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7/25/2019 Caracterizacin De Materia Orgnica Disuelta Proveniente De Efluentes De Pisciculturas.pdf
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CARACTERIZACIN DE MATERIA ORGNICA DISUELTA PROVENIENTE DEEFLUENTES DE PISCICULTURAS, MEDIANTE ESPECTROSCOPA DE
FLUORESCENCIA
PROFESOR PATROCINANTEDR. JORGE NIMPTSCH MAASS
UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE
PROFESOR CO-PATROCINANTE
DR. STEFAN WOELFLUNIVERSIDAD AUTRAL DE CHILE
PROFESOR INFORMANTEDR. FRANCISCO ENCINA MONTOYA
UNIVERSIDAD CATOLICA DE TEMUCO
TESIS PRESENTADA COMO REQUISITO PARAOPTAR AL TTULO DE BILOGO MARINO.
SEBASTIN IGNACIO OSORIO RUZ
Valdivia, Mayo 2014
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Tabla de Contenido
1. Resumen ............................................................................................................................. 1
2. Abstract ............................................................................................................................... 2
3. Prologo ............................................................................................................................... 3
4. Introduccin ........................................................................................................................ 3
4.1 Salmonicultura en Chile ................................................................................................... 3
4.2 Ciclo de vida de salmnidos en cautiverio ....................................................................... 5
4.3 Sistemas actualmente en uso para la produccin de smolts de salmnidos en Chile ....... 7
4.4 Efectos de la contaminacin general de la piscicultura .................................................... 9
4.5 Materia orgnica en sistemas acuticos .......................................................................... 114.6 Materia Orgnica Disuelta (DOM) ................................................................................. 12
4.7 Materia Orgnica Disuelta Fluorescente ........................................................................ 13
4.8 Medicin e identificacin de DOM a travs de tcnicas de Espectroscopia deFluorescencia ........................................................................................................................ 19
4.8.1 Espectrofluormetros .................................................................................................. 20
4.8.2 Correccin espectral, correccin de filtro interno, normalizacin y sustraccin delblanco para realizar mediciones de fluorescencia comparables entre las muestras, estudios y
espectrofluormetros ............................................................................................................ 224.9 ndices de Fluorescencia ................................................................................................. 28
4.10 PARAFAC .................................................................................................................... 30
4.11 Efectos ambientales sobre la fluorescencia de DOM y seguimiento de DOM en aguasnaturales y efectos de la contaminacin antropognica ....................................................... 32
5. Hiptesis ........................................................................................................................... 34
6. Objetivos ........................................................................................................................... 34
6.1 Objetivo general ............................................................................................................. 34
6.2 Objetivos especficos ...................................................................................................... 34
7. Materiales y Mtodos ....................................................................................................... 36
7.1. Metodologa ................................................................................................................... 36
7.2. Preparacin de las muestras para el anlisis ptico y fluoromtrico de DOM, DOC y N-P inorgnicos ........................................................................................................................ 38
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7.3 Parmetros de calidad del agua ...................................................................................... 38
7.4 Experimentos de incubacin y dilucin.......................................................................... 40
7.5 Metodologa de anlisis ptico y fluoromtrico de DOM .............................................. 43
7.6 Anlisis PARAFAC ........................................................................................................ 44
8. Resultados ......................................................................................................................... 45
8.1 Validacin del modelo .................................................................................................... 45
8.2 Descripcin de los componentes .................................................................................... 51
8.2.1 Componente 1, Similar a Tirosina ............................................................................... 52
8.2.2 Componente 2, Similar a Triptfano ........................................................................... 53
8.2.3 Componente 4 .............................................................................................................. 54
8.2.4 Componente 3, Similar a cidos Hmicos ................................................................. 56
8.3 Relacin entre los componentes y los ndices de Fluorescencia .................................... 66
8.4 Correlacin entre los parmetros fsico-qumicos y los componentes ........................... 70
8.5 Correlacin entre las concentraciones de N y P, DOC y los componentes .................... 76
8.6 Experimentos de incubacin y dilucin.......................................................................... 86
9. Discusin .......................................................................................................................... 91
10. Conclusin .................................................................................................................... 102
11. Bibliografa ................................................................................................................... 105
11.1 Pginas web ................................................................................................................ 11512. Anexos .......................................................................................................................... 116
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ndice de Figuras
Figura 1 . Ciclo de vida del salmn Atlntico (Salmo salar) (Fuente: Sistemas de
Produccin de Smolts en Chile Nieto et al. 2010. Basado en Atlantic Salmon Federation
2010). ...................................................................................................................................... 6
Figura 2. Etapas del desarrollo juvenil de Salmo salar. (a) Alevn con saco vitelino casi
absorbido, (b) Pez Fry, (c) Pez Fingerling, (d) Pez Parr y (e) Pez Smolt. (Fuente: Bjrnsson
et al. 2012) .............................................................................................................................. 6
Figura 3. Esquema de un proceso estndar de produccin de salmones (Salmo salar)
(Fuente: FAO 2014)2. ............................................................................................................. 7
Figura 4. Relacin entre la materia orgnica disuelta presente en los ecosistemas acuticos,
y la fraccin de la materia orgnica disuelta pticamente activa. ........................................ 14
Figura 5. Diagrama de los niveles electrnicos y vibracionales de una molcula (Fuente:
Hudson et al., 2007) .............................................................................................................. 16
Figura 6. Estructuras de los compuestos orgnicos de triptfano, tirosina y fenilalanina
(Fuente: Hudson et al. 2007. Basado en A spectral database of organic fluorophores by
Colin A. Stedmon)3. ............................................................................................................. 17
Figura 7. Esquema de las categoras de las sustancias hmicas presentes en DOM y que se
definen qumicamente por su solubilidad a diferentes pH ................................................... 18Figura 8. Estructuras tericas de los fluorforos orgnicos de (a) un cido hmico y (b) un
cido flvico (Fuente: Hudson et al., 2007. Basado en Aitken et al., 1985) ........................ 18
Figura 9. Ejemplo de una matriz tridimensional de excitacin y emisin (EEM) ............... 20
Figura 10. Componentes de un espectrofotmetro de fluorescencia .................................... 21
Figura 11. (a) Efectos de filtro interno primario y secundario en una muestra (b) Frmula
utilizada para la correccin de la absorbancia de la luz en una medicin de fluorescencia . 23
Figura 12. Estados vibracionales de una molcula y su respuesta frente a la interaccin con
un haz de luz. En Rayleigh no hay cambio en la energa de la luz incidente con la luz
emitida. En los Raman Stokes la luz dispersada tiene menor energa que la luz incidente
(menor frecuencia). En los Raman anti-Stokes, la luz dispersada tiene mayor energa que la
luz incidente (mayor frecuencia) .......................................................................................... 25
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Figura 13. (a) Tpico espectro de emisin de fluorescencia con los diferentes peaks
marcados. La escala de la abscisa superior es la longitud de onda en nm y la escala de la
abscisa inferior es la frecuencia en cm-1. (b) Grfico de contorno de un EEM con los
respectivos efectos de las dispersiones (Fuente: Larsson et al., 2007). ................................ 26
Figura 14. Peak de Raman visible en una muestra de agua fresca Milli-Q en unidades
arbitrarias (A.U.) (Fuente: Lawaetz et al., 2009).................................................................. 27
Figura 15. Ilustracin de la sustraccin del blanco, eliminando los ruidos de medicin, la
mayora de los efectos por dispersin y la interpolacin de los datos en las regiones de no
fluorescencia ......................................................................................................................... 28
Figura 16. Localizacin de los ndices basados en fluorescencia con respecto a sus
longitudes de onda de emisin y excitacin correspondientes ............................................. 30
Figura 17. : Ilustracin de los valores obtenidos por medicin de la espectroscopa defluorescencia, los resultados del modelo de anlisis PARAFAC y los residuos entre los
valores medidos y los resultados de un modelo ................................................................... 32
Figura 18. Balance teortico masas de carbono, nitrgeno y fsforo en sistemas de
pisciculturas (Fuente: Olsen et al, 2008). ............................................................................. 33
Figura 19. Mapa general del rea de estudio, con los respectivos puntos de muestreo
ubicados en el Rio Molco en la IX Regin de la Araucana, Chile. ..................................... 37
Figura 20. Experimento de dilucin y sus respectivos porcentajes ...................................... 41
Figura 21. Experimento de incubacin ................................................................................. 42
Figura 22. Espectrofluormetro Perkin Elmer Luminescence Spectrometer LS50B y
espectrofotmetro de absorbancia Spectroquant Pharo 300 Merck ..................................... 45
Figura 23. Validacin del modelo de 4 componentes, por medio de la funcin
SplitHalfValidation en MatLab mediante el DOMFluorToolbox. Esta funcin compara
automticamente las cargas de excitacin y de emisin de diferentes modelos desplit-half y
