se considerar quando
se analisam alimentos que possuem cor. Outra vantagem é o uso de radicais peroxila ou
hidroxila como pró-oxidantes, conferindo maior significado biológico em relação aos
métodos que usam oxidantes que não são necessariamente pró-oxidantes fisiológicos
(LIMA, 2008; SUCUPIRA et al., 2012), representando um método sensível e confiável que
quantifica a capacidade de absorção de radicais de oxigênio dos antioxidantes (CAO et al.,
1993; BANK e SCHAUSS, 2004).
Quando se refere a antioxidantes o interesse não é apenas na quantidade de
antioxidantes presentes no alimento, mas também na qualidade do antioxidante. O método
ORAC é um ensaio in vitro que mede a força antioxidante de alimentos e de compostos
químicos. Existe uma tendência mundial de adotar o ORAC como método padrão para a
avaliação da capacidade antioxidante total em alimentos (DUXBURY, 2005 apud
PEREIRA, 2009). Esse método é muito utilizado em indústrias, universidades e controles
de qualidade (DÁVALOS et al., 2004).
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 Reagentes e Equipamentos
Metanol, grau cromatográfico, foi adquirido da Chemco, etanol absoluto p.a. da
Quemis e o carbonato de sódio, persulfato de potássio da Synth. O reagente Folin
Ciocalteau, foi adquirido da Dinâmica® e os reagentes DPPH· (2,2-diphenyl-1-
picrylhydrazyl), ABTS· (2,2'-azino-bis (3-etilbenzotriasolina) 6-ácido sulfônico), Trolox e
os reagentes utilizados no teste de ORAC foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis,
130
USA). Os padrões de ácido gálico monohidratado puríssimo da Vetec. Os equipamentos
utilizados foram espectrofotômetro – DU 640 (Marca – Beackman Coulter), banho-maria
(Marca – Marconi BTC-9090 Digimec), balança analítica (Marca – UHT HR-200 máx
210g) e fluorímetro NovoSTAR - BMG Labtech.
2.2 Preparo do Extrato
Para a extração dos compostos das sementes de alpiste foram utilizados 150 g de
sementes, as quais foram homogeneizadas com 200 mL de água destilada e deixadas em
repouso por 12 horas, desprezou-se essa água e adicionou-se novamente 200 mL de água
destilada, sob trituração de cinco minutos, peneirou-se quatro vezes em peneira comum,
filtrou-se dez vezes em filtro de nylon, em seguida foram realizadas centrifugações
sucessivamente (quatro vezes a 4000 rpm/4 minutos, uma vez a 5000 rpm/5 minutos, uma
vez a 5000 rpm/10 minutos), sendo recolhido o sobrenadante por meio de filtração a vácuo
com papel de filtro. Ao extrato, houve acréscimo de água realizando três diluições e
novamente filtração à vácuo com papel 0,45 µm, 47 mm (membrana de esteres de celulose
branca). E por fim uma última filtração de todo o conteúdo com filtro milex de 0,22 µm
com auxílio de seringa. Os extratos obtidos foram utilizados para determinação de TPC e
das atividades antioxidantes.
2.3 Determinação de Compostos Fenólicos Totais
O método de Folin-Ciocalteu foi usado para medir o teor de fenólicos totais com
espectrofotômetro DU 640 (Marca – Beackman Coulter).
Para a reação colorimétrica, a alíquota de 500 µL de amostra (amostra do extrato
filtrada) diluída em água destilada, foi adicionado 2,5 mL de solução aquosa do reativo de
Folin-Ciocalteau. Após homogeneização procedeu-se repouso de 5 minutos no escuro. Em
seguida foram adicionados 2,0 mL de solução de carbonato de sódio 7,5%. A solução
permaneceu por 2 horas em repouso ao abrigo da luz, à temperatura ambiente.
A solução “branco” foi preparada nas mesmas condiçoes do extrato, substituindo-se
o volume de extrato fenólico pelo volume dos solventes contidos no extrato fenólico. As
leituras das absorbâncias foram realizadas no comprimento de onda de 760 nm em
espectrofotômetro.
131
Os resultados foram calculados e comparados com base na curva-padrão de
calibração de ácido gálico em concentrações variando de 10 a 100 µg/mL. O total de
fenólicos foram determinados como equivalentes de ácido gálico (GAE). A determinação
foi realizada em triplicata.
2.4 ABTS
A determinação da atividade antioxidante pelo método ABTS•+ foi realizada de
acordo com o método descrito por Re et al., (1999).
O ensaio com o radical livre ABTS, foi obtido pela reação de 5 mL de ABTS (7
Mm) com 88 µL de persulfato de potássio (2,45 µM, concentração final). O sistema foi
mantido em repouso, a temperatura ambiente (±25ºC), durante 16 horas em ausência de luz.
Uma vez formado o radical ABTS•+, o mesmo foi diluído com água destilada até obtenção
de absorbância de 0,7000 ± 0,02 à 734 nm. A amostra foi preparada em água destilada e
posteriormente, foram diluídas em diferentes concentrações. A leitura da absorbância
ocorreu com a mistura da reação contendo 750 µL de amostra e 3750 µL de solução ABTS,
contra o branco, realizada exatamente após 6 minutos, a partir da mistura do radical com o
extrato em um comprimento de onda de 734 nm.
O branco da reação foi preparado conforme o procedimento descrito acima, sem
adição da amostra, onde a água é utilizada para corrigir a linha de base. O percentual do
decréscimo na absorbância foi medido pela concentração e a capacidade de capturar o
ABTS•+ foi calculado com base no decréscimo da absorbância observada.
A curva gerada a partir dos valores das absorbâncias e das concentrações das
amostras foi calculada (RUFINO et al., 2006). A porcentagem de desativação do radical
ABTS foi calculada de acordo com a fórmula:
% de inibição = (Abs controle – Abs amostra) / Abs controle
2.5 DPPH
A atividade antioxidante do extrato aquoso de alpiste foi avaliada pelo ensaio DPPH
segundo Roesler et al., (2007).
Misturou-se 200 µL de amostra com 1000 µL de solução DPPH, após 30 minutos de
incubação, ao abrigo da luz e à temperatura ambiente, realizou-se a medida de absorbância
132
da amostra e da curva. O mesmo procedimento foi adotado para a curva padrão de Trolox.
O branco da reação foi preparado conforme procedimento descrito acima, sem adição da
amostra. O solvente extrator é utilizado para corrigir a linha de base. O percentual do
decréscimo na absorbância é medido pela concentração e a capacidade de sequestrar
radicais livres e é calculado com base no decréscimo da absorbância observada. A leitura
da absorbância foi feita a 517 nm em espectrofotômetro.
Todas as leituras foram feitas em triplicata e acompanhadas de um controle (sem o
antioxidante). A queda na leitura da densidade ótica das amostras foi correlacionada com o
controle, estabelecendo-se a porcentagem de descoloração do radical DPPH. A
porcentagem de descoloração do radical DPPH foi calculada de acordo com a Equação 1:
Equação 1. % de inibição = (Abs controle – Abs amostra) / Abs controle
2.6 ORAC
O ensaio foi realizado de acordo com o método proposto por Dávalos et al., (2004).
Todos os reagentes e diluições das frações hidrofílicas e lipofílicas das amostras
foram preparados diariamente.
As reações ocorreram em microplacas de poliestireno, específicas para reações de
fluorescência, contendo 96 compartimentos. Para cada leitura foi preparada uma curva
padrão de Trolox específica para a avaliação da fração hidrofílica e/ou lipofílica, seguida de
diluições apropriadas. Todas as leituras foram realizadas em leitor de microplacas
NOVOstar (BMG Labtech ®, Offenburg, Germany), acompanhado com o software de
análise de dados MARS Data Analysis versão 1.3 (BMG Labtech ®, Offenburg, Germany).
2.6.1 Fração Hidrofílica
Foram preparadas diluiçoes estoque denominadas “mãe” de cada amostra na
concentração de 10 mg/mL (p/v) com tampão fosfato de potássio 75 mM, pH 7,4. As
soluçoes “mães” foram misturadas em agitador vórtex por 30 segundos, seguido de
ultrassonicação a 10ºC durante 30 minutos.
O padrão Trolox 1500 µM foi diluído em tampão fosfato de potássio 75 mM, pH 7,4
em diferentes concentrações, para a confecção da curva padrão do ensaio.
A solução de fluoresceína foi preparada em tampão fosfato de potássio 75 mM, pH
133
7,4, na concentração de 0,00378 mg/mL e mantida ao abrigo da luz até o momento de uso.
O AAPH [2,2’-azobis(2’-metilproprionamidine) dihidrocloreto] foi ressuspendido
em tampão fosfato de potássio 75 mM, pH 7,4, momentos antes do início da leitura da
microplaca.
O sistema de reação em cada poço da microplca continha: 20 µL de amostra, 120
µL de solução de fluoresceína e 60 µL de AAPH a uma temperatura constante de 37ºC,
durante 80 minutos. A intensidade de fluorescência (485 nmEx/520 nmEm) foi verificada a
cada ciclo de 60 segundos, durante 80 ciclos em leitor de microplacas. O mesmo
procedimento foi adotado para os padrões de referência. O branco da reação foi preparado
conforme procedimento descrito acima, sem adição de amostra.
2.6.2 Fração Lipofílica
A amostra foi preparada na concentração de 10 mg/mL (p/v) com solução de
ciclodextrina metilada randomizada a 7% (RMCD) em solução acetona: água (1:1). Estas
soluçoes denominadas “mães” foram misturadas em agitador vórtex por 30 segundos,
seguido de ultrassonicação a 10ºC durante 30 minutos. O padrão Trolox 1500 µM foi
diluído em solução de RMCD 7% em diferentes concentrações, para confecção da curva
padrão do ensaio.
As soluções de fluoresceína e AAPH foram preparadas do mesmo modo que no
ensaio hidrofílico e mantidas ao abrigo da luz até o momento de uso.
O sistema de reação em cada poço da microplaca foi composto de: 20 µL de
amostra, 120 µL de solução de fluoresceína e 120 µL de AAPH, agitou-se suavemente a
placa sob a superfície de uma bancada, para a mistura dos compostos e monitorada a uma
temperatura constante de 37ºC, durante 80 minutos. A intensidade de fluoresceína (485
nmEx/520 nmEm) foi verificada a cada ciclo de 60 segundos, durante 80 ciclos em leitor de
microplacas. O mesmo procedimento foi adotado para os padrões de referência e o branco
da reação foi preparado conforme o procedimento descrito acima, com tampão no lugar da
amostra.
O cálculo da curva de decaimento da fluorescência ou AUC foi realizado com o
auxílio da seguinte fórmula:
AUC = 1+fi/f0+... fi/ f0 + ...f80/f0
134
Onde, o f0 é representado pela fluorescência obtida no tempo 0 e fi a fluorescência
obtida nos tempos intermediários entre 0 e 80 minutos.
As leituras foram realizadas em triplicata e os valores expressos em µmolar
equivalente de Trolox/g de amostra, utilizando-se a curva padrão, realizada em cada ensaio.
A área da perda de fluorescência de uma amostra foi calculada subtraindo a área
correspondente à do controle (branco).
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Além de considerar as características nutricionais do alpiste, é também importante
avaliar os antioxidantes e componentes bioativos presentes no mesmo com potencial
benéfico à saúde humana. Li et al., (2011); Li, (2012) relata, conteúdo de fenólicos totais
(TPC) entre 174-209 mg/kg, estando os ácidos fenólicos do alpiste em concentrações
relativamente elevadas, em particular na fração ligada insolúvel. Estes compostos são
conhecidos por proteger as plantas contra predadores e por fornecer propriedades de
prevenção de doenças, devido as suas propriedades antioxidantes. Semelhante a outros
grãos de cereais, os ácidos fenólicos estão concentrados principalmente na fração do farelo
do alpiste.
Evidências epidemiológicas reforçam que os antioxidantes presentes na dieta podem
desempenhar papel importante na prevenção de diversas doenças crônicas, como doenças
cardiovasculares, câncer e diabetes (WILLCOX; ASH e CATIGNANI, 2004 apud LI,
2012).
3.1 Teor de Fenólicos Totais
Para os resultados do teor de fenólicos totais, uma curva padrão de ácido gálico foi
constrúida, conforme mostra a Figura 21. Todas as determinações foram realizadas em
triplicata e os resultados obtidos nos experimentos foram analisados estatisticamente com
média, desvio padrão e coeficiente de variação.
O conteúdo total de fenólicos calculado para quantidade de sementes de alpiste
utilizada foi de 280,15 µgEAG/g ou 28,02 mg EAG/100g amostra.
135
Figura 21. Curva padrão de ácido gálico para quantificação de compostos fenólicos totais.
Os valores obtidos de TPC para o extrato aquoso de sementes de alpiste, assim
como os valores de desvio padrão relativo, que mostra a dispersão entre os resultados das
replicatas das análises está demonstrado na Tabela 3.
Tabela 3. Resultados obtidos do conteúdo de fenólicos totais.
Fenólicos Totais
( µg EAG/g)Média DP CV
Fenólicos Totais
(mg/100g)Média DP CV
270,54 27,05
283,01 28,30
286,91 28,69
3,05280,15 8,55 3,05 28,02 0,85
Valores elevados de TPC implicam em elevada capacidade antioxidante in vitro. Os
compostos fenólicos em grãos incluem derivados dos ácidos benzóico e cinâmico,
antocianidinas, quininas, flavonóides, flavonas, flavanonas (MADHUJITH & SHAHIDI,
2006; LI, 2011), que são os principais contribuintes para a capacidade antioxidante total in
vitro. Variações em TPC são evidentes para diferentes tipos de grãos por causa de suas
variações naturais nos tipos e níveis de compostos fenólicos (LI, 2011).
O TPC é afetada pela variedade, localização de crescimento e uso mínimo de
fertilizantes (DVORAKOVA, et al., 2008; LI, 2011) e por solventes utilizados na extração
(ZHOU & YU, 2004; LI, 2011). Algumas amostras de alpiste mostraram TPC elevado,
136
expresso como equivalente de ácido ferúlico, variando de 174-209 mg/100g para o integral,
360-450 mg/100g para o farelo e 124-138 mg/100g para a farinha. A remoção do farelo na
produção da farinha, resultou em TPC significativamente menor do que aquele encontrado
em amostras integrais. Assim, o TPC de alpiste diminui na ordem: Farelo> integrais>
farinha. Semelhante a outros relatórios sobre grãos de cereais, compostos fenólicos foram
mais abundantes no farelo (camada externa do grão) do que no endosperma dos grãos
(BETA et al., 2005 apud LI et al., 2011).
Takagi e Iida (1980); Li (2011), também relataram que o antioxidante lipossolúvel,
o qual consiste de esterol e triterpeno, ésteres de álcool de ácido caféico, foi encontrado em
alpiste e o extrato etéreo de alpiste mostraram uma maior atividade antioxidante do que as
sementes de cânhamo, painço italiano e milho comum.
A diferença observada em relação ao TPC das amostras e as encontradas nas
literaturas acima mencionadas, pode ser devido: a época de colheita (safra), bem como a
variação existente tanto entre os lotes (para algumas das espécies) como entre as
localidades de cultivo, estágio de crescimento da planta, dentre outros vários fatores
metabólicos de cada planta envolvida e principalmente como as amostras foram
processadas antes da extração dos fenólicos (solventes, retirada de cascas, etc) (BARROSO
et al., 2014), quantidade de grão para o volume de água utilizada, temperatura da água,
entre outros (GOFFMAN & BERGMAN, 2004). É importante destacar que as análises no
presente estudo, foram realizadas com o extrato aquoso de alpiste, o qual passou por
diversas filtragens e centrifugações, além de ter sido desprezado a água de molho durante o
preparo, fato este que pode ter contruido com os valores inferiores encontrados.
Embora o interesse em estudar os compostos fenólicos e os fitatos nos alimentos
tenha sido estimulado em virtude de seu efeito antinutricional, capaz de complexar
proteínas (KUMAR et al., 2010; SILVA et al., 2011) e quelar minerais (FREDLUND et al.,
2006; SILVA et al., 2011), esses compostos têm recebido atenção especial principalmente
por suas propriedades funcionais (NORAZALINA et al., 2010 apud SILVA et al., 2011;
KIM et al., 2010), tais como efeito hipocolesterolêmico e antioxidante (MORO et al.,
2004).
De acordo com Abdel-Aal; Hucl (2005) apud Abdel-Aal et al., (2010) o alpiste
também contêm fitoquímicos, incluindo fitatos, fenóis, taninos e inibidores de enzima.
Contudo neste trabalho, é possível que esses fitatos foram removidos na água do molho.
137
Comparando com o sorgo (Sorghum bicolor (L.) Moench) um cereal da mesma
família do alpiste, Poaceae (U.S. GRAINS COUNCIL, 2004 apud MARTINO, 2014).
Dicko et al., (2002); Silva et al., (2011), ao avaliar o teor de fenólicos solúveis totais em 50
variedades de sorgo, encontraram valor médio de 0,6 mg/g de EAG. De forma geral, no
pericarpo do sorgo (revestimento externo) e na testa encontram-se os compostos fenólicos
(3-deoxiantocianidinas, taninos condensados, ácidos fenólicos, entre outros) e ainda os
carotenóides (FOOD SECURITY DEPARTMENT, 1999; WANISKA; ROONEY, 2000;
EARP et al., 2004; SLAVIN, 2004 apud MARTINO, 2014). Os resultados de estudos
científicos demonstram que compostos isolados do sorgo, principalmente os fenólicos,
modulam parâmetros relacionados às doenças crônicas não transmissíveis como a
obesidade, o diabetes, as dislipidemias, as doenças cardiovasculares, o câncer e a
hipertensão (MURIU et al., 2002; KAMATH et al., 2007; SHIH et al., 2007a; SHIH et al.,
2007b; FARRAR et al., 2008; AWIKA et al., 2009; YANG et al., 2009; KIM; PARK,
2012; MORAES et al., 2012; WOO et al., 2012; MARTINO, 2014). Relatos que
demonstram que a quantidade de fenólicos está mais concentrada nas frações externas dos
grãos, sendo que no extrato aquoso de alpiste na sua preparação, toda fração externa foi
removida, o que de certa forma foi constatado no ensaio biológico do diabetes não tendo
ação esperada, inclusive nas consequências da evolução da doença.
Segundo Dlamini et al., (2009) e Martino, (2014) os resultados demonstraram que a
presença de taninos nos grãos aumentou significativamente a AA, contrariamente ao
processo de descorticação. Desta forma, a utilização do sorgo descorticado reduz a AA do
cereal e os benefícios que seriam vinculados ao uso do grão integral. Também é relatado
por Farrar et al., (2008) e Martino, (2014) a redução das concentrações dos compostos
fenólicos por lixiviação da água do molho removida. De acordo com as citações acima, os
resultados obtidos do sorgo assemelham-se com os resultados deste trabalho em relação a
atividade antioxidante reduzida do extrato aquoso de alpiste.
Na análise de sorgo comparando os diferentes grãos, notou-se o conteúdo médio de
fenólicos solúveis totais mais elevado nos grãos vermelhos com 1,39 mg/g de EAG, em
comparação aos brancos com 0,40 mg/g de EAG (DICKO et al., 2002). De fato, Tian et al.,
(2004) observaram que a cor do arroz está relacionada ao conteúdo de compostos fenólicos
solúveis totais, e grãos com coloração mais escura apresentam teor consideravelmente mais
elevado desses compostos. Em arroz (Oryza sativa L.), os maiores teores de fenólicos
138
solúveis totais são encontrados nos grãos com pericarpo preto e vermelho, em detrimento
do marrom-claro. De acordo com Walter (2009), essas variações podem ser atribuídas,
principalmente, à cor dos grãos.
O extrato de arroz polido cru apresentou a menor média de compostos fenólicos de
31,73 mg EAG/100g, em comparação ao integral marrom-claro de 278,54 mg EAG/100g,
preto de 427,51 mg EAG/100g e vermelho de 546,95 mg EAG/100g (GOFFMAN &
BERGMAN, 2004). O extrato aquoso de arroz vermelho cru apresentou 17 vezes mais
compostos fenólicos em comparação ao extrato aquoso de arroz branco polido, e o extrato
aquoso de arroz preto cru apresentou aproximadamente 14 vezes mais compostos fenólicos
em relação ao de arroz branco polido cru (GOFFMAN & BERGMAN, 2004). A literatura
relata uma grande variação nos teores desses compostos em grãos de arroz. Alguns autores
identificaram que nos grãos de pericarpo vermelho as concentrações de polifenois variaram
de 34 a 424 mg EAG/100g (GOFFMAN; BERGMAN, 2004), de 478,72 a 972,99 mg
EAG/100g (WALTER et al., 2013) e de 69,6 a 74,80 mg EAG/100g (SHAO et al., 2014a;
SHAO et al., 2014b), o que sugere uma grande variação dentro de um mesmo grupo.
Goffman & Bergman (2004); Walter (2009), avaliando diferentes genótipos de arroz,
obtiveram conteúdo de fenólicos totais entre 1,90 e 50,32mg EAG/g farelo, e entre 0,25 e
5,35mg EAG/g grão, observando os menores valores para aqueles genótipos com pericarpo
marrom-claro.
Analisando antioxidantes em grão de trigo, encontraram teor médio de fenólicos
totais de 53,1±2,8 mg EAG/100 g de trigo (CRUZ et al., 2011; CÓRDOVA et al., 2012).
Em linhaça (Linum usitatissimum L.), Kähkönen et al., (1999); Silva et al., (2011)
relataram teor de fenólicos solúveis totais de 0,80 mg/g de EAG. Velioglu et al., (1998) e
Bozan & Temelli (2008) apud Barroso et al., (2014) analisaram fenóis totais em sementes
de linhaça e reportaram, respectivamente, 509 e 1670 mg de EAG/100g na semente.
Segundo Dykes e Rooney (2007) o conteúdo de compostos fenólicos na aveia é 472
µg/g e no sorgo 385-746 µg/g.
De acordo com Brindzová et al., (2008) a quantidades de compostos fenólicos totais
em aveia utilizados foram semelhantes aos cinco cultivares de aveia de 238 a 278 mg
GAE/g testadas por Emmons e Peterson (1999).
Queiroz et al., (2009) relataram que compostos fenólicos totais do grão do amaranto
foi de 31,7 mg EAG/g.
139
Semente de chia de duas regiões diferentes em México apresentaram valores entre
0,88 e 0,92 mg GAE/g, que é similar ao encontrado para as amostras do Chile de 0,94 mg
GAE/g (MARINELI et al., 2014). De acordo com Picinin (2014) o teor de compostos
fenólicos, nos grãos de chia, foi de 488,8 mg/100g.
O gergelim preto apresentou teor de compostos fenólicos solúveis totais de
261,9±7,5 mg EAG/100g de farinha, aproximadamente duas vezes superior ao do gergelim
creme de 147,5±31,7 mg/100g de EAG. O teor de fitatos do gergelim creme foi duas vezes
inferior ao do gergelim preto. Os grãos de gergelim analisados apresentaram teores de
compostos fenólicos solúveis totais maiores do que os descritos para alguns grãos (SILVA
et al., 2011).
Segundo Bezerra (2012) cultivares de cevada do Rio Grande do Sul demonstrou
conteúdo de compostos fenólicos totais no extrato aquoso de cevada 0,71 – 1,67 mg
EAG/g.
Os valores obtidos para o conteúdo de fenólicos totais para semente jenipapo
192mg/100g em extrato aquoso da amostra seca do fruto (PORTO et al., 2014).
De acordo com Silva et al., (2014) a noz apresenta maior conteúdo de fenólicos
totais em 1759,8 mg/100g seguida pela castanha-do-pará 428,2 mg/100g, amendoim 477,6
mg/100g, amêndoa de baru 301,8 mg/100g e castanha-de-caju 306,9 mg/100g.
O teor de compostos fenólicos no chá de hibisco foi de 672,97 mg EAG/100g de
chá. Oh et al., (2013) trabalhando com diferentes tipos de chás em infusão encontraram um
total de fenólicos de 82,21 mg EAG/100g para infusão de chá verde (NUNES et al., 2014).
De acordo com Sales (2011), teores de compostos fenólicos (em equivalente de
ácido gálico) de extratos aquosos da ração suplementada com aveia, linhaça, gergelim,
semente de girassol e jatobá, foi de 28,8 mg/100g de amostra úmida.
Nestas comparações pode-se ressaltar que o extrato aquoso de sementes de alpiste,
“leite de alpiste”, possue menor quantidade de compostos fenólicos totais em relação ao
sorgo, trigo, linhaça, aveia, amaranto, chia, gergelim, cevada, jenipapo, noz, castanha-do-
pará, amendoim, amêndoa de baru, castanha-de-caju, chá de hibisco e verde. Relacionando
com o extrato aquoso de arroz polido cru, aveia, algumas variedades de sorgo o teor de
TPC fica bem próximo em determinados genótipos. E valores encontrados na literatura na
variação de genótipos de grão de arroz, extratos aquosos da ração suplementada com aveia,
140
linhaça, gergelim, semente de girassol e jatobá comparando com o extrato do alpiste, este
se apresenta superior ou igual respectivamente.
A variação dos compostos fenólicos existentes faz com que diversas amostras em
metodologias diversificadas tenham diferentes habilidades em sequestrar radicais.
3.2 ABTS
Para a determinação da atividade antioxidante pelo método ABTS, foi realizado
uma curva em escala linear para o extrato, com seis pontos distintos e lineares, com r² >
0,99. Os resultados obtidos e a curva estão apresentados abaixo, Figura 22 e Tabela 4.
Figura 22. Curva padrão de trolox % Desativação ABTS em 6 minutos.
