2010 pres jdthese desaunay - lthe.fr

Rôle des bactéries dans la rétention et le transfert accéléré de multipollutions

métalliques dans les sols

DESAUNAY Aurélien

Sous la direction de Jean MARTINS

Financement: bourse CNRS-BDI

1

Contexte d’étude

?

• Ruissellement de surface• Transport fluvial• Transport dynamique• Bio transformations• Volatilisation

Nécessité d’identifier ces mécanismes pour mieux prédire le devenir des polluants et leur impact sanitaire et environnemental

Rôle de la fraction colloïdale dans le transport des métaux ?

2

Impact du transport colloïdalLes colloïdes abiotiques du sol (argiles, MO…) :

- Taille < 1µm

- Faible solubilité

- Réactivité importante

Colloïdes abiotiques sont connus pour la mobilisation et l’accélération du transport de contaminants (ETM et Radioéléments)

Encore peu de connaissances sur:- La présence de plusieurs polluants dans le milieu

- Le rôle joué par les biocolloïdes (bactéries)

3

Les bactéries• Êtres vivants unicellulaires, procaryotes (pas de

noyau) micrométriques comportement colloïdal• Mobiles, fixées ou formant des biofilms

présentes dans tous types d’environnementNombreuses (106 à 1010 cellules/g sol sec) et actives Participation aux cycles biogéochimiques Réactivité importante

COMPARTIMENT REACTIF DU SOL

4

Copper encrustationson P. aeruginosa cells

(Little et al. 1997)

Se accumulation in R. metallidurans CH34

(Roux et al. 2001)

Contribution au transfert accéléré des polluants ?

Comprendre les mécanismes d’interactions métaux bactéries et leur prépondérance

Accumulation intracellulaire

Adsorption sur la membrane

Spécificité des bactéries vis-à-vis des métaux

Ln cristals sorptionon P. aeruginosa

(Fortin et al. 1997)

Sorption aux polymères de

surface

5

Prise en charge des métaux par les bactéries?

- A l’échelle subcellulaire

- A l’échelle Biofilm

Démarche expérimentale couplée

D’après Véronique Guiné

0

0.25

0.5

0.75

1

C/C

0

Bio-transported metal (C. metallidurans CH34) Bio-transported metal (E. coli DH5α) Cadmium

pH ≈ 6

0

0.25

0.5

0.75

1

C/C

0

Bio-transported metal (C. metallidurans CH34) Bio-transported metal (E. coli DH5α) Cadmium

pH ≈ 6

Cadmium

pH ≈ 6

0 1 2 3 4 5 6 7 8V/V0

0 1 2 3 4 5 6 7 8V/V0

Étude du transfertaccéléré des polluants

- Bactéries seules

- Métaux seuls

- Mélanges

Statique Dynamique

Impact d’une Multipollution

Photo MEB, Muris

6

Plan• Introduction

• Axe 1 : interactions bactéries/métaux

– Étude de la distribution subcellulaire des métaux– Visualisation en microscopie électronique

• Axe 2 : Étude du transfert accéléré des métaux

7

Réactivité Bactérie/Métaux

D’après Ledin, 2000

Adsorption(Propriétés de surface)

Accumulation intracellulaire

Fixation aux polymères de surface

Cytoplasme

Membrane

Polymères de surface

8

Approche classique interactions bactéries/métaux

Conceptualisation simplisteNe décrit qu’une partie des mécanismes

Souvent mis en défaut

POH PO- + H+

ROH RO- + H+

COOH COO- + H+

OH

Acides carboxyliques

Neutres phosphatés

Basiques hydroxiles (amines)

9

Approche insuffisante

AUTRES MECANISMES?