determina si son iguales o no. ............................................................................................... 47
Figura 24. Evaluacin del ajuste de un modelo PARAFAC a travs de la comparacin entre
la medicin de una EEM (arriba a la izquierda), el modelo a validar (en medio a la
izquierda) y los residuos (diferencia entre lo medido y el modelado de datos) (abajo a la
izquierda). ............................................................................................................................. 47
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Figura 25. Comparacin entre un modelo de 4 componentes con outliers (muestra 148, 149
y 150) (a) y un modelo de 4 componentes sin outliers (b). .................................................. 48
Figura 26. Comparacin de los espectros de emisin y excitacin entre dos (a), tres (b) y
cuatro (c) componentes. ........................................................................................................ 49
Figura 27. Comparacin de la suma espectral de las desviaciones al cuadrado entre las
cargas de excitacin y emisin de los anlisis split-half para los modelos de 2, 3 y 4
componentes. ........................................................................................................................ 50
Figura 28. Forma en que la funcin SplitData divide los datos en dos mitades para el
anlisissplit-halfy usar el mejor ajuste para la validacin del modelo de componentes .... 50
Figura 29. Componente 1, grfico de contorno .................................................................... 52
Figura 30. Componente 1, grfico de superficie .................................................................. 53
Figura 31. Componente 2, grfico de contorno .................................................................... 54Figura 32. Componente 2, grfico de superficie .................................................................. 54
Figura 33. Componente 4, grfico de contorno .................................................................... 55
Figura 34. Componente 4, grfico de superficie .................................................................. 55
Figura 35. Componente 3, grfico de contorno .................................................................... 57
Figura 36. Componente 3, grfico de superficie .................................................................. 57
Figura 37. Variacin espacial de DOM a lo largo del Rio Molco, durante el mes de Agosto
.............................................................................................................................................. 58
Figura 38. Variacin espacial de DOM a lo largo del Rio Molco, durante el mes de Octubre
.............................................................................................................................................. 59
Figura 39. Variacin espacial de DOM a lo largo del Rio Molco, durante el mes de
Noviembre ............................................................................................................................ 59
Figura 40. Variacin espacial de DOM a lo largo del Rio Molco, durante el mes de
Diciembre ............................................................................................................................. 60
Figura 41. Variacin espacial de DOM a lo largo del Rio Molco, durante el mes de Enero 60
Figura 42. Aporte porcentual de los componentes en el mes de Agosto .............................. 62
Figura 43. Aporte porcentual de los componentes en el mes de Octubre ............................ 62
Figura 44. Aporte porcentual de los componentes en el mes de Noviembre ....................... 63
Figura 45. Aporte porcentual de los componentes en el mes de Diciembre ........................ 63
Figura 46. Aporte porcentual de los componentes en el mes de Enero ................................ 64
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Figura 47. Intensidades mximas de los fluorforos presentes en la estacin Molco
Efluente, a travs de los meses de monitoreo ....................................................................... 65
Figura 48. Variacin en los ndices de fluorescencia (FI, : y HIX), con respecto a las
estaciones en el mes de Agosto ............................................................................................ 66
Figura 49. Variacin en los ndices de fluorescencia (FI, : y HIX), con respecto a las
estaciones en el mes de Octubre ........................................................................................... 67
Figura 50. Variacin en los ndices de fluorescencia (FI, : y HIX), con respecto a las
estaciones en el mes de Noviembre ...................................................................................... 67
Figura 51. Variacin en los ndices de fluorescencia (FI, : y HIX), con respecto a las
estaciones en el mes de Diciembre ....................................................................................... 68
Figura 52. Variacin en los ndices de fluorescencia (FI, : y HIX), con respecto a las
estaciones en el mes de Enero .............................................................................................. 68Figura 53. Correlacin entre la conductividad y los componentes similar a tirosina y similar
a triptfano en los meses de muestreo .................................................................................. 71
Figura 54. Correlacin entre el oxgeno disuelto y los 4 componentes validados por
PARAFAC en los meses de muestreo .................................................................................. 72
Figura 55. Correlacin entre la turbidez total y los componentes similar a tirosina y similar
a triptfano en los meses de muestreo .................................................................................. 74
Figura 56. Variabilidad de la conductividad monitoreada cada 10 minutos en la estacin
Molco Cabaas ..................................................................................................................... 75
Figura 57. Correlacin entre el ortofosfato y los componentes similar a tirosina y similar a
triptfano en los meses de muestreo ..................................................................................... 77
Figura 58. Correlacin entre el fosforo total y los componentes similar a tirosina y similar a
triptfano en los meses de muestreo ..................................................................................... 78
Figura 59. Correlacin entre el amonio y los componentes similar a tirosina y similar a
triptfano en los meses de muestreo ..................................................................................... 79
Figura 60. Correlacin entre el nitrito y los componentes similar a tirosina y similar a
triptfano en los meses de muestreo ..................................................................................... 80
Figura 61. Correlacin entre el nitrato y los componentes similar a tirosina y similar a
triptfano en los meses de muestreo ..................................................................................... 81
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Figura 62. Correlacin entre el nitrgeno inorgnico y los componentes similar a tirosina y
similar a triptfano en los meses de muestreo ...................................................................... 82
Figura 63. Correlacin entre el nitrgeno orgnico y los componentes similar a tirosina y
similar a triptfano en los meses de muestreo ...................................................................... 83
Figura 64. Correlacin entre el nitrgeno total y los componentes similar a tirosina y
similar a triptfano en los meses de muestreo ...................................................................... 84
Figura 65. Correlacin entre el carbono orgnico disuelto y los componentes similar a
tirosina y similar a triptfano en los meses de muestreo ...................................................... 85
Figura 66. Variacin de los componentes a travs de las horas que dur el experimento de
incubacin ............................................................................................................................. 86
Figura 67. Comparacin entre los resultados obtenidos en el experimento de dilucin y el
promedio de los componentes en el mes de Noviembre ...................................................... 87Figura 68. Comparacin entre los resultados obtenidos en el experimento de dilucin y el
componente similar a tirosina ............................................................................................... 87
Figura 69. Comparacin entre los resultados obtenidos en el experimento de dilucin y el
componente similar a triptfano ........................................................................................... 88
Figura 70. Comparacin entre los resultados obtenidos en el experimento de dilucin y el
componente similar a cidos hmicos .................................................................................. 88
Figura 71. Comparacin entre los resultados obtenidos en el experimento de dilucin y el
componente similar a protena .............................................................................................. 89
ndice de Tablas
Tabla 1. Fechas y puntos muestreados en el Rio Molco, IX Regin de la Araucana, Chile.
.............................................................................................................................................. 36
Tabla 2. Coordenadas geogrficas de los puntos de muestreo en el Rio Molco en la IX
Regin de la Araucana, Chile. ............................................................................................. 37
Tabla 3. R2 de los 4 componentes validados por PARAFAC y su correlacin con el oxgeno
disuelto ................................................................................................................................. 73
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Agradecimientos
Se agradece a la Comisin Nacional de Ciencia y Tecnologa (CONICYT) y al proyecto
FONDECYT 1130132 como fuente de financiamiento.
En primer lugar quiero agradecer a mi madre por estar siempre conmigo brindndome ese
apoyo moral y fraternal que solo ellas pueden entregar, tambin a mi padre por ayudarme
cuando no tena con que sustentarme, por velar a que no pasara hambre ni frio. A mi
familia por estar siempre en las buenas y en las malas, por su constante alegra y siempre
tender ese abrazo incondicional y amigable que no busca nada a cambio, esa cosa que
llamamos de corazn. Les agradezco por ensearme a que no importa cuntas veces puedes
caerte en esta vida, mientras exista la unin y el cario ms all de las fronteras del rencor y
egocentrismo.
A la seora Anglica Aguilar directora de la DAE y al profesor, ex vicerrector de la
Universidad Austral, don Oscar Galindo, que sin su ayuda el culmine de esta etapa no
hubiera sido posible, gracias por la comprensin y el apoyo.
A mi profesor patrocinante, Jorge Nimptsch y al profesor co-patrocinante Stefan Woelfl,
por colaborar y traspasar conocimiento constante a quienes participan e interactan con
ellos en el laboratorio, por brindar apoyo y empata con las personas con quienes trabajan,
cosa que mucha falta hace hoy en da.
A mis compaeros de esta aventura universitaria, que sin duda, no hubiera sido tan
entretenida sin ellos. A las personas con las que comparto la conviccin de un mejor
maana, ms justo y ms noble, en donde la competencia por opacar al compaero o colega
sea cambiada por una visin ms holstica, de fraternidad y colaboracin. Donde el
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conocimiento sea traspasado a cualquier persona sin importar su condicin social o
econmica, ms all de una publicacin en una revista de prestigio o entre 4 paredes.
Y finalmente quiero agradecer al motor de mi vida, a mi hijo Salvador, que gatillo un
cambio sustancial en mi forma de ver el mundo, ese esfuerzo constante, el saber que todo lo
que merece la pena cuesta trabajo conseguirlo y que nada de lo que de verdad importa es
fcil. Gracias por ensearme algo fundamental en estos aos de vida... el amor no es
perfecto sino incondicional...