Tabela 4. Resultados do extrato aquoso de sementes de alpiste no sequestro do radical
ABTS•.
µg eq trolox/g Média DP CV
226,76
228,78
231,25
228,93 2,25 0,98
141
3.3 DPPH
Para a determinação de inibição do DPPH•, é muito importante que seja realizado
uma curva em escala linear para o extrato. Portanto, foi realizada uma curva com doze
pontos distintos, onde a concentração variou e obteve-se um r² > 0,97, com intuito de
avaliar a linearidade de cada ponto da curva. Os resultados obtidos nas análises de atividade
antioxidante DPPH e a curva estão apresentados abaixo, Figura 23 e Tabela 5.
Figura 23. Curva padrão de trolox para quatificação da atividade antioxidante por DPPH (% de Desativação).
Tabela 5. Habilidade do extrato aquoso de sementes de alpiste no sequestro do radical
DPPH•.
µg eq trolox/g Média DP CV
112,62
106,64
99,26
106,17 6,69 6,30
3.4 ORAC
Os ensaios antioxidantes para determinação da atividade antioxidante do extrato
aquoso de sementes de alpiste pelo método ORAC, determinou o potencial hidrofílico e
lipofílico da amostra em questão. A análise foi feita em triplicata e repetida em três dias
diferentes.
142
Nas Figuras abaixo 24 e 25 estão as curvas de Trolox Hidrofílico e Lipofílico. E as
Tabelas 6 e 7 resultados das análises e padrões de referências utilizados.
Figura 24. Curva Trolox Hidrofilico - tampão fosfato de potássio 75mM pH 7.4.
Figura 25. Curva Trolox Lipofílico - RMCD 7%.
Tabela 6. Resultados ORAC.
ORAC Hidro ORAC Lipo ORAC Total
1177,37 ± 5,32 147,79 ± 0,48 1325,16
µMTE*/g (± desvio padrão)
* µmolar de trolox equivalente.
143
Tabela 7. Resultados do potencial antioxidante de padrões de referência.
Compostos µmol TE*/mol de padrão
Ácido cafeico 95,52 ± 2,34
Acido ferrúlico 107,89 ± 2,08
Acido P -coumarico 110,30 ± 5,43
Apigenina 89,25 ± 5,68
* µmolar de trolox equivalente
Nas análises antioxidantes pode-se perceber valores superiores no método ABTS em
relação ao DPPH, o que é esperado, pois a metodologia do ABTS, medi a atividade de
compostos de natureza hidrofílica e lipofílica, enquanto que o DPPH só pode ser dissolvido
em meio orgânico, portanto medindo as frações lipofílicas.
Até o momento das consultas em bancos de dados conhecidos, foram poucos os
trabalhos científicos relacionados a semente estudada neste trabalho o que dificultou a
comparação com a literatura. Não há muitos estudos sobre o potencial antioxidante, das
sementes de alpiste na forma de extrato aquoso, chamado popularmente como “leite de
alpiste”, a literatura apenas aborda a identificação dos principais ácidos fenólicos e
comparação de fenólicos totais das diversas variedades de sementes, não existindo até o
prezado momento dados científicos do que normalmente se consome, podendo apresentar
resultados discrepantes aos analisados na presente pesquisa.
Alguns autores avaliando outros alimentos através da técnica de ABTS encontraram
as concentrações variando entre o arroz branco de 0,012 a 0,413 mM de TEAC, enquanto
que entre o arroz vermelho, variando de 0,291 a 2,963 mM TEAC e o arroz preto teve a
capacidade antioxidante da média TEAC 4,484 mM, em torno de três de vezes que o de
arroz vermelho (SHEN et al., 2009). Goffman & Bergman (2004); Walter (2009),
avaliando genótipos com diferente cor de pericarpo, observaram valores de atividade
antioxidante entre 10,0 e 13,1µM TE/g de farelo para grãos com pericarpo marrom-claro,
entre 119,9 e 312,3µM TE/g de farelo para grãos com pericarpo vermelho e entre 56,3 e
345,3µM TE/g de farelo para grãos com pericarpo preto. Estudos de Massaretto (2013),
envolvendo arroz preto, vermelho e selvagem crus mostraram valores para DPPH de 2,2;
1,7 e 0,9 mmol TE/100g e para ORAC de 19,1; 8 e 6,8 mmol TE/100g.
Assim como na concentração de compostos fenólicos solúveis totais, também foi
observada diferença na atividade antioxidante usando a técnica ABTS em grãos com a
144
mesma cor do pericarpo, variando de 37,19 a 68,83 mmol TE/g naqueles com pericarpo
vermelho, demonstrando variabilidade nessa característica dentro do grupo (WALTER,
2009). Atividade antioxidante de grãos de arroz integral 4,70 ± 0,38 a 66,58 ± 1,35 mmol
de TE (WALTER, 2009).
Segundo Cunha (2014) extratos metanólicos de semente de trigo apresentaram de
86,42 a 425,6 mg Trolox/g no teste ABTS e 15,33 a 112,3 mg Trolox/g em DPPH, após 10
dias de germinação.
Honermeier (2011) avaliou a capacidade antioxidante da farinha de trigo integral
pelo teste ORAC e observou atividade de 15,1 a 25,2 mmol TE/g, que foi menor do que na
maioria das outras investigações de trigo relatadas na literatura. Por exemplo, ORAC
valores de cultivares de trigo mole investigados pela MOORE et al., (2005);
HONERMEIER (2011) variou 32,9-47,7 TE µmol/g. Cultivares de trigo mole foram
analisados por ZHOU et al., (2004) variou entre 15,5 e 24,5 µmol TE/g.
Extratos metanólicos de semente de cevada variou de 181,5 a 363,5 mg Trolox/g em
ABTS e 54,71 a 83,38 mg Trolox/g no DPPH em 10 dias de germinação (CUNHA, 2014).
Atividade antioxidante de cultivares de cevada do Rio Grande do Sul pelo método DPPH
apresentaram atividade de 86,62 a 96,47% (BEZERRA, 2012).
Os valores de ORAC determinados para grãos de cevada exibiram valores variando
entre 2034 à 3829 μmol TE/g (ROSA, 2007).
Barroso et al., (2014) determinou a capacidade antioxidante total mmol TEAC/kg
para linhaça marrom e dourada respectivamente, encontrando na fração hidrofílica de 3,76
e 3,41 e na fração lipofílica 5,15 e 3,54. No ensaio de DPPH a amostra de linhaça
apresentou valor de IC50 de 0,226 mg/ml (PILAR, 2014).
Comparativamente, as amostras de amaranto mostraram 2133,16 μmoles TE/g,
seguido de 1800,71 μmoles TE/g, 751,49 μmoles TE/g e 342,25 μmoles TE/g (CARLOS et
al., 2013).
Na aveia segundo os testes de DPPH 3,5 mg Trolox/g e 17,8 mg de Trolox/g e
ABTS 0,83 a 3,5 mg Trolox/g em um peso seco (BRINDZOVÁ et al., 2008).
Os valores ORAC de sete comumente consumidos, variedades de aveia
geneticamente independentes, são relatados resultados variando de 11 µmol TE/g a 28
µmol TE/g (CHU et al., 2013).
145
Atividade antioxidante do sorgo pela técnica de ABTS apresentou atividade de 427
µmol TE/g, e atividade antioxidante por DPPH de 305 µmol TE/g (DLAMINI et al., 2007).
De acordo do Dykes e Rooney (2006) a atividade do grão do sorgo por meio da técnica
ORAC variou entre 868 – 3124 µmol TE/g de sorgo com taninos; 219-1008 µmol TE/g de
grão de sorgo preto; 140-710 µmol TE/g de grão de sorgo vermelho e 22-64 µmol TE/g de
grão de sorgo branco. Em geral, os sorgos pigmentados tiveram valores de ORAC de 140-
870 mg TE/g nos grãos e 710-3100 mg TE/g nos farelos (MOYER et al., 2002; AWIKA et
al., 2003).
Dicko et al., (2002); Silva et al., (2011) relataram que os extratos metanólicos
obtidos do gergelim creme e preto apresentaram 27,45 e 52,98 respectivamente de
capacidade de eliminar o radical DPPH.
Segundo Othman et al., (2015) valores de ORAC hidro de sementes de gergelim
branco e dourado foram 34.720 e 21.700 mols TE/100g. Os resultados mostraram que o
extrato bruto polar de sementes de gergelim tinha um valor mais alto que o encontrado para
sementes de soja (5409 mmol TE/100g) e para de farelo de arroz (8817 µmol TE/100g).
Ishiyama et al., (2006) relataram valores de ORAC para extrato metanólico de duas
variedades de sementes de gergelim do Japão de 658,3 e 827 mg TE/100g.
O potencial do grão de chia em sequestrar radicais livres foi expresso como
concentração final do extrato, necessária para inibir a oxidação do radical DPPH em 50%
(EC50), com resultados de 0,75 a 0,94 mg/mL (PICININ, 2014).
Dados relatados por Marineli et al., (2014) para sementes de chia foram de TEAC
523,78 mmol TE/g, DPPH 436,61 mmol TE/g, ORAC hidro 517,30 mmol TE/g, ORAC
lipo 6,48 mmol TE/g. As amostras também apresentaram maior atividade antioxidante em
relação ao encontrado em farinha de trigo, cevada e sorgo (cereais integrais) (8,3, 14,9 e
51,7 TEAC, mmol/g) e foram semelhantes ao do farelo de sorgo com alto teor de tanino
(512,0 TEAC, mmol/g) (MARINELI et al., 2014).
A noz também apresenta maior capacidade antioxidante comparado com o extrato
de alpiste (290,6 ± 0,60 µmol TE/100g) seguida pelas demais nozes e sementes
comestíveis, que apresentaram capacidade antioxidante semelhante entre si, tais como:
castanha-do-pará 69,1 µmol TE/ 100g; castanha-de-caju 63,6 µmol TE/ 100g; amêndoa de
baru 65,1 µmol TE/ 100g e amendoim 62,7 µmol TE/ 100g (SILVA et al., 2014).
146
Dados relacionados a erva-mate na atividade antioxidante hidrofílica variou de
0,1336 a 0,5583 mM TE, variando meses (épocas de ano) e regiões do sul do Brasil,
atividade antioxidante pelo método DPPH 4,0221 a 11,1393 mM TE (CANTERLE, 2005).
Para elaboração do extrato do fruto noni, acetona 80% foi utilizado como solvente,
por apresentar um melhor poder de extração. Os resultados da atividade antioxidante foram
507,27 μmol TEAC/100g pelo método ABTS, 367,54 μmol TEAC/100g pelo método
DPPH no fruto in natura e 7593,04 μmol TEAC/100g pelo método ABTS, 5184,51 μmol
TEAC/100g pelo método DPPH no fruto do noni pré-seco (SILVA et al., 2014).
A atividade antioxidante da semente de jenipapo expressa em EC50, quantidade de
antioxidante necessária para reduzir a 50% a concentração inicial de DPPH, são 5747,12
μg/mL do extrato ou mg/100g de semente (PORTO et al.,2014).
De acordo Pugliese (2010) a atividade ORAC na semente de cacau é de 1087 ± 56
µmoles TE/g de amostra.
Conforme Cazarin et al., (2014) a casca de maracujá apresenta pelo teste do ORAC
hidrofílico 40,83 ± 1,75 μmol TE/ g de amostra.
Avaliando 40 cultivares de mirtilo, Wang; Chen e Ehlenfeldt (2011) encontraram
valores ORAC que variaram de 196 a 528 µmol TE/g em base seca. Já em goiabas foi de
86,97 µmol TE/g (PATTHAMAKANOKPORN et al., 2008). Em outro estudo, Wu et al.,
(2004) encontraram para manga 54,75 µmol TE/g, uva 64,28 µmol TE/g, cereja 169,75
µmol TE/g, maçãs entre 164 a 294 µmol TE/g e morango 401,91 µmol TE/g.
Estudo realizado com extratos com água e acetona de sementes de uva (V. vinífera)
demonstrou que a atividade antioxidante determinada por ORAC, variou no intervalo de
1425,9 a 3009,2 µmolTE/g. Avaliou a atividade antioxidante por ORAC das sementes de
romã (P. granatum) obtendo valores de 12.202,06 µmolTE/g (SCHAUSS et al., 2006;
BOZAN et al., 2008; MÜLLER et al., 2010). Segundo Xia et al., (2010) vinho de uva
apresenta 10.724 µmol/L.
Dados da literatura demonstraram que extratos aquosos de erva-mate, menta e chá
verde avaliados pela metodologia ORAC, apresentaram atividade antioxidante de 5092,
1409 e 4704 µmolTE/g, respectivamente (DUDONNÉ et al., 2009; KRATCHANOVA et
al., 2010; MACEDO et al., 2011).
Hudnall, 2007, demonstrou que um extrato de própolis preparado com água e
acetona apresentou atividade antioxidante, determinada por ORAC, de 2459 µmolTE/g.
147
Fazendo um comparativo global, apesar de algumas unidades e os solventes
extratores não serem correspondentes, pode-se afirmar que a atividade antioxidante do
extrato aquoso de sementes de alpiste é inferior ao trigo, cevada, linhaça, aveia, sorgo,
gergelim, jenipapo, cacau, uva, romã, erva-mate, menta, chá verde e própolis, ficando
acima apenas da casca de maracujá, mirtilo, manga, cereja, maçã e morango. Muito
próximo de alguns genótipos de arroz integral marrom-claro e da aveia, provavelmente
devido a similaridade entre as amostras.
Segundo Awika et al., (2003) valores de ORAC geralmente são 3 a 4 vezes mais
elevados do que o ABTS ou valores DPPH.
O método ORAC é considerado preferencial devido a sua relevância biológica
através da eficácia in vivo, contudo apesar dos resultados superiores aos métodos ABTS e
DPPH, a comparação com outros alimentos demonstrou baixos resultados do extrato
aquoso de sementes de alpiste.
Diferentes métodos são descritos na literatura científica para a extração de
compostos fenólicos solúveis totais em alimentos de origem vegetal. O metanol, etanol e
acetona são os solventes mais utilizados na obtenção dessas substâncias (JU; HOWARD,
2003 apud GOFFMAN & BERGMAN, 2004). Porém, poucos autores relatam a utilização
somente de água como solvente no isolamento dos compostos fenólicos solúveis totais de
diversas matrizes alimentares (GOFFMAN & BERGMAN, 2004). Para a determinação da
capacidade antioxidante o tipo de solvente e a polaridade podem afetar a transferência de
elétrons e de átomos de hidrogênio. A presença de compostos não antioxidantes nas
soluções testadas também pode afetar os resultados (PÉREZ-JIMÉNEZ; SAURA-
CALIXTO, 2006). O rendimento da extração depende tanto do solvente utilizado (OU;
HAMPSCH-WOODILL; PRIOR, 2001; GRAY et al., 2002; YU et al., 2002; SUN; HO,
2005; YILMAZ; TOLEDO, 2006) como do método aplicado, que pode ser baseado em
mecanismos químicos diferentes. Além do rendimento, há grande variação na composição
do extrato em função do sistema solvente utilizado (MOURE et al., 2001). Segundo os
resultados de Goffman & Bergman (2004) observa-se que o extrato metanólico de grão de
arroz preto foi capaz de extrair um valor médio 1,7 vezes maior em relação ao extrato
aquoso. Esses dados sugerem uma maior solubilidade dos compostos fenólicos totais de
grãos de arroz preto em meio hidrofóbico.
148
Em algumas pesquisas pode se notar que quando utilizados outros solventes como
metanol, etanol ou acetona a atividade antioxidante pode se apresentar mais elevada, neste
experimento o solvente de extração utilizado foi a água, solvente usado no uso popular e
todos os ensaios deste projeto teve essa alegação principal, o que de certa forma resultou
em números inferiores. Extrações com outros solventes poderia melhorar as características
e a biodisponibilidade de seus componentes. Além de parte dos compostos fitoquímicos
terem sido descartados na água do molho, de acordo como feito no popular, sendo muitas
vezes esses fitatos os responsáveis pelos compostos fenólicos e antioxidantes. Sabe-se que
a atividade antioxidante está relacionada com a quantidade de compostos fenólicos o que
também se mostrou inferior.
É válido ressaltar que a extração realizada com água na matriz de alpiste não foi
eficiente, contudo a partir deste trabalho é possível definir outras pesquisas para verificação
com diferentes solventes orgânicos. A extração foi realizada apenas com água, pois a
investigação foi determinada pelo consumo das pessoas ao “leite de alpiste”, um extrato
aquoso.
4. CONCLUSÃO
Os resultados deste trabalho demonstraram que o extrato aquoso de alpiste
apresentou teor de compostos fenólicos compatíveis com matrizes similares como arroz e
cevada.
Entre os métodos aplicados o que demonstrou valores maiores para a atividade
antioxidante foi o ORAC, em seguida o teste ABTS, sendo uma análise que permite a
avaliação de compostos de natureza hidrofílica e lipofílica e com menor atividade
antioxidante foi o ensaio DPPH, uma vez que cada metodologia mede compostos diferentes
e sendo o extrato analisado aquoso, parte dos compostos que poderiam reagir em cada
método pode não ter sido extraído. O sistema solvente utilizado na extração foi a água o
que influenciou diretamente os conteúdos de fenólicos totais e atividade antioxidante. O
extrato aquoso de alpiste pode ser considerado como fonte intermediária de atividade
antioxidante comparada a outros alimentos, segundo dados obtidos por comparação com
outros alimentos. Para obtenção de dados ainda mais conclusivos, devem ser realizados
trabalhos posteriores com outros solventes indicados na literatura.
149
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Capítulo IV
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE HIPOGLICEMIANTE DO
EXTRATO AQUOSO DE SEMENTES DE ALPISTE EM
MODELO DE DIABETES INDUZIDA POR
ESTREPTOZOTOCINA
Michele Christine Machado de Oliveira1, Débora Barbosa Vendramini Costa2,
Michelle Pedroza Jorge3, João Ernesto de Carvalho3, Karin Maia Monteiro3, Sirlene
Valerio Tinti3, Marcelo Alexandre Prado1
1Departamento de Ciência de Alimentos, Faculdade de Engenharia de Alimentos,
Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), CP 6121, 13083-862, Campinas,
SP, Brasil. 2Departamento de Química Orgânica, Instituto de Química, Universidade
Estadual de Campinas (UNICAMP), CP 6154, 13083-970, Campinas,
SP, Brasil. 3Divisão de Farmacologia e Toxicologia, Centro Pluridisciplinar de Pesquisas
Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA/UNICAMP), C.P. 6171, 13081-970, Campinas,
SP, Brasil.
Manuscrito em preparo a ser submetido ao periódico Food Research International
164
165
Resumo
A espécie vegetal Phalaris canariensis - (alpiste) é usado como ração de animais e
atualmente também utilizado na culinária. Relatos etnofarmacológicos indicam o uso das
sementes em forma de chá no tratamento da hipertensão e hipercolesterolemia
acompanhado ou não de outras formas de terapia. Recentemente surgiram relatos sobre o
uso do extrato aquoso de sementes de alpiste ou “leite de alpiste” como coadjuvante no
tratamento do diabetes mellitus, porém estudos abordando as ações farmacológicas dessa
espécie são escassos, havendo a necessidade de mais informações científicas acerca dessas
propriedades. Dessa forma, este estudo teve como objetivo avaliar os efeitos do extrato
aquoso de sementes de alpiste sobre os níveis glicêmicos, aspectos gerais de toxicidade e
alterações bioquímicas e histopatológicas em modelo de diabetes induzida por
estreptozotocina (STZ) em ratos Wistar machos. Os animais foram distribuídos em grupos
(n=10), sendo: sham (controle não-diabético), controle negativo diabético e diabéticos
tratados por via oral, diariamente, com 250, 500 e 1000 mg/kg de extrato aquoso de
sementes de alpiste por 28 dias. Um outro experimento mais longo (87 dias) foi realizado a
fim de avaliar o desenvolvimento do processo diabético e a ação do extrato (1000 mg/kg)
nesse processo. O diabetes foi induzido por administração intraperitoneal de STZ (60
mg/kg), sendo considerados os animais com glicemia de jejum ≥ 250 mg/dL. Após 5 dias
da indução do diabetes os tratamentos foram iniciados e durante os experimentos os
animais foram avaliados quanto ao ganho de massa corporal, glicemia e ingestão de água e
ração. No final do experimento (28 ou 87 dias) os animais foram eutanasiados e os
seguintes parâmetros avaliados: perfil hematológico (hemograma), perfil de enzimas
hepáticas e renais, colesterol total, triglicerídeos, eletrólitos na urina e sangue e alterações
histológicas em órgãos que são afetados pela condição diabética (pâncreas, fígado e rins),
tendo como valores de referência para os parâmetros hematológicos e bioquímicos dos
animais não-diabéticos (sham). O diabetes foi caracterizado por queda progressiva da
massa corporal, elevação substancial da ingestão hídrica, alimentar, da diurese e aumento
dos índices glicêmicos (acima de 250 mg/dl), além de aumento expressivo na atividade das
enzimas hepáticas TGO e TGP. O tratamento com o extrato aquoso de sementes de alpiste
não foi capaz de reverter a condição diabética em nenhuma das doses avaliadas. Por outro
lado, animais não-diabéticos e tratados com 1000 mg/kg de extrato não apresentaram sinais
de toxicidade nas condições e tempos avaliados nesse estudo. Dessa forma, apesar dos
relatos populares acerca dos benefícios do extrato aquoso de sementes de alpiste, o “leite de
alpiste”, no tratamento do diabetes mellitus, nas condiçoes experimentadas nesse estudo
não foi observado o efeito hipoglicemiante.
Palavras-chave: Phalaris canariensis, “leite de alpiste”, Diabetes, Glicemia,
Estreptozotocina, Ratos Wistar.
166
Abstract
The vegetal specie Phalaris canariensis – (canary seed) is largely used as food for animals
and currently has been used in culinary. Ethnopharmacological reports indicate the use of
canary seeds tea in the treatment of hypertension and hypercholesterolemia, accompained
or not by other forms of therapy. Recently the use of the aqueous extract of canary seeds or
the "canary seed milk" as an adjunct in the treatment of diabetes mellitus was reported, but
studies addressing the pharmacological actions of this specie are scarce, thus there is a need
for more scientific information concerning these properties. Thus, this study aimed to
evaluate the effects of the aqueous extract of canary seeds in blood glucose levels, general
aspects of toxicity and biochemical and histopathological changes in a model of diabetes
induced by streptozotocin (STZ) in male Wistar rats. The animals were distributed into
groups (n = 10), as follows: sham (non-diabetic control group), negative control (diabetic)
and diabetic animals treated orally, daily, with 250, 500 and 1000 mg/kg of aqueous extract
of canary seeds for 28 days. A long-term experiment (87 days) was performed to assess the
development of the diabetic process and the action of the extract (1000 mg/kg) in this
process. Diabetes was induced by an intraperitoneal administration of STZ (60 mg / kg),
and animals presenting fasting glycemia ≥ 250 mg/dL were considered diabetic. After 5
days of the diabetes induction, treatments were initiated and during the experiment the
animals were evaluated for body weight gain, glucose and water and food intake. At the
end of the experiments (28 or 87 days) the animals were euthanized and the following
parameters were evaluated: hematological profile, hepatic and kidney enzymes levels, total
cholesterol, triglycerides, electrolytes in the urine and blood and histological changes in
organs that are affected by diabetic condition (pancreas, liver and kidneys), taking as
reference values for haematological and biochemical parameters from the non-diabetic
animals (sham). Diabetes was characterized by progressive loss of body weight,
significative intake of water and food, diuresis, increased blood glucose levels (above 250
mg / dl) and significant increase in the activity of hepatic enzymes AST and ALT. Any of
the treatments with aqueous extract of canary seed seed was able to reverse the diabetic
condition. On the other hand, non-diabetic rats treated with 1000 mg / kg extract showed no
signs of toxicity under the conditions and times evaluated in this study. Thus, despite the
popular reports about the benefits of the aqueous extract of the seeds of canary seed
"canary seed milk" in the treatment of diabetes, the hypoglycemic effect was not observed
in the conditions applied in this study.
Keywords: Phalaris canariensis, "canary seeds milk," Diabetes, Glucose, Streptozotocin,
Wistar rats.
167
1. INTRODUÇÃO
O Diabetes mellitus é uma desordem metabólica crônica caracterizada por
hiperglicemia decorrente de defeitos na secreção e/ou uso da insulina pelo organismo.
Existem dois tipos de diabetes: a do tipo I (cerca de 3-5% dos casos de diabetes) e a do tipo
II (90% dos casos de diabetes) (YU et al., 2014). O diabetes tipo I decorre da falta de
produção de insulina e a do tipo II pela ineficiência na utilização de insulina, sendo este
último tipo também relacionado à obesidade e inatividade física (OMS, 2015). De acordo
com a Organização Mundial de Saúde, até 2025 existirão cerca de 300 milhões de novos
casos de diabetes no mundo, dobrando o número de casos existentes hoje (OMS, 2015).
O aumento do estresse oxidativo, defeitos no sistema de defesa antioxidante e a
peroxidação lipídica são os principais fatores no desenvolvimento e progressão do diabetes
mellitus (DM) e suas complicações (RUDGE et al., 2007). Dentre as complicações mais
frequentes estão as relacionadas às redes microvascular (retinopatias, nefropatias,
neuropatias) e macrovascular (doenças cardiovasculares) (OMS, 2015).
