avances en biolog ía molecular con fines diagn ósticos · tendencias en el diagn óstico de...
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Avances en biologAvances en biologíía a
molecular con fines molecular con fines
diagndiagnóósticossticos
Jovita Fernández Pinerofpinero@inia.es
Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA-INIA), Valdeolmos, Madrid
XVI SIMPOSIO ANUAL AVEDILA, Tenerife, 24-25 Noviembre 2011
Técnicas de detección molecularTTéécnicas de deteccicnicas de detecci óón molecularn molecular
Tendencias en el diagnTendencias en el diagn óóstico de stico de enfermedades infecciosas animalesenfermedades infecciosas animales
TTéécnicas de aplicacicnicas de aplicacióón en campo n en campo
o o penpen--sideside teststests
TTéécnicas de aplicacicnicas de aplicacióón a gran escalan a gran escala
Avances tecnológicos en PCRAvances tecnolAvances tecnol óógicos en PCRgicos en PCR
Enzimas/reactivos mejoradosEnzimas/reactivos mejorados
PolimerasasPolimerasas hothot--startstart: : ensayos de RTensayos de RT--PCR en un solo pasoPCR en un solo paso
Master Master mixmix: : reactivos premezclados, menor manipulacireactivos premezclados, menor manipulacióónn
PCR PCR fastfast: : reacciones de amplificacireacciones de amplificacióón en una horan en una hora
PolimerasasPolimerasas menos sensibles a inhibicimenos sensibles a inhibicióón: n: ensayos mensayos máás robustoss robustos
Avances tecnológicos en PCR:
sistemas de PCR múltipleAvances tecnolAvances tecnol óógicos en PCR: gicos en PCR:
sistemas de sistemas de PCR mPCR múúltipleltiple
Empleo de varias parejas de primers en una única
reacción
Empleo de varias parejas de primers en una única
reacción
DetecciDeteccióón simultn simultáánea de varios patnea de varios patóógenos:genos:ahorro econahorro econóómico y de tiempomico y de tiempo
AplicaciAplicacióón en el diagnn en el diagnóóstico diferencial:stico diferencial:enfermedades relacionadas (huenfermedades relacionadas (huéésped, clsped, clíínica)nica)
HemorrágicasVesiculares
RespiratoriasAcuicultura
HemorrágicasVesiculares
RespiratoriasAcuicultura
PESTE PORCINA AFRICANA (PPA)
PESTE PORCINA AFRICANA (PPA) PESTE PORCINA CLÁSICA
(PPC)PESTE PORCINA CLÁSICA
(PPC)
• 1-3: Cerdo infectado con el VPPC España 2/2001. 1: bazo, 2: tonsila, 3: riñón.
• 4-5: Cerdo infectado con el VPPC Paderborn. 4: bazo, 5: ganglio linfático.
• 6-7: Cerdo infectado con el VPPC Alfort 187. 6: sangre-EDTA, 7: riñón.
• 8-14: Cerdo infectado con el VPPA Lisboa 60. 8: sangre-EDTA, 9: bazo, 10: riñón, 11: ganglio linfático, 12: pulmón, 13: hígado, 14: tonsila.
• C: Control positivo de reacción. MV y MVI: Marcadores de peso molecular V y VI (Roche)
108 bp-
257 bp-
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 C M V
PPA-1/2 + PPC-3/4
DetecciDetecci óón de VPPA y VPPC n de VPPA y VPPC mediante RTmediante RT --PCR mPCR múúltipleltiple
Avances en PCR: PCR múltipleAvances en PCR: Avances en PCR: PCRPCR mmúúltipleltiple
FIEBRE AFTOSA (FA)FIEBRE AFTOSA (FA) ENFERMEDAD VESICULAR PORCINA (EVP)
ENFERMEDAD VESICULAR PORCINA (EVP)ESTOMATITIS
VESICULAR (EV)ESTOMATITISVESICULAR (EV)
DetecciDetecci óón de VFA, VEVP y VEV n de VFA, VEVP y VEV mediante RTmediante RT --PCR mPCR múúltipleltiple
275 bp-
154 bp-110 bp-
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C+ M11 12
• 1-2: Cerdo infectado con el VFA-O UK2001. 1: epitelio vesicular, 2: suero.