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1. Resumen
La alta calidad fsico-qumica del ambiente fluvial y lacustre presente en el Sur de Chile,
constituyen un rasgo fundamental en sus estructuras de equilibrio ecolgico y flujos de energa.Sin embargo, el cultivo intensivo de peces en tierra por medio del sistema de flujo abierto
utilizado en la salmonicultura, prev una serie de efectos potenciales sobre el medio ambiente que
lo sustenta, siendo principalmente la contaminacin generada por los efluentes de las
pisciculturas, los cuales transportan heces, desperdicios de comida no consumida y subproductos
metablicos, aportando una fuerte entrada de materia orgnica e inorgnica disuelta hacia los
ros, contribuyendo directa e indirectamente al estado trfico del ecosistema acutico. La materia
orgnica disuelta (DOM) es un componente ubicuo en las aguas naturales, que afecta el
funcionamiento biogeoqumico de los sistemas acuticos. La espectroscopa de fluorescencia es
una herramienta de monitoreo ecolgica eficaz, precisa y representativa, capaz de brindar una
mayor informacin acerca de la composicin, concentracin y origen de DOM, permitiendo
observar sus reacciones y distribucin tras la incorporacin de residuos orgnicos provenientes en
este caso de una piscicultura, comparando las variaciones cuantitativas y cualitativas de los
componentes fluorescentes especficos evaluados mediante el anlisis estadstico PARAFAC
entre aguas naturales y las aguas contaminadas. El potencial para la caracterizacin y
cuantificacin de DOM, nos permite dar un enfoque de la naturaleza y comportamiento de DOM,
como tambin la importancia de la fuente que la precede, permitiendo tener una interpretacin y
validacin de los fluorforos obtenidos, y aplicarlos como un indicador de la calidad del agua y
facilitar la compresin de los datos fsicos, qumicos y biolgicos utilizados comnmente para
evaluar el estado ambiental de los cuerpos de agua, mediante programas de monitoreo.
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2. Abstract
The high quality of the fluvial and lacustrine environment in terms of physic-chemical properties
in southern Chile, are a fundamental feature in their structures of ecological balance and energy
flow. However, intensive fish farming in land based flow-through aquaculture system used in the
salmon farming, provides a number of potential effects on the environment that sustains it, being
mostly pollution from the effluents of fish farms, which transport feces, uneaten food wastes and
metabolic byproducts, providing a strong influx of dissolved organic and inorganic matter into
rivers. This contributes directly and indirectly to the trophic state of the aquatic ecosystem. The
dissolved organic matter (DOM) is a ubiquitous component of natural waters, which affects the
biogeochemical functioning of aquatic systems. Fluorescence spectroscopy is an effective,
accurate, representative and ecological friendly tool for monitoring freshwater systems, being
able to provide information about the composition, concentration and origin of DOM, allowing to
observe their reactions and distribution after the incorporation of organic residues (i.e. fish
farming outfall), comparing the quantitative and qualitative variations in specific fluorescent
components evaluated by statistical analysis PARAFAC between natural waters and
contaminated waters. The potential for characterization and quantification of DOM, allows us to
approach the nature and behavior of DOM, including the importance of the source that precedes
it, allowing to have an interpretation and validation of the fluorophores obtained, apply as an
indicator of water quality and facilitate the understanding of the physical, chemical and biological
data commonly used to assess the environmental status of water bodies by monitoring programs.
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3. Prologo
Es paradjico que una actividad que se inici hace 25 aos atrs para aprovechar la alta calidad
ambiental de los lagos y ros del sur de Chile constituya hoy una amenaza creciente para su
conservacin.
4. Introduccin
Los cuerpos de agua continentales presentes en el Sur de Chile, forman una extensa red de
sistemas hdricos con caractersticas ecolgicas distintivas y nicas (Armesto et al., 1996; Habit
et al., 2006), como as tambin altos niveles de endemismo de peces (Campos et al., 1993; Ruiz
& Berra, 1994; Vila et al., 1999; Dyer, 2000). La alta calidad del ambiente dulceacucola del Sur
de Chile, presente en sus ros y lagos, constituyen un rasgo fundamental en sus estructuras de
equilibrio ecolgico y flujos de energa. Sin embargo, estos sistemas lacustres extensos y
prstinos poseen un alto grado de vulnerabilidad ambiental, debido a su capacidad como
receptculo y reservorio de distintas fuentes de emisin de material orgnico y residuos qumicos,
los cuales aportan de manera abrupta y desmedida un flujo de nutrientes y otras sustancias que
afectan negativamente la calidad de las aguas y el sedimento de estos ecosistemas, generados
mayoritariamente por la agricultura, prdida de bosque nativo, ganadera, salmonicultura,
desechos domsticos e industriales, y las malas prcticas del turismo, entre otros (Len-Muoz et
al. 2007).
4.1 Salmonicultura en Chile
En Chile, una actividad que ha sometido a los ecosistemas lmnicos a una intensa modificacin
durante los ltimos 25 aos, es la salmonicultura, industria que genera altos niveles de
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produccin y un dinmico desarrollo econmico a nivel nacional, registrando para el ao 1991,
140 mil toneladas de produccin (US$ 160 millones por concepto de exportaciones), mientras al
ao 2011,la produccin de salmn super las 650 mil toneladas (US$ 2,9 mil millones) cifras que
ubican a Chile como el segundo exportador mundial de salmnidos detrs de Noruega y
productor lder de productos de la acuicultura en Sur Amrica. Las mayores exportaciones
chilenas son a Japn, USA y Rusia y se basan en el cultivo de 4 especies: Salmn Atlntico,
Salmn Coho, Salmn Rey y Trucha (MultiExportsFood. 20121, Len-Muoz et al., 2013).
Las razones para el rpido crecimiento y expansin de esta industria, son las condiciones
hidrogrficas ptimas, como tambin las temperaturas del agua adecuadas y estacionalidad
inversa respecto al resto de zonas productoras, adems del modelo econmico y de desarrollo por
el que Chile lleva optando desde hace aos, en donde, la insercin internacional basada en la
apertura comercial y la iniciativa empresarial, impulsada desde sus inicios hasta el momento
actual por un intenso apoyo pblico, le otorga todo tipo de facilidades y ayuda directa al sector en
diversos mbitos, para producciones que tienen un porcentaje superior al 95% de su destino en el
mercado internacional de exportacin. Estas producciones se desarrollan en pases pobres o en las
zonas pobres de los pases, zonas con un alto porcentaje de poblacin rural, en donde estas
estrategias de desarrollo se implantan en los sectores ms vulnerables, con la esperanza de
mejorar las condiciones de vida de sus habitantes, pero que finalmente prioriza la implantacin de
empresas y el capital extranjero, haciendo caso omiso a los impactos socioambientales que esto
podra ocasionar (Garca Moreno, 2005).
En ese contexto la salmonicultura, al igual que otras actividades econmicas, usa y transforma los
recursos naturales, en productos con un valor econmico y social, disminuyendo la plusvala de
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los terrenos por el emplazamiento de estos centros de cultivo y la consecuente contaminacin de
sus aguas.
4.2 Ciclo de vida de salmnidos en cautiverio
El Salmn al ser una especie introducida (andromo), necesita usar o reproducir distintas
caractersticas ecolgicas y silvestres, asociadas a condiciones de agua dulce para la fase ova -
alevn, hasta una condicin marina para los procesos de maduracin y engorda, es decir, el ciclo
de vida natural de estos peces es reproducido (Fig. 1). En este contexto, y en funcin de los
cambios fisiolgicos, morfolgicos y de comportamiento que registran los salmnidos, es
necesario realizar una etapa de transicin entre los ambientes dulceacucolas y ocenicos, esta
etapa es denominada smoltificacin, proceso en el cual el pez comienza a conformar todo una
complejo enzimtico y excretor a fin de eliminar el exceso de sales que ingresan al pez cuando
ste se encuentre en el mar. Se estima que la mayor parte de la produccin actual de smolts (Fig.
2) proviene de pisciculturas, principalmente de flujo abierto realizado en concesiones de ros,
lagos y estuarios en el Sur de Chile (Nieto el al. 2010, Tello et al., 2010).
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Figura 1 . Ciclo de vida del salmn Atlntico (Salmo salar) (Fuente: Sistemas de Produccin deSmolts en Chile Nieto et al. 2010. Basado en Atlantic Salmon Federation 2010).
Figura 2. Etapas del desarrollo juvenil de Salmo salar. (a) Alevn con saco vitelino casiabsorbido, (b) Pez Fry, (c) Pez Fingerling, (d) Pez Parr y (e) Pez Smolt. (Fuente: Bjrnsson et al.2012)
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4.3 Sistemas actualmente en uso para la produccin de smolts de salmnidos en Chile
En las pisciculturas los peces son mantenidos en balsas-jaulas o bien en granjas de tierra (Fig. 3),
las cuales son instalaciones especialmente diseadas para circular el agua a travs de las unidades
de produccin, por ejemplo, tanques, estanques y canales con flujo abierto o sistemas de
recirculacin de agua, en donde las condiciones emuladas permitan controlar las variables
biticas (patgenos) y abiticas (temperatura, concentraciones de oxgeno disuelto, pH)
posibilitando que estos sistemas de cultivo reduzcan rangos de mortalidad, obtengan menores
tasas de conversin de alimento, mejoren los ndices de crecimiento y realicen un mayor nmero
de rotaciones de cultivo por ao.
Figura 3. Esquema de un proceso estndar de produccin de salmones ( Salmo salar) (Fuente:FAO 2014)2.