Estudos anteriores mostraram que compostos fenólicos possue propriedades de
eliminação de radicais livres e redução do estresse oxidativo associado com diabetes
mellitus (KUSIRISIN et al., 2009; GANDHI, 2011). Vários estudos têm mostrado que o
tratamento antioxidante reduz complicações diabéticas (WOHAIB; GODIN, 1987;
CAMERON, 1993; SINGH et al., 2005). A propriedade mais recentemente identificada nos
polifenóis é o seu efeito nas complicações a longo prazo do diabetes, incluindo retinopatia,
nefropatia e neuropatia (BAHADORAN et al., 2013).
Os polifenóis, antioxidantes bem conhecidos, também demonstraram função
antidiabética reduzindo os níveis de glicemia (MATSUMOTO et al., 1993; GOMES et al.,
1995; ANDERSON; PALANSKY, 2002; SINGH et al., 2005). Os ácidos fenólicos são
metabólitos secundários que são comumente encontrados em muitos componentes de
alimentos e frutas. Muitos estudos epidemiológicos descobriram que o consumo de
alimentos e bebidas com alto teor de fenólicos é associado com a prevenção de diabetes
(KARTHIKESAN; PARI; MENON, 2010). Ao longo dos últimos anos, a investigação tem
associado o consumo elevado de alimentos ricos em compostos fenólicos com benefícios
para a saúde, como a prevenção de doenças cardiovasculares e neurodegenerativas, diabetes
168
e câncer (VISIOLI & DAVALOS, 2011; EBRAHIMI & SCHLUESENER, 2012; MURSU;
VIRTANEN; TUOMAINEN; NURMI E VOUTILAINEN, 2014).
As terapias disponíveis para o tratamento do DM tipo II incluem antidiabéticos orais
como sulfoniluréias, biguanidas, inibidores da α-glicosidade, tiazolidinedionas, inibidores
de dipeptidil peptidase-4, que podem ser usados como monoterapias ou em combinação
com outras terapias. Novos alvos têm sido buscados atualmente, a fim de minimizar efeitos
adversos e aumentar a eficiência do tratamento (HUNG et al., 2012).
Um dos mecanismos que está sendo explorado atualmente é o estresse de retículo
endoplasmático, pois sabe-se que grande parte das células β-pancreáticas morrem via
estresse reticular (HUNG et al., 2012).
Na busca por novas terapias, modelos experimentais de indução de diabetes
possuem um papel importante na triagem de novos compostos. Tais modelos podem
envolver manipulação farmacológica, cirúrgica ou genética, utilizando-se roedores ou
animais de grande porte. Atualmente modelos murinos são os mais utilizados, devido a
disponibilidade de tecnologias relacionados à condição ou controle do diabetes (FRÖDE e
MEDEIROS, 2008). Têm sido usados na explicação de fenômenos que afetam condições
humanas. Tal fato se observa em pesquisas para o desenvolvimento científico, na área de
análises de produtos químicos e contaminantes ambientais, controle e desenvolvimento
farmacológico, área biomédica e estudo de alimentos (MENENDEZ, 1985 apud JONG,
1996).
Estudos têm sido realizados com ratos albinos da linhagem Wistar, espécie de fácil
manuseio, a qual possibilita o trabalho com vários grupos experimentais simultâneos, os
animais apresentam elevada resistência a infecções, e permite, com facilidade, a retirada de
órgãos para estudo (LERCO et al., 2003; GUIMARÃES et al., 2009).
A utilização de animais de laboratório é de suma importância nas pesquisas
científicas contribuindo sobremaneira para o desenvolvimento da ciência e tecnologia
(CHORILLI et al., 2007; MELO, 2012). É por meio destas pesquisas que o avanço sobre o
conhecimento dos mecanismos vitais como também o aperfeiçoamento dos métodos de
prevenção, diagnóstico e tratamento de diversas doenças vêm se desenvolvendo ao longo
dos anos (ALMEIDA et al., 2008; MELO, 2012).
169
Muitos estudos para avaliação de diabetes em animais têm sido realizados a partir
da indução química com fármacos β-citotóxicos, sendo a estreptozotocina (STZ) um dos
compostos químicos mais utilizados (LERCO et al., 2003; GUIMARÃES et al., 2009).
Embora o mecanismo de ação citotóxica da STZ nas células β não seja totalmente
compreendido, várias linhas de evidências indicam que a STZ estimula a geração dos
radicais livres, os quais levam à destruição e disfunção das células β das ilhotas de
Langerhans do pâncreas, que pode ser uma das causas mais importantes de danos celulares
e efeito diabetogênico da STZ (OHKUWA et al., 1995 apud SEFI, 2011; SZKULDESKI,
2001).
A STZ é uma glicosaminanitrosureia (Fígura 26) com propriedades tóxicas ao
DNA e que foi inicialmente isolada e caracterizada como um antimicrobiano de largo
espectro a partir de colônias de Streptomyces achromogenes (DELFINO et al., 2002 apud
BERA et al., 2012; SZKULDESKI, 2001; MALLICK et al., 2010; XIANG et al., 2010). A
STZ apresenta semelhança estrutural com a molécula de glicose e é igualmente
internalizada nas células via transportadores de glicose do tipo GLUT2, altamente
expressos na superficie das células β-pancreáticas (KARUNANAYAKE et al., 1976;
SZKULDESKI, 2001). Isso explica sua toxicidade seletiva para as células β-pancreáticas,
uma vez que essas células expressam elevados níveis desse transportador.
Figura 26. Estrutura química da Estreptozotocina.
Fonte: www.medicinescomplete.com, (2015).
A ação tóxica da STZ se dá pelo aumento dos níveis de espécies reativas de
oxigênio molecular intracelular, ocasionando alquilações das bases nitrogenadas que
compõem o DNA (Figura 27) (LEDOUX et al., 1986; ELSNER et al., 2000;
SZKULDESKI, 2001; LENZEN, 2008). Tais danos oxidativos causam alterações no
metabolismo das células β por acarretarem diminuição dos níveis de nicotinamida adenina
170
dinucleotideo (NAD) e consequentemente de adenosina trifosfato (ATP). Assim, este
esgotamento da energia celular resulta, em última análise, em necrose das células β-
pancreáticas (DELFINO et al., 2002 apud BERA, 2012; SANDLER e SWENNE, 1983;
BOLZAN e BIANCHI, 2002). O quadro resultante é o surgimento de diabetes após 2-4 dias
(WEISS, 1982 apud AKBARZADEH et al., 2007).
Figura 27. Esquema ilustrativo da ação da estreptozotocina na célula β do pâncreas.
Fonte: Adaptado a partir de Murata et al., (1999).
Além da alteração no metabolismo de carboidratos e lipídeos, os animais tratados
com STZ também exibem níveis reduzidos de proteína total e de glicogênio no fígado
(HUANG et al., 2000; GUTIERREZ et al., 2014). A administração de uma dose menor de
STZ (40 mg/kg) leva à destruição parcial de células β, levando à secreção insuficiente de
insulina e a um quadro semelhante ao de diabetes do tipo 2 (MURALI, 2013). Além disso,
apresentam hiperglicemia, permanecendo viáveis sem suplementação insulínica (FRICKER
et al., 2008 apud GUIMARÃES et al., 2009).
Similarmente ao que ocorre em pacientes diabéticos, esses animais apresentam
poliúria (aumento do fluxo e frequência de urina), polifagia (aumento do consumo de
alimento) e hiperglicemia (GOYARY e SHARMA, 2010). Além de evidências clínicas, os
estudos pré-clínicos mostram um aumento no comportamento do tipo depressivo em
animais com diabetes induzida quimicamente pela injeção de STZ (GOMEZ e BARROS,
2000; WAYHS et al., 2010; CALETTI et al., 2012; HO et al., 2012).
A incidência de efeitos adversos ainda constitui um desafio na terapia do DM e
nesse contexto plantas medicinais constituem uma alternativa para o tratamento e
171
prevenção dessa doença, podendo apresentar menor toxicidade e consequentemente menos
efeitos adversos (YASSA e TOHAMY, 2014).
Na medicina popular, a semente de alpiste (Phalaris canariensis L.) está sendo
empregada para o tratamento de diabetes (MERZOUKI et al., 2003 apud GUTIERREZ, 2014).
Seu uso mais conhecido é como alimento para pássaros, sozinho ou misturado com outros
grãos, porém, devido ao alto valor nutricional, o interesse no uso da semente de alpiste
como alimento alternativo na alimentação livre de glúten aumentou substancialmente nos
últimos tempos (ESTRADA-SALAS et al., 2014).
Apesar de seu uso popular no tratamento de diabetes, são escassos os estudos
científicos que objetivaram a comprovação da atividade do alpiste nesta patologia.
Gutierrez et al., (2014) avaliaram os efeitos do extrato hexânico de sementes de alpiste em
modelo de diabetes induzido por STZ em camundongos. Nesse estudo, os animais tratados
por via oral com 400 mg/kg do extrato por 30 dias não apresentaram os sinais típicos do
diabetes, tais como perda de massa corporal, hiperglicemia, polifagia e poliúria. Além
disso, os níveis das enzimas hepáticas transaminase glutâmico-oxalacética (TGO),
transaminase glutâmico-pirúvica (TGP) e fosfatase alcalina (ALP) se mantiveram normais
em comparação com os animais do grupo controle negativo, que apresentaram aumento
significativo dessas enzimas. Os níveis de insulina e atividade de enzimas antioxidantes
também se mantiveram próximos aos dos animais não-diabéticos, demonstrando um efeito
antidiabético nesse modelo (GUTIERREZ et al., 2014).
Os resultados com o extrato hexânico, apesar de serem positivos, não traduzem a
forma como a semente de alpiste tem sido usada pela população. Fontes informais tais
como páginas de internet, programas de televisão relatam o uso da semente de alpiste na
forma de um extrato aquoso, denominado “leite de alpiste”. Tais fontes informais clamam
que o “leite de alpiste” seja rico em vitaminas E, complexo B e em antioxidantes, que
evitam o envelhecimento precoce e atuam como anti-inflamatórios, podendo ser eficaz
como terapia complementar de pacientes com diabetes e cirrose hepática (GALVÃO, 2013;
BITTAR, 2013). Relata-se também seu uso como diurético, emagrecedor, removedor de
gordura, combate à prisão de ventre, úlceras, hiperuricemia, edema, gota, gastrite,
hipotensivo e antiacne (GALVÃO, 2013; ALPISTE..., 2013).
Estudo recente avaliou a ação dos peptídeos isolados do “leite” de semente de
alpiste (extrato aquoso das sementes) sobre a enzima dipeptidil peptidase IV, um alvo
172
importante na terapia antidiabética pois é responsável pela inativação das incretinas
(substâncias que atuam no controle do metabolismo da glicose) (ESTRADA-SALAS et al.,
2014). Nesse estudo, peptídeos isolados do “leite” de semente de alpiste apresentaram in
vitro uma ação inibitória sobre a dipeptidil peptidase IV e também sobre a enzima
conversora de angiotensina, demonstrando potencial ação em diabetes e hipertensão
(ESTRADA-SALAS et al., 2014). Apesar de abordar um importante alvo terapêutico do
diabetes, não relata a ação in vivo do extrato aquoso de sementes de alpiste.
Dessa forma, diante do potencial nutricional da semente de alpiste e dos relatos
sobre seu uso popular no tratamento de diabetes, o objetivo do presente estudo foi avaliar
os possíveis efeitos hipoglicemiantes do extrato aquoso de sementes de alpiste em modelo
de diabetes induzida quimicamente por estreptozotocina em ratos Wistar machos, avaliando
também os efeitos sobre os principais parâmetros relacionados ao diabetes, tais como
alteração de massa corporal, perfil de enzimas hepáticas e renais e hemograma total.
Com esse estudo, pretende-se fornecer maiores informações sobre o uso das
sementes de alpiste no diabetes, já que baseada em grande quantidade de relatos informais,
a população se deixa levar pelas “dietas da moda”, que muitas vezes são ineficazes e podem
até mesmo oferecer riscos à saúde.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Reagentes e Equipamentos
Estreptozotocina foi adquirida da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EUA),
glicosímetro (Accu-Chek, da Roche Diagnostics, EUA), balança semi-analítica (Marca
BEL), analisador hematológico (pocH-100 iν Diff), microcentrífuga para eppendorf
(5415C), centrífuga refrigerada, Reflotron plus (Roche), 9180 Electrolyte Analyser (Roche)
e espectrofotômetro VersaMax (Marca Molecular Devices). Os experimentos e análises
foram realizados na Divisão de Farmacologia e Toxicologia do Centro Pluridisciplinar de
Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA/UNICAMP).
173
2.2 Preparo do Extrato Aquoso de Sementes de P. canariensis L.
Para a determinação da toxicidade do extrato e da atividade hipoglicemiante, o
mesmo era preparado diariamente e monitorado quanto ao seu extrato seco (20% de resíduo
seco), garantindo a mesma composição. A matéria-prima foi obtida do comércio de
Campinas – SP e realizada sua composição centesimal como descrito no capítulo anterior.
Para a obtenção do extrato aquoso das sementes de alpiste Phalaris canariensis L.,
foi utilizada uma proporção de 150 g de alpiste em 200 mL de água destilada. Após deixar
de molho em água por 12 horas, a água de resíduo foi desprezada, e as sementes trituradas
com 200 mL de água destilada por 5 minutos em liquidificador comercial até a obtenção de
um “leite” (Fig. 28 A). Em seguida peneirou-se quatro vezes, para a separação dos sólidos
insolúveis (resíduo) (Fig. 28 B e C), seguida de filtração em filtro de nylon dez vezes para
posterior gavagem nos animais do estudo (Fig. 28 D).
Figura 28. Sequência do preparo do extrato aquoso de alpiste.
Fonte: Biotério CPQBA – UNICAMP (OLIVEIRA, 2014).
2.3 Animais
Foram utilizados 86 ratos albinos machos da linhagem Wistar (Rattus norvegicus),
com dois meses de idade, adultos, normais e saudáveis, com peso médio de 164g,
provenientes do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em
Animais de Laboratório – CEMIB da Universidade Estadual de Campinas. Os animais
foram mantidos no biotério de manutenção de animais da Divisão de Farmacologia e
Toxicologia – CPQBA – UNICAMP, onde permaneceram em condições ambientais
controladas, em gaiolas coletivas de polipropileno com cama de maravalha, com
temperatura média de 24 ± 2ºC e umidade relativa de 50 a 60% ± 5%, com ciclo
claro/escuro de 12/12 horas e com fornecimento de água e ração em forma de pellet padrão
(Biobase) (Anexo 3) ad libitum. A identificação dos animais foi realizada por meio de
174
marcação permanente nos pêlos e cauda de cada animal e brincos com identificação
numérica (Fig. 29).
Os cuidados dos animais bem como os protocolos de pesquisa estavam de acordo
com os princípios e diretrizes adotadas pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
(COBEA) e aprovados pelo comitê de ética em pesquisa animal do Instituto de Biologia –
UNICAMP (n°3177-1 e 3178-1) Anexos 1 e 2.
Figura 29. Condições ambientais dos grupos do estudo: A. Estantes com as gaiolas experimentais. B. Gaiola
experimental com cama de maravalha e animais em estudo.
Fonte: Biotério CPQBA – UNICAMP (OLIVEIRA, 2014).
2.4 Análise de Toxicidade Dose Única
A avaliação da toxicidade aguda foi realizada com o objetivo de verificar o efeito da
administração única de extrato aquoso de alpiste por via oral (gavagem). Testes que
avaliam a toxicidade sistêmica de dose única são utilizados para classificar e
apropriadamente rotular substâncias de acordo com o seu potencial de letalidade ou
toxicidade como estabelecido pela legislação (VALADARES, 2006).
Os animais foram divididos aleatoriamente em três grupos (n = 6), de ratos Wistar
machos, que foram tratados por via oral (v.o.) com diferentes doses (500 mg/kg, 1000
mg/kg e 2000 mg/kg) de extrato aquoso de sementes de alpiste. Os grupos foram
observados continuamente por um período de 4 horas e então diariamente, por 15 dias, para
avaliação de sinais gerais de toxicidade, tais como efeitos na locomoção, comportamento
(agitação, atividade reduzida, sonolência), respiração, salivação, lacrimejamento, cianose
de extremidades e mortalidade, além da massa corporal e glicemia de cada animal (Fig. 30)
(OECD 2002). A partir desse experimento foram selecionadas as doses de extrato de alpiste
a serem avaliadas no teste de diabetes.
175
Figura 30. Análise de toxicidade aguda em ratos Wistar macho tratados com extrato aquoso de sementes de
alpiste.
Fonte: Biotério CPQBA – UNICAMP (OLIVEIRA, 2014).
2.5 Indução de Diabetes Experimental por Estreptozotocina
Os animais foram previamente deixados em jejum de 12 horas com acesso livre à
água potável. Após serem pesados, o diabetes foi induzido através da administração
intraperitoneal (ip.) de estreptozotocina (STZ), (PM=265.22), a uma dose de 60 mg/kg de
massa corporal (Sigma-Aldrich Chemical, USA) dissolvida em tampão citrato de sódio
10mM e pH 4,5 (PATEL et al., 2011). Os ratos dos grupos controle receberam volume
equivalente de tampão citrato de sódio 10mM e pH 4,5 (Fig. 31).
Figura 31. A. Gaiola do jejum. B. Administração intraperitoneal de estreptozotocina para indução de
diabetes.
Fonte: Biotério CPQBA – UNICAMP (OLIVEIRA, 2014).
Devido à similiaridade entre as moléculas de glicose e STZ e a sua competição pelo
transportador de glicose tipo 2 (GLUT2), os animais permaneceram em jejum 90 minutos
após a administração da droga, evitando assim a internalização da glicose ao invés da droga
diabetogênica (SZKULDESKI, 2001). No quinto dia após a indução, a confirmação do
diabetes foi realizada por meio da determinação da glicemia de jejum utilizando tiras
A B
176
reagentes Accu-Chek. Foram considerados diabéticos somente animais apresentando
glicemia maior ou igual a 250 mg/dL (LERCO et al., 2003).
2.6 Experimento I: 28 dias - Delineamento Experimental
Foram utilizados diferentes grupos experimentais para estudar o efeito
hipoglicemiante do extrato aquoso de sementes de Phalaris canariensis. Os ratos foram
aleatoriamente divididos em seis grupos (Fig. 32 - A) e receberam os seguintes tratamentos
por via oral:
Grupo I: Sham - Ratos normoglicêmicos sem tratamento;
Grupo II: Controle Negativo - Ratos com diabetes sem tratamento;
Grupo III: Controle Positivo Maior Dose - Ratos normoglicêmicos tratados com
1000 mg/kg de extrato aquoso de sementes de alpiste;
Grupo IV: Ratos diabéticos tratados com 250 mg/kg de extrato aquoso de sementes
de alpiste;
Grupo V: Ratos diabéticos tratados com 500 mg/kg de extrato aquoso de sementes
de alpiste;
Grupo VI: Ratos diabéticos tratados com 1000 mg/kg de extrato aquoso de sementes
de alpiste.
Figura 32. Disposição dos grupos, bebedouros e rações controlados.
Fonte: Biotério CPQBA – UNICAMP (OLIVEIRA, 2014).
177
2.7 Tratamentos
Antes do início dos procedimentos, todos os animais passaram por uma semana de
adaptação ao biotério (alimentação e gaiolas).
Os animais foram alimentados diariamente com ração comum (Biobase) e tratados
com as doses pré-selecionadas de extrato aquoso de sementes de alpiste, v.o. (gavagem),
por 28 dias após a indução do diabetes. Os grupos sham (Grupo I) e controle negativo
(Grupo II) receberam água potável, v.o. (veículo). A administração foi realizada por
gavagem com o animal imobilizado, por meio de tração manual da pele da região dorsal e
utilizando cânula de plástico flexível (Fig. 33).
O extrato aquoso, em temperatura ambiente, foi oferecido aos animais durante 4
semanas, nas doses estimadas de 250 mg/kg, 500 mg/kg e 1000 mg/kg de massa corporal.
As doses foram ajustadas três vezes por semana de acordo com a massa corporal do animal
e com a concentração do extrato (mg/mL), obtida a partir da divisão da massa do extrato
em mg (correspondente às doses) pela média do consumo líquido em mL de cada animal,
para manter a mesma dose por kg de massa corporal durante todo o período de estudo para
cada grupo.
Figura 33. A. Animal imobilizado. B. Gavagem do extrato aquoso de sementes de alpiste.
Fonte: Biotério CPQBA – UNICAMP (OLIVEIRA, 2014).
3. AVALIAÇÕES
Os animais foram avaliados semanalmente quanto ao ganho de massa corporal e a
glicemia. Além disso, foi avaliado diariamente o consumo de água e ração.
Após 28 dias, os animais foram eutanasiados (aprofundamento de anestesia) e
avaliados o perfil hematológico e as funções hepática e renal, por meio de análise
B A
178
bioquímica dos níveis séricos das enzimas aspartato aminotransferase e alanina
aminotransferase, gama-glutamil transferase, análise de uréia, fosfatase alcalina, creatinina,
ácido úrico, colesterol e triglicérides. Também foram avaliados os perfis de hemoglobina
glicada e eletrólitos. Os órgãos relacionados à condição diabética (fígado, rins e pâncreas)
foram pesados e analisados quanto às alterações histopatológicas. Os demais órgãos
(coração, baço e adrenais) foram apenas pesados.
3.1 Glicemia
As dosagens glicêmicas foram realizadas em glicosímetro Accu-Chek Performa®
com a utilização da tira-teste, com amostras de sangue obtidas por punção da veia caudal
dos animais (Fig. 34 A e B). As amostras de sangue foram coletadas antes do início do
tratamento (t=0) e então uma vez por semana.
Figura 34. Coleta de sangue através da cauda do animal e leitura em glicosímetro.
Fonte: Biotério CPQBA – UNICAMP (OLIVEIRA, 2014).
3.2 Consumo Alimentar, de Água e Controle de Massa Corporal
A quantidade de ração consumida foi avaliada por meio do registro diário de
ingestão alimentar pelos animais (variação entre a oferta e as sobras da dieta deixadas nas
gaiolas) durante os 28 dias de ensaio, para obtenção da ingesta nos diferentes grupos
experimentais (Fig. 35 A). O volume de água consumido pelos diferentes grupos também
foi registrado diariamente, através da diferença entre a oferta e a sobra de água nas garrafas.
Durante todo período experimental, os animais foram submetidos, semanalmente, a
três avaliações da massa corpórea, de forma a minimizar a manipulação e estresse dos
animais e também realizar o controle das doses de extrato (Fig. 35 B).
179
Figura 35. Controle do consumo alimentar e massa corporal dos animais.
Fonte: Biotério CPQBA – UNICAMP (OLIVEIRA, 2014).
3.3 Eutanásia dos Animais e Coleta de Sangue
No final do período experimental, após jejum de 12 horas, todos os animais foram
pesados, anestesiados com barbitúrico (pentobarbital). Em seguida o sangue foi coletado
por punção cardíaca e os animais foram submetidos a eutanásia por aprofundamento de
anestesia.
O sangue foi distribuído em microtubos de 0.5 mL contendo 10 μL de
anticoagulante EDTA sódico a 10% para realização dos parâmetros hematológicos,
microtubos de 1.5 mL contendo 30 μL de anticoagulante EDTA sódico a 10% para
hemoglobina glicada, tubos com heparina para medição de eletrólitos séricos, dois
microtubos de 1.5 mL sem EDTA para centrifugação do soro e posterior realização das
análises bioquímicas e tubos secos para coleta da urina para posterior análise de eletrólitos.
Para a obtenção do soro, após a coagulação do sangue os microtubos foram centrifugados
durante 15 minutos a 3500 rpm (rotações por minuto) e o sobrenadante (soro) foi coletado.
Os parâmetros hematológicos foram verificados através do analisador hematológico
(pocH-100 iν Diff) (Fig. 36). Já os parâmetros bioquímicos foram dosados através do
analisador automatizado Reflotron plus (Roche) (Fig. 37) e os eletrólitos do sangue e urina
avaliados através do 9180 Electrolyte Analyser (Roche). Para a determinação bioquímica,
foi empregado o método cinético UV, utilizando-se kits comerciais de reagentes padrão
(Roche).
A B
180
Figura 36. Analisador hematológico pocH-100 iν Diff.
Fonte: Biotério CPQBA – UNICAMP (OLIVEIRA, 2014).
Figura 37. Centrifugação do sangue para obtenção do soro e Reflotron analisador automatizado para análises
bioquímicas.
Fonte: Biotério CPQBA – UNICAMP (OLIVEIRA, 2014).
Foram analisados os seguintes parâmetros:
(1) hematológicos: leucócitos totais, hemácias, hemoglobina, hematócrito, volume
corpuscular médio (VCM), hemoglobina corpuscular média (HCM), concentração da
hemoglobina corpuscular média (CHCM) e plaquetas (PLT);
(2) bioquímicos: aspartato aminotransferase (AST ou TGO), alanina
aminotransferase (ALT ou TGP), fosfatase alcalina (ALP), gama-glutamil transferase
(GGT), creatinina, uréia, colesterol total, triglicérides e ácido úrico. Para as análises, foram
utilizados kits comerciais e seguidas as orientações recomendadas pelo fabricante. A
atividade das aminotransferases foram expressas em unidades internacionais por litro
(UI/L) e as demais medidas expressas em mg/dL;
(3) eletrólitos: sangue (Na, K, Ca) e urina (Na e K).
Após eutanásia, de cada animal foram excisados os seguintes órgãos: coração,
fígado, rins, baço, pâncreas e adrenais, que foram pesados em balança analítica sendo o
fígado, rins e pâncreas separados em frascos identificados com solução de formaldeído
10% para análises histopatológicas (Fig. 38). Desta forma foi possível calcular a média de
181
peso dos órgãos dos animais para cada grupo e avaliar com testes estatísticos a existência
de possíveis diferenças de resultados entre os diferentes grupos (LOPES, 2011).