• 3-4: Cerdo infectado con el VFA-A A22 Iraq. 3: hisopo faríngeo, 4: sangre-EDTA.
• 5-8: Cerdos infectados con el VEVP UKG 27/72. 5: epitelio vesicular, 6: heces, 7: hisopo faríngeo,
8: sangre-EDTA.
• 9-10: Cerdo infectado con el VEV-Ind-1 Colorado 1942. 9: epitelio vesicular, 10: sangre-EDTA.
• 11-12: Cerdo infectado con el VEV-NJ Colombia 1964. 11: hisopo faríngeo, 12: tonsila.
• C+: control positivo de reacción. M: Marcador de peso molecular V (Roche)
FMD-B/FMD-C + SS4/SA2 + VSV-1/VSV-2
Avances en PCR: PCR múltipleAvances en PCR: Avances en PCR: PCRPCR mmúúltipleltiple
DETECCIDETECCI ÓÓN DEL PRODUCTO N DEL PRODUCTO AMPLIFICADO DURANTE LA PCRAMPLIFICADO DURANTE LA PCR
� Mayor rapidez
� Menor riesgo de contaminaciones
� Sensibilidad igual o superior
� Cuantitativa
� Amplificación-detección automatizadas
� Creciente implantación en laboratorios de
diagnóstico
Avances tecnológicos en PCR: PCR en tiempo realAvances tecnolAvances tecnol óógicos en PCR: gicos en PCR: PCRPCR en tiempo realen tiempo real
¿¿CCÓÓMO?MO? UtilizaciUtilizacióón de n de fluorocromosfluorocromos y y termocicladorestermocicladores
con sistemas de deteccicon sistemas de deteccióón de n de fluorescenciafluorescencia
PCR en tiempo real: sondas de hidrólisisPCR en tiempo real: sondas de hidrPCR en tiempo real: sondas de hidr óólisislisis
MGB:minor groove binder
LNA: locked nucleic acid
• Sondas de hidrólisis tipo TaqMan
• Grupos modificados para mayor estabilidad en la
unión con ADN molde: sondas más cortas
• Útil para detección de virus con genoma variable
VLA, VPEA, WNV, …VLA, VPEA, WNV, …
Sondas Sondas TaqManTaqMan
VPPA, VPPC, VFA, VEVP, VIA, …VPPA, VPPC, VFA, VEVP, VIA, …
Avances en PCR en tiempo real: sondas UPL (Universal Probe Library)Avances en PCR en tiempo real: Avances en PCR en tiempo real: sondas UPL sondas UPL (Universal (Universal ProbeProbe LibraryLibrary ))
• Sondas de hidrólisis (8-9 LNA) de detección
universal: 165 sondas pre-validadas
• Desarrolladas para estudios de expresión génica
• Reciente comercialización: sistema rápido y
asequible
• Aplicación en técnicas de detección de patógenos:
influenza pandémica H1N1
Avances en PCR en tiempo real: sistema PriProETAvances en PCR en tiempo real: Avances en PCR en tiempo real: sistema sistema PriProETPriProET
Cy5 FAM
Energy transferEmission
Excitation
Cy5 FAM
”Cold” primer Fluorescent primerFluorescent probe
DVI, Lindholm
• Sistema robusto
• Buena sensibilidad
• Confirmación mediante curva de disociación
VPPC, VPPAVFA, VEVP, VEV…VPPC, VPPAVFA, VEVP, VEV…
Avances tecnológicos en PCR:
desarrollo de kits comercialesAvances tecnolAvances tecnol óógicos en PCR: gicos en PCR:
desarrollo de desarrollo de kitskits comercialescomerciales
• Único tubo con master mix: menor riesgo de
contaminaciones, pipeteo más fiable
• Facilidad y rapidez ante una situación de emergencia
• No necesidad de optimizar el ensayo en el laboratorio
• Gran variedad para la detección y caracterización de
patógenos
• Reactivos liofilizados: empleo en equipos portátiles
• Sistemas costosos
Avances tecnológicos en PCR: AutomatizaciónAvances tecnolAvances tecnol óógicos en PCR: gicos en PCR: AutomatizaciAutomatizaci óónn
ExtracciExtraccióón de n de áácidos nucleicoscidos nucleicos
PreparaciPreparacióónn de de muestrasmuestras