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En los cultivos intensivos de flujo abierto usados por la industria chilena, se utilizan cuerpos o
cursos de agua contiguos a los centros de produccin. El flujo del agua que ingresa pasa a travs
de los estanques donde se encuentran los peces, para posteriormente ser descargada nuevamente
al ro, estero o lago como efluente. Otra forma de cultivos intensivos en tierra utilizados por la
salmonicultura, pero no muy masificado son los sistemas de recirculacin el cual incorpora un
tratamiento y reutilizacin del agua considerando alrededor de un 10% de reemplazo de agua
diariamente, pudiendo variar entre el 5 al 20% dependiendo del estanque de cultivo y eficiencia
de filtracin. En estos sistemas el agua del efluente no es vertida directamente en su totalidad al
curso de agua adyacente, si no que se capta el agua de los efluentes de cada estanque de cultivo, y
se conduce a travs de una secuencia de procesos que la devolvern finalmente a los estanques en
tal calidad que los peces puedan seguir creciendo en condiciones favorables. Los procesos
utilizados para lograr esta recirculacin incluyen filtracin mecnica de fecas, materia orgnica,
alimento no consumido, nitrificacin, eliminacin de dixido de carbono, esterilizacin e
inyeccin de oxgeno. (Gooley y Gavine, 2003, Nieto et al., 2010).
Sin embargo, a pesar de ser esta una de las industrias con mayor tasa de crecimiento a nivel
nacional la informacin que se dispone en forma pblica, generada desde el gobierno o la misma
industria, es escasa, en temas tales como la distribucin espacial de las concesiones, sus
tendencias productivas y los impactos ambientales. Por lo tanto, es casi nula la posibilidad de
instaurar un debate de polticas pblicas en base a informacin cientfica, para reestructurar el
actual marco regulatorio, incluyndose niveles mximos de densidad y produccin, y
mejorndose los actuales protocolos de muestreos medioambientales, como para crear
herramientas educativas y de formacin en los distintos niveles de la sociedad en Chile.
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4.4 Efectos de la contaminacin general de la piscicultura
La Regin de La Araucana (Patagonia Norte, Chile S39 - 41) posee un 25 % de los recursos de
aguas dulce del pas y actualmente un 70% de la produccin total de cras de salmnidos se
encuentra en esta Regin, debido a que los principales ros de bajo orden son usados para
mantener las granjas de peces en tierra. Estos ros son esenciales en el desarrollo de la industria,
debido a sus caractersticas fsico-qumicas como por ejemplo, un bajo nivel de perturbaciones
antropognicas, concentraciones optimas de nutrientes y rangos tolerables de temperatura del
agua, brindando de tal manera excelentes condiciones para la cra de alevines de salmn sensibles
a bajos niveles de oxgeno disuelto y contaminantes (Tello et al., 2010).
Las pisciculturas en tierra prev una serie de efectos potenciales sobre los ecosistemas lmnicos
que la sustentan, uno de estos impactos negativos es el que ha provocado sobre las especies
nativas cuando ocurren escapes de ejemplares (Seplveda et al., 2009), esto debido a que no
poseen depredadores naturales para su control. Estos peces desplazan o depredan la fauna nativa
que no puede competir con ellos (Buschmann, 2001). Otro problema presente y significativo que
conlleva el proceso de produccin de salmnidos en aguas continentales, proviene principalmente
de la contaminacin generada por los efluentes de las pisciculturas, los cuales transportan heces,
desperdicios de comida no consumida y subproductos metablicos, hacia los ros aportando una
fuerte entrada de materia orgnica e inorgnica disuelta (ej. principalmente nitrgeno, fosforo y
carbono), DBO, slidos suspendidos, agentes patgenos y residuos qumicos (Tello et al., 2010,
Oberdoff & Porcher, 1994) afectando directamente e indirectamente en los procesos ecolgicos
estructurales y funcionales, como la alteracin del hbitat, proliferacin de algas, influencia en el
ciclo del nitrgeno y generacin de condiciones de hipoxia y/o anoxia en el agua, produciendo
cambios significativos en la composicin de la biota, que disminuye tanto en cantidad como
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diversidad. La magnitud de dichos efectos sobre el medio natural van a depender, por un lado, de
la tecnologa utilizada para el cultivo, el tipo y nivel de produccin, como tambin de la cantidad
y calidad de los mismos nutrientes y compuestos usados para el tratamiento de las enfermedades,
en relacin a las caractersticas y calidad del cuerpo de agua receptor, especialmente si ste
disminuye significativamente su caudal durante la poca de estiaje (Len-Muoz et al., 2013,
Nieto et al., 2010, Tello et al., 2010).
Como ya se haba mencionado las pisciculturas de flujo abierto, son las ms comunes dentro de
los procesos de cultivos smolt y alevines en los ros del Sur de Chile. Estos sistemas utilizan
grandes volmenes de agua que circulan permanentemente por el sistema generando altas tasas
de dilucin, condicin que resulta en el cumplimiento de la mayor parte de los parmetros
contenidos en la norma de emisin (D.S. 90 de 2000 del MINSEGPRES). Sin embargo, esta
regulacin slo se basa en las cargas por contaminante pero no en su carga total y adems para
los estndares de la OCDE no es suficiente para proteger y mantener la calidad de agua, el estado
trfico y la biota asociada a los sistemas fluviales (Len-Muoz et al., 2007; Nieto et al., 2010).
En especial no solo la concentracin sino la carga de materia orgnica tiene un gran potencial de
generar problemas y distrofias resultando en un enriquecimiento orgnico y efectos acumulativos
tanto en cercanas como lejos de la fuente emisora, debido a los altos volmenes de agua vertidos
a cuerpos de agua fluviales y lacustres (Nieto et al., 2010).
La adicin de nutrientes a los cuerpos acuticos ha sido reconocida internacionalmente como una
de las causas en el desequilibrio de los procesos productivos internos y el origen de los cambios
en el estado trfico de los cuerpos de agua afectados. Algunos efectos del aumento de la carga de
materia orgnica y concomitante de los nutrientes en la columna de agua y sedimentos del
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ecosistema tienen el potencial de generar una disminucin de las concentraciones de oxgeno y
aumento de la demanda biolgica de oxgeno, promoviendo alteraciones en los ciclos normales
de los nutrientes (N y P) (Buschmann, 2001).
Tradicionalmente, como ya se haba mencionado la evaluacin de la contaminacin acutica de
las pisciculturas en Chile son regidas en trminos de cargas inorgnicas de N y P, y es limitada
solo a la determinacin de los efectos acumulativos y sinrgicos sobre el medio ambiente,
dejando completamente ausente la informacin sobre calidad y cantidad de la materia orgnica
disuelta (DOM) y de carbono orgnico disuelto (DOC).
Es por esto que debido a los cambios en el uso del suelo de los sectores aledaos y la
subsiguiente influencia de la salmonicultura en los sistemas lmnicos, se requieren enfoques de
estudios aplicados y de lneas bases con el fin de preservar la integridad ecolgica de los sistemas
acuticos, y as evitar la carencia con respecto a cmo administrar esta actividad bajo un enfoque
ecosistmico sostenible sin el deterioro del medio ambiente.
4.5 Materia orgnica en sistemas acuticos
La materia orgnica natural (NOM) es un componente universal en aguas naturales y afecta el
funcionamiento de los procesos geoqumicos de los ecosistemas acuticos al actuar como
donador o receptor de protones en reacciones redox y como un tampn de pH, afectando el
transporte y la degradacin de los contaminantes, y participando en la disolucin mineral y
reacciones de precipitacin (generacin de productos insolubles, por la combinacin de uno o
ms reactivos). La materia orgnica tambin controla la estructuracin de la comunidad bitica
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de la corriente e influye en la dinmica de nutrientes del sistema (Bisson and Bilby, 1998,
Weishaar et al., 2003).
En las cuencas de los arroyos y ros, NOM es derivado principalmente por fuentes externas a los
sistemas acuticos (alctonas) proveniente de fracciones orgnicas de suelos y de la vegetacin
adjunta (Brooks et al., 1999), sin embargo, la NOM derivada del mismo sistema acutico
(autctona) compone una fraccin significativa de la reserva total de carbono orgnico disuelto
(COD) en los sistemas acuticos (Cole et al., 2000) y proviene de la produccin primaria del
cuerpo fluvial o lacustre.
En las aguas naturales existen estados de la materia orgnica en forma disuelta, coloidal y
particulada. Siendo la fraccin de la materia orgnica disuelta (DOM) la ms estudiada.
4.6 Materia Orgnica Disuelta (DOM)
La materia orgnica disuelta (DOM) se define como la parte del material orgnico que pasa a
travs de un filtro con un tamao de poro de menos de 0.45 m (0.22 - 1.22 m).DOM es uncomponente ubicuo en las aguas naturales, y representa una importante fuente de nutrientes para
organismos heterotrficos, siendo adems una de las mayores fuentes de carbono orgnico
biolgicamente disponible en los ecosistemas acuticos, teniendo una amplia contribucin en los
flujos de carbono tanto a escala local como global (Battin et al., 2009). Al ser la principal forma
de la materia orgnica natural en estos ambientes, la composicin de DOM puede derivar de
fuentes alctonas, provenientes de la lixiviacin de sustancias hmicas de material vegetal y
orgnico del suelo, como tambin puede tener origen autctono, proviniendo de la produccin
primaria del fitoplancton o macrfitas, por lo que DOM juega un papel integral en la
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estructuracin de los ecosistemas acuticos, influyendo tanto directa como indirectamente en la
biogeoqumica de estos ambientes (Stedmon et al., 2003).