Figura 38. Animais em jejum, necropsia e pesagem dos órgãos.
Fonte: Biotério CPQBA – UNICAMP (OLIVEIRA, 2014).
3.3.1 Análises Bioquímicas
A função hepática foi avaliada por meio das determinações dos níveis séricos de
transaminase glutâmico-oxalacética (TGO) e transaminase glutâmico-pirúvica (TGP). Em
tais determinações, assim como nas demais análises bioquímicas (ácido úrico, uréia,
creatinina, GGT, fosfatase alcalina, colesterol e triglicérides) foram utilizados kits reagentes
da Roche®, conforme especificações do fabricante. Todas as medidas de atividade
enzimática foram visualizadas para a temperatura 37ºC (selecionada no aparelho). Uma
alíquota de 30µL de soro de cada animal foi inserida no centro da zona vermelha reativa da
tira, removendo anteriormente a banda protetora. Após 15 segundos foi introduzida
horizontalmente a tira no aparelho e o aparecimento no visor confirma que a leitura do
código magnético específico do teste foi corretamente lida pelo aparelho. O tempo foi
indicado em segundos, até surgimento do resultado.
De acordo com o manual de instruções do kit Reflotron (GOT-AST) (2010), níveis
elevados de TGO podem indicar infarto do miocárdio, doenças do fígado, distrofia
muscular e lesões nos órgãos. Quando a atividade da TGO medida foi superior ao intervalo
de medição do Reflotron, a amostra de soro foi diluída com solução salina fisiológica numa
medida de 1+4. A normalização de TGO foi calculada a partir da fórmula A= 5.A dil.
Segundo o manual de instruções do kit Reflotron (GPT-ALT) (2010), níveis
elevados de TGP podem indicar infarto do miocárdio, doença hepática, distrofia muscular
ou lesões dos órgãos. A atividade aumentada de TGP (ALT) é bastante específica para a
doença parenquimal do fígado, enquanto que a TGO (AST) não é uma enzima específica do
182
fígado. Quando a atividade TGP medida foi superior ao intervalo de medição do Reflotron,
a amostra de soro foi diluída com solução salina fisiológica numa medida de 1+1. A
normalização de TGP foi calculada a partir da fórmula A= 2.A dil.
A determinação de ácido úrico é usada para o diagnóstico e monitorização de vários
distúrbios renais e metabólitos como a insuficiência renal, gota, leucemia, psoríase,
situações de jejum ou outras doenças com distúrbios nutricionais. A uma temperatura de
37ºC foi formado o corante e medido a 642 nm e a concentração de ácido úrico visualizada
depois de 200 segundos, em mg/dL. Quando o valor de ácido úrico medido foi superior ao
intervalo de medição do Reflotron, a amostra de soro foi diluída com solução salina
fisiológica numa medida de 1+1. A concentração de ácido úrico foi calculada a partir da
fórmula C= 2.C dil, conforme detalhado no manual de instruções do kit Reflotron (Uric
Acid) (2010).
A uréia é determinada para a avaliação da função renal. A reação provoca a
alteração parcial da cor de um indicador tamponizado em verde/azul, sendo a sua
intensidade proporcional à concentração de uréia na amostra. Quando o valor de uréia
medida foi superior ao intervalo de medição do Reflotron, a amostra de soro foi diluída
com solução salina fisiológica numa medida de 1+1. A normalização da concentração de
uréia foi feita a partir da fórmula C= 2.C dil, de acordo com o manual de instruções do kit
Reflotron (Urea) (2010).
Creatinina é usada para diagnóstico e monitorização de distúrbios renais crônicos e
agudos e para monitorizar a diálise, conforme manual de instruções do kit Reflotron
(Creatinine) (2010). Quando o valor de creatinina medida foi superior ao intervalo de
medição do Reflotron, a amostra de soro foi diluída com solução salina fisiológica numa
medida de 1+1. A normalização da concentração de creatinina foi feita a partir da fórmula
C= 2.C dil.
De acordo com o manual de instruções do kit Reflotron (GGT) (2010), GGT é usada
para diagnóstico e monitorização de doenças do fígado e do trato biliar. A atividade elevada
desta enzima, é um dos indicadores mais sensível da doença hepato-biliar. Quando a
atividade GGT medida foi superior ao intervalo de medição do Reflotron, a amostra de soro
foi diluída com solução salina fisiológica numa medida de 1+1. A normalização de GGT
foi calculada a partir da fórmula A= 2.A dil.
183
Segundo o manual de instruções do kit Reflotron (Alkalina Phosphatase) (2010), a
causa mais frequente do aumento total da atividade de Fosfatase Alcalina (ALP) no soro é a
doença do fígado e/ou trato biliar. Quando a atividade ALP medida foi superior ao intervalo
de medição do Reflotron, a amostra de soro foi diluída com solução salina fisiológica numa
medida de 1+1. A normalização de ALP foi calculada a partir da fórmula A= 2.A dil. – A0
A determinação do colesterol é utilizada para alertar sobre o risco aterogênico e no
diagnóstico e tratamento de doenças com níveis de colesterol elevados e distúrbios do
metabolismo lipídico e das lipoproteínas, detalhado no manual de instruções do kit
Reflotron (Cholesterol) (2010). Quando o valor de colesterol medido foi superior ao
intervalo de medição do Reflotron, a amostra de soro foi diluída com solução salina
fisiológica numa medida de 1+1. O valor real de colesterol foi calculado a partir da fórmula
C= 2.C dil. – C0.
Os triglicérides são determinados para detecção precoce do risco de aterosclerose,
classificação da hiperlipoproteinemia e para a monitorização da dieta ou terapia
farmacológica com o objetivo de diminuir os lipídeos, definido pelo manual de instruções
do kit Reflotron (Triglycerides) (2010). Quando o valor de triglicérides medido foi superior
ao intervalo de medição do Reflotron, a amostra de soro foi diluída com solução salina
fisiológica numa medida de 1+1. A verdadeira concentração de triglicérides foi calculada a
partir da fórmula C= 2.C dil.
3.3.2 Hemoglobina Glicada
No final do tratamento, amostras de sangue foram obtidas para determinação da
porcentagem de hemoglobina glicada, avaliando os níveis glicêmicos retroativos durante as
semanas de estudo. A hemoglobina glicada foi dosada por meio de cromatografia de troca
iônica em microcolunas.
Em relação a avaliação do percentual de hemoglobina glicada, é importante destacar
que tal mensuração e a de glicemia são complementares, revelando aspectos diferentes,
uma vez que a primeira reflete o controle glicêmico nos últimos dois a três meses, enquanto
a segunda refere-se a glicemia unicamente do dia (SUMITA; ANDRIOLO, 2008; Revista
Interdisciplinar NOVAFAPI, 2010).
As determinações foram realizadas pelo método enzimático colorimétrico,
utilizando-se kits e reagentes LABTEST, seguindo as recomendações do fabricante. Uma
184
alíquota de sangue foi acondicionada em tubo com anticoagulante (EDTA) para
determinação de hemoglobina glicada (HbA1). A percentagem de HbA1 em relação a
hemoglobina total foi calculada com base nos valores da leitura da absorbância em 415 nm.
Em um tubo adicionou-se o hemolisante juntamente com a amostra de sangue e
agitou-se por alguns minutos até a hemólise completa. Realizou-se a cromatografia em
coluna, assegurando a temperatura uniforme, a penetração de todo hemolisado sobre a
resina e a adição do tampão Hb-rápida. Aguardou-se a eluição completa da Hb-G.
Homogeneizou-se o conteúdo do tubo Hb-G e este foi aplicado em placas de 96 poços para
análise colorimétrica em leitor de microplacas. Para determinação de Hb-Total, pipetou-se
em cada poço uma alíquota de água deionizada, adicionou-se o hemolisado e homogenizou-
se. Logo em seguida determinaram-se as absorbâncias de todas as amostras. Calculou-se
corrigindo com valores de temperaturas, de acordo com as intruções do kit (LABTEST)
(Fig. 39).
Figura 39. Etapas para dosagem de hemoglobina glicada.
Fonte: Biotério CPQBA – UNICAMP (OLIVEIRA, 2014).
3.3.3 Análises de Eletrólitos na Urina e Sangue
No final do tratamento, amostras de urina e sangue foram coletadas para análise de
eletrólitos. Para coleta de sangue utilizou-se o anticoagulante heparina.
As amostras de sangue foram submetidas ao aparelho 9180 Electrolyte Analyser
(Roche) (Fig. 40), já nas amostras de urina, quando os valores de Na+ e K+ apareceram
muito elevados, procedeu-se a diluição com diluente de urina e água destilada.
185
Figura 40. Coleta de urina e o Aparelho 9180 Electrolyte Analyser.
Fonte: Biotério CPQBA – UNICAMP (OLIVEIRA, 2014).
3.3.4 Avaliação Histopatológica
Quando ocorre a toxicidade em um órgão, a maior parte do diagnóstico inicial
depende do reconhecimento da mudança na estrutura do órgão, peso relativo e morfologia,
o que pode ser avaliado por meio de análises histopatológicas. Alternativamente, as
evidências de exames de histopatologia pode ser correlacionados com dosagens hormonais
em estudos onde existem efeitos marcados no órgão alvo e hormônios relevantes.
Normalmente, uma alteração dos resultados dos testes são apoiados por outras provas,
recolhidas principalmente pela histopatologia e tais observações permitem a confirmação
sobre se um efeito é devido à toxicologia, farmacologia, ou é uma variação biológica
(EVANS, 2008 cap. 11).
Foram avaliadas possíveis alterações histológicas de órgãos que são afetados pela
condição diabética (fígado, rins e pâncreas). A avaliação histológica dos pâncreas objetivou
a análise da morfologia das ilhotas de Langerhans.
Os órgãos foram limpos e armazenados em solução de formol tamponada neutra a
10% (Fig. 41). As peças foram então desidratadas com gradiente crescente de etanol e
embebidas em parafina. Após a desparafinização e hidratação das lâminas, estas foram
coradas com hematoxilina de Harris e eosina para o exame histopatológico.
Figura 41. Remoção do pâncreas e análise histopatológica dos órgãos (fígado, rins e pâncreas).
Fonte: Biotério CPQBA – UNICAMP (OLIVEIRA, 2014).
186
4. EXPERIMENTO II: 87 dias
A fim de avaliar qual seria o efeito da indução de diabetes por STZ sobre a
sobrevida dos animais, bem como os efeitos do tratamento prolongado com a maior dose de
extrato aquoso de sementes de alpiste (1000 mg/kg) um segundo experimento foi realizado
por 87 dias. A indução de diabetes foi realizada conforme relatado anteriormente (página
175).
4.1 Delineamento Experimental
Foram utilizados dois grupos experimentais para o estudo da sobrevida em relação
ao efeito anti-diabético do extrato aquoso das sementes de Phalaris canariensis .
Grupo I: Controle Diabético Maior Dose - Ratos diabéticos tratados com 1000
mg/kg de extrato de sementes de alpiste;
Grupo II: Controle Negativo - Ratos diabéticos sem tratamento.
4.2 Tratamentos
Os animais foram alimentados diariamente com ração comum (Biobase) e tratados
pela via oral com 1000 mg/kg de extrato aquoso de sementes de alpiste, v.o. (gavagem), por
87 dias após a indução do diabetes. O grupo controle negativo (Grupo II) recebeu água
destilada por v.o. (veículo). A administração foi realizada da mesma forma que no teste de
28 dias.
4.3 Avaliações
As avaliações em relação ao ganho de massa corporal, glicemia, consumo de água e
ração foram realizados da mesma maneira que no teste de 28 dias.
Após 87 dias, os animais foram eutanasiados devido a cegueira aparente (cataratas)
e avaliados o perfil hematológico, análises bioquímicas, perfil de hemoglobina glicada e
eletrólitos. Os órgãos relacionados à condição diabética (fígado, rins e pâncreas) foram
pesados e analisados quanto a alterações histopatológicas. Os demais órgãos (coração, baço
e adrenais) foram apenas pesados.
187
4.3.1 Análises Bioquímicas
Os animais de sobrevida foram avaliados quanto as suas funções hepática e renal
por meio de análise bioquímica dos níveis séricos das enzimas aspartato aminotransferase
(TGO) e alanina aminotransferase (TGP), e análises de uréia, creatinina, fosfatase alcalina,
GGT, ácido úrico, colesterol e triglicérides.
4.3.2 Hemoglobina Glicada
A hemoglobina total foi determinada por método enzimático colorimétrico,
utilizando-se kit comercial (Hemoglobina - Laborclin). Para a análise, foram seguidas as
orientações descritas no protocolo do fabricante. A hemoglobina glicada foi determinada
por método de troca iônica. Após as reações, a leitura de absorbância foi realizada em
espectrofotômetro VersaMax em 415 nm. A concentração de HbA1 foi expressa em % de
Hb total.
Resumidamente, as amostras de sangue foram misturadas com reagente de lise para
preparar o hemolisado, durante 5 minutos. Após centrifugação 3000 rpm/5 minutos, a
hemoglobina glicada foi determinada no sobrenadante.
4.3.3 Análises de Eletrólitos na Urina e Sangue e Avaliação
Histopatológica
As análises de eletrólitos e a avaliação histopatológica foram realizadas igualmente
ao teste de 28 dias.
4.4 Análise Estatística
Os resultados foram descritos de forma quantitativa e analisados estatisticamente
pelo teste One-Way Anova (não paramétrico) seguido de Tukey multicomparison test para
análise de variância entre os grupos e Two Way seguido de teste de Bonferroni para
comparação pós teste em diferentes tempos. A análise estatística foi realizada com auxílio
do programa GraphPad Prisma 5.0 ® software, utilizando-se como nível de significância,
p<0.05, p<0.01 e p<0.001. As médias e valores de erro padrão foram determinados para
todos os parâmetros estudados.
188
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
No presente estudo utilizamos ratos (Rattus novergicus) da linhagem Wistar como
animais de experimentação, por apresentarem inúmeras vantagens em relação aos outros
animais de maior porte: fácil manuseio (alimentação, higiene, acomodação); possibilidade
de trabalhar simultaneamente com vários grupos experimentais, sem a ocupação de grandes
espaços; elevada resistência à infecção; facilidade para remoção dos diversos órgãos
(SPADELLA, 1989; SCHELLINI, 1992 apud LERCO et al., 2003; JUNOD et al., 1969;
ORLOFF et al., 1975).
Linhagens de animais de experimentação, quando padronizadas, atuam como
ferramentas capazes de simular as complexas interações de órgãos e sistemas,
possibilitando a compreensão in vivo dos eventos relacionados ao desenvolvimento da
doença (PASSOS, 2003 apud MELO, 2012).
5.1 Análise de Toxicidade Aguda
As doses adequadas das substâncias para serem utilizadas em um estudo/ensaio são
escolhidas após a realização de testes de toxicidade aguda, nos quais são observados sinais
clínicos de toxicidade, dor, comportamento e ocorrência de morte (OECD, 2002). Neste
trabalho realizou-se o teste de toxicidade aguda com doses crescentes do extrato aquoso de
sementes de alpiste e durante o período de estudo e observação de 15 dias, não houve
registro de mortes ou de quaisquer variações na aparência geral ou sinais de toxicidade.
Dessa forma, as doses selecionadas para o estudo da atividade hipoglicemiante foram 250,
500 e 1000 mg/kg.
5.2 Avaliação do Extrato Aquoso de Sementes de Alpiste em Modelo
Experimental de Diabetes Induzida por Estreptozotocina – Teste de 28 dias
No presente estudo uma dose única de 60 mg/kg de STZ foi administrada para a
indução do diabetes nos animais. O diabetes induzido por STZ foi selecionado como um
modelo experimental por ser uns dos modelos de diabetes que mais se assemelha à
patologia humana (SARKHAIL et al., 2007; FERNANDES et al., 2010). Sinais como
hiperglicemia, hipoinsulinemia, polifagia, poliúria e polidipsia acompanhada de perda de
189
massa corporal são observados em animais que desenvolvem diabetes induzida por STZ, o
que também ocorre em seres humanos (HOLEMANS et al., 1997; THULESEN et al.,
1997; AKBARZADEH et al., 2007).
5.2.1 Massa Corporal
A indução de diabetes por STZ leva à perda severa na massa corporal, devido ao
aumento da perda de massa muscular, perda de proteínas teciduais e alteração do
metabolismo de carboidratos (CHEN; IANUZZO, 1982 apud GANDHI, 2011). Neste
estudo, a variação de massa corporal entre os animais diabéticos e não diabéticos pode ser
notada após 15 dias da indução do diabetes, quando a diferença foi estatisticamente
significativa entre os grupos (p < 0.001). A massa corporal do grupo sham e do grupo não
diabético tratado com a maior dose aumentou significativamente (cerca de 120g ao final de
28 dias de experimento). Já os ratos diabéticos mostraram redução acentuada do ganho da
massa corporal em comparação com ratos saudáveis (diferença de 76g entre controle
negativo diabético e grupo sham no final do experimento) (Fig. 42).
O tratamento dos animais diabéticos com o extrato aquoso de sementes de alpiste
não resultou em uma recuperação significativa da massa corporal, ficando muito próximo
do controle negativo (todos os animais diabéticos ganharam cerca de 52g até o fim do
experimento) (Fig. 43). Isto pode ser explicado devido à indisponibilidade de carboidratos
para o metabolismo energético, redução do tecido adiposo e a perda ou degradação de
proteínas estruturais (BALAMURUGAN; DURAIPANDIYAN; IGNACIMUTHU, 2011
apud MURALI, 2013; SARAVANAN et al., 2009; SUBRAMANI et al., 2014). Além
disso, o excesso de catabolismo de proteínas para proporcionar aminoácidos para
gliconeogênese durante a deficiência de insulina, resulta em perda de massa muscular e
perda de massa em pacientes diabéticos, neste caso ratos induzidos com STZ
(SUBRAMANI et al., 2014).
190
Variação da Massa Corporal
D0
D1
D3
D5
D8
D10
D12
D15
D17
D19
D22
0
50
100
150Controle Negativo com STZ
Dose 250 mg/kg com STZ
Dose 500 mg/kg com STZ
Dose 1000 mg/kg com STZ
Dose 1000 mg/kg sem STZ
SHAM
***
Dias
Va
ria
ção
da
ma
ssa
co
rpo
ral
(g)
Figura 42. Variação da massa corporal durante o estudo de 28 dias.
Variação da massa corporal dos animais diabéticos (induzidos com STZ, 60 mg/kg i.p) e não diabéticos,
tratados ou não com extrato aquoso de sementes de alpiste por via oral, nas doses de 250, 500 e 1000 mg/kg,
por 28 dias. Os resultados são expressos como média ± erro padrão. One way ANOVA, seguido de teste de
Bonferroni para comparação dos diferentes grupos. *** p<0.001.
Figura 43. Pesagem dos animais.
Fonte: Biotério CPQBA – UNICAMP (OLIVEIRA, 2014).
A perda de massa corporal dos animais doentes corrobora com a constatação de
Oyedemi et al., (2011a), que observou efeito semelhante em animais diabéticos induzidos
com estreptozotocina. No entanto, a administração oral de extrato aquoso da casca do caule
de Afzelia africana (Smith) foi capaz de manter o ganho de massa corporal dos animais. O
resultado indicou que o extrato possui a capacidade de gerir o nível de glicose, bem como
controlar a perda muscular e adipogênese induzida pelo modelo experimental (SHENOY;
RAMESH, 2002; OYEDEMI et al., 2011). O aumento da massa corporal em animais
191
tratados apoiam o efeito antidiabético de extratos, pois a condição diabética está associada a
perda de massa corporal (MAITI, 2004). No entanto, isso não pode ser observado para os
tratamentos com o extrato aquoso das sementes de alpiste.
Além disso, visualmente ratos saudáveis e diabéticos são distintos: as caudas dos
ratos saudáveis são rosa e recobertas por um veludo branco (AKBARZADEH et al., 2007).
Devido a indução de diabetes, a cauda torna-se de cor escura e manchada e sua pelagem
muda de branco aveludado para rosa ou cinza por trás da cabeça e na parte inferior do
corpo (AKBARZADEH et al., 2007). Se o ambiente dos ratos é mantido limpo, haverá uma
mudança de cor de branco para cor de rosa. Caso contrário a mudança será do branco ao
cinza (HOLEMANS et al., 1997; AKBARZADEH et al., 2007). Neste ensaio os ratos
diabéticos se apresentaram mais frágeis, raquíticos, com perda de pêlos, pelagem eriçada e
sem brilho, características bem diferentes dos animais saudáveis.
Gutierrez et al., (2014) avaliaram a ação do extrato hexânico de sementes de alpiste
em modelo de diabetes induzida por STZ em camundongos. Neste estudo, o tratamento oral
com a dose de 400 mg/kg, por 30 dias, inibiu a perda de massa corporal causada pela STZ.
Porém, não é possível fazer uma relação direta entre a composição química do extrato
hexânico e aquoso, o que sugere que na semente existem compostos de baixa polaridade
que poderiam apresentar efeito sobre as manifestações clínicas do diabetes e que
possivelmente foram concentrados após a extração com hexano.
5.2.2 Glicemia
A STZ é usada como um agente para induzir diabetes por efeito de citotoxicidade
seletiva em células β pancreáticas (NASTARAN, 2011 apud OYEDEMI et al., 2011). Sua
administração ocasiona destruição seletiva da célula β em várias espécies animais. A
produção se dá a partir da glicose da sua molécula como responsável pela incorporação da
metilnitrosuréia na célula β, a qual seria a indutora de citotoxicidade (BEDOYA et al.,
1996)
O inóculo de STZ foi eficiente em induzir aumento de glicemia, como pode ser
observado a partir da leitura D1, quando todos os grupos que foram inoculados com STZ
possuiam valores de glicemia maiores que os grupos que não foram expostos (sham e maior
dose sem STZ). Descartou-se uma possível ação do extrato sobre o aumento da glicemia
192
com os valores obtidos para o grupo tratado com 1000 mg/kg porém não induzido com
STZ, o que comprovou que o extrato por si só não elevou esse parâmetro (Tabela 8).
Em relação ao controle negativo, as doses maior e intermediária apresentaram
valores de glicemia menores nas leituras D7 (ambos) e D14 (dose intermediária), porém os
valores se igualam a partir da leitura D18. De maneira interessante, na leitura D28 o grupo
tratado com a menor dose do extrato apresentou valor de glicemia estatisticamente menor
que o grupo controle negativo, podendo ser uma tendência de manutenção dos índices
glicêmicos (Tabela 8).
A partir desses resultados pode-se inferir que o tratamento diário com extrato
aquoso de sementes de alpiste por via oral nas doses de 250, 500 e 1000 mg/kg não reduziu
os índices glicêmicos ou preveniu a hiperglicemia em ratos Wistar expostos à
estreptozotocina (60 mg/kg), durante 28 dias de experimento.
Tabela 8. Efeito do tratamento com extrato aquoso de sementes de alpiste sobre os níveis
de glicose no sangue em animais diabéticos e controle, durante 28 dias de experimento.
Grupos/Dias DO D1 D7 D14 D18 D24 D28
Sham 120 ± 0 120,0 ± 0 116,3 ± 4,5 128,0 ± 2,0 144,2 ± 13,5 129,2 ± 4,5 113,7 ± 4,0
Controle Negativo com STZ 120 ± 0 346,4 ± 13,3
***
529,3 ± 26,1
***
492,8 ± 26,1
***
543,1 ± 21,8
***
521,1 ± 27,3
***
546,8 ± 14,9
***
Dose 250 mg/kg com STZ 120 ± 0 391,4 ± 25,9
***
519,1 ± 31,1
***
420,6 ± 26,4
***
532,3 ± 28,2
***
457,2 ± 24,1
***
456,6 ± 21,2
***##
Dose 500 mg/kg com STZ 120 ± 0 398,5 ± 18,6
***
443,0 ± 22,5
***#
417,9 ± 15,7
***#
505,7 ± 19,0
***
494,6 ± 23,2
***
477,5 ± 21,5
***
Dose 1000 mg/kg com STZ 120 ± 0 378,6 ± 17,6
***
452,7 ± 24,5
***#
436,9 ± 24,7
***
508,9 ± 27,9
***
520,1 ± 26,6
***
498,6 ± 22,2
***
Dose 1000 mg/kg sem STZ 120 ± 0 120,0 ± 0
###
142,8 ± 16,5
###
122,0 ± 5,4
###
135,5 ± 15,1
###
125,0 ± 2,0
###
111,8 ± 3,2
###
Níveis de glicose sanguínea após jejum em animais diabéticos (induzidos com STZ, 60 mg/kg i.p) e não
diabéticos, tratados ou não com extrato aquoso de sementes de alpiste por via oral, nas doses de 250, 500 e
1000 mg/kg, por 28 dias. Os resultados são expressos como média ± erro padrão. Two-way ANOVA, seguido
de teste de Bonferroni para comparação dos diferentes grupos. * Diferente em relação ao grupo Sham. #
Diferente em relação ao grupo controle negativo *** p<0.001, ### p<0.001.
Diferente do que foi observado nesse estudo, Gutierrez et al., (2014) mostraram que
o tratamento com extrato hexânico de sementes de alpiste inibiu o aumento glicêmico
induzido pela STZ em modelo de diabetes severa e não-severa. Comparando com outros
dados da literatura que relatam a ação de produtos naturais, animais tratados com extrato
aquoso de sementes de Tamarindus apresentam redução significativa da glicemia em jejum
após 7 dias da indução do diabetes em ratos machos diabéticos induzidos com STZ
193
(MAITI, 2004). No estudo de Sales (2011) os níveis séricos de glicose foram maiores nos
ratos diabéticos ao final do período experimental quando comparados com os ratos não
diabéticos. A suplementação da ração com aveia, linhaça, gergelim e semente de girassol
não alterou a glicemia dos animais tratados em comparação com o grupo diabético sem
suplementação.