AmplificaciAmplificacióónn--deteccideteccióónn
• Menor riesgo de contaminación
• Mayor reproducibilidad
• Análisis a gran escala
Avances tecnológicos en PCR: Sistemas portátilesAvances tecnolAvances tecnol óógicos en PCR: gicos en PCR: Sistemas portSistemas port áátilestiles
AdaptaciAdaptacióónn de de mméétodostodos de PCR en de PCR en
tiempotiempo real a real a sistemassistemas portportáátilestiles
• Pen-side tests: técnicas de primera línea
• Laboratorios móviles
• Aplicación rápida en situación de
emergencia sanitaria
• Sistemas costosos
R.A.P.I.D. SystemRAZOR EX
Bio-seeq
T-COR 4
Avances tecnológicos en PCR:
nuevos equipos de bajo costeAvances tecnolAvances tecnol óógicos en PCR: gicos en PCR:
nuevos equipos de bajo costenuevos equipos de bajo coste
Eco real-time PCR systemEco realEco real--time PCR systemtime PCR system
•Primer equipo low-cost de PCR en tiempo real del mercado
•48 muestras
•Software sencillo y fácil interpretación
•Todas las aplicaciones necesarias en diagnóstico
•Primer equipo low-cost de PCR en tiempo real del mercado
•48 muestras
•Software sencillo y fácil interpretación
•Todas las aplicaciones necesarias en diagnóstico
Avances tecnológicos en PCR:
nuevos equipos de bajo costeAvances tecnolAvances tecnol óógicos en PCR: gicos en PCR:
nuevos equipos de bajo costenuevos equipos de bajo coste
LightCycler Nano real-time PCR systemLightCyclerLightCycler NanoNano realreal--time PCR time PCR systemsystem
•Nuevo equipo low-cost de PCR en
tiempo real ya disponible en el mercado
•32 muestras (4x8 tubos en tiras
estandar)
•Software sencillo y fácil interpretación
•4 canales de lectura de fluorescencia
•Todas las aplicaciones necesarias en
diagnóstico
•Nuevo equipo low-cost de PCR en
tiempo real ya disponible en el mercado
•32 muestras (4x8 tubos en tiras
estandar)
•Software sencillo y fácil interpretación
•4 canales de lectura de fluorescencia
•Todas las aplicaciones necesarias en
diagnóstico
Avances tecnológicos: LATE-PCR (linear-after-the-exponential PCR)Avances tecnolAvances tecnol óógicos: gicos: LATELATE --PCR PCR (linear(linear --afterafter --thethe --exponentialexponential PCR)PCR)
• PCR asimétrica en tiempo real
• Obtención de gran nº de moléculas ssDNA
• Sonda de detección con baja Tm
• Técnica de elevada sensibilidad: detección desde una sola célula
• Aplicación en sistema portátil de PCR Bio-seeq
Influenza AviarEnfermedad de NewcastleFiebre Aftosa
Influenza AviarEnfermedad de NewcastleFiebre Aftosa
Sánchez et al., PNAS 2004
• No requieren uso de termocicladores
• Desarrolladas para su empleo como pen-side tests
• Técnicas rápidas y de alta sensibilidad
• Diseño difícil: necesidad de primers largos
Avances tecnológicos: Técnicas de amplificación isotérmicaAvances tecnolAvances tecnol óógicos: gicos: TTéécnicas de cnicas de amplificaciamplificaci óón isotn isot éérmicarmica
LAMP (loop-mediated isothermal amplification)
LAMP (loop-mediated isothermal amplification)
NASBA (nucleic acid sequence-based amplification)
NASBA (nucleic acid sequence-based amplification)
Técnicas de amplificación isotérmica: LAMP (loop-mediated isothermal amplification)TTéécnicas de amplificacicnicas de amplificaci óón isotn isot éérmica: rmica: LAMP LAMP ((looploop --mediatedmediated isothermalisothermal amplificationamplification ))