Tanto la composicin como la concentracin de DOM, depende de la ubicacin y las condiciones
ambientales dentro y fuera del cuerpo de agua, por lo que la actividad humana, como ya se haba
mencionado es una importante una fuente de DOM, mucha de la cual se cree que es lbil (materia
orgnica fcilmente degradable), pudiendo entrar en el sistema acutico a travs de puntos de
descarga directa como efluentes, lixiviacin o dispersin area, interactuando con muchos
contaminantes orgnicos o inorgnicos, como los metales, pesticidas e hidrocarburos aromticos
policclicos (HAP) influyendo directamente en su transporte, estabilidad y biodisponibilidad
(Huguet et al., 2009, Hudson et al., 2007).
La heterogeneidad de DOM es producto de su amplia variedad de fuentes y reactividad frente a
procesos fsicos, qumicos y degradacin microbiana, por lo que la naturaleza de DOM puede ser
un poco difusa y compleja, sin embargo, se sabe que consiste de una mezcla heterognea de
polmeros alifticos y aromticos cuya composicin vara segn su reactividad y rol ecolgico en
el tiempo y espacio en funcin de la proximidad a las fuentes y la exposicin a los procesos de
degradacin (Fellman et al., 2010). Para comprenderla dinmica de DOM en los sistemas
acuticos, es esencial trazarlas diferentes fracciones de la reserva de DOM a travs del
ecosistema que lo sustenta.
4.7 Materia Orgnica Disuelta Fluorescente
Una caracterstica que presenta la materia orgnica disuelta, es su propiedad ptica que absorbe la
luz en un amplio intervalo de longitudes de onda visibles y UV, debido a la naturaleza qumica
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que esta posee, por lo que es posible medir sus propiedades pticas como la fluorescencia, a
travs de tcnicas espectroscpicas que han mejorado nuestra comprensin de la dinmica de
DOM en los ecosistemas acuticos. Entre el 40 y el 60 % de la materia orgnica natural es
fluorescente (Fig. 4), y se le denomina materia orgnica disuelta coloreada o cromofrica
(CDOM) (Green & Blough, 1994).
Figura 4. Relacin entre la materia orgnica disuelta presente en los ecosistemas acuticos, y lafraccin de la materia orgnica disuelta pticamente activa.
La fluorescencia se refiere principalmente a estados vibracionales y electrnicos, en este caso de
la materia orgnica y esta ocurre cuando una molcula absorbe energa, proveniente de un haz de
luz (generalmente ultravioleta), causando que un electrn en estado basal (S0) sea excitado a
estados singlete de energa superior (S1, S2), movindose a un orbital desocupado. Al perder
rpidamente cualquier exceso de energa vibracional la molcula se relaja y desciende luego a
uno de los distintos niveles de vibracin del estado electrnico basal, emitiendo un fotn en el
proceso. Como las molculas pueden descender a cualquiera de los diferentes niveles de
vibracin en el estado basal, los fotones emitidos tendrn diferentes energas y, por lo tanto,
frecuencias, as pues, la longitud de onda de la emisin de fluorescencia se determina por la
diferencia de energa entre los estados singlete ms bajo (S1) y el estado basal (S0). Cuanto mayor
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sea la conjugacin de estructuras de doble enlace en la molcula, menor es la diferencia de
energa, que resulta en una mayor longitud de onda de la fluorescencia (Fig. 5). Por lo tanto, las
longitudes de onda de excitacin y emisin en las que se produce la fluorescencia son
caractersticas de estructuras moleculares especficas. Los compuestos aromticos con anillos de
carbono de alto peso molecular, son estructuras con electrones impares y que pueden pasar
fcilmente a un estado excitado y compartir energa, lo que hace un poco ms sencilla su
identificacin. En el estudio de la materia orgnica fluorescente, aquellos compuestos que
absorben la luz son llamados cromforos y los que absorben y re-emiten la energa luminosa se
llaman fluorforos (Baker A. 2001; Hudson et al., 2007; Mopper et al., 1996; Stedmon et al.,
2003).
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Figura 5. Diagrama de los niveles electrnicos y vibracionales de una molcula (Fuente: Hudsonet al., 2007)
Los principales grupos de fluorforos orgnicos que se presentan en relacin a su seal de
fluorescencia son atribuidos a los grupos naturales de DOM similares a cidos hmicos y cidos
flvicos (con una fluorescencia azul), como tambin el grupo similar a protenas (con una
fluorescencia UV), este grupo consta de tres aminocidos disueltos fluorescentes el triptfano, la
tirosina y la fenilalanina (Fig. 6). Las posibles fuentes de estas emisiones de fluorescencia
similares a protenas incluyen ecosistemas que soportan una alta actividad biolgica y microbiana
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y aguas que reciben las descargas de aguas residuales de plantas o algunos tipos de desechos
industriales antes ya mencionados. (Coble, 1996, Mopper and Schultz, 1993; Parlanti et al.,
2000).
Figura 6. Estructuras de los compuestos orgnicos de triptfano, tirosina y fenilalanina (Fuente:Hudson et al. 2007. Basado en A spectral database of organic fluorophores by Colin A.Stedmon)3.
Las sustancias hmicas pueden ser derivadas de la descomposicin de material vegetal mediante
procesos biolgicos y qumicos en los ambientes terrestres y acuticos (Steinberg et al., 2006).
Estas a su vez se pueden sub-dividir en tres categoras, que se definen qumicamente por su
solubilidad a diferentes pH (Fig. 7). Los cidos hmicos son insolubles en solucin acuosa a pH
inferior a 2, pero soluble a un pH ms alto (Fig. 8(a)). Los cidos flvicos son solubles en agua
bajo todas las condiciones de pH (Fig. 8(b)). Las huminas son insolubles en agua en todas las
condiciones de pH (Aiken et al., 1985). Este tipo de molculas polimricas se han considerado
qumica y biolgicamente como materia orgnica refractaria.
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Figura 7. Esquema de las categoras de las sustancias hmicas presentes en DOM y que sedefinen qumicamente por su solubilidad a diferentes pH
Figura 8. Estructuras tericas de los fluorforos orgnicos de (a) un cido hmico y (b) un cidoflvico (Fuente: Hudson et al., 2007. Basado en Aitken et al., 1985)
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4.8 Medicin e identificacin de DOM a travs de tcnicas de Espectroscopia de
Fluorescencia
Los avances en la tecnologa, particularmente en los rangos de longitud de onda a travs de
fuente de luz y estabilidad, la velocidad de escaneo y la capacidad de procesamiento de datos,
han permitido a la espectroscopa de fluorescencia transformarse en una herramienta popular para
el estudio y seguimiento de la concentracin y la naturaleza de la materia orgnica disuelta
(DOM) (Murphy et al., 2010), proporcionando una alternativa a los mtodos tradicionales en
trminos de cargas inorgnicas de N y P, para la caracterizacin de DOM en los ecosistemas
acuticos. Esta tcnica es rpida, precisa y no invasiva, ideal para programas de muestreos
temporales y espacialmente extensos, ofreciendo la posibilidad de un seguimiento a la evolucin
de DOM fluorescente desde un punto de vista cualitativo y semi-cuantitativo, esto debido a que la
cuantificacin de la concentracin de un fluorforo exacta es difcil de lograr debido a la
interferencia con compuestos adicionales, la atenuacin y otros factores que influyen en el
rendimiento de fluorescencia (Mayer et al., 1999, Huguet et al., 2009).
Para la deteccin de las fracciones fluorescentes especficas de DOM, se utilizan matrices
tridimensionales de excitacin y emisin, denominados EEM (Fig. 9), este proceso implica en
excitar una muestra en un rango sucesivo de longitudes de onda y registrar la emisin de
fluorescencia sobre otra gama de mltiples longitudes de onda, todo esto de forma sincrnica
(Hudson et al., 2007), produciendo un grfico 3D por medio de las intensidades y las longitudes
de ondas utilizadas en la excitacin y emisin, permitiendo visualizar una variedad de fluorforos
en una muestra dada y sus posiciones relativas en el espacio ptico, logrando proporcionar
informacin muy detallada de las fuentes, el comportamiento y los ciclos biogeoqumicos de
DOM y de los compuestos fluorescentes.
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El registro de las medidas de fluorescencia de DOM es un proceso relativamente sencillo, llevado
a cabo en espectrofotmetros de fluorescencia o espectrofluormetros, que permiten escanear y
visualizar la informacin de forma detallada en la identificacin de grupos fluorescentes, pero
mltiples pasos son requeridos para la calibracin y correccin de los instrumentos, ya que es
necesario corregir los sesgos especficos del instrumento, para lograr el espectro 'verdadero'
comparable e independiente de la mquina (Stedmon & Bro, 2008).