Tensão oxidativa no diabetes coexiste com uma redução na atividade antioxidante,
que pode aumentar ainda mais os efeitos deletérios dos radicais livres (COLLIER et al.,
1990 apud SINGH et al., 2005). Modelos diabéticos em animais experimentais
supostamente apresentam alto estresse oxidativo, devido à hiperglicemia persistente e
crônica (SINGH et al., 2005). A hiperglicemia, o principal sintoma do diabetes, não só
aumenta a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), mas também afeta os
antioxidantes. Com base nisso pode-se notar que as doses utilizadas de extrato aquoso de
sementes de alpiste não foram ideais para combater a hiperglicemia, portanto a produção de
EROs e o estresse oxidativo geralmente formados na doença podem estar presentes.
5.2.3 Consumos de Ração, Água e Poliúria
Antes e durante o experimento, os animais foram alimentados com dieta padrão de
laboratório (Biobase), com livre acesso à água. Como esperado para animais diabéticos
induzidos com STZ, foi observado aumento significativo no consumo de ração e água pelos
ratos diabéticos, em comparação com os grupos não-diabéticos (Fig. 44 e 45). Este fato é
resultado de uma redução crônica da captação de glicose e sua utilização pelas células,
além da perda considerável na urina, o que gera um estímulo persistente para comer e
beber.
194
1ª 2ª 3ª 4ª0
100
200
300
400
500Controle Negativo com STZ
250 mg/kg com STZ
500 mg/kg com STZ
1000 mg/kg com STZ
1000 mg/kg sem STZ
SHAM
****** ******
Consumo de Ração
Semanas
Co
nsu
mo
(g
)
Figura 44. Consumo de ração durante as 4 semanas de experimento (28 dias).
Consumo de ração por animais diabéticos (induzidos com STZ, 60 mg/kg i.p) e não diabéticos, tratados ou
não com extrato aquoso de sementes de alpiste por via oral, nas doses de 250, 500 e 1000 mg/kg, por 28 dias.
Os resultados são expressos como média do grupo experimental.
O tecido hepático é sensível à insulina e desempenha um papel importante no
metabolismo da glicose, regulando a interação entre a utilização da glicose e a
gliconeogênese (SUBRAMANI et al., 2014). Estes processos são marcadores do diabetes
tipo 2 em humanos e animais, pois são consequência direta da deficiência de insulina
(SWANTSON-FLATT et al., 1990; OYEDEMI et al., 2011). De acordo com Wei (2003);
Murali (2013), animais diabéticos apresentam um estado de poliúria, aumento da ingestão
hídrica, desidratação, perda de massa corporal e muscular, perda excessiva de pêlos e
aumento da ingestão de alimentos.
De acordo com Sales (2011) o consumo alimentar, a ingestão hídrica e a diurese
apresentaram-se significativamente aumentados nos grupos de animais diabéticos quando
comparados com os animais saudáveis. Todos os grupos diabéticos tiveram o consumo
alimentar elevado quando comparado com o controle sadio.
As fibras, sobretudo as solúveis, aumentam o bolo fecal, a motilidade
gastrointestinal e a saciedade, reduzem a glicemia e a insulinemia pós-prandial (SILVA et
al., 2003), e melhoram a tolerância à glicose e o perfil lipídico (LOCK et al., 2005), o que
favorece o controle do DM por meio do controle do peso corporal, reduzindo o risco de
complicações do DM (LIU et al., 2003). Apesar de alguns estudos relatarem um aumento
da saciedade e redução do apetite após o consumo de dietas ricas em fibras. Os resultados
do presente estudo não evidenciaram tal efeito, o que pode ser explicado pelo fato do
extrato possuir uma quantidade baixa de fibras e também em relação a ausência de insulina
195
para promover a captação de glicose pelas células dependentes, sua ação contribuiu para a
manutenção de níveis elevados de glicemia e de estado de catabolismo aumentado, o que
resultou na perda de massa corporal e manutenção de polifagia, sintomas de DM
descompensado. As fibras têm reconhecidas propriedades antidiabéticas, sobretudo por
reduzir a absorção intestinal de colesterol e carboidratos sendo, por isso, amplamente
utilizadas no controle do DM (LINDSTRÖM et al., 2006).
1ª 2ª 3ª 4ª0
500
1000
1500
2000Controle Negativo com STZ
250 mg/kg com STZ
500 mg/kg com STZ
1000 mg/kg com STZ
1000 mg/kg sem STZ
SHAM
*** ****** ***
Consumo de Água
Semanas
Co
nsu
mo
(m
L)
Figura 45. Consumo de água durante as 4 semanas de experimento (28 dias).
Consumo de água por animais diabéticos (induzidos com STZ, 60 mg/kg i.p) e não diabéticos, tratados ou não
com extrato aquoso de sementes de alpiste por via oral, nas doses de 250, 500 e 1000 mg/kg, por 28 dias. Os
resultados são expressos como média do grupo experimental.
A falta ou resistência de insulina provoca hiperglicemia, elevando a quantidade de
açúcar na urina, e para eliminar o excesso de glicose há a necessidade de urinar mais,
eliminando muita água, necessária para a diluição dessa glicose, ocasionando uma
desidratação. Para compensar a perda urinária de líquidos, o animal consome mais água
(polidipsia compensatória) (MOTTA, 2003). Poliúria e polidpsia são sinais típicos do
diabetes, que sobrecarrega a função dos rins acarretando em disfunção renal (TANG et al.,
2011).
De fato, logo na primeira semana de experimento observou-se que as caixas dos
animais que receberam STZ estavam mais úmidas, principalmente a dos animais diabéticos
que não receberam o extrato aquoso de sementes de alpiste, indicando poliúria (Fig. 46), o
que está diretamente relacionado com o aumento de ingestão de água apresentado na (Fig.
45).
196
Figura 46. Comparação das camas de maravalha quanto à poliúria.
A. Comparação das camas de maravalha na caixa sem uso, de animais sham e diabéticos. B. Comparação do
estado da maravalha 1 dia após a troca das caixas de animais diabéticos e não diabéticos.
Fonte: Biotério CPQBA – UNICAMP (OLIVEIRA, 2014).
Novamente os dados obtidos com o extrato aquoso de sementes de alpiste diferem
dos obtidos por Gutierrez et al., (2014) com o extrato hexânico das sementes, no tratamento
com 400 mg/kg por 30 dias, observou-se diminuição na incidência de poliúria e polifagia.
5.2.4 Análises Bioquímicas
As análises bioquímicas são uma parte importante, que ajuda na identificação dos
órgãos-alvo e efeitos adversos (EVANS, 2009 cap. 14).
Os resultados foram analisados e comparados em relação ao grupo Sham (não-
diabético) e ao grupo controle negativo com STZ. Os valores de referência hematológicos e
bioquímicos em ratos não-tratados são dados de grande valor como ponto de partida para
diversos estudos, tais como as avaliações de efeitos farmacológicos e toxicológicos sobre
estes parâmetros (MELO, 2012). A administração de STZ em animais afeta não somente as
células β-pancreáticas, mas também pode levar à injúria renal, estresse oxidativo
inflamatório e disfunção do endotélio, portanto é de se esperar que existam alterações nos
perfis hematológico e bioquímico nos animais que receberam STZ (FRÖDE e MEDEIROS,
2008).
As enzimas são proteínas com propriedades catalisadoras sobre as reações que
ocorrem nos sistemas biológicos. Elas têm um elevado grau de especificidade sobre seus
substratos acelerando reações específicas sem serem alteradas ou consumidas durante o
processo. Os níveis de enzimas no plasma são normalmente avaliados como suporte na
detecção de hepato, cardio, neuro e miotoxicidade e toxicidade pancreática, enquanto que
197
na avaliação da nefrotoxicidade, usa-se medidas de enzimas urinárias. Em alguns casos, o
foco está na redução da atividade da enzima (EVANS, 2009 cap. 2).
A distribuição de enzimas varia entre os diferentes órgãos e tecidos corporais e pode
variar em diferentes tipos de células dentro de um órgão (CLAMPITT e HART, 1978;
BRAUN et al., 1983; LINDENA et al., 1986; MILNE e DOXEY 1986; DAVY et al., 1988;
EVANS, 2009 cap. 2).
A exposição a STZ com consequente aumento dos índices glicêmicos eleva também
os níveis das enzimas hepáticas TGO e TGP. Esse aumento não é prevenido pelo
tratamento com extrato aquoso de sementes de alpiste por via oral, por 28 dias. Pode-se
observar uma tendência de aumento nos níveis da enzima ALP e também dos níveis de
triglicérides. O tratamento com a maior dose sem exposição de STZ não alterou nenhum
parâmetro bioquímico plasmático, sugerindo que as alterações são decorrentes da elevação
dos níveis glicêmicos e instalação da doença (Tabela 9).
Tabela 9. Efeito do extrato aquoso de sementes de alpiste em parâmetros bioquímicos.
Análises/Grupos ShamControle Negativo
com STZ
Dose 250 mg/kg
com STZ
Dose 500 mg/kg
com STZ
Dose 1000 mg/kg
com STZ
Dose 1000 mg/kg
sem STZ
TGO 115,3 ± 11,4 402,0 ± 60,1 552,2 ± 105,6 * 494,6 ± 167,0 497,2 ± 97,9 * 150,6 ± 17,0
TGP 22,5 ± 0,8 213,7 ± 61,5 * 241,1 ± 41,8 * 211,6 ± 35,3 * 153,0 ± 23,1 28,4 ± 2,1
ALP 146,3 ± 10,5 286,5 ± 75,1 307,7 ± 85,7 323,0 ± 112,5 339,6 ± 119,7 132,0 ± 23,9
Uréia 86,6 ± 42,8 72,7 ± 6,3 76,2 ± 7,3 79,4 ± 5,0 81,8 ± 6,0 43,0 ± 1,5
Creatinina 0,5 ± 0 0,5 ± 0 0,5 ± 0 0,5 ± 0 0,5 ± 0 0,5 ± 0
GGT 5,0 ± 0 7,4 ± 1,7 5,0 ± 0 5,0 ± 0 5,0 ± 0 5,0 ± 0
Colesterol 100,0 ± 0 101,8 ± 1,8 100,0 ± 0 100,5 ± 0,5 100,0 ± 0 100,0 ± 0
Triglicérides 90,9 ± 8,0 133,2 ± 15,5 117,6 ± 10,1 129,5 ± 15,0 149,5 ± 11,7 87,1 ± 8,9
Ácido Úrico 2,9 ± 0,7 2,1 ± 0,1 2,1 ± 0,1 2,3 ± 0,2 2,1 ± 0,1 2,3 ± 0,3
Níveis das diferentes enzimas, colesterol, triglicérides e ácido úrico em animais diabéticos (induzidos com
STZ, 60 mg/kg i.p) e não diabéticos, tratados ou não com extrato aquoso de sementes de alpiste por via oral,
nas doses de 250, 500 e 1000 mg/kg, por 28 dias. Os resultados são expressos como média ± erro padrão. One
way ANOVA, seguido de teste de Tukey para comparação dos diferentes grupos. * Diferente em relação ao
grupo Sham. * p<0.05.
As reações catalisadas pelas aminotransferases (transaminases) exercem papéis
centrais tanto na síntese como na degradação de aminoácidos, atuando como uma ponte
entre o metabolismo dos aminoácidos e carboidratos (MOTTA, 1998). Estas enzimas estão
amplamente distribuídas nos tecidos humanos. As atividades mais elevadas de TGO
encontram- se no miocárdio, fígado, músculo esquelético, com pequenas quantidades nos
rins, pâncreas, baço, cérebro, pulmões e eritrócitos (MOTTA, 1998). Da mesma forma a
198
enzima TGP, está largamente distribuída nos tecidos cardíaco, incluindo, tecidos
esqueléticos, hepáticos e renais (EVANS, 2009 cap. 2).
Apesar das enzimas transaminases TGO e TGP serem igualmente abundantes no
tecido hepático, a TGO apresenta concentração 20 vezes maior que a TGP no músculo
cardíaco. A TGP é encontrada principalmente no citoplasma do hepatócito, enquanto 80%
da TGO está presente na mitocôndria. Porém, TGP é mais hepato-específica do que TGO,
sendo que o TGO pode ser normal ou estar discretamente alterada em doenças hepáticas
crônicas graves (THRALL, 2007 apud ESPESCHIT, 2010). Lesões ou destruição das
células hepáticas liberam estas enzimas para a circulação e esta diferença tem auxiliado no
diagnóstico e prognóstico de doenças hepáticas. Em dano hepatocelular a forma
predominante no soro é a citoplasmática TGP, enquanto em lesões graves há liberação da
enzima mitocondrial TGO, elevando a relação TGO/TGP (MOTTA, 1998).
O estado de diabetes aumenta os níveis de quantidade sérica das enzimas hepáticas
TGO e TGP. Atividades elevadas de transaminases pode ser um sinal de alterações
hepáticas e doenças cardiovasculares e sendo observadas com maior fequência entre
pessoas com diabetes do que na população em geral (ARKKILA et al., 2001;
FERNANDES et al., 2010). Tais alterações são explicáveis por que essas enzimas são
requeridas quando há aumento do metabolismo energético, uma vez que desempenham um
importante papel na gliconeogênese (MORI et al., 2003 apud FERNANDES et al., 2010).
No estudo de Sales (2011) a avaliação de marcadores bioquímicos de metabolismo e
função hepática não revelou diferenças estatisticamente significativas nos níveis séricos de
TGO entre os grupos, exceto no grupo diabético com ração suplementada com aveia,
linhaça, gergelim, semente de girassol que apresentou aumento significativo nos níveis
séricos de TGO quando comparado com o grupo de animais normais. Quanto aos níveis de
TGP observou-se que, com exceção do grupo diabético tratado com ração suplementada
combinada com administração de concentrado de jatobá, os grupos de animais diabéticos
tratados e não tratados apresentaram níveis de TGP significativamente maiores em relação
aos animais normais. Este fato esta relacionado com a presença de antioxidantes que inibem
o aumento dos níveis séricos de TGO e TGP em ratos tratados com STZ (IMAEDA et al.,
2002; FERNANDES et al., 2010).
No estudo desenvolvido por Gutierrez et al., (2014), o extrato hexânico de sementes
de alpiste previniu o aumento da atividade dessas enzimas, o que pode estar correlacionado
199
ao menor dano hepático. Neste estudo com o extrato aquoso de alpiste os níveis de TGO e
TGP aumentaram, sendo que concentração utilizada de antioxidantes não garantiu a
prevenção.
O extrato aquoso de sementes de P. canariensis, como mostrado nesse estudo, não
exibe um efeito hepatoprotetor in vivo, estando os níveis de fosfatase alcalina (ALP)
também aumentados em todos os grupo tratados. ALP está amplamente distribuída nos
tecidos humanos, notadamente na mucosa intestinal, fígado (canalículos biliares), túbulos
renais, baço, ossos (osteoblastos) e placenta (MOTTA, 1998).
É bem sabido que ratos diabéticos mostram um aumento significativo na atividade
da ALP (SKILLEN et al., 1987; RAO; MORGHOM, 1986; WEISS; REDDI, 1980 apud
FERNANDES, et al., 1999; STEPAN et al., 1980). A ALP é uma enzima hidrolítica
intracelular que age sobre os fosfoglicerídios ou ésteres fosfóricos, completando sua
degradação com a liberação de fosfato. Alterações na atividade da fosfatase alcalina do soro
sanguíneo pode indicar, pelo menos em parte, incapacidade de excreção biliar ou lesão das
células hepáticas (SHERLOCK, 1985 apud apud JONG, 1996). Este aumento também pode
estar relacionado ao aumento de atividade nos osteoblastos, onde encontra-se em maior
concentração. Deve-se entretanto verificar a idade dos animais pois o aumento fisiológico
de atividade desta enzima ocorre no soro de ratos em crescimento. Valores normais de
atividade da fosfatase alcalina demonstrados por Ringler & Dabich (1979), oscilam entre o
máximo de 480 U/L, para ratos machos com 8 semanas de idade a 220 U/L para animais do
mesmo sexo com 7 meses (JONG, 1996).
O diabetes mellitus também está estritamente relacionada com outras anormalidades
metabólicas, tais como o perfil de lipídeos, caracterizada principalmente por níveis
elevados de colesterol total e triglicérides (VERGES, 1991; MERZOUK et al., 2000; SEFI,
2011), estando este útimo também elevado nos ratos diabéticos induzidos por STZ.
Associado a alterações profundas há um aumento também na uréia, creatinina e LDL, com
diminuição nos níveis de HDL, o que contribui para as doenças coronárias (ARVIND et
al., 2002 apud MARSLIN et al., 2014; CULLEN et al., 1999; FERNANDES et al., 2010).
Segundo Sales (2011) a análise do efeito do diabetes revelou níveis de uréia
significativamente maiores nos grupos de animais diabéticos controle e tratados quando
comparados com o grupo controle sadio. O tratamento com ração suplementada de aveia,
linhaça, gergelim, semente de girassol, com administração de concentrado de jatobá ou
200
administração de insulina não resultaram em redução na concentração sérica de uréia e
creatinina. A uréia sanguínea encontra-se elevada proporcionalmente ao nível de
desidratação. Entretanto, o grupo diabético tratado com insulina e o grupo com ração
suplementada combinada com o concentrado de jatobá apresentaram níveis
significativamente maiores de creatinina quando comparados com o grupo diabético
controle.
Uma elevação da creatinina, geralmente, ocorre simultaneamente com o aumento de
uréia no plasma, sendo muitas vezes mensurada não apenas para avaliar o
comprometimento dos rins, mas também como ponto final clínico de detecção de
tratamento relacionado a efeitos tóxicos de compostos no rim em modelo experimental de
diabetes com animais (TRAVLOS et al., 1996; SALES, 2011). Nenhum dos parâmetros
acima descritos (uréia, creatinina e colesterol total) encontraram-se alterados após 28 dias
da indução de diabetes, o que pode sugerir o desenvolvimento de uma forma mais branda
da doença (Tabela 9).
Diabetes induzida por STZ leva ao aumento dos níveis plasmáticos de colesterol,
triglicérides, ácidos graxos livres e fosfolipídeos. A deficiência ou resistência à insulina
pode ser o fator responsável por dislipidemias porque a insulina aumenta os índices de
ácidos graxos, bem como a síntese de triglicérides no tecido adiposo e fígado. Atua ainda
inibindo a lipólise, via desfosforilação (e, por conseguinte, a inativação) de lipases (GOHIL
et al., 2010 apud GUTIERREZ et al., 2014). Em ratos diabéticos, a utilização prejudicada
de carboidratos leva a lipólise acelerada, resultando em hiperlipidemia (MOREL;
CHISOLM, 1989; SAH, et al., 2011) e contribuindo para o desenvolvimento de
aterosclerose (STOUT, 1993; FERNANDES et al., 2010). A ação ineficiente da insulina
leva a um metabolismo celular deficiente, o que resulta em um aumento dos níveis
circulantes de triglicérides e uma diminuição na concentração de lipoproteína de alta
densidade (HDL). Prolongada hiperglicemia causa danos aos nervos, olhos, rins, coração e
os vasos sanguíneos. Cetoacidose pode ocorrer nestes doentes, como resultado do estresse,
tais como uma infecção, a administração de certos fármacos tais como corticosteróides e
desidratação (SARAVIA, 2005; DIAGNOSTICO, CLASIFICACION Y PATOGENIA DE
LA DIABETES MELLITUS, 2011 apud ORTIZ, 2012).
O aumento dos níveis de triglicérides séricos no presente estudo indica desarranjo
do metabolismo de lipídeos, o que pode contribuir com o aumento da incidência de
201
disfunção cardíaca nos ratos diabéticos. Elevação de lipídeos séricos indica tanto o defeito
na remoção ou superprodução de uma ou mais lipoproteínas (AKULA; KOTA;
GOPISETTY, 2003; FERNANDES et al., 2010). Apesar do extrato aquoso de sementes de
alpiste possuir em sua composição ácido graxo ômega 3, que pode contruibuir com a
redução dos níveis de triglicérides e LDL, o extrato aquoso de sementes de alpiste não
previniu o aumento desse parâmetro nos animais diabéticos, pois a porção encontrada foi
baixa 2,6%.
Schrijver & Privett (1982), estudando o efeito dos ácidos graxos de cadeia longa na
biossíntese de ácidos graxos insaturados em ratos, encontraram dados indicativos de que o
ácido eicosapentaenóico (20:5 n-3) e docosahexaenóico (22:6 n-3) diminuiram o
requerimento de ácido linoléico na dieta. A interação destes interfere no tipo e quantidade
de ácidos graxos de cadeia longa depositados no tecido animal e na regulação da
biossíntese de ácidos graxos poli-insaturados. Banerjee et al., (1992), concluiram que o
efeito hipolipidêmico depende da composição dos ácidos graxos poli-insaturados (n-3)
ingeridos (JONG, 1996).
A gama glutamil transpeptidase ou transferase (GGT) é uma enzima responsável
pelo catabolismo extracelular da glutationa (EMDIN et al., 2005). Pode ser produzida por
diferentes tecidos, porém a maior parte da GGT presente no soro provém do fígado
(EMDIN et al., 2005). Por mecanismo ainda não muito bem esclarecido, pacientes com
diabetes mellitus, hipertireoidismo, artrite reumatóide e doença pulmonar obstrutiva crônica
frequentemente apresentam valores aumentados de GGT. Pode-se inferir que os níveis
aumentados de GGT nesses pacientes está diretamente relacionado ao aumento do estresse
oxidativo, já que a glutationa é uma das principais enzimas antioxidantes (HAGHIGHI et
al., 2011). A avaliação dos níveis de GGT pode ser útil na determinação do risco para
desenvolvimento de diabetes tipo II em pacientes, havendo correlação direta entre aumento
de GGT e hemoglobina glicada, LDL e triglicérides (HAGHIGHI et al., 2011). Apesar da
direta correlação com o desenvolvimento do diabetes, em nosso estudo não foram
observadas alterações significativas nos níveis de GGT, havendo tendência de aumento no
grupo diabético não tratado (Tabela 9). Podendo o extrato aquoso apresentar um aumento
na capacidade antioxidantes dos animais.
O ácido úrico é um dos principais produtos do catabolismo de proteínas oriundas da
dieta e de fontes endógenas, concentrando-se principalmente no fígado. É principalmente
202
excretado pelo rim (urina) e os níveis séricos são determinados pela relação entre a dieta, a
produção endógena e os mecanismos de reabsorção e de excreção renal (DEL-FABRO,
2007). O aumento nos níveis de ácido úrico é decorrente do desequilíbrio entre sua
absorção e a excreção, podendo estar associado com patologias como diabetes mellitus e
distúrbios lipídicos. Em nosso estudo não foram observadas alterações nos níveis de ácido
úrico (Tabela 9).
5.2.5 Hemograma e Hemoglobina Glicada
A avaliação de possíveis alterações de parâmetros hematológicos pode ser utilizada
para revelar o efeito tóxico de xenobióticos, incluindo extratos vegetais, sobre os
constituintes do sangue. Tais avaliações também são úteis na determinação de possíveis
alterações nos níveis de biomoléculas, tais como enzimas, produtos metabólicos,
hematologia, funcionamento dos órgãos (MAGALHÃES et al., 2008; OYEDEMI et al.,
2011).
Os exames hematológicos fornecem o perfil dos elementos celulares do sangue,
mostrando os valores quantitativos dos eritrócitos (hemácias), leucócitos e plaquetas, bem
como a concentração de hemoglobina, hematócrito (porcentagem de hemácias no sangue),
volume corpuscular médio (VCM - tamanho das hemácias), hemoglobina corpuscular
média (HCM - peso da hemoglobina dentro da hemácia) e concentração de hemoglobina
corpuscular média (CHCM – concentração de hemoglobina dentro da hemácia). No
presente estudo, após 28 dias de experimento o sangue foi coletado e processado para
avaliação dos principais parâmetros hematológicos (Tabela 10).
203
Tabela 10. Efeito do extrato aquoso de sementes de alpiste em parâmetros hematológicos.
Análises/Grupos ShamControle Negativo
com STZ
Dose 250 mg/kg
com STZ
Dose 500 mg/kg
com STZ
Dose 1000 mg/kg
com STZ
Dose 1000 mg/kg
sem STZ
Leucócitos Totais 6,1 ± 1,3 2,9 ± 0,4
***
3,9 ± 0,5 3,1 ± 0,4
*
2,6 ± 0,6
**
8,2 ± 0,5
###
Hemoglobina 16,2 ± 0,3 17,2 ± 0,2 17,6 ± 0,5
*
17,9 ± 0,2
**
17,4 ± 0,1 15,8 ± 0,2
#
Plaquetas 890,8 ± 34,4 696,6 ± 29,9 610,4 ± 86,8
*
640,7 ± 26,1
*
625,2 ± 63,0
*
889,7 ± 16,0
Hemácias RBC 8,4 ± 0,1 9,4 ± 0,1
**
9,5 ± 0,3
**
9,8 ± 0,1
***
9,6 ± 0,1
***
8,3 ± 0,1
##
Hematócritos HCT 45,5 ± 0,6 51,0 ± 0,5
***
51,8 ± 1,5
***
53,0 ± 0,5
***
51,9 ± 0,4
***
45,1 ± 0,4
###
VCM 54,2 ± 0,5 54,2 ± 0,5 54,7 ± 0,3 53,9 ± 0,3 54,1 ± 0,4 54,2 ± 0,2
HCM 19,3 ± 0,3 18,3 ± 0,2
**
18,6 ± 0,1 18,2 ± 0,2
**
18,2 ± 0,1
**
19,0 ± 0,1
CHCM 35,6 ± 0,2 33,8 ± 0,2
***
33,9 ± 0,2
***
33,7 ± 0,2
***
33,6 ± 0,1
***
35,0 ± 0,1
###
Hemoglobina Glicada 3,6 ± 0,1 4,9 ± 0,1
***
4,7 ± 0,1
***
3,9 ± 0,1
###
3,9 ± 0,1
###
4,3 ± 0,3
**
Hemograma de sangue total e perfil de hemoglobina glicada em animais diabéticos (induzidos com STZ, 60
mg/kg i.p) e não diabéticos, tratados ou não com extrato aquoso de sementes de alpiste por via oral, nas doses
de 250, 500 e 1000 mg/kg, por 28 dias. Os resultados são expressos como média ± erro padrão. One way
ANOVA, seguido de teste de Tukey para comparação dos diferentes grupos. * Diferente em relação ao grupo
Sham. # Diferente em relação ao grupo controle negativo. * e # p<0.05; ** e ## p<0.01; *** e ### p<0.001.