� Reacción de amplificación isotérmica a 60-65ºC
� 1 hora
� Válido para ARN/ADN
� ADN polimerasa con actividad desplazadora de doble cadena de ADN
� 4 primers en 6 regiones del fragmento a amplificar: FIP, F3, BIP, B3
de M. Hakhverdyan, SVA, Suecia
B3B2 B1c
FIP
BIP
F3F3
B3
Notomi et al., Nucl Acids Res 2000
F3 F2 F1 B1c B2c B3c5’ 3’
F3c F2c F1c B1 B2 B33’ 5’
F2
F1c
Técnicas de amplificación isotérmica: LAMPTTéécnicas de amplificacicnicas de amplificaci óón isotn isot éérmica: rmica: LAMPLAMP
http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/principle.html
Técnicas de amplificación isotérmica: LAMPTTéécnicas de amplificacicnicas de amplificaci óón isotn isot éérmica: rmica: LAMPLAMP
http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/principle.html
Técnicas de amplificación isotérmica: LAMPTTéécnicas de amplificacicnicas de amplificaci óón isotn isot éérmica: rmica: LAMPLAMP
http://loopamp.eiken.co.jp/e/
Detección visual por turbidez
Detección visual por fluorescencia
Detección a tiempo real
Detección mediante electroforesis
Técnicas de amplificación isotérmica: LAMPTTéécnicas de amplificacicnicas de amplificaci óón isotn isot éérmica: rmica: LAMPLAMP
• No requiere equipamiento especial
• Sensibilidad comparable a PCR
• Alta especificidad por el empleo de 4 primers
frente a 6 regiones del genoma a detectar
• Detección directa del producto amplificado
• Aplicación real en campo como pen-side test
• Posibilidad de análisis cuantitativo y a gran
escala en laboratorio
• Diseño difícil, principalmente en virus altamente
variables
NDV, VIA, VFA, VEVP, VPPA, VPPC,Virus del Nilo Occidental
NDV, VIA, VFA, VEVP, VPPA, VPPC,Virus del Nilo Occidental
Técnicas de amplificación isotérmica: RPA(Recombinase Polymerase Amplification)TTéécnicas de amplificacicnicas de amplificaci óón isotn isot éérmica: rmica: RPARPA(Recombinase (Recombinase PolymerasePolymerase AmplificationAmplification ))
� Reacción de amplificaciónisotérmica a 37ºC
� No necesaria la desnaturalización del ADN
� Resultados en minutos
� Válido para ARN/ADN
•• No hay mNo hay méétodos para deteccitodos para deteccióón n de patde patóógenosgenos
•• CombinaciCombinacióón con equipos n con equipos portportáátilestiles
Piepenburg et al., PLOS Biology 2006
Avances tecnológicos: Bioinformática y secuenciaciónAvances tecnolAvances tecnol óógicos: gicos: BioinformBioinform áática tica y secuenciaciy secuenciaci óónn
• Análisis y comparación de secuencias de ADN
• Estudios de caracterización y epidemiología molecular
• Tipificación rápida de virus: vacunación, medidas de
control
• Diseño de nuevos métodos de detección molecular
Avances en diagnóstico molecular: Algunos trabajos del grupo EET del CISA-INIA en respuesta al escenario epidemiológico
Avances en diagnAvances en diagn óóstico molecular: stico molecular: Algunos Algunos trabajos del grupo EET del CISAtrabajos del grupo EET del CISA --INIA en INIA en respuesta al escenario epidemiolrespuesta al escenario epidemiol óógicogico
Peste Porcina AfricanaPeste Porcina AfricanaPeste Porcina Africana
Lengua AzulLengua AzulLengua Azul
Virus BagazaVirus Virus BagazaBagaza
Avances en diagnóstico molecular:
Lengua AzulAvances en diagnAvances en diagn óóstico molecular: stico molecular:
Lengua AzulLengua Azul
• Afecta a rumiantes salvajes y domésticos.