Figura 9. Ejemplo de una matriz tridimensional de excitacin y emisin (EEM)
4.8.1 Espectrofluormetros
Estos instrumentos (Fig. 10) utilizan una haz de luz (lser, fotodiodos, LED, arcos de xenn y
lmparas de vapor de mercurio) como fuente de excitacin, estos son generalmente tiles debido
a su alta intensidad en todas las longitudes de onda que van desde los 200 nm hacia arriba. La luz
emitida pasa a travs de un filtro o monocromador, e incide sobre la muestra ubicada en una
cubeta (comnmente de cuarzo) de 1cm3. Los monocromadores se utilizan para dispersar la luz
policromtica o blanca en un ngulo diferente que el de incidencia, desvindola en varios colores
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o longitudes de onda a travs de rejillas de difraccin en lugar de prismas, lo cual disminuye la
luz difusa, es decir, la luz con longitudes de onda diferentes a la escogida. Una parte de la luz
incidente es absorbida por la muestra, y algunas de las molculas de la muestra producen una
fluorescencia. Parte de esta luz fluorescente pasa a travs de un segundo filtro o monocromador y
llega a un fotomultiplicador, el cual muy a menudo se encuentra a 90 con respecto al haz de luz
incidente para evitar la interferencia de la luz de excitacin transmitida. La salida se suele
presentarse en forma grfica y se almacena digitalmente (Lackowicz, 2006) 4.
En general, los espectros utilizados para registrar la fluorescencia de DOM tienen un amplio
rango de longitudes de onda, que va desde 240 a 450 nm para la excitacin y desde 300 a 600 nm
para la emisin, es decir, comprenden los espectros UV hasta el color azul (espectro visible por el
ojo humano). La ubicacin de los peaks de excitacin y emisin, la forma de los espectros de
fluorescencia y su intensidad vara con la composicin qumica y concentracin de DOM, as
como tambin la intensidad y la forma de los espectros de fluorescencia.
Figura 10. Componentes de un espectrofotmetro de fluorescencia
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4.8.2 Correccin espectral, correccin de filtro interno, normalizacin y sustraccin del
blanco para realizar mediciones de fluorescencia comparables entre las muestras, estudios y
espectrofluormetros
Algunos de los problemas asociado a este tipo de anlisis pueden deberse a alteraciones derivadas
de la muestra o el mismo instrumento. Como punto de partida, la intensidad de las fuentes de luz
y las caractersticas de la longitud de onda varan con el tiempo durante cada experimento, y a su
vez ninguna lmpara tiene una intensidad constante en todas las frecuencias. Por lo que, los datos
en brutos del instrumento estn intrnsecamente sesgados debido a imperfecciones en los
componentes pticos o su alineamiento, mostrando variaciones en la eficiencia con la que las
diferentes longitudes de onda de la luz se transmiten a travs de los monocromadores. Esto da
lugar a espectros de excitacin o de emisin distorsionados, lo cual debe ser normalizado a travs
de la correccin espectral, este tipo de alteracin se conoce como efecto de filtro externo
(Murphy et al., 2013).
Otro tipo de interferencia asociado a este tipo de anlisis se observa en las muestras pticamente
densas, en donde la relacin entre la concentracin y la intensidad de la fluorescencia, se ve
alterado por efectos de filtro internos primarios y secundarios (EFI) (Fig. 11(a)). Esto ocurre
cuando la radiacin es absorbida por la matriz de la muestra al momento de entrar o salir de la
cubeta de medicin, reduciendo la cantidad de luz de excitacin absorbida por los cromforos en
el centro de la cubeta y de menor manera, la cantidad de luz emitida que incide sobre el detector.
Los cromforos que no presentan fluorescencia tambin contribuyen a este efecto. El resultado es
que la intensidad de excitacin de la luz no es constante a lo largo de la solucin. Como
resultado, slo un pequeo porcentaje de la luz de excitacin llega a los fluorforos que son
visibles para el sistema de deteccin. En general, hay dos maneras de reducir los EFI: por
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dilucin o correccin matemtica de las intensidades. Si la dilucin aun no es significativa en la
reduccin de este efecto, existe un mtodo sencillo y popular para su disminucin, el cual utiliza
un espectro de absorcin de la muestra (medido en un espectrofotmetro de absorbancia a
longitudes de ondas determinadas) para calcular una matriz de factores de correccin, con un
factor de correccin separado correspondiente a cada par de longitudes de onda en el EEM (Fig.
11(b)), esta correccin a base de la absorbancia solo funciona para las muestras con una capacidad
de absorcin de
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sistemas de deteccin y / o utilizan diferentes fotomultiplicadores; por lo tanto, a menudo se
utilizan diferentes escalas para registrar la intensidad de fluorescencia. Adems, la intensidad de
fluorescencia es casi siempre (excepto para sistemas de conteo de fotones) dada en unidades
arbitrarias (A.U) (Lawaetz et al., 2009).
La seal de luz que incide en la muestra (independiente de la fuente) al interactuar con las
molculas de agua, induce o provoca una dispersin de la fluorescencia transmitida. Los efectos
de dispersin ms comunes del espectro de luz se llaman dispersin de Rayleigh (de primer y
segundo orden) y la dispersin Raman. La dispersin Rayleigh, ocurre en la misma longitud de
onda que el haz de excitacin, siendo una dispersin directa de la fuente de luz. Esta dispersin se
debe a partculas cuyo tamao es mucho menor que la longitud de onda de los fotones incidentes,
producindose una dispersin elstica de las molculas que se han excitado a un estado de
energa virtual. Tpicamente, una muestra es iluminada con un rayo lser. La luz del punto
iluminado es recogida con un lente y es enviada a un monocromador. Sin embargo, las longitudes
de onda cercanas a la lnea del lser son filtradas o enmascaradas, dando como resultado una
intensidad mucho mayor en magnitud que la fluorescencia real y que por ende es recogido y
almacenado en el detector (fotomultiplicador). La dispersin de Rayleigh en las EEM's es una
estructura exactamente diagonal que ocurren en em = exc (Larsson et al., 2007, Rinnan et al.,
2005, Zeep et al., 2004).
La dispersin Raman, al igual que Rayleigh, ocurre por la interaccin de la luz de excitacin con
las molculas de agua, pero en este caso, la molcula se relaja a un nivel de energa de vibracin
diferente al del estado basal, es decir, la dispersin ocurre de forma inelstica. Cuando la
molcula se relaja a un nivel de vibracin ms alta, la luz emitida tiene una frecuencia ms baja
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que la luz de excitacin, y para el caso en que la molcula se relaja a un nivel de vibracin ms
baja, la luz emitida tendr una frecuencia ms alta que la luz de excitacin. Este cambio o
diferencia de energa se denomina cambio de Stokes. Los desplazamientos Stokes de una
determinada molcula sern constante independientemente de la frecuencia de la luz de
excitacin. Esta es una manifestacin ptica de las propiedades de dispersin del agua debido a la
vibracin de los enlaces moleculares covalentes O-H con la aplicacin de energa lumnica, en
donde la luz emitida tiene una prdida de energa con frecuencia fija (Fig. 12) (Larsson et al.,
2007; Hudson et al., 2007).
Figura 12. Estados vibracionales de una molcula y su respuesta frente a la interaccin con unhaz de luz. En Rayleigh no hay cambio en la energa de la luz incidente con la luz emitida. En losRaman Stokes la luz dispersada tiene menor energa que la luz incidente (menor frecuencia). En
los Raman anti-Stokes, la luz dispersada tiene mayor energa que la luz incidente (mayorfrecuencia)
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La identificacin de estos fenmenos de dispersin, fue un avance fundamental en la
espectroscopa de fluorescencia (Fig. 13). Al identificarse que Raman tiene baja intensidad, se
reconoci que la nica molcula de concentracin suficiente para producir dispersin Raman
visible e identificable es el agua (normalmente ubicado a los 350 nm de excitacin) (Fig. 14). Por
lo tanto, la dispersin Raman proporciona la base ms apropiada para un mtodo de correccin ya
que es mucho menos dependiente de la composicin de la muestra (Lawaetz et al., 2009).
Figura 13. (a) Tpico espectro de emisin de fluorescencia con los diferentes peaks marcados. La
escala de la abscisa superior es la longitud de onda en nm y la escala de la abscisa inferior es lafrecuencia en cm-1. (b) Grfico de contorno de un EEM con los respectivos efectos de lasdispersiones (Fuente: Larsson et al., 2007).
Un mtodo simple y que es directamente proporcional a la medicin del agua, es el uso del rea
del peak de Raman (Arp). (Arp) se puede utilizar para calibrar las mediciones realizadas en
diferentes instrumentos, o hechas con diferentes ajustes instrumentales que pueden variar en
consecuencia la altura o el ancho del peak. Esto equivale a que cada punto de la matriz de
excitacin-emisin se divide por (Arp), dando como resultado una nueva unidad comparable, la
unidad Raman (R.U) (Lawaetz et al., 2009).
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Figura 14. Peak de Raman visible en una muestra de agua fresca Milli-Q en unidades arbitrarias(A.U.) (Fuente: Lawaetz et al., 2009)
Finalmente, la normalizacin de la seal medida del peak Raman y el uso de espectros de
correccin para la excitacin y emisin eliminan de forma efectiva todos los sesgos especficos
de los instrumentos. Sin embargo, para poder visualizar de forma especfica y detallado los
fluforos dentro de las matrices de excitacin-emisin, es necesario realizar una sustraccin del
espectro del blanco (agua), esencial para cualquier experimento de fluorescencia, ya que son
idnticos a la muestra pero no contienen el fluforo, corrigiendo los valores de esta y eliminando
definitivamente los ruidos de la medicin y los efectos debido a las dispersiones Raman y
Rayleigh (Fig. 15) (Lakowicz, 2006; Zepp et al., 2004). Seguido a esto se realiza una
interpolacin de los datos, en donde la excitacin es mayor a la emisin (regin de no
fluorescencia), utilizando una "triangulacin de ceros" en la regin de los datos faltantes (mtodo
de triangulacin de Delaunay) (Stedmon et al., 2003; McKnight et al., 2001).