O tratamento com STZ levou ao aumento da contagem de hemácias (RBC) e
hematócrito em todos os grupos, tratados ou não com alpiste, o que pode estar relacionado
com aumento dos níveis de glicemia ou a possível toxicidade da STZ. O aumento da
contagem de hemácias também pode ocorrer em casos de desidratação (perda de líquido),
pois há aumento da concentração do sangue ou quando ocorre produção excessiva
(policitemia) (HEMOGRAMA..., 2013).
Em nosso estudo todos os grupos foram manipulados da mesma forma a fim de
evitar a interferência do estresse como possível variável, visto que o estresse e anestesia
pode alterar significativamente alguns parâmetros hematológicos e bioquímicos. A tensão
causada pela manipulação e imobilização resulta frequentemente numa elevação de
hematócrito e alterações na contagem de glóbulos brancos, assim como as variações dos
níveis de glicose no sangue e certos hormônios (TECNICAS DE INOCULACION Y
SANGRIA DE ANIMALES, 2011 apud ORTIZ, 2012).
Ao contrário do que ocorreu com a contagem de hemácias e hematócrito, o
tratamento com STZ diminuiu a contagem de leucócitos totais, plaquetas, HCM e CHCM
em todos os grupos diabéticos, o que também pode estar relacionado com o aumento dos
níveis de glicemia ou a possível toxicidade da STZ.
204
A STZ suprime o sistema imunitário e pode levar a danos em certos órgãos do corpo
(PAUL, 2011 apud OYEDEMI et al., 2011). Em nosso estudo a injeção intraperitoneal de
STZ nos ratos reduziu significativamente o número de leucócitos, sendo que tal redução
pode estar ligada a efeitos sobre o sistema imunológico (TORELL et al., 1986; OYEDEMI
et al., 2011). A contagem de glóbulos brancos e de seus índices relacionados não foram
restaurados ao normal após a administração do extrato de alpiste nas doses testadas.
As plaquetas, também conhecidas como trombócitos ajudam a mediar a coagulação
do sangue, o qual é uma malha de fibras de fibrina. As fibras aderem a qualquer abertura
vascular e assim, evitam o agravamento do coágulo de sangue. Ela desempenha um papel
crucial na redução da perda de sangue e reparação de lesão vascular (OYEDEMI et al.,
2010 apud OYEDEMI et al., 2011). A redução dos níveis de plaquetas em ratos diabéticos
induzidos com STZ foi confirmado neste estudo em relação à ratos controle não-diabéticos.
Redução a longo prazo deste parâmetro pode resultar em hemorragia interna e externa
(ADEBAYO et al., 2005; OYEDEMI et al., 2011).
De maneira geral o tratamento com o extrato aquoso de sementes de alpiste não foi
eficaz em prevenir alterações no perfil de hemograma, já que os grupos tratados apresentam
as mesmas alterações do grupo controle negativo. Com relação ao tratamento com o extrato
em animais saudáveis não foi observada alteração nos parâmetros sanguíneos, como pode
ser observado no grupo tratado com maior dose e não exposto a STZ (Tabela 10).
De acordo com Espeschit, (2010), a faixa de variação de Hb sérica para rato é 11 a
19 g/dL. Sendo assim os resultados apresentados neste estudo estão dentro da faixa de
normalidade.
Os níveis de hemoglobina glicada (HbA1) são significativamente aumentados em
animais diabéticos, e este aumento é encontrado diretamente proporcional ao nível de
glicose no sangue em jejum (KOENIG et al., 1976 apud PARI; SATHEESH, 2006).
Durante o diabetes, o excesso de glicose presente no sangue reage com a hemoglobina.
Portanto, o nível total de hemoglobina é diminúida em ratos diabéticos (SHEELA;
AUGUSTI, 1992 apud PARI; SATHEESH, 2006).
A indução com STZ eleva os níveis de hemoglobina glicada, como pode ser
observado no grupo controle negativo e menor dose de extrato aquoso de sementes de
alpiste (Tabela 10). A hemoglobina glicada é um marcador do controle de glicose no
sangue, sendo um parâmetro de análise indireta da média dos níveis de glicose no sangue
205
ao longo dos últimos 120 dias em humanos, o que coincide com o tempo de meia-vida dos
eritrócitos. A glicação ocorrerá em maior ou menor grau, conforme o nível de glicemia
(ANDRIOLO e VIEIRA, 2008; GRUPO INTERDISCIPLINAR 2004; SACKS, 2006 apud
SUMITA e ANDRIOLO, 2008; SUMITA e ANDRIOLO, 2006). A hemoglobina glicada
permanece dentro das hemácias, e sua glicação não-enzimática é determinada
principalmente por três fatores: concentração média da glicose plasmática, tempo de meia-
vida da hemácia e permeabilidade da membrana do eritrócito à glicose (HIGGINS et al.,
1982; CAMARGO e GROSS, 2004).
A formação da hemoglobina glicada ocorre via uma reação de glicação não-
enzimática entre o grupo aldeído livre da glicose, ou outros açúcares, e um grupo amino
livre na molécula da hemoglobina. Esta reação é conhecida como reação de Maillard. A
reação envolve a formação de um composto intermediário instável (base de Schiff,
aldimina ou fração lábil), que se forma rapidamente e é proporcional à concentração de
glicose momentânea (BUNN et al., 1976; CAMARGO e GROSS, 2004). Este composto
sofre, lentamente, o rearranjo de Amadori e forma uma cetoamina estável e irreversível
(proteína glicada/GHb) (CAMARGO e GROSS, 2004).
Nos grupos tratados com as doses intermediária e maior não houve aumento dos
níveis de hemoglobina glicada, sugerindo uma ação protetora do extrato. Porém, o grupo
tratado com maior dose não exposto à indução com STZ também apresenta aumento nos
níveis de hemoglobina glicada.
Os resultados hematológicos demonstraram que os valores de referência dos ratos
da linhagem Wistar foram similares aos valores de referência para humanos, com exceção
da quantidade de hemácias e de plaquetas. Os ratos possuem uma quantidade maior destes
dois parâmetros hematológicos, o que confere maior viscosidade ao sangue e rápida
coagulação.
Assim os índices hematimétricos (VCM, HCM e CHCM) que são calculados a
partir das hemácias, hemoglobina e hematócrito sofrem também uma pequena alteração
quando comparados aos valores de referência para humanos. Já em relação aos parâmetros
bioquímicos, o TGO ou AST, apresenta-se mais elevada, possivelmente pela influência da
anestesia e estresse muscular os quais os ratos são submetidos para a coleta de sangue.
206
5.2.6 Análise de Eletrólitos
O balanço iônico do líquido extracelular é principalmente regulado pelos rins. Para
melhor apreciar a importância destas regulações renais, basta fazer uma listagem parcial
das substâncias inorgânicas simples mais importantes que constituem o meio interno e
quais são reguladas pelo rim: água, sódio, potássio, cloreto, magnésio, sulfato, fosfato e íon
hodrogênio (VANDER et al., 1981 apud JAHN, 2004).
Sódio, potássio e cloro são íons monovalentes e exercem forte efeito iônico no
equilíbrio ácido-básico, sendo denominados de “íons fortes”. Esses íons são utilizados no
cálculo devido a sua importante participação no metabolismo animal, principalmente no
balanço osmótico, balanço ácido-básico, mecanismos de transporte em membrana e
integridade das membranas celulares (BLOCK, 1984).
O balanço dos eletrólitos, especialmente sódio e potássio, realizada pelos rins é
importante na regulação corpórea. Para manter esse balanço normal, a velocidade de
excreção do sódio e do potássio deve ser cuidadosamente controlada, de modo a
corresponder exatamente à sua ingestão diária. Outros eletrólitos também são encontrados
na urina, entre os quais figuram cálcio, magnésio e cloretos (CARNEIRO, 2012).
Entre as várias funções dos eletrólitos se destacam: manter a pressão osmótica e a
distribuição de água nos vários compartimentos do organismo, manter o pH fisiológico,
regular a função apropriada do coração e músculos, envolvimento nas reações de oxidação-
redução (transferência de elétrons) e participar da catálise como cofatores para as enzimas.
Assim sendo, torna-se óbvio que níveis elevados de eletrólitos e oligoelementos podem ser
a causa ou a consequência de várias desordens (MOTTA, 2003).
A urina é uma solução complexa e um meio eficiente para a eliminação de produtos
de excreção do organismo. É a principal rota pela qual se eliminam produtos metabólicos
(uréia e creatinina), minerais (cálcio, fósforo e magnésio), eletrólitos (sódio e potássio) e
água. Desempenha papel importante na regulação do balanço de líquidos e no equilíbrio
entre ácidos e bases. A urina é composta aproximadamente por 95% de água e 2% de uréia.
Nos 3% restantes, encontram-se fosfato, sulfato, amônia, magnésio, cálcio, ácido úrico,
creatina, sódio, potássio e outros elementos. O pH urinário varia como consequência da
manutenção homeostática do equilíbrio acidobásico (DIBARTOLA, 2006).
O transporte de vários solutos através do epitélio renal pode ser feito por mecanismo
passivos a favor de um gradiente eletroquímico ou por processos ativos específicos
207
localizados na membrana da célula tubular. Os vários sistemas de transporte são
independentes e um importante mecanismo como a reabsorção ativa de sódio, que utiliza
uma fração do suprimento energético total do rim, exerce uma significativa influência no
gradiente eletroquímico através do epitélio tubular renal, que passa afetar o transporte
passivo de água e demais solutos, promovendo a energia necessária para a reabsorção de
várias substâncias, como glicose e aminoácidos (MALNIC & MARCONDES, 1986 apud
JAHN, 2004).
Perdas perceptíveis de água corporal são aquelas que são facilmente detectadas,
mensuradas e podem ocorrer por meio do trato urinário e gastrointestinal. Tais perdas de
água normalmente são acompanhadas de perda de eletrólitos, sendo considerada perda
isotônica. A poliúria resulta em aumento das perdas perceptíveis. Um animal normal tem
em torno de 20 a 30 ml/kg/dia de perdas perceptíveis e imperceptíveis. Perdas urinárias e
gastrointestinais resultam em perda de eletrólitos e água, incluindo sódio, potássio, cloreto
e bicarbonato (FLUIDOTERAPIA... 2014). A associação entre a perda de água e eletrólitos
e a ausência de ingestão hídrica adequada pode resultar em desidratação e, por conseguinte,
insuficiência circulatória periférica (PITANGA, 2004 apud SALES, 2011). A poliúria,
aumento gerado no volume urinário, acompanhada da excreção renal de sódio e água, torna
o animal desidratado, desencadeando consequentemente a polidpisia no animal (ÉVORA et
al., 1999 apud SILVA, 2011).
Devido à relação existente entre diabetes e o aumento do fluxo urinário (poliúria),
avaliou-se o perfil de eletrólitos na urina dos animais (Tabela 11).
Tabela 11. Avaliação dos eletrólitos no sangue e na urina dos grupos testados.
Eletrólitos/Grupos ShamControle Negativo
com STZ
Dose 250 mg/kg
com STZ
Dose 500 mg/kg
com STZ
Dose 1000 mg/kg
com STZ
Dose 1000 mg/kg
sem STZ
Na Urina 68,5 ± 12,5 80,6 ± 17,5 85,0 ± 12,7 55,0 ± 11,9 79,1 ± 10,2 40,5 ± 15,0
K Urina 42,3 ± 13,4 62,9 ± 10,2 54,1 ± 11,5 80,4 ± 5,9 55,2 ± 6,6 36,8 ± 1,0
Na Sangue 136,8 ± 0,5 128,8 ± 0,7
***
127,7 ± 0,8
***
127,2 ± 1,1
***
127,5 ± 1,0
***
137,0 ± 0,9
###
K Sangue 4,0 ± 0,1 5,6 ± 0,3 5,6 ± 0,4 5,9 ± 0,5
*
6,1 ± 0,4
*
4,4 ± 0,2
Ca Sangue 1,2 ± 0 1,3 ± 0 1,2 ± 0 1,2 ± 0 1,3 ± 0 1,3 ± 0
Perfil de eletrólitos no sangue e urina dos animais diabéticos (induzidos com STZ, 60 mg/kg i.p) e não
diabéticos, tratados ou não com extrato aquoso de sementes de alpiste por via oral, nas doses de 250, 500 e
1000 mg/kg, por 28 dias. Os resultados são expressos como média ± erro padrão. One way ANOVA, seguido
de teste de Tukey para comparação dos diferentes grupos. * Diferente em relação ao grupo Sham. # Diferente
em relação ao grupo controle negativo. * e # p<0.05; ** e ## p<0.01; *** e ### p<0.001.
208
Alterações da ingestão de líquidos afetam o equilíbrio de eletrólitos no plasma
(CLAUSING e GOTTSCHALK 1989; BOEMKE et al., 1990 apud EVANS, 2009 cap. 12;
HAMMOND et al., 1998).
A glicosúria aumenta o volume urinário excretado (poliúria) e osmolaridade
urinária, levando ao aumento da excreção de água e eletrólitos, como cloreto, sódio e
potássio, processo denominado diurese osmótica (BAILEY, 2011). Além de reduzir a
volemia e causar desidratação, a diurese osmótica acarreta alterações nos túbulos
contorcidos proximais renais, bem como lesão glomerular como consequente prejuízo na
filtração (BAILEY, 2011).
Em geral os animais expostos à STZ apresentam tendência de aumento de sódio e
potássio na urina, o que pode ter relação direta com o aumento do fluxo urinário, já que
grande parte dos processos de reabsorção e excreção de eletrólitos ocorre no rim.
O sódio sob forma ionizada é um dos principais fatores de regulação osmótica do
sangue, plasma, fluidos intercelulares e do equilíbrio ácido-base é essencial à motilidade e à
excitabilidade muscular e na distribuição orgânica de água e volume sangüíneo.
A hipernatremia (excesso de sódio no sangue) ocorre na desidratação hipertônica, no
diabetes insipidus e em comas hiperosmolares, entre outras situações. A hiponatremia pode
se manifestar na síndrome nefrótica, na insuficiência cardíaca, na desidratação hipotônica,
na secreção inapropriada de hormônio antidiurético e em nefropatias com perda de sódio
(FLUIDOTERAPIA... 2014).
As mudanças no equilíbrio hídrico são as principais responsáveis pelas mudanças na
concentração de sódio. A hipernatremia está quase sempre associada à elevação da
osmolaridade no plasma. Ocorre em animais desidratados quando as perdas de água
excedem as perdas de eletrólitos. Observa-se hipernatremia em estágios iniciais de vômito,
diarréia e doença renal, queimaduras cutâneas, causas iatrogênicas (ex. nutrição parenteral,
uso exagerado de diuréticos), respiração ofegante por calor ou exercício físico intenso,
diabetes insipidus, diabetes mellitus, hiperaldosteronismo por tumor adrenal
(FLUIDOTERAPIA... 2014).
A hipocalemia pode ser sequela de doença ou tratamento. Baixos níveis de potássio
estão relacionados com perdas gastrointestinais por vômito ou diarreia, perdas renais por
alteração da função tubular renal, deficiência de potássio na dieta, movimento de potássio
do líquido extracelular (LEC) para o líquido intracelular (LIC) em alcalose aguda, uso
209
exagerado de diuréticos, hiperadrenocorticismo, tratamento inadequado de insulina em
diabéticos. Pode ocorrer pseudohipocalemia em casos de hiperlipidemia, hiperproteinemia,
hiperglicemia e azotemia. Sinais clínicos incluem debilidade muscular, arritmias cardíacas,
poliúria e câimbras. As causas mais comuns de hipercalemia são a translocação de potássio
entre espaços, comprometimento da excreção renal (ex. insuficiência renal crônica,
hipoadrenocorticismo), iatrogênica devido a fluidoterapia com potássio em excesso, uso de
digitálicos ou diuréticos poupadores de potássio (FLUIDOTERAPIA... 2014).
O teste tem utilidade na avaliação do equilíbrio hidroeletrolítico e acidobásico. A
monitorização do potássio sérico auxilia o acompanhamento de indivíduos em terapia com
diuréticos, de nefropatias, principalmente com insuficiência renal, de cetoacetose diabética
e de insuficiência hepática. O exame ajuda a avaliar quadros de hiperaldosteronismo
primário ou secundário e de hipoaldosteronismo.
Os animais induzidos com STZ apresentam diminuição significativa de Na+ no
sangue quando comparados ao controle sem tratamento e sadio. Não houve diferença entre
os grupos diabéticos. Os animais saudáveis tratados com maior dose não apresentaram
diminuição de Na+, havendo diferença em relação ao controle negativo induzido.
O sódio (Na+) é encontrado principalmente no fluido extracelular (FEC), tendo
grande participação na regulação de seu volume e da pressão osmótica (osmolalidade). O
volume do FEC é determinado pela quantidade total corpórea de sódio, ao passo que a
osmolalidade e a concentração de sódio no FEC são determinadas pelo balanço hídrico. Na
regulação do sódio e da água corpórea é de suma importância a influência da aldosterona,
hormômio anti-diurético, angiotensina, catecolaminas e peptídeo atrial natriurético nos rins
(MANUAL ... 2012).
O aumento da concentração plasmática de sódio (hipernatremia) é resultante do
aumento de sua ingestão, ou diminuição do consumo e perda excessiva de água. Ao
contrário, a diminuição da concentração plasmática de sódio (hiponatremia) resulta do
aumento de sua perda ou hiperidratação (MANUAL ... 2012).
Outras causas são: hiperadrenocorticismo (doença de Cushing), restrição ao
consumo de água, intoxicação por sal, perda excessiva de água pura (hiperventilação ou
diabetes insípido), perda de fluidos hipotônicos (insuficiência renal, diurese pós-obstrutiva,
diabetes mellitus) e administração exagerada de soluções hipertônicas e de bicarbonato de
sódio. Os sinais clínicos da hipernatremia podem aparecer quando os níveis plasmáticos
210
estão acima de 170 mmol/L e compreendem em fraqueza, sede extrema, irritabilidade,
depressão, ataxia, mioclonias e coma (MANUAL ... 2012).
Os animais diabéticos tratados com 500 e 1000 mg/kg apresentaram aumento
significativo de K+ no sangue comparados ao controle. Não houve diferença entre os grupos
diabéticos. Os animais saudáveis tratados com menor dose não apresentaram aumento de
K+.
O potássio (K+) é encontrado quase que em sua totalidade no meio intracelular,
sendo que somente 5% estão presentes no FEC. Esse cátion é responsável pelas
manutenções do volume intracelular e do potencial de membrana, e as concentrações
intracelular de potássio e extracelular de sódio são mantidas ativamente pela bomba de
sódio-potássio-ATPase, cuja função é levar o potássio para o interior da célula e o sódio
para o exterior. As alterações nas funções das células eletricamente excitáveis (tecido
nervoso e muscular) iniciam-se em concentrações superiores a 6,5 mmol/L ou abaixo de
2,5mmol/L, quando ocorrem desequilíbrios entre as concentrações intra e extracelulares
desse íon. A regulação da concentração plasmática do potássio é feita principalmente pelos
rins; 90% a 95% é excretado pela urina e 5% a 10% pelas fezes, suor e saliva, sendo que a
aldosterona é o hormônio que participa dessa regulação. A diminuição da concentração
sérica do potássio (hipocalemia, hipopotassemia) é uma das alterações eletrolíticas mais
comuns em pequenos animais, e é devido à ingestão insuficiente, perda excessiva ou
redistribuição do potássio extracelular. Diabetes mellitus (falta de insulina) e uso de ß-
bloqueadores podem elevar os níveis plasmáticos de potássio (MANUAL ... 2012).
O cálcio (Ca) é um mineral que tem importância na manutenção da homeostase,
tendo funções na contração muscular, coagulação sanguínea, atividade enzimática,
excitabilidade neuronal e secreção hormonal, além de ser o componente principal estrutural
do tecido ósseo. O cálcio é regulado pelo paratormônio (PTH), calcitonina e vitamina D,
portanto, alterações nesses hormônios causam o aumento (hipercalcemia) ou a diminuição
(hipocalcemia) do cálcio plasmático. A maior parte do cálcio corpóreo se localiza na matriz
óssea inorgânica (99%), e o restante encontra-se na membrana plasmática e retículo
endoplasmático celular (0,9%) e no FEC (0,1%). Desse total de cálcio extracelular, cerca de
56% correspondem à forma biologicamente ativa desse mineral (cálcio ionizado – Ca2+). O
restante (34%) pode ser dividido em cálcio ligado à proteína albumina e cálcio quelado com
ânions, como por exemplo, citrato, fosfato, bicarbonato e lactato (10%). Essas duas últimas
211
frações, por serem biologicamente inativas, podem sofrer reduções quantitativas, com
diminuição da quantidade total de cálcio, sem que ocorram alterações clínicas
significativas, portanto, faz-se importante a mensuração do Ca2+ (MANUAL ... 2012).
5.2.7 Peso Relativo dos Órgãos
Tabela 12. Efeito do extrato aquoso de sementes de alpiste sobre o peso relativo dos órgãos
dos animais induzidos ou não com STZ.
Órgãos/Grupos ShamControle Negativo
com STZ
Dose 250 mg/kg
com STZ
Dose 500 mg/kg
com STZ
Dose 1000 mg/kg
com STZ
Dose 1000 mg/kg
sem STZ
Coração 0,292 ± 0,010 0,378 ± 0,007
***
0,367 ± 0,007
***
0,373 ± 0,007
***
0,376 ± 0,007
***
0,312 ± 0,009
###
Fígado 3,158 ± 0,124 3,910 ± 0,104 3,949 ± 0,065 3,995 ± 0,052 5,438 ± 1,515 3,257 ± 0,099
Rins 0,592 ± 0,008 0,986 ± 0,026
***
0,998 ± 0,024
***
0,997 ± 0,017
***
0,988 ± 0,029
***
0,595 ± 0,016
###
Baço 0,230 ± 0,009 0,220 ± 0,004 0,221 ± 0,007 0,228 ± 0,012 0,223 ± 0,007 0,236 ± 0,010
Adrenais 0,013 ± 0,002 0,020 ± 0,007
**
0,020 ± 0,001
**
0,019 ± 0,001
*
0,018 ± 0,001 0,012 ± 0,002
###
Peso relativo dos órgãos dos animais normais e diabéticos (induzidos com STZ, 60 mg/kg i.p), tratados ou
não com extrato aquoso de sementes de alpiste por via oral, nas doses de 250, 500 e 1000 mg/kg, por 28 dias.
Os resultados são expressos como média ± erro padrão da relação peso do órgão/100 g de peso do animal.
One way ANOVA, seguido de teste de Tukey para comparação dos diferentes grupos. * Diferente em relação
ao grupo Sham. # Diferente em relação ao grupo controle negativo. * e # p<0.05; ** e ## p<0.01; *** e ###
p<0.001.
Em geral existe aumento do peso relativo do coração, rins e adrenais nos animais
expostos a STZ (Tabela 12). Não foram observadas alterações hepáticas ou esplênicas,
conforme confirmado pelas análises histopatológicas. O tratamento com a maior dose de
alpiste também não levou a alterações de peso de órgãos.
O coração apresenta um esqueleto de tecido conjuntivo que sustenta e dá inserção a
musculatura. Seu aumento, no conteúdo total, tem sido evidenciado com o avanço da idade
e em determinados estados patológicos, tal como o diabetes mellitus. Uma das principais
causas de morte em diabéticos é a isquemia cardíaca devida a lesões das coronárias. Neles
as plaquetas tendem a agregar-se mais facilmente por causa da glicolisação do colágeno, já
que produzem um fator de crescimento que estimula a proliferação das células musculares
dos vasos. Além disso, a glicolisação do colágeno aumenta a espessura da membrana basal,
estreitando os vasos (DINIZ et al., 2011).
Segundo Ortolan et al., (2010) ao pesquisar o rim de ratos induzidos ao diabetes por
STZ evidenciou, após 50 dias da indução, aumento no peso dos rins, no comprimento dos
212
túbulos contorcidos proximais e no comprimento dos túbulos contorcidos distais, os quais
se mostraram anormais no córtex e na faixa externa da medula.
Reinckle et al., (1996), sugerem que talvez a própria hiperinsulinemia, encontrada
com maior acúmulo de gordura visceral, e a hiperatividade do hipotálamo-hipofisário-
adrenal (HHA), estimulariam o aumento do volume das adrenais o que culminaria num
ciclo vicioso: hiperatividade HHA - aumento das adrenais - aumento da gordura visceral -
resistência à insulina - hiperinsulinemia - maior aumento das adrenais.