• Ovinos: enfermedad aguda con mortalidad entre 0-
50%.
• Bovinos: enfermedad subclínica habitualmente.
Virus de la Lengua Azul (VLA)Virus de la Lengua Azul (VLA)
• Familia Reoviridae, género Orbivirus.
• Genoma viral: 10 segmentos dsRNA.
• 24 serotipos descritos con alta variabilidad genética
entre ellos (25 y 26 propuestos).
• Transmisión por vectores artrópodos (Culicoides)
• Vacunación específica de serotipo.
BTV ST-1 Y ST-8BTV STBTV ST--1 1 YY STST--88 Desarrollo de un ensayo
múltiple de RRT-PCR DesarrolloDesarrollo de un de un ensayoensayo
mmúúltipleltiple de RRTde RRT--PCR PCR
OBJETIVO:OOBJETIVO:BJETIVO:
DetecciDeteccióónn gengenééricarica de BTV: de BTV: primers y primers y sondasonda TaqManTaqMan--LNA LNA
PanPan--BTV BTV de Toussaint et al., 2007de Toussaint et al., 2007
IdentificaciIdentificacióónn especespecííficafica de BTVde BTV--1 1 ((ArgeliaArgelia 2006): 2006): primers y primers y sondasonda
TaqManTaqMan--MGB MGB disediseññadosados en en regiregióónn VP2 (M. VP2 (M. AgAgüüeroero))
IdentificaciIdentificacióónn especespecííficafica de BTVde BTV--8:8: DiseDiseññoo dede primers y primers y sondasonda
TaqManTaqMan en en regiregióónn VP2 de VP2 de BTVBTV--8 8
Control Control internointerno parapara material material clclííniconico:: primers y primers y sondasonda TaqManTaqMan parapara
ββββββββ--actinaactina de Toussaint et al., 2007de Toussaint et al., 2007
AutomatizaciAutomatizacióónn del del procesoproceso de de
extracciextraccióónn de ARNde ARN
DiseDiseññoo del del mméétodotodo empleandoempleando
sondassondas marcadasmarcadas concon distintosdistintos
fluorocromosfluorocromos
EmpleoEmpleo de de reactivosreactivos parapara
amplificaciamplificacióónn mmúúltipleltiple
Análisis a gran escala
Menor riesgo de contaminación
Detección simultánea
Lecturas independientes
Sensibilidad comparable a ensayos individuales
Desarrollo del ensayo múltiple de RRT-PCR:
pan-BTV/BTV-1/BTV-8/ββββ-actina DesarrolloDesarrollo del del ensayoensayo mmúúltipleltiple de RRTde RRT--PCR: PCR:
panpan--BTV/BTVBTV/BTV--1/BTV1/BTV--8/8/ββββββββ--actina actina
FAMFAM
Pan-BTV (Toussaint et al 2007)
Pan-BTV (Toussaint et al 2007)
VICVIC
BTV-1BTV-1
Cy5Cy5
BTV-8BTV-8
ROXROX
ββββ-actinaββββ-actina
Detección específica en la reacción múltipleDetecciDeteccióónn especespecííficafica en la en la reaccireaccióónn mmúúltipleltiple
Aplicación del ensayo en muestras clínicasAplicaciAplicacióónn del del ensayoensayo en en muestrasmuestras clclíínicasnicas
100 Km.
Cádiz
Alectoris rufa
Phasianus colchicus
Identificación y caracterización de patógenos emergentes
IdentificaciIdentificaci óón y caracterizacin y caracterizaci óón n de patde pat óógenos emergentesgenos emergentes
• Septiembre 2010, Cádiz.
• Alta mortalidad en perdices (faisanes
afectados).
• Debilidad, postración, diarrea, pérdida de
peso, ausencia de coordinación motora.
• Primeros casos de WNV en caballos.