Calcul théorique de densité de sites membranaires:

2 atomes de Zn/Cd par nm-2

Capacité de sorption mesurée:

30 à 60 atomes Zn/Cd par nm-2

Ratio:

15 à 30 X

Adsorption de Zn/Cd sur 3 bactéries (Guiné et al., 2006)

10

1. Mieux comprendre les mécanismes de prise en charge des métaux par les bactéries

- Étude de la distribution subcellulaire des métaux- Microscopie électronique

2. Ces mécanismes sont-ils conservés en présence de plusieurs métaux (2) ?

Objectif de l’Axe 1

11

Les modèles : les bactéries (Gram-)

Sensibilité aux métaux

Morphologie et taille

Cellules en forme de bâtonnets1.2 x 0.4 µm 2.1 x 0.6 µm

Guiné , 2006

Très résistante à de nombreux métaux

Cupriavidus metallidurans CH34

Escherichia coliK12DH5α

Plus sensible aux métaux àforte concentration

Bactéries maintenant bien connues au laboratoire:Capacités d’échange et groupes réactifs sont

identifiés et caractérisés

12

• ZINC (Zn):Oligo-élément essentiel à la vie (métalloenzymes)Toxique à fortes concentrationsPrincipale utilisation : industrielle (galvanisation)

• CADMIUM (Cd):Aucune fonction biologique connueMétal très toxiquePrincipales utilisations: cadmiage, accumulateurs électriques, pigments colorés…

Les modèles : Métaux (ETM)

13

Démarche expérimentale

« Contact passif » « Contact actif »

Culture en présence de

métal

48h à 30°C

Culture en absence de

métal

(48h à 30°C)

Resuspensiondans H2O

Mise en contact avec le métal

2h à 4°C

Centrifugation et rinçage du milieu de culture (3X)

Distribution subcellulaire

14

Distribution subcellulaire des métaux

surnageantCulot

Bactérie + Métal

Centrifugation 5000g / 10 min

Casse cellulaire par une presse de French à 1500kgf/cm2

Resuspension dans H2O

Ultracentrifugation 20000g / 20 min

surnageant Culot

Compartimentmembranaire

Compartimentintracellulaire

Compartimentextracellulaire

X2

Analyse des métaux par ICP-MS Sarah Bureau

15

Interactions bactéries/CdContact passif (2h à 4°C)

Comportement dépendant de la bactérie

Forte accumulation dans les compartiments intracellulaireet extracellulaire

Accumulation faible dans les membranes

C. metallidurans CH3446%

43%

11%

65%

31%

4%

E. coli K12DH5α

10-5M10-5M

16

Interactions bactéries/ZnContact passif (2h à 4°C)

E. coli K12DH5α

10-5M

9%

2%

89%

10-5M

55%

39%

6%

C. metallidurans CH34

Comportement dépendant de la bactérie

Forte accumulation dans les compartiments extracellulaireet intracellulaire ( surtout C. metallidurans CH34)

Accumulation faible dans les membranes

17

Interactions bactéries/ZnContact actif (48h à 30°C)

10%

3%

87%

E. coli K12DH5α

88%

7%

5%

C. metallidurans CH34

16%

3%

81%80%

17%

3%

Cadmium

Zinc

• Prise en charge « similaire » pour les 2 bactéries

• 80 à 90 % du métal dans le fluide extracellulaire

18

Interactions bactéries/CdC. metallidurans CH34

• Distribution très différente selon la mise en contact

• Mise en évidence de mécanismes de résistance

• Contact actif = comportement en milieu naturel

46%

43%

11%

Contact actifContact passif

88%

7%

5%

19

Microscopie électroniqueMET/EDX

Confirmation d’ accumulation intracellulaire

Control

Zn 1000ppm

Control

Zn 1000ppm

Présence de nanogranulesextracellulaire contenant du

métal

Collaboration avec Roland Hellmann (LGIT)

20

Travaux en cours• Poursuivre la microscopie pour confirmer ces résultats

• Mise au point d’un protocole d’ultrafiltration pour isoler les polymères extracellulaires (manip en cours)

Bactéries Exopolymères:

- ADN

- Polysaccharides

- Protéines

• Effet d’un mélange (Zn/Cd) sur la distribution de ces métaux chez les bactéries

21

Conclusions• Mise au point du protocole:

– Manip. Reproductibles

• Étude de distribution des métaux

– Faible importance de la membrane– Forte accumulation intracellulaire et extracellulaire

• Microscopie électronique

– Mise en évidence de l’accumulation intracellulaire– Présence de nanogranules extracellulaires

22

Plan• Introduction

• Axe 1 : interactions bactéries/métaux (seuls et en mélange)