5.2.8 Histopatologia
O diabetes é uma doença resultante de uma interação variável de fatores hereditários
e ambientais, e é caracterizada por secreção anormal de insulina ou receptor de insulina ou
eventos pós-receptores que afetam o metabolismo, envolvendo carboidratos, proteínas e
lipídeos, além de danificar o fígado, rim e células do pâncreas (BAYNES, 1991; SINGH et
al., 2005).
A STZ por meio da ação de radicais livres produz efeitos tóxicos no pâncreas, rins e
fígado, sendo muitas vezes difícil determinar se a hepatotoxicidade observada é ocasionada
pela hiperglicemia, pelos efeitos tóxicos e específicos da STZ sobre o tecido hepático ou
pela combinação desses dois fatores (OKAWA; DOI, 1983 apud SALES, 2011).
O pâncreas endócrino pode ser avaliado por meio do exame histológico das ilhotas
pancreáticas. As alterações observadas nos cortes histológicos corados por
hematoxilina/eosina são sutis e a avaliação quantitativa, tecnicamente difícil. A porção
endócrina do pâncreas (ilhotas de Langerhans) compreende entre 1% e 2% das células
medindo entre 100 e 200 μm de diâmetro, das quais, no pâncreas normal, 80% são células
β, 15% células α e 4% células δ. As alteraçoes regenerativas das ilhotas podem ser
observadas em animais tratados com químicos diabetógenos, podendo ser observadas em
neonatos, após agressão tóxica. A hiperplasia das ilhotas pode ser observada tanto em
animais com idade avançada (espontaneamente) como em animais tratados com químicos.
Apoptose é um evento comum em animais diabéticos insulino dependentes após tratamento
com múltiplas doses subdiabetogênicas de estreptozotocina. Na administração de
estreptozotocina em dose única e elevada (200mg/kg), esperam-se alterações morfológicas
com destruição completa das células β-pancreáticas, entretanto na administração de 40
mg/kg diariamente, espera-se insulinite por linfócitos. A administração da estreptozotocina
213
provoca lesão grave do pâncreas, tal como uma diminuição do diâmetro das ilhotas do
pâncreas, provavelmente devido a redução do número β células (SEFI, 2011). De acordo
com Chávez et al. (2007), a aplicação de estreptozotocina em ratos produz uma diminuição
no número de ilhotas no pâncreas.
A fim de avaliar possíveis alterações nos animais induzidos com STZ e tratados
com extrato aquoso de sementes de alpiste, os rins, pâncreas e fígados dos animais foram
submetidos à análise histopatológica (Fig. 47). A avaliação foi feita por patologista e de
maneira cega, ou seja, sem identificação dos grupos no momento da análise.
Grupo: Sham (controle)
Fígado: Arquitetura lobular preservada. Hepatócitos distribuídos em trabéculas
radiadas. Discreta congestão sinusoidal em zona 3 acinar. Ausência de depósitos. Leve
fibrose portal. Ectasia de veia centro-lobular. Infiltrado linfocítico leve portal e sinusoidal.
Baço: Congestão discreta com frequentes células gigantes multinucleadas em polpa
vermelha. Rins: Arquitetura córtico-medular preservada. Glomérulos normocelulares.
Discretas alterações degenerativas do epitélio tubular. Pâncreas: Os cortes histológicos
mostram tecido pancreático dentro dos limites da normalidade, com distintos componentes
exócrinos e endócrinos. O componente exócrino, é composto por células epiteliais com
formato piramidal e orientadas radialmente em torno de um lúmem central e o componente
endócrino exibe pequenos aglomerados de células de Langerhans. Várias ilhotas com
grande tamanho, sugerindo hiperplasia. Alguns apresentaram poucas ilhotas de Langerhans,
sugerindo diminuição numérica. Microcistos intra-insulares.
Grupo: Controle Negativo com STZ (sem tratamento)
Fígado: Arquitetura lobular preservada. Hepatócitos distribuídos em trabéculas
radiadas. Discreta congestão sinusoidal em zona 3 acinar. Ausência de depósitos. Alguns
apresentando leve fibrose portal. Ectasia de veia centro-lobular. Infiltrado linfocítico leve
portal e sinusoidal. Baço: Congestão discreta com frequentes células gigantes
multinucleadas em polpa vermelha. Rins: Arquitetura córtico-medular preservada.
Glomérulos normocelulares. Discretas alterações degenerativas do epitélio tubular.
Pâncreas: Os cortes histológicos mostram tecido pancreático dentro dos limites da
normalidade, com distintos componentes exócrinos e endócrinos. O componente exócrino,
é composto por células epiteliais com formato piramidal e orientadas radialmente em torno
214
de um lúmem central e o componente endócrino exibe pequenos aglomerados de células de
Langerhans. Alguns com poucas ilhotas de Langerhans, sugerindo diminuição numérica.
Microcistos intra-insulares. Fibrose focal e focos de apoptose nas ilhotas de Langerhans.
Alteração de tamanho nas ilhotas, sugerindo hiperplasia.
Grupo: Menor dose com STZ (250mg/kg extrato aquoso de sementes de alpiste)
Fígado: Arquitetura lobular preservada. Hepatócitos distribuídos em trabéculas
radiadas. Discreta congestão sinusoidal em zona 3 acinar. Ausência de depósitos. Leve
fibrose portal. Ectasia de veia centro-lobular. Infiltrado linfocítico leve portal e sinusoidal.
Alguns com leve alteração vacuolar hepatocítica Baço: Congestão discreta com frequentes
células gigantes multinucleadas em polpa vermelha. Rins: Arquitetura córtico-medular
preservada. Glomérulos normocelulares. Discretas alterações degenerativas do epitélio
tubular. Pâncreas: Os cortes histológicos mostram tecido pancreático dentro dos limites da
normalidade, com distintos componentes exócrinos e endócrinos. O componente exócrino,
é composto por células epiteliais com formato piramidal e orientadas radialmente em torno
de um lúmem central e o componente endócrino exibe pequenos aglomerados de células de
Langerhans. Alguns com poucas ilhotas de Langerhans, sugerindo diminuição numérica.
Outros com linfonodos. Microcistos intra-insulares. Necrose focal nas ilhotas de
Langerhans.
Grupo: Dose intermediária com STZ (500 mg/kg extrato aquoso de sementes de
alpiste)
Fígado: Arquitetura lobular preservada. Hepatócitos distribuídos em trabéculas
radiadas. Discreta congestão sinusoidal em zona 3 acinar. Ausência de depósitos. Leve
fibrose portal. Ectasia de veia centro-lobular. Infiltrado linfocítico leve portal e sinusoidal.
Alguns com infiltrado linfocítico leve portal e sinusoidal. Moderada alteração vacuolar
hepatocítica. Baço: Congestão discreta com frequentes células gigantes multinucleadas em
polpa vermelha. Rins: Arquitetura córtico-medular preservada. Glomérulos
normocelulares. Discretas alterações degenerativas do epitélio tubular. Pâncreas: Os cortes
histológicos mostram tecido pancreático dentro dos limites da normalidade, com distintos
componentes exócrinos e endócrinos. O componente exócrino, é composto por células
epiteliais com formato piramidal e orientadas radialmente em torno de um lúmem central e
o componente endócrino exibe pequenos aglomerados de células de Langerhans. Alguns
215
com focos de apoptose nas ilhotas de Langerhans. Microcistos intra-insulares. Outros com
linfonodos. Poucas ilhotas de Langerhans, sugerindo diminuição numérica.
Grupo: Maior dose com STZ (1000 mg/kg extrato aquoso de sementes de alpiste)
Fígado: Arquitetura lobular preservada. Hepatócitos distribuídos em trabéculas
radiadas. Discreta congestão sinusoidal em zona 3 acinar. Ausência de depósitos. Leve
fibrose portal. Ectasia de veia centro-lobular. Infiltrado linfocítico leve portal e sinusoidal.
Leve alteração vacuolar hepatocítica. Baço: Congestão discreta com frequentes células
gigantes multinucleadas em polpa vermelha. Rins: Arquitetura córtico-medular preservada.
Glomérulos normocelulares. Discretas alterações degenerativas do epitélio tubular.
Pâncreas: Os cortes histológicos mostram tecido pancreático dentro dos limites da
normalidade, com distintos componentes exócrinos e endócrinos. O componente exócrino,
é composto por células epiteliais com formato piramidal e orientadas radialmente em torno
de um lúmem central e o componente endócrino exibe pequenos aglomerados de células de
Langerhans. Linfonodos. Microcistos intra-insulares. Necrose focal nas ilhotas de
Langerhans. Alguns apresentam poucas ilhotas de Langerhans, sugerindo diminuição
numérica. Outras com focos de apoptose nas ilhotas de Langerhans. Necrose focal nas
ilhotas de Langerhans.
Grupo: Maior dose sem STZ (não diabéticos tratados com 1000 mg/kg extrato
aquoso de sementes de alpiste)
Fígado: Arquitetura lobular preservada. Hepatócitos distribuídos em trabéculas
radiadas. Discreta congestão sinusoidal em zona 3 acinar. Ausência de depósitos. Leve
fibrose portal. Ectasia de veia centro-lobular. Infiltrado linfocítico leve portal e sinusoidal.
Leve alteração vacuolar hepatocítica. Baço: Congestão discreta com frequentes células
gigantes multinucleadas em polpa vermelha. Rins: Arquitetura córtico-medular preservada.
Glomérulos normocelulares. Discretas alterações degenerativas do epitélio tubular.
Pâncreas: Os cortes histológicos mostram tecido pancreático dentro dos limites da
normalidade, com distintos componentes exócrinos e endócrinos. O componente exócrino,
é composto por células epiteliais com formato piramidal e orientadas radialmente em torno
de um lúmem central e o componente endócrino exibe pequenos aglomerados de células de
Langerhans. Alguns apresentaram várias ilhotas com grande tamanho, sugerindo
hiperplasia. Outras poucas ilhotas de Langerhans, sugerindo diminuição numérica.
216
Figura 47. Principais alterações encontradas nas análises histopatológicas do Pâncreas, Fígado e Rins. A:
Pâncreas: hiperplasia da ilhota pancreática (400x); B: Pâncreas: microcistos (400x); C: Pâncreas: necrose,
apoptose e fibrose (200x); D: Diminuição do tamanho das ilhotas pancreáticas; E: Fígado: ectasia ductal
(100x); F: Figado: fibrose portal leve (400x); G: Figado: infiltrado leve sinusoidal (400x); H: Rim: leves
alteraçoes degenerativas do epitélio tubular (400x).
Fonte: CITOCAMP, 2014.
A análise histopatológica mostra que não existem diferenças significativas entre os
grupos induzidos com STZ. Em geral todos os fígados e rins têm algum tipo de lesão, as
quais provavelmente ocorreram na retirada e manipulação do órgão. Esses dados estão de
acordo com os resultados da análise bioquímica, onde também são observadas poucas
alterações significativas nos níveis das enzimas relacionadas à atividade hepática e renal.
Apesar de haver aumento no peso dos rins de grupos que receberam STZ, não existem
alterações morfológicas relacionadas.
Quanto o pâncreas, em geral os animais expostos à STZ apresentam focos de
necrose e apoptose, diminuição numérica de ilhotas de Langerhans, hiperplasia das ilhotas e
microcistos intra-insulares, porém pode-se concluir que a administração de dose única de
STZ (60 mg/kg) não foi suficiente para causar grandes alterações nesse órgão, já que o
laudo final das análises considera o pâncreas morfologicamente normal.
A partir dos dados do experimento de 28 dias após indução de diabetes com dose
única de 60 mg/kg de estreptozotocina pode-se concluir que o tratamento diário com o
extrato aquoso de sementes de alpiste o “leite de alpiste” nas doses de 250, 500 e 1000
mg/kg, por via oral, não preveniu o aumento da glicemia, perda de massa corporal ou
alterações hematológicas e bioquímicas induzidas pela estreptozotocina. Por outro lado, o
tratamento dos animais normais com 1000 mg/kg de “leite de alpiste” por 28 dias não
G
A B C D
E F H
217
promoveu perda de massa corporal ou alterações hematológicas e bioquímicas, o que
sugere ausência de toxicidade.
Como não foi possível ver alterações expressivas além do aumento de glicemia e
perda de massa corporal após 28 dias de experimento, realizou-se um segundo experimento
a longo prazo, por 87 dias, onde comparou-se animais diabéticos não tratados com animais
diabéticos tratados com 1000 mg/kg do extrato, diariamente.
5.3 Avaliação do Extrato Aquoso de Sementes de Alpiste em Modelo
Experimental de Diabetes Induzida por Estreptozotocina – Teste de 87 dias.
O teste de longa duração foi realizado com intuito de observar as possíveis
complicações decorrentes da indução do diabetes e se o tratamento com a maior dose do
extrato exerceria alguma ação protetora.
Ao longo dos 87 dias de experimento os animais induzidos com STZ tratados ou
não com extrato aquoso de sementes de alpiste, apresentaram-se apáticos, com perda
excessiva de massa corporal, pêlos arrepiados e sem brilho, agressividade, odor forte da
urina, poliúria, polidipsia, polifagia, além da perda gradativa da visão (formação de
cataratas) (Fig. 48).
No entanto, estes animais sobreviveram até o final do experimento. Já no grupo não
diabético (Sham) os animais apresentaram-se ativos, com apetite normal, tônus e reflexos
conservados, ganho progressivo de peso e manutenção da ingestão hídrica, ingestão
alimentar e diurese, dentro dos padrões de normalidade para a espécie e em conformidade
com outros trabalhos (BREKKE et al., 1981 apud LERCO et al., 2003).
Figura 48. Comparação entre os tamanhos dos ratos diabéticos (menores) e não diabéticos (maiores).
Fonte: Biotério CPQBA – UNICAMP (OLIVEIRA, 2014).
218
A poliúria, uma das características do estado hiperglicêmico, ocorreu devido ao
aumento elevado da concentração de glicose no filtrado glomerular, excedendo a
capacidade das células tubulares em reabsorvê-la e dando origem à diurese osmótica. Esse
mecanismo tem sido o responsável pela produção de grande volume de urina com elevada
osmolaridade (LERCO et al., 2003). Foi detectada pela presença da cama de maravalha
sempre molhada necessitando a troca diária e redistribuição de menor número de animais
por caixas.
A polidipsia presente nos animais diabéticos deve-se à hiper-osmolaridade
sanguínea, em razão de altos níveis de glicose circulante, que faz a água passar do meio
intracelular para o extracelular, a fim de manter o equilíbrio osmótico. A desidratação
intracelular é percebida pelos osmorreceptores cerebrais, desencadeando sede intensa.
Essas alterações estiveram associadas, ainda, à debilidade geral, pouca atividade, queda de
pêlos, distensão abdominal, catarata bilateral. Esses quadros foram relatados por Lee et al.,
(1972); Ueda et al., (1979); Brekke et al., (1981); Calderon, (1988); Spadella, (1989) e
Breim, (1990) apud Lerco et al., (2003), em estudos com o diabetes induzido por aloxana
ou pela estreptozocina.
Condições hiperglicêmicas em condições experimentais são conhecidas por
causarem alterações lenticulares (KONOSHITA, 1986 apud SINGH et al., 2005). No
diabetes, ocorre aumento das concentrações tanto da frutose quanto do sorbitol, o que pode
acarretar em catarata do diabético. A via do sorbitol, ausente no fígado, é responsável pela
formação de frutose a partir de glicose, e aumenta sua atividade quando aumenta a
concentração de glicose no diabetes, naqueles tecidos que são insensíveis à insulina, isto é,
o cristalino, os nervos periféricos e os glomérulos renais. O sorbitol não se difunde
facilmente através da membrana celular o que ocasiona prejuízo osmótico (MURRAY et
al., 2006). Estas alterações, incluindo o aumento dos níveis de sorbitol, permeabilidade
alterada da membrana, perda de GSH, diminuição dos níveis de aminoácidos e síntese de
proteína diminuída, eventualmente, levam à formação de catarata (POLLOCK et al., 1999;
SINGH et al., 2005). Nos animais deste experimento o surgimento de catarata foi evidente
(Fig. 49).
219
Figura 49. Avaliação oftalmoscópica e comparação dos animais sem alterações e com cataratas.
Fonte: Biotério CPQBA – UNICAMP (OLIVEIRA, 2014).
No experimento de 28 dias os animais não apresentaram alterações nos olhos, já no
teste de 87 dias a maioria apresentou alterações, as quais foram identificadas através do
aparelho oftalmoscópio (Tabela 13). A pontuação e análise da incidência de catarata foram
realizadas com auxílio da médica veterinária Msc. Karin Maia Monteiro.
Tabela 13. Avaliação das alterações nos olhos dos animais do experimento de 87 dias.
Animal Olho Esquerdo Olho Direito Animal Olho Esquerdo Olho Direito
383 +++ opacidade sem alteração 390 sem alteração sem alteração
378 sem alteração ++ opacidade 321 +++ opacidade +++ opacidade
376 + opacidade sem alteração 387 + opacidade aumento de vascularização
323 sem alteração sem alteração 391 + opacidade sem alteração
364 + opacidade + opacidade 397 ++ opacidade +++ opacidade
393 + opacidade + opacidade 320 sem alteração sem alteração
386 + opacidade +++ opacidade 367 + opacidade + opacidade
374 +++ opacidade +++ opacidade 337 aumento de vascularização aumento de vascularização
Animais diabéticos sem tratamento Animais diabéticos tratados com dose 1000 mg/kg
Estudos anteriores demonstraram que os antioxidantes podem retardar
significativamente o desenvolvimento de catarata (POLLOCK et al., 1999; ORHAN et al.,
1999; SINGH et al., 2005), neste estudo não foi observado este efeito.
5.3.1 Massa Corporal
No gráfico abaixo podemos perceber uma pequena variação positiva no grupo de
animais diabéticos que receberam o extrato aquoso de sementes de alpiste na dose de 1000
mg/kg ao longo de 87 dias, porém essa diferença não teve significância estatística nos
tempos avaliados. Ao final de 87 dias a média de massa corporal dos animais não tratados
foi de 288,8 ± 9,5 enquanto que no grupo que recebeu tratamento foi de 307,5 ± 36, valores
que são inferiores ao de animais normais com mesma idade, que é de 513,9 ± 13. Portanto,
pode-se dizer que o menor ganho de massa corporal nos grupos controle negativo e tratados
220
com o extrato está relacionado com a administração de STZ. É de se esperar que os ratos
conforme vão ficando mais velhos, tendem a aumentar sua massa, devido ao metabolismo,
muito parecido com o que ocorre com seres humanos, mas quando induzidos ao diabetes
pela STZ isso acaba gerando efeito contrário, devido a ação tóxica dessa substância (Fig.
50).
D0
D1
D8
D15
D24
D31
D38
D44
D51
D62
D70
D76
D85
0
50
100
150
Controle Negativo com STZ
Dose 1000 mg/kg com STZ
Variação de Massa Corporal
Dias
Vari
açã
o d
a m
ass
a c
orp
ora
l (g
)
Figura 50. Variação de massa corporal durante o estudo de 87 dias.
Variação da massa corporal dos animais diabéticos (induzidos com STZ, 60 mg/kg i.p) e não diabéticos,
tratados ou não com extrato aquoso de sementes de alpiste por via oral, na dose de 1000 mg/kg, por 87 dias.
Os resultados são expressos como média ± erro padrão. Two way ANOVA, seguido de teste de Bonferroni
para comparação dos diferentes grupos.
5.3.2 Glicemia
É notável que ambos os grupos apresentaram níveis glicêmicos elevados ao longo
das semanas de experimento. A administração oral do extrato aquoso de sementes de alpiste
nesta dosagem não alterou os picos glicêmicos, o que sugere que não houve melhoria do
controle da glicemia, ou seja, o extrato não apresentou efeito hipoglicêmico em ratos
diabéticos (Tabela 14). Em ratos Wistar machos normais (sham), após 90 dias de
experimento no biotério, a glicemia aferida é de 92,9 ± 6,6, ou seja, bem abaixo dos valores
obtidos na avaliação do 87º dia de experimento, o que comprova a ação da STZ sobre a
glicemia. Mesmo não tendo sido observada diferença estatística os animais tratados
mostraram uma tendência em diminuir a glicemia comparado ao grupo não tratado.
221
Tabela 14. Efeito do tratamento com extrato aquoso de sementes de alpiste sobre os níveis
de glicose no sangue em animais diabéticos e controle, durante 87 dias de experimento.
Grupos/Dias DO D1 D6 D10 D16 D20 D27 D38
Controle Negativo com STZ 120 ± 0 600,0 ± 0 477,5 ± 20,8 576,5 ± 13,4 506,8 ± 34,0 575,1 ± 16,1 576,0 ± 15,4 573,8 ± 15,4
Dose 1000 mg/kg com STZ 120 ± 0 551,2 ± 48,0 393,2 ± 44,7 427,5 ± 50,2 406,0 ± 43,7 434,0 ± 35,3 489,4 ± 49,6 524,2 ± 52,6
Grupos/Dias D45 D52 D57 D66 D71 D79 D86
Controle Negativo com STZ 599,1 ± 0,9 574,6 ± 14,9 531,1 ± 45,2 573,4 ± 17,3 571,0 ± 14,8 539,4 ± 18,8 600,0 ± 0
Dose 1000 mg/kg com STZ 531,4 ± 48,4 473,0 ± 48,4 485,6 ± 53,0 520,0 ± 44,5 495,9 ± 58,3 515,4 ± 52,0 533,5 ± 61,0
Níveis de glicose sanguínea após jejum em animais diabéticos (induzidos com STZ, 60 mg/kg i.p) e não
diabéticos, tratados ou não com extrato aquoso de sementes de alpiste por via oral, na dose de 1000 mg/kg,
por 87 dias. Os resultados são expressos como média ± erro padrão. Two-way ANOVA, seguido de teste de
Bonferroni para comparação dos diferentes grupos. * Diferente em relação ao grupo Sham.
5.3.3 Consumo de Ração e Água
Com relação ao consumo de ração a diferença entre os grupos é pequena ao longo
das semanas de experimento, havendo uma tendência à diminuição do consumo pelo grupo
tratado a partir da quarta semana. Porém, na 12ª semana os níveis de consumo se igualam
(Fig. 51). Já o consumo de água é muito semelhante entre os grupos, indicando que não há
diferenças significativas nesses dois parâmetros entre os animais não tratados e tratados
com extrato aquoso de sementes de alpiste (Fig. 52). Em ratos Wistar machos normais
(sham), após 90 dias de experimento no biotério, o consumo de ração foi de 200,87g e de
água foi de 260,14mL, valores inferiores aos observados pelos ratos diabéticos.
Consumo de Ração
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120
100
200
300
400Controle Negativo com STZ
Dose 1000 mg/kg com STZ
Semanas
Co
nsu
mo
(g
)
Figura 51. Consumo de ração pelos animais ao longo de 12 semanas (87 dias).
Consumo de ração por animais diabéticos (induzidos com STZ, 60 mg/kg i.p), tratados ou não com extrato
aquoso de sementes de alpiste por via oral, na dose de 1000 mg/kg, por 87 dias. Os resultados são expressos
como média do grupo experimental.
222
Consumo de Água
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120
500
1000
1500
2000Controle Negativo com STZ
Dose 1000 mg/kg com STZ
Semanas
Co
nsu
mo
(m
L)
Figura 52. Consumo de água pelos animais ao longo de 12 semanas (87 dias).
Consumo de água por animais diabéticos (induzidos com STZ, 60 mg/kg i.p), tratados ou não com extrato
aquoso de sementes de alpiste por via oral, na dose de 1000 mg/kg, por 87 dias. Os resultados são expressos
como média do grupo experimental.
5.3.4 Análises Bioquímicas
A exposição a STZ com consequente aumento dos índices glicêmicos eleva também
os níveis das enzimas hepáticas TGO, TGP e ALP. Esse aumento não foi prevenido pelo
tratamento com extrato aquoso de sementes de alpiste por via oral, nos 87 dias, apesar de os
valores para TGO, TGP e ALP terem sido menores nesse grupo. Pode-se observar também
tendência de aumento nos níveis de triglicérides como no teste de 28 dias (Tabela 15).
Tabela 15. Efeito do extrato aquoso de sementes de alpiste em parâmetros bioquímicos.
Análises/Grupos ShamControle Negativo
com STZ
Dose 1000 mg/kg
com STZ
TGO 115,3 ± 11,4 529,7 ± 92,7** 384,1 ± 73,0*
TGP 22,5 ± 0,8 162,6 ± 28,5** 127,2 ± 32,3*
ALP 146,3 ± 10,5 616,7 ± 135,5* 507,7 ± 131,8
Uréia 86,6 ± 42,8 83,7 ± 9,5 88,7 ± 9,5
Creatinina 0,5 ± 0 0,5 ± 0 0,5 ± 0
GGT 5,0 ± 0 6,0 ± 1,0 6,2 ± 1,2
Colesterol 100,0 ± 0 100,6 ± 0,6 100,4 ± 0,4
Triglicérides 90,9 ± 8,0 159,6 ± 15,7* 141,7 ± 16,4
Ácido Úrico 2,9 ± 0,7 2,3 ± 0,2 2,3 ± 0,2
Níveis das diferentes enzimas, colesterol, triglicérides e ácido úrico em animais controle e diabéticos
(induzidos com STZ, 60 mg/kg i.p), tratados ou não com extrato aquoso de sementes de alpiste por via oral,
na dose de 1000 mg/kg, por 87 dias. Os resultados são expressos como média ± erro padrão. One way
ANOVA, seguido de teste de Tukey para comparação dos diferentes grupos. * Diferente em relação ao grupo
Sham. * p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001.