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Figura 15. Ilustracin de la sustraccin del blanco, eliminando los ruidos de medicin, la mayorade los efectos por dispersin y la interpolacin de los datos en las regiones de no fluorescencia
4.9 ndices de Fluorescencia
A travs de los anlisis de fluorescencia por medio de la espectroscopa, las diferentes longitudes
de ondas presentes en las matrices de excitacin-emisin, permiten identificar el origen de los
fluorforos y cuantificar las diferencias en las propiedades de fluorescencia de DOM,
denominados ndices de fluorescencia. En este contexto usaremos 3 ndices que utilizan
diferentes posiciones en los espectros de excitacin y emisin para brindar informacin anexa al
anlisis cuantitativo y cualitativo que efecta PARAFAC (seccin 4.10 PARAFAC) de los
fluorforos presentes.
El ndice FI, es uno de los ms simples y utilizados, este proporciona informacin acerca de la
fuente (por ejemplo, microbiano o de plantas superiores derivados de la materia orgnica
terrestre) o el grado de degradacin de DOM, ya que refleja la contribucin relativa de los DOM
aromticos vs los no aromticos. Este ndice es una relacin de intensidades de emisin a
longitud de onda 450 nm y 500 nm a una excitacin de 370 nm. Su variabilidad va desde valores
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altos ~1,9 para derivados por liberacin extracelular y los lixiviados de las bacterias y algas y un
valor de ~1,4 para los derivados planta terrestre y la materia orgnica del suelo (McKnight, 2001;
Fellman et al, 2010)
El ndice HIX, indica el grado de humificacin o de sustancias hmicas contenidas en el
fluorforo. Este se basa en la idea de que los espectros de emisin de molculas fluorescentes se
desplazarn hacia longitudes de onda ms largas (debido a las bajas proporciones H:C) como de
donde procede la humificacin de DOM. Los valores ms altos indican un mayor grado de
humificacin. Se calcula a travs del rea bajo los espectros de emisin de 435 a 480 nm dividida
por el rea del pico de 300 a 345 nm + 435 a 480 nm, a la ex 255 nm. Los valores sobre 10
corresponden a extractos de cidos flvicos valores debajo de 2 corresponde a material vegetal no
humificado
El ndice :, es un indicador de la contribucin recientemente producida de DOM, donde
representa a DOM derivado recientemente (autctono) y representa a DOM ms descompuesto
(alctono). Este se calcula a travs de la relacin entre la intensidad de emisin a 380 nm dividida
por la intensidad mxima de emisin observada entre 420 y 435 nm, obtenidos a una excitacin a
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310 nm (Parlanti et al., 2000; Fellman et al., 2010). Los valores > 1 indica que DOM es
autctono, los valores
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fluorescencia en un conjunto de componentes trilineales y vectores residuales, permitiendo la
identificacin de los diferentes grupos de fluorescencia, logrando separar la seal compleja
medida en sus fenmenos fluorescentes subyacentes individuales con excitacin especfica y
espectros de emisin, proporcionando estimaciones de la contribucin relativa de cada
componente de fluorescencia en la reserva total de DOM. Por lo tanto, los componentes
generados por la modelacin mediante PARAFAC proporcionan informacin sobre la
composicin bioqumica, origen, y el papel biogeoqumico del DOM acutico (Fellman et al.,
2010). Un modelo PARAFAC de vectores de tres vas est dada por tres matrices de carga, A, B
y C con los elementos aif, b
jf, y c
kf. El principio detrs del modelo trilineal se encuentra en
minimizar la suma de cuadrados del residuo, eijk entre el modelo y los valores medidos (Fig. 17)
Donde i= 1, ...., I; j= 1,...., J; k= 1,....., K
En la ecuacin, xijk es la intensidad de la fluorescencia de la muestras itha longitudes de ondas de
emisiones jth y a longitudes de ondas de excitaciones kth, y eijk es el residuo que representa la
variabilidad no explicada por el modelo (Fig. 16). Estos componentes del modelo tienen una
interpretacin qumica directa en un modelo vlido. El parmetro aif es directamente proporcional
a la concentracin del fluorforo fth en la muestra i; los vectores bjf y ckf estn linealmente
relacionadas con la eficiencia cuntica de fluorescencia (fraccin de energa absorbida-emitida
como fluorescencia) del fluorforo fth. Para tener una descomposicin exitosa de datos de
mltiples vas usando PARAFAC, se debe tener en cuenta: Primero, la variabilidad, no hay dos
componentes qumicos que puedan tener intensidades de fluorescencia perfectamente covariando
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o espectros idnticos. Segundo, la trilinearidad, los espectros de emisin son invariantes a travs
de longitudes de onda de excitacin, los espectros de excitacin son invariantes a travs de
longitudes de onda de emisin, y la fluorescencia aumenta aproximadamente de forma lineal con
la concentracin. Tercero, aditividad, la seal total es debido a la superposicin lineal de un
nmero fijo de componentes (Bro, 1997; Murphy et al., 2013; Guo et al., 2010).
Figura 17. : Ilustracin de los valores obtenidos por medicin de la espectroscopa defluorescencia, los resultados del modelo de anlisis PARAFAC y los residuos entre los valoresmedidos y los resultados de un modelo
4.11 Efectos ambientales sobre la fluorescencia de DOM y seguimiento de DOM en aguas
naturales y efectos de la contaminacin antropognica
Finalmente, y a modo de resumen, es posible desarrollar por medio de la espectroscopia de
fluorescencia ptica una investigacin aplicada sobre las fuentes, caractersticas y reacciones de
la materia orgnica disuelta en aguas naturales, como tambin para la deteccin de DOM
originado por diferentes fuentes de contaminacin en las corrientes de agua dulce.
Como ya se haba mencionado, se espera que los sistemas de produccin acucola como lo son las
pisciculturas produzcan un alto aporte de materia orgnica disuelta (DOM) en el curso de agua
asociada a la descarga. Esta se originara a partir de alimentos no consumidos, las heces y los
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subproductos metablicos de los peces. Teniendo en cuenta que la composicin media de pellets
es 40% de protena, 17% de grasa, 19% de carbohidratos, 14% de cenizas, 7% de agua, 50% de
carbono, 6% de nitrgeno y 1% de fsforo (Olsen et al., 2008), y considerando que en la
eliminacin de desechos slidos, se espera una entrada de 3,2% de carbono orgnico disuelto, 3%
de nitrgeno orgnico disuelto y 7,5% de fsforo orgnico disuelto hacia el cuerpo de agua
asociado, en forma de molculas de diversa complejidad (Fig. 18). Aportando de manera
significativa fracciones de materia orgnica disuelta a la cuenca hidrogrfica y afectando
directamente e indirectamente los procesos ecolgicos estructurales y funcionales de los ros.
Figura 18. Balance teortico masas de carbono, nitrgeno y fsforo en sistemas de pisciculturas(Fuente: Olsen et al, 2008).
Sin embargo, el potencial para la caracterizacin y cuantificacin de la materia orgnica en las
aguas naturales, de origen alctono y autctono, es cada vez ms comn en los anlisis de agua
dulce (Fellman et al., 2010). De particular inters son los vnculos entre los anlisis defluorescencia y las tcnicas de monitoreo de calidad del agua. Si se pueden encontrar
correlaciones vlidas, la fluorescencia podra ser utilizada como una rpida herramienta para
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evaluar la calidad del agua y como tcnica de monitoreo a largo plazo de la contaminacin en los
sistemas acuticos (Hur and Cho, 2012).
5. Hiptesis
La espectroscopa de fluorescencia ptica es una herramienta de monitoreo ecolgica eficaz,
precisa y representativa, capaz de brindar una mayor informacin acerca de la composicin,
concentracin y origen de la materia orgnica disuelta, permitiendo observar sus variaciones y
distribucin tras la incorporacin de residuos orgnicos provenientes de una piscicultura que
afectan a los ecosistemas de agua dulce, comparando los componentes fluorescentes especficos
evaluados mediante el anlisis PARAFAC entre aguas naturales y las aguas contaminadas.
6. Objetivos
6.1 Objetivo general
El objetivo del presente trabajo es realizar un seguimiento de la contaminacin orgnica de unapiscicultura en el Sur de Chile, centrndose sobre el contenido y composicin de DOM, a travs
de la caracterizacin y evaluacin de la variacin de los componentes de fluorescencia de DOM,
presentes en el sistema lotico.