• Axe 2 : Étude du transfert accélérédes métaux

- Comprendre ce que deviennent les métaux dans le sol après prise en charge

Étude du transfert en milieu poreux

23

Analyses:- Dosage des métaux- Énumération cellulaire- pH- conductivité…

Pompepéristaltique

Collecteur defractions

Balance

C/C0

V/V0

T

C

Sable

Colonne de laboratoire

Métaux et/ou

bactéries

2 sols modèles:- Sable de Fontainebleau

- Sable d’Hostun

24

Démarche expérimentale pour l’étude du transfert:

– Bactéries seules et en mélange

– Métaux seuls et en mélange

– Bactéries et métaux

Et Modélisation…

25

Sable de Fontainebleau (Guiné 2006)

Importance de la souche bactérienne et des conditions physico-chimique (FI, pH, q, Conc…)

Transfert des bactéries

0

0.25

0.5

0.75

1

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5V/V0

C/C

0

C. metallidurans CH34E. coli DH5αE. coli HMS174A. tumefaciens C58

KBr 1g L-1

Pour le transport de mélanges de bactéries :

nécessité d’outils plus puissants et nouveaux

26

Énumération cellulaire

La cytométrie renseigne sur:

• Taille relative (Forward scatter - FSC)

• Granularité relative (Side scatter - SSC)

• Intensité de fluorescence (Fluorochrome)

• Méthodes classiques:Dénombrement / DAPI / Densité Optique (600nm)

Inutilisable pour l’étude du mélange de bactéries

• Utilisation de la cytométrie en flux (Sylvie)

27

Résultats préliminairesDensité optique

0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50

0.60

0.70

0.80

0.90

1.00

0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50

V/V0

C/C

0

CytométrieDilution x 10000

0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50

0.60

0.70

0.80

0.90

1.00

0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50

V/V0

C/C

0

DO

H2O non filtré

H2O filtré 0.1µm

CytométrieDilution x 1000

0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50

0.60

0.70

0.80

0.90

1.00

0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50

V/V0

C/C

0

DO

H2O non filtré

H2O filtré 0.1µm

CytométrieDilution x 5000

0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50

0.60

0.70

0.80

0.90

1.00

0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50

V/V0

C/C

0

DO

H2O non filtré

H2O filtré 0.1µm

Outil « puissant et rapide »

Mise au point à compléter

28

Sable de Fontainebleau Sable d’Hostun

Faible rétention des 2 bactéries

KBr 1g L-1

0

0.25

0.5

0.75

1

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5V/V0

C/C

0

C. metallidurans CH34

E. coli DH5α

KBr 1g L-1KBr 1g L-1

0

0.25

0.5

0.75

1

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5V/V0

C/C

0

C. metallidurans CH34

E. coli DH5α

Transfert des bactéries

Rétentions réversible et irréversible plus

importantes

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5

V/V0

C/C

0

C. metallidruansCH34

E.coli K12DH5

29

Transfert des métauxSable Fontainebleau

Retard importantAccélération par les bactéries

Rétention totale des métaux

0

0,25

0,5

0,75

1

0 2 4 6 8V/V0

C/C0

67%Cadmium

Transport en présence des bactéries:-E. coli DH5a-R. metallidurans CH34

Transport en l'absence des bactéries

14%13%

0

0,25

0,5

0,75

1

0 2 4 6 8V/V0

C/C0

53%

Zinc

20%

17%

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

0 2 4 6 8 10 12

Cd

Zn

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0 20 40 60 80 100

% de metal total

Prof

. de

colo

nne

(en

cm)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0 20 40 60 80 100

% de metal total

Prof

. de

colo

nne

(en

cm)

ZnCd

Sable d’Hostun

30

Travaux en cours

-Terminer la mise au point du cytométre pour l’étude des mélanges de bactéries

- Étude du transport des bactéries et des métaux seuls ou en mélange dans une colonne de sable

- Modélisation du transfert

31

Conclusions

• Mise au point de la cytométrie en flux:

– Résultats préliminaires prometteurs (forme de la courbe de percée,mise au point à affiner)

• Étude du transfert accéléré des métaux

– 1 sable peu réactif accélération du transfert

– 1 sable trop réactif remobilisation des polluants

32

MERCI DE VOTRE ATTENTION

Remerciements:

Erwann, Aline, Jean, Sylvie, Lorenzo, Véronique LTHE

Sarah Bureau LGCA

Géraldine Sarret, Roland Hellmann