biyoteknolojide kullanılan yöntemler
Post on 30-Dec-2015
98 Views
Preview:
DESCRIPTION
TRANSCRIPT
Biyoteknolojide Kullanılan Yöntemler
Protein Saflaştırmada Yapılan İşlemler
Hücrelerin Parçalanması
• Tekrarlı dondurma ve eritme (Örn: Sıvı azot)• Sonikasyon (Ultrason),• Mekanik Parçalama (Blender)• Organik çözücülerle hücre zarının
geçirgenleştirilmesi• Deterjanlarla muamele
Ultrasonla Parçalama
Ultrason ile zayıflamak mümkün mü?
Mekaniksel Parçalama
Çöktürme ile kısmi saflaştırma
• Amonyum sülfat çöktürmesi• İzoelektrik çöktürme• Organik çözücülerle çöktürme• Asit ile çöktürme• Isı yoluyla çöktürme• Triton X-100 veya CHAPS ile membran
proteinleri sökülebilir. SDS proteinleri denatüre ettiği için bu amaç için kullanılmaz.
Santifüj
• Santrifüj ile karışımda asılı kalan maddelerin daha hızlı çökmesi salanır.
• Ultra santrifüj kullanılarak mitekondriler bile çöktürülebilir.
Diferansiyel santrifüjleme. Homojenat, gittikçe artan santrifüj kuvvetine
maruz bırakılarak fraksiyonlara ayrılır.
Denge yoğunluk gradient santrifüj yöntemi
Diyaliz
• Protein saflaştırmasının çeşitli aşamalarında proteinlerin küçük moleküllerden ayrıştırılması için kullanılan bir işlemdir. Örneğin, amonyum sülfat ile çökeltmenin ardından kullanılacak bir iyon değişim kromatografisi (bkz. aşağıdaki bilgili bölüm) adımı için bu tuzun giderilmesi gerekir, bunun için diyaliz yapılır.
Diyaliz
• Diyalizde, yarı geçirgen bir membran kullanılır, porlu bir selüloz membran gibi. Porların büyüklüğü proteinlerin geçmesine izin vermez ama küçük moleküller ve tuz iyonları geçebilir.
Diyaliz
• Diyaliz edilecek protein karışımı bir dializ torbasına konur, torba da büyük hacimli bir tampon çözeltisi içine yerleştirilir. Birkaç saat sonra torbanın dışındaki ve içindeki çözelti dengelenir, iki taraf küçük moleküller bakımından aynı bileşime sahip olur.
Diyaliz İşlemi ile tuzların uzaklaştırılması
Diyaliz sistem dengeye ulaşıncaya kadar devam eder
Jel filtrasyon kromatografisi ile de tuzlar uzaklaştırılabilir
Kromatografik Yöntemler
• Protein Saflaştırılmasında genellikle kolon kromatografisi kullanılır. Bunlar:– Afinite kromatografisi– İyon değişim kromatografisi– Jel filtrasyon kromatografisi
• Kromatografi, bir karışımdaki maddelerin bir sabit faz üzerinde farklı hızlarda sürüklenmesi sonucunda birbirinden ayrılması temeline dayanır.
• Maddeleri sürükleyen ise bir sıvı ya da gaz olabilir
• Karışımdaki maddeler sabit faz tarafından ne kadar alıkonuyorsa o oranda yavaş ilerler.
• Örneğin; sıkışık bir trafikte taksiler durmuş iken motosikletlerin daha hızlı ilerlemesi gibi…
• Ya da trafik kontrolünde taşıtlar durdurulurken yayaların ilerlemesi gibi…
Uygulama Şekline Göre
• İnce Tabaka Kromatografisi• Kolon Kromatografisi
Sabit faz, saflaştırılmak istenen maddenin cinsine göre değişir. Bu sabit fazı genellikle hem ince tabaka hem de kolon kromatografisine uygulayabiliriz. Tercih size kalmış.
İnce Tabaka Kromatografisi
• Sabit Faz
Başlangıç
Hareketli Faz
More polar!
Less polar!
s olvent frontorigin mixture
s olvent front
component B
component A
origin
s olvent front
component B
component A
origin
• Rf değeri aynı şartlarda bir madde için aynıdır.
• Rf ayırt edici bir özelliktir.
A B unknown
Elinizdeki karışımda, şüphelendiğiniz maddenin olup olmadığını İTK ile anlayabilirsiniz.
Ayrılan noktayı kazıyıp maddeyi saf olarak da elde edebilirsiniz.
Kolon Kromatografisi
Principles of Separation on a column
Principles of Separation
Principles of Separation
Principles of Separation
Principles of Separation
Principles of Separation
Principles of Separation
• Kolon kromatografisi uygulanan tekniğe göre değişik alt bölümlere ayrılabilir.