6.2 Especficos
1. Evaluar el grado de correlacin entre los parmetros de monitoreo fsico-qumicos y los
componentes validados por PARAFAC
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2. Evaluar el grado de correlacin entre los componentes similares a protena validados por
PARAFAC y las concentraciones de N y P
3. Evaluar el grado de correlacin entre los componentes validados por PARAFAC y los ndices
de Fluorescencia
4. Evaluar el grado de correlacin entre los componentes validados por PARAFAC y el carbono
orgnico disuelto (COD)
5. Encontrar si existen variaciones cuantitativas y cualitativas entre los componentes validados
por PARAFAC a lo largo del cauce fluvial
6. Observar los procesos degradativos que afectan a DOM proveniente del efluente, bajo
condiciones de laboratorio controladas, mediante experimentos de incubacin y dilucin
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7. Materiales y Mtodos
7.1. Metodologa
Las muestras de agua utilizadas para efecto de la caracterizacin de la materia orgnica disuelta
(DOM) fueron recolectadas entre los meses de Agosto y Diciembre del ao 2013, y Enero del ao
2014, a lo largo del Rio Molco (en Mapudungun; significa planta de agua) (3925884 S,
7210098 E) ubicado entre las ciudades de Villarrica y Pucn, en la IX regin de la Araucana,
Chile (Fig.19). El ro se extiende por unos 3,8 km, influenciado principalmente por las descargas
del efluente de la Piscicultura Molco de Multiexport, desembocando en el lago Villarrica. La
piscicultura present una produccin de 91.023 Kg de peces y 963 Kg de alimento en promedio
durante los meses de muestreo, con una descarga promedio de 277 litros por segundo (lps). Un
total de 183 muestras fueron colectadas, por medio de 16 puntos monitoreados intermitentemente
a lo largo del ro en el presente estudio. Las fechas y estaciones de los muestreos se encuentran en
la tabla 1 y las coordenadas GPS de los puntos muestreados se encuentran en la tabla 2.
Tabla 1. Fechas y puntos muestreados en el Rio Molco, IX Regin de la Araucana, Chile.
Fecha Estaciones Fecha Estaciones Fecha Estaciones
01-08-2013 Molco Control 05-11-2013 Molco Control 23-01-2104 Molco Control
Molco Efluente Molco Efluente Molco Efluente
Molco Puente Arriba Molco Puente Arriba Molco Puente Arriba
Molco Cabaas Molco Puente Pucon Molco Cabaas
Molco Puente Madera 26-11-2013 Molco Control Molco Puente Pucon
Molco Puente Pucon Molco Efluente 24-01-2104 Molco Control
15-10-2013 Molco Control Molco Puente Arriba Molco Efluente
Molco Efluente Molco Puente Madera Post Efluente 1
Post Efluente 1 Chosco Post Efluente 2
Post Efluente 2 Molco Puente Pucon Post Efluente 3
Post Efluente 3 12-12-2013 Molco Control Post Efluente 4
Molco Bifurcacin Molco Efluente Post Efluente 5
Post Efluente 4 Chosco Post Efluente 6
Post Efluente 5 Molco Puente Pucon Afluente
Post Efluente 6 Molco Puente Arriba
Molco Puente Arriba Molco Puente Madera
Puente Molco 1 Arroyo Lateral Molco Puente Pucon
Molco Cabaas
Molco Puente Madera
Chosco
Molco Puente Pucon
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Figura 19. Mapa general del rea de estudio, con los respectivos puntos de muestreo ubicados enel Rio Molco en la IX Regin de la Araucana, Chile.
Tabla 2. Coordenadas geogrficas de los puntos de muestreo en el Rio Molco en la IX Regin dela Araucana, Chile.
Punto GPS Punto GPS
Pue nte Molco-Pucon 39.29915 S Post Efl ue nte 5 39.33352 S
72.10150 W 72.09432 W
Chosco 39.310240 S Post Efluente 4 39.33403 S
72.099400 W 72.09443 W
Molco Puente Madera 39.313516 S Bifurcacin 39.33427 S
72.101040 W 72.09454 W
Cabaas Millaleufu 39.32603 S Afluente 39.334870 S
72.09782 W 72.094230 W
Pue nte Molco 1 Arriba 39.33226 S Post Efl ue nte 3 39.33530 S
72.09465 W 72.09414 WPuente Molco 1 Arroyo Lateral 39.33226 S Post Efluente 2 39.33535 S
72.09465 W 72.09411 W
Post Efluente 6 39.33273 S Post Efluente 1 39.33571 S
72.09437 W 72.09425 W
Post Efluente 5 39.33352 S Efluente 39.335780 S
72.09432 W 72.094270 W
Post Efluente 4 39.33403 S Control 39.336300 S
72.09443 W 72.094230 W
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7.2. Preparacin de las muestras para el anlisis ptico y fluoromtrico de DOM, DOC y N-
P inorgnicos
Las muestras recogidas se depuraron a travs de filtros de jeringa Millex -GP Hydrophilic PES
0,22 M previamente acondicionado con 100 ml de agua (Desionizada) para obtener la fraccin
disuelta y eliminar los slidos suspendidos, y luego guardadas en frascos de borosilicato mbar I-
Chem (Merck). Por cada punto de muestreo se generaron 3 replicados de 40 ml de muestra de
agua filtrada para la medicin de fluorescencia de DOM y 3 replicados de 40 ml de muestra de
agua filtrada adicionando 100 l de HCl fumante (Merck) para la medicin de DOC. En la
recoleccin de muestras se utilizaron botellas plsticas comerciales de agua mineral (PET) de 0.5
L, que se acondicionaron 3 veces con el agua de la muestra para posteriormente rellenarlas, con
el fin de medir las cargas de N y P presentes, paralelamente se midieron parmetros
fisicoqumicos como oxgeno disuelto, temperatura, conductividad, turbidez y pH. Se utilizaron y
rellenaron botellones de vidrio mbar de 5 L con agua proveniente del efluente para realizar
experimentos de incubacin y dilucin, posteriormente en el laboratorio. El transporte de las
muestras se efectu a T = 4 - 7 C dentro de coolers con hielo para su posterior anlisis. Todas las
mediciones pticas de DOM se hicieron dentro de 2 das, para evitar la degradacin y
subestimacin de DOM.
7.3 Parmetros de calidad del agua
Los parmetros de calidad del agua como oxgeno disuelto, temperatura, conductividad, turbidez
y pH, fueron registrados en el mismo momento que se realizara la toma de muestra para efecto de
caracterizacin de la materia orgnica disuelta. A travs de una sonda multiparamtrica Multi
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3420 SET H WTW, WeilHemm, Alemania, Mientras que la turbidez fue medida a travs de un
turbidmetro AL250T-IR AquaLytic.
Los anlisis de nitrgeno y fosforo se realizaron en el laboratorio de anlisis de aguas, Instituto
de Ciencias Marinas y Limnolgicas de la Universidad Austral de Chile, responsable Dr. S.
Woelfl, a travs de mtodos y lmites de deteccin especficos para cada fraccin inorgnica de
nitrgeno (NH4+, NO2
-, NO3-), nitrgeno total y nitrgeno orgnico, el fsforo total y el
ortofosfato (PO4).
Nitrato: 4500-NO3 E Standard Methods Edicin 2005; Segmented flow anlisisModul
SKALAR, L.D.: 0,002 mg N/L
Nitrito: 4500-NO2 B Standard Methods Edicin 2005; Segmented flow anlisisModul
SKALAR, L.D.: 0,002 mg N/L
Amonio: 4500-NH4 F Standard Methods Edicin 2005, L.D.: 0,003 mg N/L
Nitrgeno total: Mtodo de digestin bsica con Hidrxido de Sodio y Persulfato de Potasio
segn Koroleff (1983) y 4500-N/C y 4500-NO3E Standard Methods Edicin 2005; Segmented
flow anlisis Modul SKALAR, L.D.: 0,015 mg N/L
Nitrgeno orgnico: Norg. = NT(N-NO3 + N-NO2 + N-NH4). L.D.: 0,015 mg N/L
Fsforo soluble: Mtodo azul del cido ascrbico segn 4500-P E. Standard Methods APHA
(2005). L.D.: 0,002 mg P/L
El anlisis de carbono orgnico disuelto (DOC) fue medido a travs de un Elementar high TOC
de combustin cataltica a altas temperaturas, en el laboratorio de anlisis de aguas, Instituto de
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Ciencias Marinas y Limnolgicas de la Universidad Austral de Chile, responsable Dr. Jorge
Nimptsch.
7.4 Experimentos de incubacin y dilucin
Se realizaron experimentos de laboratorio bajo condiciones controladas con el fin de comparar
tanto el grado de dilucin o mezcla del ro, como tambin los posibles procesos de degradacin o
actividad biolgica que ocurren en DOM proveniente del efluente a medida que transcurre un
periodo de horas establecidas.
Estos experimentos se llevaron a cabo, con las muestras obtenidas del efluente el da 25 de
Noviembre del 2013. Los ensayos de incubacin y dilucin fueron realizados de manera paralela.
El experimento de dilucin se desarroll en botellas plsticas (HDPE) de 1 L previamente
lavadas y acondicionadas. Se utilizaron 5 botellas, cada una corresponda a un porcentaje de
dilucin del efluente, siendo la primera un 100% de las aguas residuales, a continuacin en la
segunda botella se mezcl 500 mL de agua desionizada con 500 mL de efluente, es decir, la
muestra del efluente quedo ahora a un 50% de dilucin, para la tercera botella se utiliz 500 mL
de la mezcla previamente homogenizada de la botella de 50% de dilucin, y se le adiciono
nuevamente 500 mL de agua desionizada quedando ahora en un 25% de dilucin. Este
procedimiento se realiz hasta llegar a un 6.25 % de dilucin de las aguas residuales proveniente
de las descargas de la piscicultura (Fig. 20). Una vez que las mezclas se encontraban en las 5
botellas, se efectu el mismo procedimiento que en la seccin 7.2 Pr
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