Diagnóstico inicialen LCV-MARM
DiagnDiagnóósticostico inicialinicial
en LCVen LCV--MARMMARM
Secuencia parcial NS5
VIRUS BAGAZA
Identificación y caracterización de patógenos
emergentes: Virus BagazaIdentificaciIdentificaci óón y caracterizacin y caracterizaci óón de patn de pat óógenos genos
emergentes: emergentes: Virus Virus BagazaBagaza
• Familia Flaviviridae, género Flavivirus.
• Genoma ssRNA+ (aprox. 11 kb).
• Transmisión por mosquitos Culex.
• Descrito únicamente en mosquitos en Rep.
Centroafricana (1966) y en India (1996)
• Evidencia serológica en humanos
Gaunt, M.W. et al (2001) J Gen Virol, 82:1867-76
Gen E
Caracterización del genoma completo: Diseño de primers, amplificación y secuenciación
CaracterizaciCaracterizacióónn del del genomagenoma completocompleto: : DiseDiseññoo de primers, de primers,
amplificaciamplificacióónn y y secuenciacisecuenciacióónn
• Corazón y cerebro de una perdiz
• 27 parejas de primers diseñadas
• Regiones solapantes del genoma
• Rediseño de 5 parejas de primers
• Secuencias 100% idénticas
• Corazón y cerebro de una perdiz
• 27 parejas de primers diseñadas
• Regiones solapantes del genoma
• Rediseño de 5 parejas de primers
• Secuencias 100% idénticas
BAGVBAGV
Caracterización del genoma
completo: Comparación de secuencias
CaracterizaciCaracterizacióónn del del genomagenoma
completocompleto: : ComparaciComparacióónn de de
secuenciassecuencias
BAGVBAGV
Caracterización del genoma completo: Análisis filogenéticoCaracterizaciCaracterizacióónn del del genomagenoma completocompleto: : AnAnáálisislisis filogenfilogenééticotico
BAGVBAGV
Análisis filogenético de secuencia parcial gen EAnAnáálisislisis filogenfilogenééticotico de de secuenciasecuencia parcialparcial gengen EE
• BAGV es similar al virus de la
meningoencefalitis del pavo
• Sólo descrito en Israel y Sudáfrica
BAGVBAGV
Avances en diagnóstico molecular:
Peste Porcina AfricanaAvances en diagnAvances en diagn óóstico molecular: stico molecular:
Peste Porcina AfricanaPeste Porcina Africana
Virus de la Peste Porcina Africana (VPPA)Virus de la Peste Porcina Africana (VPPA)
• Familia Asfarviridae, género Asfivirus.
• Virus ADNdc (170-190 kb).
• Viremias tempranas y prolongadas.
• Cerdo doméstico y salvaje, garrapatas del género
Ornithodoros.
• Alta mortalidad en las formas agudas.
• Diagnóstico diferencial con Peste Porcina Clásica
(PPC).
• Ausencia de vacuna.
Fuente: www.oie.int
Emergente en el este de Europa en junio 2007Emergente en el este de Europa en junio 2007
PESTE PORCINA AFRICANA: 2006-2011PPESTE ESTE PPORCINA ORCINA AAFRICANA: 2006FRICANA: 2006--20112011
Task 2: DIAGNÓSTICO DE PPA
TaskTask 2:2: DIAGNDIAGNÓÓSTICO STICO DE PPADE PPA
Actualización y mejora de lastécnicas moleculares actualesActualizaciActualizacióónn y y mejoramejora de de laslas
ttéécnicascnicas molecularesmoleculares actualesactuales
Incrementar las tIncrementar las téécnicas diagncnicas diagnóósticas disponibles sticas disponibles
en los laboratorios de referencia en los laboratorios de referencia
Ofrecer tOfrecer téécnicas sencillas y rcnicas sencillas y ráápidas de aplicacipidas de aplicacióón en n en campo como campo como penpen--sideside teststests
Proporcionar tProporcionar téécnicas asequibles a cnicas asequibles a
laboratorios/palaboratorios/paííses con recursos limitadosses con recursos limitados
"Evaluating and controlling the risk of
African swine fever in the EU", ASFRISKGrant Agreement no. 211691
April 2008-September 2011
Project coordinator: Prof. Carlos Martins
Desarrollo de un método de PCR en tiempo real rápido
y asequible para la detección mejorada de VPPADesarrollo de un método de PCR en tiempo real rápido
y asequible para la detección mejorada de VPPA
•Método de alta sensibilidad
•Resultados reproducibles
•Detecta todos los genotipos ensayados
•Método de alta sensibilidad
•Resultados reproducibles
•Detecta todos los genotipos ensayados
Adaptación del método de UPL PCR a kit comercial
AdaptaciAdaptaci óón del n del mméétodo de UPL PCR todo de UPL PCR a a kitkit comercialcomercial
•Implementación rápida y sencilla
•Reactivos listos para usar
•Actualmente en validación
•Implementación rápida y sencilla
•Reactivos listos para usar
•Actualmente en validación
Sistema de PCR empleandouna sonda UPLSistemaSistema de PCR de PCR empleandoempleandounauna sondasonda UPLUPL
Sondas listas para usar
Coste asequible
15
18
21
24
27
30
33
36
39
Ct v
alue
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27Sample no.
