biotechnol Ógia d msc gyakorlat

BIOTECHNOLÓGIA D MsC gyakorlat

Tervezési feladat

Ar1oriV

Ar1 oriV

vad típus mutáns poláris hatás ?

Deléciós mutagenezis a leolvasási keret sértése nélkül

oriV: szűk gazdaspecificitás

oriT

oriT

Ar: antibiotikum rezisztencia

A FELADAT ÁLTALÁNOS MEGFOGALMAZÁSA

• A LEOLVASÁSI KERET MEGSÉRTÉSE NÉLKÜL KI KELL ÜTNI EGY GÉNT EGY BAKTÉRIUMBAN

• ÉS HELYETTE UGYANEBBEN A BAKTÉRIUMBAN KELL TERMELTETNI A KIÜTÖTT GÉN TERMÉKÉT FÚZIÓS FEHÉRJE FORMÁJÁBAN

MEGOLDÁSI SÉMA

• 1. A megadott célgént tartalmazó genomi lókusz letöltése, a célgén és a környező gének pozíciójának kijelölése

• Eszköz: internet, adatbankok• pl. NCBI, Genbank• http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/gquery

complement(1934864..1936042)

Csak a 1 933 000 – 1 938 000 régió kell

Ekkor a gén 3 043 bp-nál kezdődik és 1 485 bp-nál ér végetComplement!

Ar1oriV

Ar1 oriV

vad típus mutáns poláris hatás ?

Deléciós mutagenezis a leolvasási keret sértése nélkül

oriV: szűk gazdaspecificitás

oriT

oriT

Ar: antibiotikum rezisztencia

500-1000 bp 500-1000 bp

DE! A két szakasznak nagyjából egyforma hosszúnak kell lennie,Hogy azonos legyen a rekombinációs valószínűség

A VEKTOR KIVÁLASZTÁSA

Szempontok:

1.Az adott feladathoz szabad-e, kell-e replikálódnia a vektornak a célsejtben

2.Olyan antibiotikum rezisztenciát hordozzon, mely antibiotikumra a sejt érzékeny

3.Milyen módon lehet bejuttatni a célsejtbe DNS-t

NÉHÁNY HASZNÁLATOS ANTIBIOTIKUM

antibiotikum működési mód a rezisztencia módja koncentráció

(µg/ml)

ampicillin bakteriocid, sejt fal szintézis inhibitor

a laktamáz elhidrolizálja az ampicillin laktám gyűrűjét

50 -100

klóramfenikol bakteriosztikus, fehérje szintézis inhibitor, kölcsönhat az 50S

riboszoma alegységgel

klóramfenikol acetiltranszferáz (cat) acetilálja a klóramfenikolt

20

kanamicin bakteriocid, fehérje szintézis inhibitor

aminoglikozid foszfotranszferáz illetve nukleotidtranszferáz

foszforilálja vangy adenilálja a kanamicint

30 - 500

tetraciklin bakteriosztatikus, proteinszintézis inhibitor, gátolja az aminoacil-tRNS kötődését a riboszómához

a sejt permeabilitásának csökkentésével a tetraciklin nem tud

bejutni a sejtbe

15

PÉLDÁK PLAZMID REPLIKONOKRA PLAZMID INKOMPATIBILTÁSI CSOPORT KÓPIASZÁM GAZDASPECIFICITÁS

pBR322 ColE1 20 E. coli és még néhány

pUC19 ColE1 300 E. coli és még néhány

F plazmid FI 1-2 E. coli és még néhány

pRK356 (R1, R6)

FII 2 E. coli és még néhány

pRK2501 (RK2)

P 1-4 Gram-negatív

baktériumokban széles

RSF1010 Q 10 Gram-negatív

baktériumokban széles

pRK353 (R6K)

X 13-40 Gram-negatív

baktériumokban széles

P1 Y 1-2 Gram-negatív

baktériumokban széles

PROKARIÓTA EXPRESSZIÓS VEKTOR ELEMEI

TT

-35 -10

SZF

-35 -10 SD kódoló szekvencia

Pr

TSZE

TTGACAN17TATAAT

5’ UAAGGAGGN(3-11)

START kodonAUGGUGUUG

STOP kodonUAAUUGAUAG

AR ORI

GS

Pr: promóterTT: transzkripciós terminációs szignál, SZF: szabályozó fehérje,, TSZE: transzlációt szabályozó elemek, SD: Shine-Dalgarno szekvencia,

AR: antibiotikum rezisztencia, ORI: replikációs origoGS: gazdasejt

Fúziós partner