223
TGO, TGP, ALP e enzimas biomarcadoras são usadas como índices dos danos no
fígado (SUBRAMANI et al., 2014). No modelo de diabetes induzido por STZ, o aumento
de TGO e TGP no soro está correlacionado com a diminuição de insulina no sangue, sendo
uma indicação sobre o efeito hepatotóxico de STZ (BARBORA et al., 2002; SUBRAMANI
et al., 2014). A deficiência de insulina leva ao aumento do catabolismo de aminoácidos e,
portanto, fornecimento de substratos para a gliconeogênese. Os níveis destas enzimas
hepáticas não foram reduzidas, mas mostram uma tendência em diminuir em ratos
diabéticos tratados, portanto o tratamento com o “leite de alpiste” nestas doses não pode
proteger os danos do tecido hepático causada por meio de diabetes induzida por STZ.
De acordo com Vasconcelos (2011), a redução no catabolismo de proteína diminui a
captação hepática de aminoácidos e, consequentemente, os níveis séricos de ácido úrico,
uréia, bem como TGO, TGP e ALP (Tabela 15).
Creatinina plasmática é um bom marcador da função glomerular de uréia, e estas
duas medidas nem sempre são simultaneamente aumentadas ou normais (PRAUSE e
GRAUER 1998; MEDAILLE et al., 2004; EVANS, 2009 cap. 4). Além de creatinina
plasmática e uréia nas medições de plasma, as medições de eletrólitos e as proteínas
plasmáticas podem ser indicativos de disfunção renal (EVANS, 2009 cap. 4).
Os resultados de Gutierrez et al., (2014) indicam que o tratamento apenas com o
extrato hexânico de sementes de alpiste reduziu a atividade das enzimas, sugerindo que o
extrato foi eficaz na redução dos efeitos tóxicos da STZ e exerceu papel hepatoprotetor.
Estes resultados sugerem P. canariensis apresenta compostos que impedem o estresse
oxidativo, atuando como um supressor de danos nas células do fígado e inibindo a
progressão da disfunção do fígado pela hiperglicemia induzida crônica. O extrato hexânico
de sementes de alpiste teve um potente efeito sobre a atividade de enzimas antioxidantes no
tecido pancreático, controlando o diabetes. P. canariensis melhorou o metabolismo da
glicose por meio da redução da resistência à insulina e proteção das células β-pancreáticas
do estresse oxidativo, além de exercer atividade hipoglicemiante e regulação lipídica. Além
disso, foi observado efeito hipolipemiantes em camundongos obesos, além de controlar o
ganho excessivo de massa corporal (GUTIERREZ et al., 2014).
224
5.3.5 Hemograma e Hemoglobina Glicada
Diferente do que ocorreu no experimento de 28 dias, aqui pode-se observar um
aumento no número de leucócitos em relação ao grupo não diabético (sham) (Tabela 16).
A leucocitose (aumento de leucócitos por volume de sangue) pode estar relacionada a um
processo inflamatório e é um evento comum no diabetes. Nesses animais também houve
diminuição no número de plaquetas (trombocitopenia), o que pode levar a problemas de
coagulação.
O tratamento com o extrato aquoso de sementes de alpiste por 87 dias não
promoveu modificações em nenhum dos parâmetros relacionados ao hemograma dos
animais, mostrando mais uma vez que não houve ação do extrato contra os efeitos da STZ
(Tabela 16).
Tabela 16. Efeito do extrato aquoso de sementes de alpiste em parâmetros hematológicos.
Análises/Grupos ShamControle Negativo
com STZ
Dose 1000 mg/kg
com STZ
Leucócitos Totais 4,9 ± 1,0 7,4 ± 0,5 7,6 ± 1,2*
Hemoglobina 16,8 ± 0,1 16,9 ± 0,2 16,9 ± 0,3
Plaquetas 910,7 ± 21,4 516,7 ± 131,4* 470,6 ± 140,6*
Hemácias RBC 9,2 ± 0,1 9,5 ± 0,2 9,5 ± 0,2
Hematócritos HCT 49,3 ± 0,5 50,2 ± 1,0 50,4 ± 1,1
MCV 54,2 ± 0,5 52,7 ± 0,5 53,1 ± 0,5
MCH 18,4 ± 0,1 17,8 ± 0,2 17,8 ± 0,2
MCHC 34,1 ± 0,1 33,7 ± 0,4 33,5 ± 0,4
Hemoglobina Glicada 8,0 ± 1,9* 3,7 ± 0,9--
Hemograma de sangue total e perfil de hemoglobina glicada em animais controle e diabéticos (induzidos com
STZ, 60 mg/kg i.p), tratados ou não com extrato aquoso de sementes de alpiste por via oral, na dose de 1000
mg/kg, por 87 dias. Os resultados são expressos como média ± erro padrão. One way ANOVA, seguido de
teste de Tukey para comparação dos diferentes grupos. * Diferente em relação ao grupo Sham. * p<0.05;
**p<0.01; ***p<0.001.
Os níveis de hemoglobina glicada (HbA1) foram significativamente aumentados em
animais diabéticos não tratados, como também observado no teste de 28 dias. Como a
doença progride nestes animais diabéticos sem tratamento, os níveis observados de HbA1
são maiores. No grupo tratado não houve aumento dos níveis de hemoglobina glicada,
sugerindo uma ação do extrato, o valor encontrado ficou muito próximo dos animais
controle não diabéticos (sham) no teste de 28 dias.
225
A grande vantagem do monitoramento da HbA1 está no fato de não sofrer grandes
flutuações, como na dosagem da glicose plasmática, bem como estar diretamente
relacionada ao risco de complicações em pacientes com diabetes tipos 1 e 2. A
determinação dos níveis da HbA1 é a melhor opção para a avaliação do controle glicêmico
em médio e longos prazos (BEM; KUNDE, 2006; LOPES, 2011).
5.3.6 Análise de Eletrólitos
Tabela 17. Avaliação dos eletrólitos no sangue e na urina dos grupos testados.
Eletrólitos/Grupos ShamControle Negativo
com STZ
Dose 1000 mg/kg
com STZ
Na Urina 68,5 ± 12,5 170,7 ± 12,3 ** 197,0 ± 18,6 ***
K Urina 42,3 ± 13,4 110,3 ± 20,7 110,8 ± 21,1
Na Sangue 136,8 ± 0,5 129,2 ± 0,9 ** 132,0 ± 1,8
K Sangue 4,0 ± 0,1 4,9 ± 0,6 4,1 ± 0,4
Ca Sangue 1,2 ± 0 1,3 ± 0 1,2 ± 0
Análise dos eletrólitos da urina e sangue em animais controle e diabéticos (induzidos com STZ, 60 mg/kg
i.p), tratados ou não com extrato aquoso de sementes de alpiste por via oral, na dose de 1000 mg/kg, por 87
dias. Os resultados são expressos como média ± erro padrão. One way ANOVA, seguido de teste de Tukey
para comparação dos diferentes grupos. * Diferente em relação ao grupo Sham. * p<0.05; **p<0.01;
***p<0.001.
Neste experimento, nos animais expostos a STZ (Tabela 17) mostraram aumento da
excreção de sódio na urina e os diabéticos sem tratamento diminuição dos níveis de sódio
no sangue. O aumento da excreção de sódio e potássio está diretamente relacionado com o
aumento do fluxo urinário causado pela administração de STZ.
Quando esse balanço natural de água e eletrólitos, realizado pelos rins, sofre
alterações e passa a ser insuficiente para manter o organismo em homeostasia, levando a
retenção de líquidos, acúmulo de sódio ou potássio, aumento de pressão arterial, entre
outras disfunções, pode ser necessário o uso de diuréticos (GALLAGHER et al., 2006).
Os diuréticos são substâncias que aumentam a velocidade de eliminação da urina. A
maioria dos diuréticos age ao reduzir a intensidade da reabsorção de líquidos nos túbulos. A
principal função dos diuréticos é reduzir a quantidade total de líquido do organismo
(CARNEIRO, 2012). Os diuréticos são especialmente importantes no tratamento de edemas
e da hipertensão arterial sistêmica. Após o uso de um diurético, geralmente a velocidade de
226
perda de sódio na urina aumenta, bem como a velocidade de perda de água. De forma geral,
os diuréticos causam perda acentuada de sódio e potássio pela urina, bem como, aumento
da diurese (KESTER et al., 2008 apud CARNEIRO, 2012; GALLAGHER et al., 2006).
A glicose é filtrada e reabsorvida nos rins, por co-transportadores de sódio; com a
hiperglicemia há uma saturação da capacidade de reabsorção renal e a glicose excedente é
eliminada do organismo através da urina, configurando o quadro de glicosúria
(GANNONG, 2006 apud GUTIERRES, 2011).
A alta ingestão de líquidos (polidipsia) verificada no diabetes pode ser explicada
através do seguinte mecanismo: a desidratação provoca uma redução moderada no volume
do líquido extracelular, porém nos casos de acidose grave, há também uma grande perda de
sódio, levando a redução acentuada do líquido extracelular. A perda de líquidos leva a um
aumento na pressão osmótica e redução no líquido extracelular, que regula a ingestão de
líquidos. A pressão osmótica age via osmorreceptores, localizados no hipotálamo anterior
estimulando a sede. Reduções no volume do líquido extracelular também estimulam a sede
por uma via independente daquela mediada em resposta ao aumento da osmolaridade
plasmática (GUYTON & HALL, 1996 apud GUTIERRES, 2011).
A concentração de sódio no sangue diminui em demasia quando o sódio se diluiu
em excesso por uma quantidade aumentada de água no corpo. O sódio pode diluir-se
excessivamente em indivíduos que bebem enormes quantidades de água, como acontece
algumas vezes em certas perturbações. De qualquer modo, a quantidade de líquido ingerido
ultrapassa a capacidade dos rins para eliminar o excesso. É associada com diferentes
doenças, e quase sempre é resultado de retenção hídrica. Na maioria das vezes, esse
problema é devido à secreção inapropriada do Hormônio Anti diurético (HAD), embora a
excreção de água livre possa estar limitada em algumas situações, como a insuficiência
renal crônica, independente, e do HAD (VIEIRA NETO e MOYSÉS NETO, 2003). A
desidratação produz-se quando a eliminação de água do corpo é maior que o volume
ingerido. A deficiência de água, em geral, provoca um aumento da concentração de sódio
no sangue. Algumas doenças, como o diabetes mellitus, podem ocasionar desidratação
devido às excessivas perdas de água que as caracterizam.
As concentrações de sódio na urina devem ser avaliadas juntamente com os níveis
de sódio no sangue. Os níveis também se podem encontrar elevados na urina quando o
organismo perde demasiado sódio. Neste caso, o nível de sódio no sangue seria normal ou
227
baixo. Níveis de sódio na urina elevados podem indicar consumo de diuréticos (LABTEST,
2010). O extrato de alpiste demonstrou um efeito diurético nos animais tratados.
5.3.7 Peso Relativo dos Órgãos
No experimento de longa duração (87 dias), pode-se notar aumento no peso relativo
do coração, fígado, rins e adrenais, o que está diretamente correlacionado com a evolução
da doença induzida pela STZ. Em geral os grupos diabéticos tratados ou não se comportam
da mesma maneira, sugerindo a não ação do extrato no parâmetro peso dos órgãos (Tabela
18).
Tabela 18. Efeito do extrato de sementes de alpiste sobre o peso relativo dos órgãos dos
animais do experimento de 87 dias.
Órgãos/Grupos ShamControle Negativo
com STZ
Dose 1000 mg/kg
sem STZ
Coração 0,292 ± 0,010 0,356 ± 0,018
*
0,328 ± 0,015
Fígado 2,658 ± 0,124 3,774 ± 0,010
***
3,854 ± 0,169
***
Rins 0,542 ± 0,008 0,970 ± 0,026
***
0,899 ± 0,098
***
Baço 0,210 ± 0,004 0,220 ± 0,015 0,187 ± 0,007
#
Adrenais 0,012 ± 0,001 0,027 ± 0,003
**
0,031 ± 0,004
***
Peso relativo dos órgãos dos animais normais e diabéticos (induzidos com STZ, 60 mg/kg i.p), tratados ou
não com extrato aquoso de sementes de alpiste por via oral, na dose de 1000 mg/kg, por 87 dias. Os resultados
são expressos como média ± erro padrão da relação peso do órgão/100 g de peso do animal. One way
ANOVA, seguido de teste de Tukey para comparação dos diferentes grupos. * Diferente em relação ao grupo
Sham. # Diferente em relação ao grupo controle negativo. * e # p<0.05; ** p<0.01; ***p<0.001.
O peso relativo do fígado é superior em ratos diabéticos por conta da
hepatotoxicidade induzida por STZ (SUGIURA et al., 2006; FERNANDES et al., 2010).
Esses dados estão de acordo com os observados na avaliação dos parâmetros bioquímicos,
onde houve também aumento dos níveis de enzimas hepáticas no soro (Tabela 15).
O aumento de peso dos rins, bem como das adrenais, também pode ser relacionado
ao aumento de eletrólitos, podendo ser sinal de insuficiência renal, embora os níveis de
creatinina e uréia não estejam alterados. De acordo com os dados de hemograma, onde
houve diminuição da contagem de plaquetas no grupo tratado com o extrato, o baço nesse
228
grupo também está diminuído em relação ao grupo diabético sem tratamento, excluindo-se
a possibilidade de aumento de captura de plaquetas por esse órgão, o que levaria à
esplenomegalia.
5.3.8 Histopatologia
A fim de avaliar possíveis alterações nos animais induzidos com STZ e tratados
com extrato aquoso de sementes de alpiste, os rins, pâncreas e fígados dos animais foram
submetidos à análise histopatológica. A avaliação foi feita por patologista e de maneira
cega, ou seja, sem identificação dos grupos no momento da análise.
Grupo: 87 dias Controle Negativo com STZ (sem tratamento)
Fígado: Arquitetura lobular preservada. Hepatócitos distribuídos em trabéculas
radiadas. Discreta congestão sinusoidal em zona 3 acinar. Ausência de depósitos. Ectasia de
veia centro-lobular. Infiltrado linfocítico leve portal e sinusoidal. Alguns tiveram leve
fibrose portal. Leve alteração vacuolar hepatocítica. Baço: Congestão discreta com
frequentes células gigantes multinucleadas em polpa vermelha. Rins: Arquitetura córtico-
medular preservada. Glomérulos normocelulares. Discretas alterações degenerativas do
epitélio tubular. Pâncreas: Os cortes histológicos mostram tecido pancreático dentro dos
limites da normalidade, com distintos componentes exócrinos e endócrinos. O componente
exócrino, é composto por células epiteliais com formato piramidal e orientadas radialmente
em torno de um lúmem central e o componente endócrino exibe pequenos aglomerados de
células de Langerhans. Focos de apoptose nas ilhotas de Langerhans. Alguns apresentaram
linfonodos. Fibrose focal nas ilhotas de Langerhans. Necrose focal nas ilhotas de
Langerhans.
Grupo: 87 dias Maior dose com STZ (1000 mg/kg extrato aquoso de sementes de
alpiste)
Fígado: Arquitetura lobular preservada. Hepatócitos distribuídos em trabéculas
radiadas. Discreta congestão sinusoidal em zona 3 acinar. Ausência de depósitos. Leve
fibrose portal. Ectasia de veia centro-lobular. Alguns tiveram infiltrado linfocítico leve
portal e sinusoidal. Baço: Congestão discreta com frequentes células gigantes
multinucleadas em polpa vermelha. Rins: Arquitetura córtico-medular preservada.
Glomérulos normocelulares. Discretas alterações degenerativas do epitélio tubular.
229
Pâncreas: Os cortes histológicos mostram tecido pancreático dentro dos limites da
normalidade, com distintos componentes exócrinos e endócrinos. O componente exócrino,
é composto por células epiteliais com formato piramidal e orientadas radialmente em torno
de um lúmem central e o componente endócrino exibe pequenos aglomerados de células de
Langerhans. Alguns apresentaram linfonodos.
Hiperglicemia e o estresse oxidativo induzido também podem causar danos às
células do fígado. No estudo de Gutierrez et al., (2014) o extrato hexânico de alpiste P.
canariensis impediu o estresse oxidativo, atuou como um inibidor e eliminador de danos
nas células do fígado relacionadas pela hiperglicemia crônica.
Apesar de alguns estudos demonstrarem que as sementes de alpiste possuem vários
compostos fenólicos importantes à saúde, não significa que eles possam proteger todas as
células e tecidos de todos os tipos de danos oxidativos. Quanto ao desempenho dos
antioxidantes in vivo, este depende de fatores como: tipo de radical formado, local e como
são gerados, análise e métodos para a identificação dos danos e as doses ideais para obter
proteção.
No teste de 87 dias não foram observadas alterações histopatológicas relacionadas
com a administração de STZ, apesar de haver aumento dos níveis de enzimas hepáticas,
uréia, eletrólitos e aumento do peso relativo do fígado e rins, o que poderia sugerir um
comprometimento desses órgãos em decorrência da administração da STZ. Porém, a
alteração nos níveis glicêmicos e a alta incidência de catarata mostra a ocorrência da
doença, permitindo concluir que o extrato aquoso de sementes de alpiste não atuou como
agente hipoglicemiante nas condições avaliadas (tempo, doses, modelo experimental). Por
outro lado, o tratamento com “leite de alpiste” por 87 dias não apresentou sinais de
toxicidade, sendo um potencial material a ser avaliado em outros modelos farmacológicos,
já que não existem dados científicos acerca das propriedades farmacológicas do extrato
aquoso de sementes de P. canarienses.
230
6. CONCLUSÃO
Esperava-se que o tratamento com extrato aquoso de sementes de alpiste controlasse
os níveis glicêmicos, sendo uma alternativa no controle do diabetes, principalmente por
apresentar em sua composição substâncias antioxidantes naturais com atividade captadora
de radicais livres. Porém, a partir dos resultados obtidos nesse estudo conclui-se que o
“leite de alpiste” não controlou os níveis glicêmicos ou efeitos colaterais relacionados ao
diabetes, tais como alterações do perfil de hemograma, bioquímico e de eletrólitos, além de
perda de massa corporal e aumento de ingestão de água e ração. No entanto a avaliação de
hemoglobina glicada mostra-se alterada positivamente nos animais diabéticos tratados com
a maior dose no teste de 87 dias. Por outro lado, pode-se concluir que o tratamento diário
com o “leite de alpiste” não promoveu sinais de toxicidade, o que aponta o extrato aquoso
de sementes de alpiste como um potencial a ser explorado, avaliando-se outras atividades
farmacológicas.
Esse estudo foi de extrema importância, já que existem diversos relatos populares
sobre os benefícios do consumo do “leite de alpiste” e a diminuição da glicemia em pessoas
diabéticas, porém há pouca bibliografia científica relacionada com essas ações ou até
mesmo com a composição nutricional desse material.
Frente a essa análise, pode-se dizer que ingerir unicamente o “leite de alpiste” a fim
de reduzir os índices glicêmicos parece ser um mito. Estudos complementares deverão ser
realizados para suportar essa hipótese.
231
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ADEBAYO, O.J.; ADESOKAN, A.A.; OLATUNJI, L.A.; BUORO, D.O.; SOLADOYE,
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247
CONCLUSÃO GERAL
Por meio desse estudo pode-se dizer que o alpiste e seu extrato aquoso apresentam:
Elevados teores de proteínas;
Semente com elevados teores de fibras totais;
Alta quantidade de amido nas sementes;
Fonte rica de ω – 6;
Com base na avaliação da composição centesimal pode ser um
possível substituto de outros grãos nas formulações, como gergelim, aveia e trigo;
Possui atividade antioxidante intermediária, comparada com outros
alimentos, podendo ser considerada fonte moderada de acordo com ensaios físicos-
químicos;
Não apresentou toxicidade aguda no ensaio in vivo em ratos Wistar;
Nos ensaios de 28 e 87 dias o extrato não apresentou melhora em
animais diabéticos tratados em relação: ao ganho de massa corporal, redução do
índice glicêmico;
Houve constante aumento no consumo de ração e água, além do
aumento da poliúria dos animais diabéticos tratados com o extrato comparados aos
animais diabéticos;
Nas análises bioquímicas, hemograma, hemoglobina e eletrólitos os
animais diabéticos tratados com o extrato apresentaram valores próximos aos
animais diabéticos;
Aumento do peso relativo dos principais órgãos afetados pela doença;
Não foram observadas alterações histopatológicas oriunda da STZ,
porém os animais do teste de 87 dias apresentaram perda visual (cataratas);
O extrato aquoso de sementes de alpiste não demonstrou atividade
antioxidante relevante e consequentemente não eficiente para combater o diabetes
induzido por estreptozotocina em ratos Wistar machos nas doses aplicadas.
248
249
SUGESTÃO PARA TRABALHOS FUTUROS
Este grupo de pesquisa sentiu-se motivado a investigar uma matriz vegetal pouco
estudada como é a semente de alpiste. Porém, em uma pesquisa científica coerente, é
necessário delimitar os objetivos do trabalho de modo a torná-lo executável dentro de um
determinado prazo. Sendo assim, esta dissertação, se torna o primeiro passo de muitos
trabalhos futuros, como os apontados a seguir:
Identificar os compostos fenólicos presentes nas sementes e extrato
do alpiste por HPLC e LC-MS/MS;
Analisar a presença de compostos fitoquímicos (fitatos) na água do
molho;
Realizar a extração com outros tipos de solventes e avaliar sua
atividade antioxidante;
Analisar o perfil de aminoácidos;
Identificar os principais minerais e vitaminas;
Identificar o conteúdo de fibras totais, quais são solúveis e insolúveis;
Analisar amidos modificados;
Realizar ensaios biológicos mais abrangentes sobre a
biodisponibilidade e bioacessibilidade desses compostos, enfatizando outras
doenças, tais como câncer, hipertensão, obesidade, infecções e benefícios dessa
semente, assim como trabalhar com outras concentrações;
Avaliar a questão da toxicidade da casca do alpiste;
Avaliar a utilização de alpiste para confecção de farinhas e alimentos
que requerem alta quantidade de amido na sua formulação;
Testar a substituição em formulações com o uso de gergelim para
alpiste.
250
251
APÊNDICE
Abaixo apresenta-se a composição centesimal da ração comercial utilizada na
alimentação dos animais no ensaio biológico.
Tabela A.1. Composição centesimal da ração comercial.
Componentes Ração Comercial
Umidade 9,71 ± 0,002
Cinzas 8,13 ± 0,17
Proteínas (N=6,25) 17,00 ± 0,92
Lipídeos 6,45 ± 0,15
Carboidratos 58,64 ± 0,07
Tabela A.2. Perfil de ácidos graxos presente na fração lipídica da ração comercial.
Ácidos Graxos % Amostra Ração Comercial
- C12:0 láurico 0,0657
- C14:0 mirístico 0,19451
- C15:0 pentadecanóico 0,05239
- C16:0 palmítico 16,3928
- C16:1 palmitoléico 0,15577
- C17:0 margárico 0,08375
- C17:1 cis-10-heptadecenóico 0,04775
- C18:0 esteárico 2,60609
- C18:1 oléico 28,09833
- C18:2 linoléico 46,53609
- C18:3 trans t-linolênico 4,16835
- C20:0 araquídico 0,5021
- C20:1 eicosenóico 0,38986
- C22:0 behênico 0,33733
- C24:0 lignocérico 0,36917
Em relação ao perfil da ração comercial os resultados obtidos neste estudo que se
destacam são: 46% ácido linoleico, 27% de oleico, 16% palmítico e 4,2% trans linolênico,
próximos ao do alpiste.
252
253
ANEXO 1
254
ANEXO 2
255
ANEXO 3
Composição centesimal observada na embalagem da ração comercial utilizada na
alimentação dos animais no ensaio biológico.
Nutriente Nível de Garantia (g/kg)
Proteína bruta (min) 220
Cálcio (min) 10
Cálcio (máx) 14
Fósforo (min) 8.000
Extrato etéreo (min) 40
Matéria fibrosa (máx) 80
Matéria mineral (máx) 100
Umidade (máx) 120
Composição centesimal da ração comercial.
256
ANEXO 4
Alguns Parâmetros de Ratos Wistar
As faixas para ratos (Wistar) de 7 a 14 semanas
Dados eritrocítico
Contagem de eritrócitos (RBC) (1012 / L) 6 a 9
A hemoglobina (g / dl) 11 a 17
Hematócrito (razão) 0,38-0,50
Volume celular médio (VCM) (fl) 50-62
Hemoglobina corpuscular média (HCM) (pg) 17 a 22
Concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM) (g / dl) 31 a 36
Dados leucocitária
Contagem de leucócitos total (WBC) (10 9 / L) 4 a 17
Dados de plaquetas
A contagem de plaquetas (109 / L) 800 de 1400
As faixas para ratos (Wistar, com idades 6-12 semanas)
Teste Unidade SI Variam em Unidades SI Unidade não-SI Variam em
Unidades não-SI
Colesterol, o total mmol / L 0,51-2,85 mg / dL 20-110
Creatinina mol / l 9-70 mg / dL 0,1-0,8
Glicose mmol / L 7,77-12,21 mg / dL 140-220
Potássio mmol / L 4,0-6,0 meq / L 4,0-6,0
Triglicérides mmol / L 0,56-2,23 mg / dL 50-200
Sódio mmol / L 138-152 meq / L 138-152
Uréia mmol / L 4,28-8,57 mg / dL 12-24
Enzimas
ALT UI / L 10-80
AST UI / L 20-100
ALP UI / L 70-450
GGT UI / L 0-4
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