run 1
run 2
run 3
run 4
run 5
run 6
run 7
run 8
VALIDADO VALIDADO
Desarrollo de un método de LATE-PCR para la detección
de VPPA en laboratorio y en campoDesarrollo de un método de LATE-PCR para la detección
de VPPA en laboratorio y en campo
•Método sensible y específico
•Detecta todos los genotipos ensayados
•Compatible con cualquier equipo de PCR tiempo real
•Método sensible y específico
•Detecta todos los genotipos ensayados
•Compatible con cualquier equipo de PCR tiempo real
BioSeeq-Vet (Smiths Detection):
•Equipo completamente portátil para aplicación
en campo
•Cartucho que incluye extracción de ADN y
amplificación
•Sistema caro
•Actualmente no disponible
BioSeeq-Vet (Smiths Detection):
•Equipo completamente portátil para aplicación
en campo
•Cartucho que incluye extracción de ADN y
amplificación
•Sistema caro
•Actualmente no disponible
Adaptación del método de LATE-PCR a kit comercialAdaptaciAdaptaci óón del mn del m éétodo de todo de LATELATE --PCR a PCR a kitkit comercialcomercial
Desarrollo de un método LAMP de detección del ADN de
VPPA para su aplicación rápida en campo como pen-si de testDesarrollo de un método LAMP de detección del ADN de
VPPA para su aplicación rápida en campo como pen-si de test
•Amplificación de ADN a Tª constante (62ºC)
•Alta especificidad, detecta todos los
genotipos de VPPA ensayados
•Menor sensibilidad que PCR en tiempo real
•No necesidad de equipos sofisticados,
técnica de bajo coste
•Rápida amplificación del ADN
•Técnica de primera línea: pen-side test
•Amplificación de ADN a Tª constante (62ºC)
•Alta especificidad, detecta todos los
genotipos de VPPA ensayados
•Menor sensibilidad que PCR en tiempo real
•No necesidad de equipos sofisticados,
técnica de bajo coste
•Rápida amplificación del ADN
•Técnica de primera línea: pen-side test
•Fácil adquisición e implementación en el laboratorio
•Reactivos liofilizados listos para usar: conservación
a Tª ambiente
•Aplicación en campo
•Fácil adquisición e implementación en el laboratorio
•Reactivos liofilizados listos para usar: conservación
a Tª ambiente
•Aplicación en campo
Adaptación del método de LAMP a kit comercialAdaptaciAdaptaci óón del mn del m éétodo de LAMP a todo de LAMP a kitkit comercialcomercial
VALIDADO VALIDADO
Validación de las técnicas moleculares desarrollada sValidación de las técnicas moleculares desarrollada s
• Único kit comercial disponible para VPPA
•Válido en cualquier equipo de PCR en
tiempo real
•Combinado con equipo de PCR portátil
para aplicación en campo
•Buena sensibilidad y especificidad
•Reactivos liofilizados listos para usar
• Único kit comercial disponible para VPPA
•Válido en cualquier equipo de PCR en
tiempo real
•Combinado con equipo de PCR portátil
para aplicación en campo
•Buena sensibilidad y especificidad
•Reactivos liofilizados listos para usar
T-COR 4TM
CombinaciCombinaci óón de n de kitkit comercial+equipo portcomercial+equipo port áátiltil