– İyon değişim kolonu– Jel filtrasyon kolonu– Afinite kolonu– Hidrofobik etkileşme kolonu
İyon Değişim KromatografisiKolondaki sabit faz çalışılan pH’da + ya da – bir yüke sahiptir. Sabit fazla zıt yükle yüklü olan maddeler kolonda alıkonurken aynı yükte olanlar alıkonmazlar.
Jel Filtrasyon KromatografisiŞOK! ŞOK! ŞOK!
Daha büyük moleküller daha hızlı ilerler.
Afinite Kroma..
Specific interactions
Afinite KromatografisiSabit faza öyle bir molekül tutturulur ki; sadece ilgilendiğimiz molekülle etkileşir ve onu kolonda tutar.
Afinite kromatografisinde gerekirse uzatma kolu kullanılabilir
• Kromatografi bir çok analiz cihazının kullandığı saflaştırma tekniğidir. Bunlardan sıklıkla kullanılan ikisi:
– HPLC– Gaz Kromatografisi
HPLCHewlett-PackardSeries 1100 HPLC
Çözücüler
Pompa
Enjektör
Kolon
Dedektör
HPLC
HPLC ŞEMA
HPLCHPLC Chromatogram of Standard 1
0.500 x 10-4 M caffeine
HPLCHPLC Chromatogram of Standard 2
1.00 x 10-4 M caffeine
HPLC
Gaz Kromatografisi
Gaz Kromatografisi
Protenleri derişikleştirmeA. Ultra Filtrasyon
Protenleri derişikleştirmeB. Liyofilizasyon
Elektroforez
1D elektroforez Doğal elektroforez (Poliakril amid, Agar) SDS-PAGE (Sodyum Dodesil Sülfat
Poliakril Amid Jel Elktroforezi)
2D elektroforez
Elektroforezin Temeli
Dikey Elektroforez Proteinleri Ayırmada Kullanılmaktadır
Dikey Elektroforez
SDS’nin (Sodyum Dodesil Sülfat) Etkisi
Elektroforezden sonra boyama yapılır
Boyamadan sonra ise yıkama yapılır
SDS-PAGE ile Mol Kütlenin Bulunması
Yatay Elektroforez Nükleer Materyalleri Ayırmada Kullanılmaktadır
Yatay elektroforezde jel olarak agar kullanılır
Nükleer Materyallerin Elektroforez ile Ayrılması
İzoelektrik Fokuslama
2D Elektroforez
2D Elektroforez
DNA İzolasyonu
Malzemeler1. Lizis solüsyonu
0.5 M Tris-HCl pH 8.0,20 mM EDTA10 mM NaCl1% SDS0.5 mg/mL proteinase K
2. Doygun NaCl (6M)3. Etanol (%96, %70)
DNA İzolasyonu Uygulama Basamakları
• Hazırlanan lizis solüsyonundan hücre peletinin üzerine 2 mL eklenir. 37°C ‘de bir gece bekletilir.
• 1 mL doygun NaCL eklenir.• Örnekler 55°C 10 dakika bekletilir.• 30 dakika 500 g’de santrifüj edilir.• Alttaki protein bölümüne dokunmadan süpernatant
yeni bir tüpe aktarılır.• Süpernatantın 2 katı hacimde soğuk %96’lık etanol
eklenir. Tüp defalarca alt üst edilerek DNA’nın çökmesi sağlanır.
DNA İzolasyonu Uygulama Basamakları
• Çöken DNA plastik spatula yada santrifüj ile alınarak yeni bir tüpe aktarılır.• Santrifüj yapılacak ise 10.000 g’de 10 dakika santrifüj edilir. Üstteki alkol
fazı atılır.• %70’lik alkol ile DNA bir kez yıkanır. Bunun için 1mL %70’lik alkol eklenir.
Tüp alt üst edilir. 10.000 g’de 10 dakika santrifüj edilir. Üstteki alkol fazı atılır.
• DNA havada kurutulur.• Distile suda DNA çözülür. Çözülmesini kolaylaştırmak için 65 0C’de 10
dakika tutulur.• Elde edilen DNA dan 1/25 -1/40 dilüsyon hazırlanır. A280 / A260 oranı
ölçülür (oran >1.5 olmalıdır). 280 nm’deki absorbans önce 50, sonra da dilüsyon faktörü ile çarpılır. Sonuç μg/mL olarak DNA konsantrasyonunu verir.
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
• Antijen-antikor ilişkisini, antikora bağlanmış bir enzimin aktivitesini araştırmak temeline dayanan kantitatif ölçüm yöntemidir. Antijene karşı antikor ya da antikora karşı antijen aramak mümkündür. Virüs ve parazit enfeksiyonlarında kullanılan bir tanı yöntemidir.
Sandviç ELISA
Sandviç ELISA
Sandviç ELISA
Sandviç ELISA
top related