Validación de kit comercial de PCR en tiempo real pa ra
detección del ADN de VPPAValidación de kit comercial de PCR en tiempo real pa ra
detección del ADN de VPPA
Simplificación en la recogida, transporte
y almacenamiento de muestrasSimplificación en la recogida, transporte
y almacenamiento de muestras
•Recogida de muestras sencilla
•Transporte y conservación a Tª ambiente
•No es necesario personal veterinario especializado
•Equipamiento básico en campo y en laboratorio
•Recogida de muestras sencilla
•Transporte y conservación a Tª ambiente
•No es necesario personal veterinario especializado
•Equipamiento básico en campo y en laboratorio
Simplificación en la recogida, transporte
y almacenamiento de muestrasSimplificación en la recogida, transporte
y almacenamiento de muestras
• Papel de filtro químicamente tratado
• Inactivación de patógenos
• Detección de genoma viral durante años
• Sistema costoso
• Papel de filtro químicamente tratado
• Inactivación de patógenos
• Detección de genoma viral durante años
• Sistema costoso
• Papel de filtro para cromatografías
• Detección de ADN y Ac (aislamiento?)
• Sistema de bajo coste
• Papel de filtro para cromatografías
• Detección de ADN y Ac (aislamiento?)
• Sistema de bajo coste
FTA cardsFTA FTA cardscards
3MM filter paper3MM 3MM filterfilter paperpaper
SANGRE muestrade elección
SANGRE muestrade elección
STANDARD DNA EXTRACTION
(Roche)
FTA-CARD DNA WASHING (Whatman)
FTA-CARD DNA EXTRACTION (NucleoSpin)
FTA-CARD DNA WASHING (Whatman)
FTA-CARD DNA EXTRACTION (NucleoSpin)
FTA-CARD DNA WASHING (Whatman)
FTA-CARD DNA EXTRACTION (NucleoSpin)
BLOOD 4DPI 19,1 23,81/23,67 25,67 21,87 27,05 22,19 25,65BL 4DPI 10 -1 22,79 26,42/26,26 29,01 25,13 30,61 26,17 30,02BL 4DPI 10 -2 27,27 29,05/29,54 32,84 28,41 33,41 29,73 33,74BL 4DPI 10 -3 30,26 33,42/33,23 35,39 32,03 39,76 32,76 35,46BL 4DPI 10 -4 33,28 37,67/36,02 37,87 36,04 No Ct 36,71 37,44BLOOD C- No Ct No Ct/No Ct No Ct No Ct No Ct No Ct No CtSERUM 4DPI 24,82 30,22/29,73 32,18 28,66 33,62 28,87 35,17S 4DPI 10-1 28,18 32,71/32,73 36,21 32,17 36,83 32,04 >40S 4DPI 10-2 31,7 36,25/37,07 No Ct 35,12 No Ct 35,39 No CtS 4DPI 10-3 34,32 38,98/>40 No Ct No Ct No Ct No Ct No CtS 4DPI 10-4 38,31 No Ct/No Ct No Ct No Ct No Ct No Ct No CtSERUM C- No Ct No Ct/No Ct No Ct No Ct No Ct No Ct No Ct
1 day at RT 1 year at RT 2 years at RT
Detección del ADN de VPPA en FTA cardsDetección del ADN de VPPA en FTA cards
UPL PCRUPL PCRUPL PCR
• Sangre como muestra de elección
• Detección de VPPA después de dos
años a RT
• Chequeo del estado del ADN
mediante ensayo de control interno
• Sangre como muestra de elección
• Detección de VPPA después de dos
años a RT
• Chequeo del estado del ADN
mediante ensayo de control interno
ββββ-actinaββββββββ--actinaactinaVPPAVPPAVPPA
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